TWI723354B - 用於癌症治療之工程化幹細胞 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提供工程化幹細胞，其包含載體，該載體包含含有自殺基因之核酸序列、免疫檢查點基因之核酸序列之聚核苷酸及天然細胞毒性觸發受體或TNF相關之細胞凋亡誘導配體，其中該幹細胞係靶向腫瘤之細胞。本揭示內容亦提供治療個體之癌症或增強腫瘤內免疫性或增強腫瘤微環境中之免疫性之方法，其包含向該個體投與有效量之本揭示內容之工程化幹細胞。

Description

用於癌症治療之工程化幹細胞
本發明係關於用於治療癌症之工程化幹細胞。具體而言，該等工程化幹細胞至少包含自殺基因及免疫檢查點基因。
藉由與PD-1/PD-L1路徑相互作用之檢查點免疫療法處於癌症治療之前沿(cutting age)，且為癌症之治癒提供希望。由此基因編碼之蛋白質係天然細胞毒性受體(NCR3)，其可幫助NK細胞溶解腫瘤細胞。然而，高達70%之患者對治療無反應，在一些臨床病例中甚至引起嚴重之併發症(The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2013, 98(4): 1361-1375)。業內亟需改良，使得抑制劑能夠選擇性地在腫瘤內累積且不會在外周正常組織中引起自體免疫反應。
US20180214544提供免疫檢查點阻斷及造血幹細胞移植及/或造血幹細胞動員之組合，其在疾病療法中產生協同效應。然而，仍然需要改良免疫檢查點抑制劑之效應。
本揭示內容提供工程化幹細胞，其包含載體，該載體包含含有自殺基因之核酸序列、免疫檢查點基因之核酸序列之聚核苷酸及天然細胞毒性觸發受體或TNF相關之細胞凋亡誘導配體，其中該幹細胞係靶向腫瘤之細胞。
該工程化幹細胞之某些實施例包括胚胎幹細胞、骨髓基質細胞、造血幹細胞及神經幹細胞。該工程化幹細胞之特定實施例係MSC。該工程化幹細胞之另一特定實施例係臍帶間充質幹細胞(UMSC)。
該自殺基因之某些實施例包括胞嘧啶去胺酶基因、水痘帶狀疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基還原酶基因、大腸桿菌(Escherichia coli) gpt基因、大腸桿菌Deo基因、胸苷激酶基因(TK)、半胱天冬酶1、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9及Fas或胞嘧啶去胺酶(CD)。
該免疫檢查點基因之某些實施例包括E3泛素連接酶Cbl-b、CTLA-4、PD-1、TIM-3、殺手細胞抑制性受體(KIR)、LAG-3、CD73、Fas、芳烴受體、Smad2、Smad4、TGF-β受體、ILT-3、IDO、KIR及LAG3。
該天然細胞毒性觸發受體之某些實施例包括NCR1、NCR2及NCR3。
TRAIL基因之某一實施例包括TIC10。
本揭示內容提供套組或組合，其包含本揭示內容之載體或工程化細胞及視情況另一活性劑。
本揭示內容亦提供用於治療個體之癌症或增強腫瘤內免疫性之方法，其包含向該個體投與有效量之本揭示內容之工程化幹細胞。在一個實施例中，有效量係在100,000 (1 × 105 )至2,000,000 (2 × 106 )個細胞範圍內。在一個實施例中，癌症係轉移性癌症。
除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解之含義相同的含義。通常，將在下文中闡述之本文所使用之命名法及實驗方法係業內熟知且通常採用之彼等命名法及實驗方法。
如本文所使用，術語「一(a、an)」、「該(the)」及類似引用應解釋為涵蓋單數及複數二者。
如本文所使用，術語「經遺傳修飾之細胞」、「重定向細胞」、「遺傳工程化細胞」或「經修飾細胞」係指表現本發明之重組聚核苷酸之細胞。
術語「聚核苷酸」、「核酸」及「寡核苷酸」在本文中可互換使用以指任一長度之核苷酸之聚合形式，無論為去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。
如本文所使用，術語「基因」係指含有至少一個開放閱讀框(ORF)之聚核苷酸，其能夠在轉錄且轉譯之後編碼特定多肽或蛋白質。
如本文所使用，術語「編碼」在其應用於聚核苷酸時係指認為「編碼」多肽之聚核苷酸，其若以其天然狀態或在藉由熟習此項技術者所熟知之方法操控時，可轉錄及/或轉譯以產生多肽及/或其片段之mRNA。反義鏈係此一核酸之補體，且可自其推斷出編碼序列。
如本文所使用，術語「依可操作方式連接」係指調控序列與異源核酸序列之間的功能鏈接體，以使後者表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列位於功能關係中時，該第一核酸序列與該第二核酸序列依可操作方式連接。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則該啟動子依可操作方式連接至該編碼序列。
如本文所使用，術語「表現」係指聚核苷酸轉錄成mRNA之過程及/或經轉錄之mRNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質之過程。
如本文所使用，術語「表現載體」係指包含重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸包含依可操作方式連接至欲表現之核苷酸序列之表現控制序列。表現載體包含足夠之用於表現之順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞或在活體外表現系統中供應。
如本文所使用，術語「胸苷激酶」或「TK」意指胸苷激酶自殺基因「TK」，其在業內已知為重組載體提供生物安全性。除非另有指定，否則術語「TK」意指業內已知基因之野生型(WT)及/或突變形式。
如本文所使用，術語「骨髓基質細胞」亦稱為「間充質幹細胞」或MSC，其係可分化成多種細胞類型之多能幹細胞。
如本文所使用，術語「個體(subject、individual)」或「患者」可互換使用，且係指脊椎動物、較佳地哺乳動物、更佳地人類。
如本文所使用，術語「治療(treatment或treating)」應理解為包括在治療、緩和或改善損傷、病理或病狀方面之任何成功跡象。此可包括諸如以下等參數：減輕；緩解；減少症狀；使退化或衰退速率減緩；使退化終點較少地減弱；改良患者之身體或心理健康；或預防疾病發作。
如本文所使用，術語「治療有效量」在提及疾病/病狀之症狀使用時係指改善、減弱或消除一或多種疾病/病狀之症狀或預防或延遲一或多種症狀發作之化合物的量及/或濃度。
間充質幹細胞(MSC)被視為係藉由基因轉移表現治療性蛋白質之細胞媒介，且顯示獨特之將抗癌物質靶向遞送至各種腫瘤(包括黑色素瘤、神經膠母細胞瘤及乳癌)之動物模型之腫瘤歸巢向性。存在若干種優點，例如易於分離及擴增、免疫耐受性質及全身或局部遞送。儘管目前藉由病毒轉導DNA至MSC之遺傳工程化方法可應用為用於癌症治療之診斷及治療性策略，但其可誘導有害轉變以增加繼發性惡性病風險。
測試MSC是否可代表遞送抗癌功能之遺傳材料之有效媒介係必不可少的。腫瘤壞死因子(TNF)相關之細胞凋亡誘導配體(TRAIL)係與TNF及FasL具有序列同源性之有希望抗癌死亡配體，其可藉由結合至其死亡受體(DR)來介導細胞凋亡效應，此乃因特定而言在TRAIL-R1/DR4及TRAIL-R2/DR5活化時，同三聚體(蛋白質複合物)引起半胱天冬酶-8活化，從而觸發細胞凋亡(Nat Rev Cancer 2008;8:782-98；Science 1998;281:1305-8；Eur J Cancer 2006;42:2233-40)。此外，自殺基因療法係基於轉移編碼單純疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)之自殺蛋白之基因，其藉由經由病毒TK酶優先將無毒前藥更昔洛韋(ganciclovir，GCV)單磷酸化成有毒化合物使其對GCV選擇性地敏化(Mol Biol Cell 2002;13:4279-95)。嵌合抗原受體-T細胞(CAR-T)免疫療法與自殺基因修飾組合已證實不僅抑制腫瘤過生長，且亦改良安全性概況以促進臨床開發(Journal of Cancer 2011; 2: 378-382)。
尚未證實PD-1或NCR3過表現之MSC是否將增強至腫瘤中之遷移及免疫敏化、誘導腫瘤死亡以及降低發炎。本揭示內容開發具有固有抗腫瘤能力之天然奈米粒子，以在治療基因工程化中發揮重要作用。
在一態樣中，本揭示內容提供工程化幹細胞，其包含載體，該載體包含含有自殺基因之核酸序列、免疫檢查點基因之核酸序列之聚核苷酸及天然細胞毒性觸發受體或TNF相關之細胞凋亡誘導配體；其中該幹細胞係靶向腫瘤之細胞。
在一個實施例中，該靶向腫瘤之細胞係選自由以下組成之群之幹細胞：胚胎幹細胞、骨髓基質細胞、造血幹細胞及神經幹細胞。
在一個實施例中，幹細胞係MSC。在一個實施例中，MSC具有表型CD34- /CD45- /CD105+ /CD90+ /CD73+ 。已顯示MSC在活體外或活體內分化，包括成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞及脂肪細胞。間充質係胚胎結締組織，其源自中胚層且分化成造血及結締組織，而MSC不分化成造血細胞。基質細胞係結締組織細胞，其形成組織之功能細胞駐留其中之支撐結構。
在遺傳學中，自殺基因將引起細胞經由細胞凋亡殺死自身。在一些實施例中，自殺基因係胞嘧啶去胺酶基因、水痘帶狀疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基還原酶基因、大腸桿菌gpt基因、大腸桿菌Deo基因、胸苷激酶基因(TK)、半胱天冬酶1、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、Fas或胞嘧啶去胺酶(CD)。在某一實施例中，自殺基因係胸苷激酶基因。在一個實施例中，TK基因係野生型TK基因。在另一實施例中，TK基因係該基因之突變形式。在一些實施例中，胸苷激酶序列包括(但不限於)以下序列。HSV1-TK 序列
Figure 02_image001
Figure 02_image003
(SEQ ID NO:1)無 CpG 之 HSV1-TK 序列
Figure 02_image005
Figure 02_image007
A (SEQ ID NO:2)
免疫檢查點係免疫系統之調控者。免疫檢查點分子由於其用於多種類型之癌症中之潛力而被視為癌症免疫療法之靶標。免疫檢查點基因之實例包括(但不限於) E3泛素連接酶Cbl-b、CTLA-4、PD-1、TIM-3、殺手細胞抑制性受體(KIR)、LAG-3、CD73、Fas、芳烴受體、Smad2、Smad4、TGF-β受體、ILT-3、IDO、KIR及LAG3。在某一實施例中，免疫檢查點基因係PD-1。在一些實施例中，PD-1序列包括(但不限於)以下序列。PD-1 序列
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
(SEQ ID NO: 3)
天然細胞毒性觸發受體亦可用於本揭示內容之載體中。天然細胞毒性觸發受體之實例包括(但不限於) NCR1、NCR2及NCR3。在某一實施例中，天然細胞毒性觸發受體係NCR3。在一些實施例中，NCR3序列包括(但不限於)以下序列。NCR3 序列
Figure 02_image015
Figure 02_image017
(SEQ ID NO:4)
TNF相關之細胞凋亡誘導配體(TRAIL)係作為誘導細胞死亡過程之配體起作用之蛋白質。TRAIL基因之實例包括(但不限於) TIC10。在一些實施例中，TIC10序列包括(但不限於)以下序列。TRAIL 序列
Figure 02_image019
本揭示內容之載體包含一或多個控制序列以調控本揭示內容之聚核苷酸之表現。已分離之聚核苷酸在插入載體中之前，依所利用之表現載體而定，可能需要或必要對其進行操縱。利用重組DNA方法修飾聚核苷酸及核酸序列之技術為業內所熟知。在一些實施例中，控制序列尤其包括啟動子、前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信號肽序列及轉錄終止子。在一些實施例中，適宜啟動子係依據所選擇之宿主細胞來選擇。
揭示一種重組表現載體，其包含本揭示內容之聚核苷酸及一或多個表現調控區，例如啟動子及終止子、複製起點等，此取決於其計畫引至其中之宿主之類型而定。組成型啟動子之非限制性實例包括SFFV、CMV、PKG、MDNU3、SV40、Ef1a、UBC及CAGG。
在一些實施例中，本文所闡述之各種核酸及控制序列接合在一起，產生重組表現載體，其包括一或多個合宜限制位點，以容許本揭示內容之聚核苷酸在此等位點處插入或取代。或者，在一些實施例中，藉由將聚核苷酸或包含該序列之核酸構築體插入至適當表現載體中來表現本揭示內容之聚核苷酸。在涉及產生表現載體之一些實施例中，使編碼序列定位於載體中，從而使得該編碼序列與適當控制序列依可操作方式連接，以進行表現。重組表現載體係方便接受重組DNA程序且可達成本揭示內容之聚核苷酸表現之任何適宜載體(例如質體或病毒)。載體之選擇通常取決於載體與欲引入該載體之宿主細胞之相容性。載體可係線性或閉環質體。在一個實施例中，載體係病毒載體。病毒載體之實例包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、阿爾法病毒(alphavirus)載體及諸如此類。在某一實施例中，病毒載體係慢病毒載體。慢病毒載體係基於或源自致癌反轉錄病毒(含有MLV之反轉錄病毒之亞群)及慢病毒(含有HIV之反轉錄病毒之亞群)。此等病毒之實例包括(但不限於)人類免疫缺失病毒(HIV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、猿猴免疫缺失病毒(SIV)及貓免疫缺失病毒(FIV)。或者，預期其他反轉錄病毒可用作載體骨架之基礎，例如鼠類白血病病毒(MLV)。
在一些實施例中，本揭示內容中所使用之載體係pLAS3w、pLAS3w.Ppuro、pLAS3w.Pneo、pLAS3w.Phyg及pLAS3w.Pbsd、pCMV-ΔR8.91或pMD.G。
在另一態樣中，本發明提供套組或組合，其包含本揭示內容之載體或工程化細胞及視情況另一活性劑。在一個實施例中，該另一活性劑係GCV。
本揭示內容之載體或工程化細胞通常與另一載劑組合，該另一載劑係例如化合物或組合物、惰性(例如可檢測試劑或標記)或活性物，例如佐劑、稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩衝劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑或諸如此類且包括醫藥上可接受之載劑。載劑亦包括醫藥賦形劑及添加劑、蛋白質、肽、胺基酸、脂質及碳水化合物(例如糖，包括單醣、二醣、三醣、四醣及寡醣；衍生糖，例如醛醣醇、醛醣酸、酯化糖及諸如此類；及多醣或糖聚合物)。例示性蛋白質賦形劑包括血清白蛋白，例如人類血清白蛋白(HSA)、重組人類白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白及諸如此類。載劑進一步包括緩衝劑或pH調整劑；通常，緩衝劑係自有機酸或鹼製備之鹽。代表性緩衝劑包括有機酸鹽，例如檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、葡萄糖酸鹽、碳酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽或苯二甲酸鹽；Tris、胺丁三醇鹽酸鹽或磷酸鹽緩衝劑。
本文所闡述之任一組合物可包含於套組中。在非限制性實例中，用於細胞療法之細胞或一或多種用以產生細胞之試劑可包含於套組中。套組亦可包含第二容器器件，其用於含有無菌、醫藥上可接受之緩衝劑及/或其他稀釋劑。在套組中存在一種以上之組分時，套組通常亦將含有第二、第三或其他額外容器，其中可單獨地放置該(等)其他組分。然而，組分之各種組合可包含於小瓶中。套組可具有單一容器器件，及/或其可具有針對每一化合物之不同容器器件。本發明之套組通常亦將包括用於容納用於商業銷售之呈封閉限制形式之任何容器之器件。此等容器可包括期望小瓶保存於其中之注射或吹塑成型塑膠容器。
在另一態樣中，本發明提供用於治療個體之癌症或增強腫瘤內免疫性之方法，其包含向該個體投與有效量之本揭示內容之工程化幹細胞。在一個實施例中，有效量係在100,000 (1 × 105 )至2,000,000 (2 × 106 )個細胞範圍內。在一些實施例中，有效量係在1 × 105 至1 × 106 個細胞範圍內。
在一個實施例中，癌症係轉移性癌症。
在一個實施例中，該方法經由增加具有中樞記憶潛能之腫瘤特異性CD8+ IFN-γ+ CD44+ T細胞來增強腫瘤微環境中之免疫性。在一個實施例中，該方法誘導Treg之顯著減少，且藉此逆轉腫瘤內CD8+ 及CD4+ T細胞對Treg之比率。該方法亦減少TAM之數量，此增加TME中CD8+ 及CD4+ T細胞對TAM之比率。在一個實施例中，有效量係在100,000 (1 × 105 )至2,000,000 (2 × 106 )個細胞範圍內。在一些實施例中，有效量係在1 × 105 至1 × 106 個細胞範圍內。
使用如本文所闡述之方法及組合物治療之例示性癌症係乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、皮膚癌、腦癌、膀胱癌、子宮內膜癌、腎癌、胰臟癌、甲狀腺癌或黑色素瘤或其轉移性癌症。例示性癌細胞包括(但不限於)癌、黑色素瘤、白血病、纖維肉瘤、肉瘤、腺癌及神經膠質瘤。
遞送方法包括(但不限於)動脈內、肌內及靜脈內。在具體實施例中，可期望將本揭示內容之醫藥組合物及/或細胞局部投與至需要治療之區域；此可藉由(例如但不限於)在手術期間之局部輸注、藉由注射或藉助導管來達成。在一些實施例中，藉由靜脈內注射投與該等組合物或細胞。在另一實施例中，藉由肌內注射投與該等組合物或細胞。該等組合物可以一次注射或以多次注射來投與。含有該等細胞之溶液可於適宜稀釋劑中來製備，例如水、乙醇、甘油、液體聚乙二醇、各種油類及/或其混合物以及熟習此項技術者已知之其他稀釋劑。在一些實施例中，本揭示內容之工程化幹細胞可以靜脈內或動脈內方式投與個體。本揭示內容意外地發現，本揭示內容之工程化幹細胞之以上投與在治療癌症、增強腫瘤內免疫性或增強腫瘤微環境中之免疫性方面具有有利效能。具體而言，動脈內投與展現優於靜脈內投與之效能。
在一個實施例中，本揭示內容之工程化幹細胞可與另一活性劑一起投與。在一些實施例中，可並行、分開或同時投與該工程化幹細胞及該另一活性劑。在一個實施例中，可定期投與該工程化幹細胞及該另一活性劑。在另一實施例中，該另一活性劑係GCV。
應理解，若本文中提及任何先前技術出版物，則此提及並不構成承認該出版物形成此項技術中公知常識之一部分。
儘管已出於清晰理解之目的藉助說明及實例相當詳細地提供揭示內容，但熟習此項技術者將明瞭，可在不背離本揭示內容之精神或範圍之情形下實踐各種變化及修改。因此，前述說明及實例不應解釋為具有限制性。實例
方法及材料 ：
UMSC 及其他幹細胞之製備、分離及表徵
將由中國醫藥大學附設醫院(China Medical University Hospital, Taichung)之機構審查委員會(Institutional Review Board，IRB)批准之所收集之人類臍帶組織用無Ca2+ 及Mg2+ 之PBS (DPBS, Life Technology)洗滌三次。藉由剪刀在中線方向上對其進行機械切割，且將臍動脈、靜脈之血管及外層膜(outlining membrane)自華通氏膠(WJ)分離。然後將膠凍內容物粗略地切割成小於0.5 cm3 之碎片，利用1型膠原酶(Sigma, St Louis, USA)處理且在37℃下於95%空氣/5% CO2 濕潤氣氛下培育3 h。然後將外植體於含有10%胎牛血清(FCS)及抗生素之DMEM中在37℃下於95%空氣/5% CO2 濕潤氣氛下培養。使其靜置5-7天以容許細胞自外植體遷移。臍帶源間充質幹細胞(UMSC)之細胞形態在傳代4-8次後在培養物中變為均勻紡錘形，且藉由流式細胞分析表徵來自WJ之特異性表面分子。利用於PBS中之2 mM EDTA使細胞分離，用含有2% BSA及0.1%疊氮化鈉(Sigma, USA)之PBS洗滌且與偶聯有異硫氰酸螢光黃(FITC)或藻紅素(PE)之各別抗體一起培育，該各別抗體包括CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49b、CD1q、CD3、CD10、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD117、HLA-ABC及HLA-DR (BD, PharMingen)。此後，使用Becton Dickinson流式細胞儀(Becton Dickinson, San Jose, CA)來分析細胞。
可根據業內已知之程序獲得且培養其他類型之幹細胞。
質體構築：
藉由特異性限制酶連接體(TK中之EcoR1及Nhe1、PD-1中之BamH1及Not1)將來自TK (0.1 µg) (pUNO1-HSV1tk, InvivoGen)、NCR3 (0.1 µg) (pLenti-C-mGFP-NCR3, Origene)、TRAIL (0.1 µg) (pCMV6-myc-DDK-TRAIL, Origene)或PDCD-1 (0.1 µg) (pLenti-C-Myc-DDK-PDCD1, Origene)質體之TK、NCR3、TRAIL、PD-1及GFP cDNA轉移至pIRES (Clontech)或pSF-CMV-CMV-SbfI (Oxford Genetics)中以構建pIRES-TK-PD-1、pIRES-TK-GFP、pIRES-PD-1-GFP等之構築體，依照製造商之說明書藉由XtremeGene HP DNA (Roche)將該構築體轉染至UMSC中以工程化為UMSC-TK-PD-1、UMSC-TK-GFP及UMSC-PD-1-GFP。以上構築體可轉染至其他類型之幹細胞中。
慢病毒質體：
慢病毒載體(pLAS3w)及包裝(psPAX2)/包封質體(pMD2.G)係自Academia Sinica, Taiwan獲得。藉由特異性限制酶連接體(TK中之EcoR1及Nhe1、PD-1中之BamH1及Not1)將自cDNA (pUNO1-HSV1tk, InvivoGen；pLenti-C-mGFP-NCR3, Origene；pCMV6-myc-DDK-TRAIL、Origene pLenti-C-Myc-DDK-PDCD1, Origene)重組之編碼全長人類TK、NCR3、TRAIL、PD-1及對照GFP之cDNA轉移至pUltra (Addgene)及pSF-CMV-CMV-Sbf1 (Oxford Genetics)中以構建為pUltra-TRAIL-TK-PD-1、pUltra-TK-PD-1、pUltra-TK-GFP、pUltra-PD-1-GFP及pUltra-TRAIL-GFP之構築體。隨後，使用特異性引子藉由PCR擴增該等模板，且用限制酶消化，亞選殖至慢病毒載體骨架質體pLAS2w及pLAS3w (Academia Sinica, Taiwan) (Lenti-TK-GFP、Lenti-PD-1-GFP、Lenti-TRAIL-GFP、Lenti-TK-PD-1-GFP、Lenti-TRAIL-PD-1-GFP及Lenti-TRAIL-TK-PD-1-GFP)。為產生攜帶TK、PD-1、TRAIL及對照GFP之重組慢病毒，藉由XtremeGene HP DNA (Roche)轉染，將重組質體及載體與包裝及包封質體以3:3:1之比率共轉染至293T細胞中。36小時後收集含有病毒粒子之培養上清液且在另一24小時後再次收集一半體積之培養上清液，且然後在15,000 rpm/min下離心10 min以去除碎片，且然後轉移至36-mL超速離心管中以在25,000 rpm/min下超速離心3 h。將含有慢病毒之糰粒重新懸浮。在即將滴定及細胞轉導之前將病毒解凍。利用適當慢病毒感染UMSC，其中基因轉移效率達到至少80%。
慢病毒轉導
在6孔板中進行慢病毒質體轉導。除非另外規定，否則將UMSC 以1 × 105 個細胞/孔以一式三份進行接種，最終體積為1 ml/孔且感染複數(MOI)為5。添加來自8 mg/ml原液(於DMEM-LG中，無菌過濾)之硫酸魚精蛋白(Sigma-Aldrich)以獲得期望最終濃度。將細胞轉導24小時，之後用1.5 ml/孔更換以構建為UMSC-TRAIL-TK-PD-1、UMSC-TK-PD-1、UMSC-TRAIL-PD-1、UMSC-TRAIL、UMSC-TK及UMSC-PD-1。將過度生長之細胞接種至6孔板上以使用1.0 mg/ml G418或嘌呤黴素(puromycin)溶液(Sigma)進行藥物篩選。每2天更換培養基。基於培養基之色彩及細胞狀態，使用倒置式螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白(GFP)之表現。篩選7天後，更換不含G418之完全培養基且繼續培養。
用於穩定細胞系之piggyBac 轉位子系統之構築
使用含有多選殖位點(MCS)、piggyBac末端重複序列(PB-TR)、核心絕緣子(CI)及嘌呤黴素選擇標記物(BSD)並與由人類EF1α驅動之RFP融合之PiggyBac載體pPB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro作為基礎載體(System Bioscience)。將含有TRAIL-TK-PD-1、TK-PD-1、TRAIL-PD-1、TRAIL、TK及PD-1 (來自pUltra-TRAIL-TK-PD-1、pUltra-TK-PD-1、pUltra-TRAIL-PD-1、pUltra-TRAIL、pUltra-TK及pUltra-PD-1)之DNA片段進行PCR擴增且亞選殖至pPB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro載體中，其在EF1α之編碼區前面。可應要求獲得關於載體構築之詳細資訊。為產生UMSC穩定細胞，藉由電穿孔方法，使用Amaxa Nucleofector II (Lonza)將以上質體與piggyBac轉位酶表現載體(System Biosciences)共轉染至UMSC細胞中。在嘌呤黴素存在下選擇穩定細胞(UMSC-TRAIL-TK-PD-1、UMSC-TK-PD-1、UMSC-TRAIL-PD-1、UMSC-TRAIL、UMSC-TK及UMSC-PD-1)。
活體外增殖、遷移及分化分析
為檢查細胞增殖及遷移，實施溴去氧尿苷(BrdU)摻入及transwell遷移分析以比較UMSC-TRAIL-TK-PD-1或UMSC。藉由使用BrdU化學發光免疫分析套組(Roche)量測BrdU摻入(10 μM)來測試UMSC-TRAIL-TK-PD-1或UMSC之增殖，且藉由計數台盼藍(Trypan blue)細胞來進一步確認。饑餓4-6 h後(在缺少血清之培養基中培育)，將UMSC在培養基中培育2天且如先前所闡述脈衝加載10 μM BrdU達12 h (J Clin Invest2009 ;119:1997)。然後將UMSC與抗BrdU-過氧化酶一起培育90 min，且藉由與受質溶液一起培育3 min使染色顯色。利用Lmax微板光度計(Molecular Devices)來讀板。分析如圖S5中所示之結果且呈現為相對於對照之增加百分比(%)。
如先前所闡述並經修改來評價細胞遷移分析(EMBO Mol Med 2013;5:1227-1246)。簡言之，根據製造商說明書(Costar，編號3421)，將UMSC-TK-PD-1或UMSC以100 μL置於上部室(transwell：6.5-mm直徑，5.0-mm孔徑)中。在下部室中使用SDF-1α (100 ng/mL, R&D System，陽性對照)。於5% CO2 培育器中在37℃下4-h培育期內進行分析。由於在遷移後幾乎所有細胞均停留在膜之底部側，因此可藉由簡單地計數該等細胞來實施量化。如先前所闡述在顯微鏡下計數膜底部側處之貼壁細胞。
根據先前所闡述之方法來誘導成脂分化(J Orthop Res2002 ;20:1060)。簡言之，使UMSC-TK-PD-1或UMSC之鋪滿單層培養物在成脂分化培養基中生長，該培養基係由以下組成：DMEM-高葡萄糖(DMEM-HG, Sigma)、100 U/mL青黴素、100 mg/mL鏈黴素、100 mM胰島素(Sigma)、500 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(Sigma)、1 mM地塞米松(dexamethasone) (Sigma)、100 mM吲哚美辛(indomethacin) (Sigma)及10% FCS。維持在普通UMSC培養基中之細胞用作陰性對照。每週三次更換成脂分化。為評價成脂分化，將細胞用0.3%油紅O (Sigma)在室溫下染色10 min (以標記細胞內脂質累積)，且用蘇木精複染。
為誘導成骨分化，使鋪滿單層UMSC-TK-PD-1或UMSC培養物在含有100 U/mL青黴素(Sigma)、100 mg/mL鏈黴素(Sigma)、50 mg/mL L-抗壞血酸2-磷酸鹽(Sigma)、10 mM b-甘油磷酸鹽(Sigma)、100 nM地塞米松(Sigma)及10% FCS之DMEM-高葡萄糖(DMEM-HG, Sigma)中生長。維持在普通UMSC培養基中之細胞用作陰性對照。每週三次更換成骨分化培養基。使用茜素紅S染色(1%, Sigma)來測定骨生成程度以檢測鈣礦化(J Biomed Mater Res1998 ,42 , 433)。
使用高密度糰粒細胞培養系統(J Biomed Mater Res1998 ,42 , 433)來誘導UMSC-TK-PD-1或UMSC之成軟骨分化。於無血清成軟骨分化培養基中洗滌細胞，該培養基係由以下組成：DMEM-HG、100 U/mL青黴素、100 mg/mL鏈黴素、50 mg/mL L-抗壞血酸2-磷酸鹽、40 mg/mL脯胺酸(Sigma)、100 mg/mL丙酮酸鈉(Sigma)、100 nM地塞米松及ITS-plus (10 mg/ml牛胰島素、5.5 mg/ml運鐵蛋白、5 mg/ml亞硒酸鈉、4.7 mg/ml亞麻油酸及0.5 mg/ml牛血清白蛋白，Sigma)。將250,000個細胞之等分試樣重新懸浮於成軟骨分化培養基中且在250 ×g下離心，且然後添加10 ng/mL TGF-β1 (R&D Systems)。維持於不含TGF-β1之成軟骨分化培養基中之糰粒用作陰性對照。每週兩次更換培養基。使用硫酸化蛋白多醣之艾爾遜藍(Alcian blue)染色(Sigma)在組織學上確認糰粒培養物之成軟骨分化。另外，如先前所闡述，藉由在預先塗覆有基質膠(300 μL/孔；Becton Dickinson)及血管內皮生長因子(VEGF, 10 ng/ml, Sigma)之24孔板上於EBM (Cambrex)中培養UMSC-TK-PD-1或UMSC達2-3天來誘導內皮細胞以分化成血管管形成(Nat Rev Cancer2002 ,2 , 826)。
為誘導神經細胞分化，使用改良之三步法(Stem Cells Transl Med. 2015;4:775-88)利用DMEM培育UMSC-TK-PD-1或UMSC。簡言之，在神經誘導步驟中，將細胞以低密度平鋪於含有纖連蛋白(Sigma)之6孔板上，且然後依序暴露於(1) 含有10% FCS及10 ng/mL bFGF (R&D System)之DMEM-HG (Sigma)達24 h，(2) 在神經約束步驟中，含有1 mM β-巰基乙醇(βME, Sigma)及10 ng/mL NT-3 (R&D Systems)之DMEM-HG達2天，及(3) 在神經分化步驟中，含有NT-3 (10 ng/mL, R&D Systems)、NGF (10 ng/mL, R&D Systems)及BDNF (50 ng/mL, R&D Systems)之DMEM-HG達3至7天。在細胞分化後，使細胞留待進行免疫組織化學分析。
流式細胞術
對於細胞表面標記物表現之分析，利用於PBS中之2 mM EDTA使細胞分離，用含有BSA (2%)及疊氮化鈉(0.1%)之PBS洗滌，且然後與偶聯有異硫氰酸螢光黃(FITC)或藻紅素(PE)之各別抗體一起培育直至分析。根據先前文獻(Mucosal Immunol 2013, 6(3): 498-510)，基於第一門之調整、藉由FSC-A及FSC-H排除雙聯體、藉由選擇7-AAD+ (R&D Systems)/CD45+ 或FSC-A排除死細胞來實施門控。作為對照，將細胞用小鼠IgG1同型對照抗體染色。用於流式細胞術之針對PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD4、CD25、Foxp3、CD44、CD45、CD11b、F4/80、IFN-γ、CD206、TRAIL及GFP之抗體係購自BD Biosciences。使用具有CellQuest Analysis (BD Biosciences)及FlowJo軟體v.8.8 (TreeStar Inc.)之FACScan (BD)分析細胞。結果以陽性染色細胞相對於總細胞數之百分比來表示。對於表面蛋白質表現之定量比較，將每一樣品之螢光強度呈現為中位螢光強度(MFI)。對於Ki-67及顆粒酶B之細胞內染色，將TIL在1 μg/ml抗CD3存在下培養48 h。然後使細胞與抗CD8一起培育，之後利用Triton ×100進行可滲透化處理，且然後利用針對Ki-67 (Millipore)及顆粒酶B之抗體進行染色。使用具有CellQuest Analysis (BD Biosciences)及FlowJo v.8.8 (TreeStar)之FACScan (BD)分析數據。
抗原特異性T 細胞反應之活體外分析
將來自BALB/c小鼠之脾細胞(2×106 )於24孔板上在補充有10% FBS (Sigma)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco)之RPMI-1640培養基(Gibco)中進行培養。然後，使與UMSC-TRAIL-TK-PD-1一起共培養之脾細胞(2×105 )保持不受刺激或與CD3-CD28珠粒(Dynabeads, Thermo)一起培育。對於增殖分析，如先前所闡述利用羧基螢光黃琥珀醯亞胺基酯(CFSE) (Invitrogen)將脾細胞染色(Nat Protoc. 2007;2:2049-56)。使用增殖指數(PI)估計細胞之增殖/分裂，其可藉由以下公式來計算：PI =增殖後之總數/增殖前之總數。在培養6天後，收穫細胞且經染色以分析Treg、CD4-及CD8- T細胞子集之增殖。或者，為分析細胞數量有限之縱向樣品中6天培養後之增殖，如先前所闡述培養非CFSE染色之脾細胞，且利用Ki67或同型對照抗體染色。將增殖(FC增殖)之倍數變化計算為UMSC-TRAIL-TK-PD-1條件下之增殖除以對照條件下之增殖的比率。
此外，藉由於平底96孔微量滴定板中將1×105 個來自小鼠脾且藉由耐綸毛管柱(Polysciences)富集之細胞反應者CD4+ T細胞與同種異體樹突細胞(DC)以10:1之比率(T:DC)共培養來實施混合淋巴球反應(MLR)分析。使CD4+ T細胞及同種異體DC在UMSC-TK-PD-1 (102 、103 及104 )不存在或存在下培育6天。將效應T細胞連續刺激總計三次。在第5天收穫培養上清液以用於IFN-γ及IL-12分泌之ELISA分析(R&D)。
UMSC-TK-PD-1 與更昔洛韋(GCV) 在活體外之自殺效應
為研究活體外之生物效應，分析UMSC-TK-PD-1與GCV組合之自殺能力。在37℃下於5% CO2 中培育24 h後，將各種劑量之GCV (0.1 μg/ mL、1 μg/ mL、10 μg/ mL及100 μg/ mL)每天添加於每一孔中，連續7天。藉由MTT分析(Invitrogen)評估細胞存活率，且藉由光度計(Promega)評估GFP螢光強度。
活體外旁觀者效應分析
將在37℃下於5% CO2 中在含有10% FBS之DMEM中共培育之4T1-Luc (BCRC, Taiwan)、CT26-Luc (BCRC, Taiwan)或Hep-55.1C-Luc (BCRC, Taiwan)細胞(1×104 個細胞)及各種數量之UMSC-TRAIL-TK-PD-1細胞(UMSC-TRAIL-TK-PD-1:腫瘤細胞比率= 1:1、1:4、1:16、1:32及1:64)接種於24孔板上。每天用含有100 μg/mL GCV之新鮮培養基更換培養基連續7天。亦將UMSC-TRAIL-TK-PD-1及4T1-Luc細胞接種於含有10% FBS而不含GCV之DMEM培養基中作為相應對照組。8天後，自5個隨機視野獲取根據光度計(Promega)之螢光素酶螢光強度以確定細胞密度。每天在相同數量的接種於含有GCV (100 μg/mL)之12孔培養板中之UMSC-TRAIL-TK-PD-1及4T1-Luc細胞中實施對以上共培養系統之旁觀者效應之時程之進一步研究。經由光度計(Promega)將細胞死亡比率量測為GFP及螢光素酶之螢光強度百分比。
活體外細胞凋亡分析
為研究針對各種腫瘤細胞之促凋亡潛能，以1:2比率進行共培養且使用FACScanto II藉由膜聯蛋白-V-FITC/碘化丙啶(PI)染色(eBioscience)在24 h評估細胞毒性。基於前向散射(FSC)及側向散射(SSC)參數對腫瘤細胞群體進行門控。
小鼠模型及腫瘤接種
所有動物實驗均係根據中國醫藥大學動物研究機構指南(Institutional Guidelines on Animal Research of China Medical University)來實施。使用4T1、CT26、Hep-55.1C、CT26-Luc、4T1-Luc或Hep-55.1C-Luc，利用6週齡至8週齡雌性BALB/c (National Animal Center of Taiwan)小鼠建立小鼠癌症模型。簡言之，將4T1細胞(1 ×106 )在腹部右側植入雌性BALB/c小鼠之第4小鼠乳腺脂肪墊中，且在腫瘤植入後第8天開始治療。
活體內UMSC 遷移分析
為檢查靜脈內或動脈內注射幹細胞之生物分佈，將螢光素酶基因(pHAGE PGK-GFP-IRES-LUC-W, Addgene)亞選殖至pUltra-TRAIL-TK-PD-1中，且然後亞選殖至pLAS3w中以構築Lenti-TRAIL-TK-PD-1-Luc。在腫瘤接種後7天將由Lenti-TRAIL-TK-PD-1-Luc工程化之UMSC (UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc) (2 × 106 個細胞)注射至荷4T1腫瘤小鼠之股靜脈或股動脈中數天。藉由在UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc注射後之指示時間點(6h、1d、3d、6d、9d及14d)將整個動物置於IVIS Lumina成像系統(Xenogen)中並基於製造商之推薦分析螢光來實施離體成像。藉由Living Image軟體(Xenogen)將螢光強度量化為光子/sec/cm2 。在UMSC注射後24小時處死小鼠，且然後分離各種器官(肺、肝、脾、心臟、腎及腦)。將每一器官切碎，用膠原酶處理，且準備用於流式細胞術分析。
生物發光成像(BLI)
利用IVIS成像系統200 Series (Xenogen)使動物成像以記錄自4T1-Luc、CT26-Luc、Hep-55.1C-Luc發射之生物發光信號(螢光素酶表現)。動物經異氟醚麻醉，且以270 mg/g體重之劑量接受D-螢光素(Caliper)之腹膜內注射。在腹膜內注射螢光素後15 min實施成像採集。對於BLI分析，使用IVIS System (Xenogen)界定涵蓋顱內信號區域之所關注區，且記錄總光子通量。為促進細胞植入速率之比較，在第14天將每一動物之發光評分針對其自身發光讀數進行正規化，藉此容許每一小鼠用作其自身對照。
UMSC-TRAIL-TK-PD-1 對荷瘤小鼠之活體內治療效應
在4T1-Luc及Hep55.1C-Luc小鼠模型中，首先檢查與抗PD-1 (Roche)或IgG對照相比，靜脈內注射UMSC-TRAIL-TK-PD-1是否可顯著誘導殺腫瘤效應。然後，將治療組細分成六個群組(圖6A )：IgG-對照組；UMSC-PD-1 (UP)組；UMSC-TRAIL (UT)組；UMSC-TRAIL-PD-1 (UTP)組；UMSC-TRAIL-TK+GCV (UTTG)組；及UMSC-TK-PD-1+GCV (UTPG)組。在每次治療之前，使細胞經受低氧預處理方案，其中於3% O2 含量中培育24小時以誘導CXCR4 (Millipore)上調，從而增強腫瘤歸巢效應(Cancer Research 2012;73:2333-2344)。藉由在每組中以10天間隔重複第二次及第三次注射5 × 105 個細胞來評估序貫療法之抗腫瘤效應。在每一治療投與後第2天開始腹膜內投與GCV (50 mg/kg)連續7天。
接下來，為進一步證實與UMSC-TK-PD-1相比，經由股動脈動脈內注射UMSC-TRAIL-TK-PD-1是否可顯著誘導殺腫瘤效應，將治療組再細分成六個群組(圖6F )：IgG-對照組；UMSC-TK-PD-1+GCV (UTPG)組；UMSC-TRAIL-TK-PD-1 (UTTP)組；及UMSC-TRAIL-TK-PD-1+GCV (UTTPG)組。
存活研究
為測定UMSC-TRAIL-TK-PD-1在活體內對4T1-Luc及Hep55.1C-Luc腫瘤小鼠之存活之治療效應，在腫瘤接種後10天內，每4天連續三次(q4d×3)經由右股靜脈用六種不同之治療靶標治療小鼠(n=8)。每2-3 d使用數位卡尺(Mitutoyo)使用以下公式監測腫瘤體積：腫瘤
Figure 02_image021
(公式1)，其中W係腫瘤之寬度且L係腫瘤之長度(W＜ L)。出於道德原因，當體積超過3,000 mm3 時，對動物實施安樂死。當腫瘤大小達到最大直徑為2 cm或當其體重降低至低於80%時，將小鼠處死。使用卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)存活分析法，以具有95%信賴區間之中值及平均存活時間報告存活率。藉由對數秩分析法決定該等不同條件之間的統計差異(n=8)。
浸潤性白血球(TIL)、脾細胞及外周血單核細胞(PBMC)之分離
最後一次治療後4週，自剛剛安樂死之小鼠收集腫瘤、脾或外周血中之白血球。使用先前所闡述之方法製備腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)之單細胞懸浮液(Blood 2005;06:2339)。簡言之，利用IV型膠原酶(2.5 mg ml-1 , Gibco)消解腫瘤組織20 min，分離TIL，且藉由不連續性percoll梯度(GE Healthcare)離心法濃縮。藉由在MACS管柱上與αCD8微珠粒(Miltenyi Biotec)混合或在FACSAria (BD Biosciences)分選器上用抗CD8抗體染色，分離TIL懸浮液中之CD8+ T細胞(純度＞95%)。由CD8+ T細胞百分比乘以得自percoll梯度之淋巴球總數，該得數再除以100及腫瘤之重量，獲得浸潤性CD8+ T細胞總數/克腫瘤。在用抗CD11b、抗CD206或抗F4/80抗體染色後，在FACSAria (BD Biosciences)上檢查TIL懸浮液中之腫瘤相關巨噬細胞(TAM，CD11b+ CD206+ F4/80+ 細胞) (純度＞95%)。使用分離套組(Miltenyi Biotec)純化調節性T淋巴球(Treg, CD4+CD25+)(純度＞ 90%)。在用抗CD4、抗CD25及抗Foxp3抗體染色後，在FACSAria (BD Biosciences)上分析調節性T淋巴球(CD4+ CD25+ Foxp3+ 細胞) (純度＞95%)。將脾撥開並用耐綸網篩將其過濾以獲得單細胞懸浮液。為進一步產生單細胞脾細胞懸浮液，藉由使用RBC溶解緩衝液將紅血球去除。藉由在MACS管柱上將細胞與αCD8微珠粒(Miltenyi Biotec)混合或在FACSAria (BD Biosciences)分選器上用抗CD8抗體染色來分離脾CD8+ T細胞(純度＞95%)。
自每一小鼠分離外周血單核細胞(PBMC) (Blood. 2001;98: 3520-6)。使用Ficoll-Histopaque (Sigma Aldrich)離心方法(Science. 1997;275: 964-7)收集細胞，且用於PBS中之1 mM EDTA洗滌兩次以進行進一步實驗。
流式細胞術
用含有BSA (2%)及疊氮化鈉(0.1%)之PBS洗滌TIL懸浮液。利用如下針對細胞表面標記物之各別螢光染料偶聯之單株抗體對細胞進行染色：抗PD-L1 (MIH5)、抗CD3 (145-2C11)、抗CD8 (53-6.7)、抗CD11b (M1/70)、抗CD45 (30-F11)、抗IFN-γ (XMG1.2)、抗CD44 (IM7.8.1R)、抗CD4 (GK1.5)、抗CD25 (PC61.5)、抗Foxp3 (MF23)、抗F4/80 (BM8)及抗CD206 (MR5D3)。作為對照，利用小鼠IgG1同型對照或IgG2同型對照抗體對細胞進行染色。使用具有CellQuest Analysis (BD Biosciences)及FlowJo軟體v.8.8 (TreeStar Inc.)之FACScan (BD)分析細胞。
根據先前文獻(Mucosal Immunol. 2013;6 :498-510)，基於第一門之正確合理性、藉由FSC-A及FSC-H排除雙聯體、排除死細胞且進一步選擇為7AAD+ /CD45+ (或FSC-A)來實施門控。然後，使用具有CellQuest Analysis (BD Biosciences)及FlowJo軟體v.8.8 (TreeStar Inc.)之FACScan (BD)分析來自TIL或脾細胞懸浮液之CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、Treg及TAM。結果以陽性染色細胞相對於總細胞數之百分比來表示。藉由二因子ANOVA以及Newman-Keuls事後測試來評估組間之差異。P 值＜0.05視為顯著的。
自TIL 分離CD8+ CD44+ IFN- γ + T 細胞
藉由在MACS管柱上與αCD8微珠粒(Miltenyi Biotec)混合來分離TIL懸浮液中之CD8+ T細胞。為檢查IFN-γ及CD44之表現，使用抗小鼠CD28 mAb (0.5 μg)、莫能菌素(Monensin)及佈雷菲德菌素A (brefeldin A)將經分離之CD8+ T細胞處理3小時。與此同時，使其與1 × 106 個經輻照4T1-Luc細胞(在84 cGy min-1 之速率下，0.5-mm Cu濾波器，Philips x射線單元)在37℃下共培養24 h。然後使用BD Cytofix/Cytoperm Plus套組，遵循製造商之說明書實施IFN-γ及CD44 表現之流式細胞分析。
CD8+ T 細胞中Ki-67 及顆粒酶B 表現之評估
對於Ki-67及顆粒酶B之細胞內染色，將TIL在抗CD3 (1 μg ml-1 )存在下培養48 h。然後使細胞與抗CD8一起培育，之後利用Tritonx100進行可滲透化處理，且利用針對Ki-67及顆粒酶B之抗體(Millipore)進行染色。
CFSE 測試
使自腫瘤分離之Treg與經羧基-二乙酸螢光黃琥珀醯亞胺基酯(CFSE)處理之脾CD8+ T細胞在CD3抗體存在下一起共培養，且使用CFSE之螢光強度來監測CD8+ T細胞之增殖。CFSE低 細胞定義為螢光強度低於原始群體之細胞，其代表增殖之CD8+ T細胞。
細胞介素量測
將來自經不同方案治療之小鼠之TIL以2 × 105 個細胞/mL之密度於6孔板中於含有2 mM L-麩醯胺酸(Sigma-Aldrich)之PRMI-1640 (Invitrogen)培養基中直接培養48 h。利用Quantikine ELISA套組(R&D Systems)量測TNF-α、VEGF、IL-10及TGF-β之含量。實施培養上清液及血清中之TNF-α、VEGF、IL-10及TGF-β含量之半定量分析。使用分光光度計(Molecular Devices)量測光學密度，且利用程式SOFTmax (Molecular Devices)生成標準曲線。
抗轉移能力之評估
藉由直接目視計數轉移結節來檢查受4T1-Luc、CT26-Luc或Hep-55.1C-Luc腫瘤攻擊之小鼠的肺轉移。然後將肺切除且於水中洗滌一次並進一步藉由浸入4% PFA中來固定，且在室溫下於30%蔗糖中脫水。表面轉移隨後表現為白色結節且在顯微鏡下計數。
免疫組織化學評價
利用水合氯醛(0.4 g/kg, ip)對動物進行麻醉且藉由用鹽水穿心灌注、之後浸入4%多聚甲醛中來固定其腹部皮膚組織。於30%蔗糖中使組織樣品脫水，於乾冰上冷凍，且然後使用低溫恒溫器切割成一系列相鄰6-mm厚之冠狀切片。切片用H&E及普魯士藍(Prussian blue) (用於鑑別鐵)染色以藉由光學顯微鏡(Nikon, E600)進行觀察。使用偶聯有FITC或Cy-3之二級抗體(1:500; Jackson Immunoresearch)，利用針對CD4 (1:100; BD)、CD8 (1:400; BD)之抗體對每一切片進行免疫染色，且然後使用Carl Zeiss LSM510雷射掃描共焦顯微鏡在三維影像中進行分析。如先前所闡述量測經細胞類型特異性標記物共染色之細胞總數(J. Cereb. Blood Flow Metab. 2008;28 ,1804-1810)。
TUNEL 分析
如先前所闡述，使用市售TUNEL染色套組(DeadEnd Fluorimetric TUNEL系統；Promega)藉由免疫組織化學分析細胞凋亡(Proceedings of the National Academy of Sciences 2009;106 , 9391-9396)。TUNEL標記百分比表示為TUNEL陽性細胞核之數量除以經DAPI染色之細胞核之總數(Nat. Protocols 2016;11: 688-713；PLoS Genet. 2009;5: e1000379)。細胞凋亡指數表示為TUNEL陽性凋亡細胞核之百分比除以自隨機選擇之顯微鏡視野之計數獲得的藉由DAPI複染而可視化之細胞核之總數。
免疫相關不良事件(irAE) 之評價
評估各組治療後之irAE，包括：(1) 重量監測，(2) 組織學，(3) 免疫細胞浸潤及(4) 肝及腎功能。在治療期間監測小鼠之體重。另外，在腫瘤接種後4週評估各組經治療小鼠(n=6)之H&E染色之肝、肺、脾、腎及結腸切片以供組織學分析。藉由IHC檢查肝、結腸、腎及肺之CD8+ 及CD4+ T細胞浸潤(Cancer Res 2016;76:5288-5301)，且藉由計數每mm2 10個高倍視野中之陽性細胞數來評分。此外，使用每組 (n= 6)來自連續時間點(0 d、5 d、10 d、15 d、20 d、25 d及30 d)之小鼠血清藉由Beckman Unicell DxC800分析儀量測ALT、AST、肌酸酐及葡萄糖之生物化學曲線。
統計學分析
此研究中之所有量測均係以盲化設計來實施。結果表示為平均值± SEM。使用雙尾司徒頓t 測試(Two-tailed Student’st test)來評估對照組與治療組之間的平均差異之顯著性。藉由二因子ANOVA以及Newman-Keuls事後測試來評估組間之差異。P 值＜0.05視為顯著的。實例 1 UMSC 及 UMSC-TK-PD-1 之活體外表徵
自華通氏膠(WJ)製備臍帶間充質幹細胞(UMSC)之原代培養物並分析細胞形態及生物性質(圖1A )。流式細胞術揭示，細胞對CD1q、CD3、CD10、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD117及HLA-DR呈陰性，但對CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49b及HLA-ABC呈陽性(圖1B )。該等觀察結果指示，UMSC具有與間充質幹細胞(MSC)相同之表面標記物，此與骨髓MSC之觀察結果一致(J Cell Sci2004 , 117, 2971)。
為評估UMSC轉染效能，藉由流式細胞術研究分析UMSC-TRAIL-TK-PD-1之RFP螢光及PD-1表現程度。在轉染後36 h至48 h，經由RFP及PD-1流式細胞術之結果證實攝取效能平均為55%-65% (圖1C )。隨後，在嘌呤黴素或G418篩選3-5天後，超過90%之細胞完全經轉基因轉導(圖1C )。
UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc保留螢光素酶表現超過100天(圖1D )，且藉由MTT分析之細胞存活率、藉由BrdU摻入之細胞增殖分析及藉由transwell分析之遷移(圖1E )揭示與未經標記之UMSC相比，在培育14 h後，pLAS3w-TRAIL-TK-PD-1標記並不影響活體外UMSC-TRAIL-TK-PD-1細胞存活率、細胞增殖或遷移。
為證實UMSC-TRAIL-TK-PD-1是否仍具有多能分化潛能，分析成脂、成軟骨、成骨及血管形成，此證實UMSC-TRAIL-TK-PD-1展示與不具有質體標記之普通UMSC相似之行為(圖1F )。藉由MAP-2、Tuj-1及GFAP之免疫螢光鑑別UMSC-TRAIL-TK-PD-1之神經膠質細胞分化，且其展現如普通UMSC一樣之折光性細胞體形態以及排列成網絡之延伸神經突樣結構(圖1G )。因此，UMSC-TRAIL-TK-PD-1在活體外並不喪失細胞分化潛能。實例 2 PD-L1 與 UMSC-TRAIL-TK-PD-1 在活體外之特異性蛋白質結合
由於腫瘤細胞出於免疫逃逸之目的而表現PD-L1 (Trends Immunol. 2006;27:195-201)，因此建立UMSC-TRAIL-TK-PD-1之經基因修飾之UMSC，其中呈遞之PD-1可藉由PD-1/PD-L1相互作用捕獲腫瘤細胞。為說明UMSC-TRAIL-TK-PD-1之蛋白質-配體結合親和力，藉由ELISA分析各種濃度下之HRP偶聯之PD-1蛋白之RLU。將UMSC-TRAIL-TK-PD-1與HRP偶聯之PD-L1蛋白一起在37℃下培育2小時。HRP偶聯之PD-1蛋白之結合親和力以劑量依賴性方式顯著增加(圖2A )。結果指示，UMSC-TRAIL-TK-PD-1具有與PD-L1之高結合效率。實例 3 人類 T 細胞中 UMSC-TRAIL-TK-PD-1 之活體外活性
為確定刺激效應是否係T細胞與MSC之間的直接相互作用，利用CD3-CD28珠粒刺激脾細胞T細胞。門控策略係基於圖 2B 中所繪示之第一門之合理性、藉由FSC-A及FSC-H排除雙聯體、藉由選擇7-AAD+ (R&D Systems)/CD45+ 或FSC-A排除死細胞。利用CFSE標記T細胞，且然後與經CD3-CD28珠粒刺激6天之UMSC或UMSC-TRAIL-TK-PD-1一起共培養。UMSC (在1:1之比率下)顯著抑制CD4+ 及CD8+ T細胞二者之增殖(圖2C )，但在1:10之比率下則不。然而，在1:1或1:10之任一比率下，UMSC-TRAIL-TK-PD-1均顯著增加CD4+ 及CD8+ T細胞二者之增殖(圖2C )。此外，與UMSC相比，經CD3-CD28珠粒刺激之UMSC-TRAIL-TK-PD-1顯著增加CD4+ INF-γ+ 之含量且降低CD8+ CD122+ (圖2D )。該等結果表明，UMSC-TRAIL-TK-PD-1之任一比率均可支持T細胞增殖，而較高之比率則具有抑制性。實例 4 UMSC-TRAIL-TK-PD-1 在活體外之自殺效應
為研究UMSC-TRAIL-TK-PD-1中胸苷激酶(TK)誘導之細胞殺死效應，藉由在各種濃度之GCV存在下評估UMSC-TRAIL-TK-PD-1之細胞存活率來測試自殺效應。首先，在UMSC-TRAIL-TK-PD-1中發現以時間及劑量依賴性方式顯著增加之TK含量(圖3A )。GCV自身並不影響UMSC之細胞增殖(圖3B )。在GCV處理後，磷酸化之GCV誘導UMSC-TRAIL-TK-PD-1中之細胞凋亡樣細胞損傷(圖3B )。UMSC-TRAIL-TK-PD-1之細胞增殖以劑量依賴性方式受抑制(圖3B )。此指示，UMSC-TRAIL-TK-PD-1在轉染TRAIL-TK-PD-1之質體後可表現TK，且可藉由誘導對UMSC自身之細胞毒性將GCV活化為其毒性形式。
腫瘤細胞對UMSC-TRAIL-TK-PD-1之旁觀者效應之活體外敏感性
為經由UMSC-TRAIL-TK-PD-1檢查旁觀者效應，藉由在各種濃度之GCV下直接共培養不同比率之每一細胞來評估4T1 (Hep55.1C、Pan18、CT26)及UMSC-TRAIL-TK-PD-1二者之細胞存活率(圖3C )。在100 μg/mL GCV存在下在共培養7天後，當比率最大為1:32且最小為1:1時，UMSC-TRAIL-TK-PD-1可顯著減弱4T1-Luc細胞(Hep55.1C、Pan18-Luc、CT26-Luc及GL261-Luc)之生長(n = 3)。此外，證實最佳抑制效率係在1:1之比率下(圖3D-3E )。
為進一步確認UMSC-TRAIL-TK-PD-1之旁觀者效應，研究UMSC-TRAIL-TK-PD-1之自殺效應及旁觀者效應二者之時程(在7天之前)。在此共培養系統中，因自殺效應所致之細胞死亡率在前兩天期間緩慢達到整個系統之約三分之一，且然後隨後自第3天加速至第6天。在旁觀者效應實驗中，相同發現顯示，大多數4T1-Luc細胞自第3天至第5天被殺死(圖3C-3E )。此外，流式細胞術研究亦證實，與4T1細胞共培養之UMSC-TRAIL-TK-PD-1以GCV劑量依賴性方式顯著增加凋亡細胞(PI+ 膜聯蛋白-V+ 細胞) (圖3C )。因此，在共培養系統中，UMSC-TRAIL-TK-PD-1之自殺效應及對4T1-Luc細胞(Hep55.1C、Pan18-Luc、CT26-Luc及GL261-Luc)之旁觀者效應在第3天至第5天發生。
表現TRAIL之UMSC-TRAIL-TK-PD-1在4T1-Luc細胞中展示活體外抗腫瘤活性。
UMSC-TRAIL-TK-PD-1可經遺傳修飾以表現高含量之TRAIL。藉由編碼全長人類TRAIL之載體轉導UMSC-TRAIL-TK-PD-1。FACS分析顯示UMSC細胞表面上之相關TRAIL蛋白表現(90%) (圖4A )。
為證實UMSC-TRAIL-TK-PD-1是否可發揮對癌細胞之殺腫瘤效應，然後實施腫瘤細胞與UMSC-TRAIL-TK-PD-1之間的共培養實驗。表現TRAIL之UMSC-TRAIL-TK-PD-1尤其在共培養後48小時誘導細胞凋亡(4T1-Luc、Hep55.1C-Luc)，細胞凋亡以細胞皺縮、貼壁4T1-Luc細胞之減少及具有細胞碎片外觀之Hep55.1C-Luc為代表，其由碘化丙啶染色(PI染色)證實(圖4B )。為量化在24小時、48小時及72小時之細胞死亡，如藉由FACS分析所量測，在共培養物中檢測到大量膜聯蛋白-V+ PI+ 死細胞(≥70%)，其中UMSC-TRAIL-TK-PD-1係以劑量依賴性方式存在(圖4C )。實例 5 UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc 在 4T1 腫瘤模型中之腫瘤靶向
為證實UMSC-TRAIL-TK-PD-1歸巢效應，使用IVIS實施在靜脈內或動脈內植入後UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc之生物分佈。首先，如藉由IVIS在活體外所量測，生物發光強度以細胞劑量依賴性方式增加(圖5A )。在健康小鼠中，靜脈內UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc移植最初自注射後一天截留在肺毛細血管中，其顯示在肺中IVIS之生物發光影像增強(圖5B )。UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc之歸巢使得UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc存活且重新定位至皮下4T1腫瘤。最初在UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc注射後5天觀察到IVIS影像中皮下腫瘤區域之生物發光信號，之後強度逐漸增加，且在第14天達到峰值(圖5B )。
股動脈內注射後2小時，UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc移植直接募集至正位4T1腫瘤區域而無肺壓迫(亦適用於Hep55.1C及pan18腫瘤區域)，其顯示增強的IVIS之生物發光影像(圖5C-5E )。 隨後，UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc之歸巢使得UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc存活且重新定位至腫瘤部位。
為進一步證實UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc是否可追蹤源自4T1-腫瘤模型之轉移性基因座，在4T1-腫瘤模型誘導後21天實施UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc之動脈內植入。一致地，來自原始4T1腫瘤模型之轉移性肺腫瘤顯著募集UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc，從而增加如藉由IVIS所量測之在多個轉移部位中之生物發光強度(圖5F )。經由免疫組織化學分析，在治療後1天，在4T1腫瘤中發現多個GFP+ 螢光素酶+ 細胞，此指示UMSC-TRAIL-TK-PD-1-GFP募集至腫瘤微環境中(圖5G )。。實例 6 UMSC-TRAIL-TK-PD-1 對 4T1-Luc 模型之治療效應
藉由IVIS、腫瘤體積及q4dx3 療程方案後之存活時間來評價經基因修飾之UMSC之各種策略治療的表現螢光素酶之荷4T1-Luc及Hep55.1C-Luc腫瘤之小鼠中之殺腫瘤效應(圖6A )。在治療之前，使每組測試細胞於3% O2 中經受低氧預處理培養，此誘導CXCR4過表現，以便以時間依賴性方式增強幹細胞歸巢(圖6B )。明顯地，UMSC-PD-1 (UP)組及UMSC-TRAIL (UT)組展現治療效應，其與如藉由IVIS所量測之IgG對照組之彼等腫瘤體積相比降低腫瘤體積(圖6C )。此外，UMSC-TK-PD-1+GCV (UTPG)組、UMSC-TRAIL-TK+GCV (UTTG)組及UMSC-TRAIL-PD-1 (UTP)組分別顯示更強之抗腫瘤效應，且其各自展現對腫瘤生長之抑制(圖6C )。經IgG、UP、UT、UTPG、UTTG及UTP治療之小鼠之中值存活時間分別為24天、32天、34天、34天、43天及44天(圖6D )。與其他組相比，UTP顯著延長存活時間至63天(圖6D )。此外，與其他治療相比，UTP顯著預防肺中之腫瘤轉移(圖6E )。平均而言，與對照小鼠之肺中超過20個轉移相比，在經UTP治療之小鼠中發現少於5個肺轉移結節。然而，與對照組相比，UMSC-TK (UT)、UP及UTP並不顯示轉移之顯著降低。因此，假設轉移不僅受UTP誘導之旁觀者效應抑制，且很大程度上受TME中來自UTP之免疫增強效應之影響，此使得系統地分析腫瘤內免疫。
接下來，為驗證動脈內注射UMSC-TRAIL-TK-PD-1是否在q7dx2 療程方案後在4T1-Luc及Hep55.1C-Luc模型中展示顯著之治療效應(圖6F )，檢查四個群組(UMSC-TK-PD-1+GCV (UTPG)組、UMSC-TRAIL-TK-PD-1 (UTTP)組及UMSC-TRAIL-TK-PD-1+GCV (UTTPG)組)之腫瘤生長及中值存活時間。在動脈內注射之分析之前，UMSC-TK-PD-1+GCV (UTPG)組、UMSC-TRAIL-TK-PD-1 (UTTP)組及UMSC-TRAIL-TK-PD-1+GCV (UTTPG)組之靜脈內投與分別顯示更強之抗腫瘤效應且展現對腫瘤生長之抑制(圖6F-6G )。重要的是，動脈內植入揭示強有力優於靜脈內植入之治療效應。此外，在4T1-Luc及Hep55.1C-Luc模型中，UTTPG組分別較IgG對照、UTPG及UTTP之其他組顯著抑制腫瘤生長且延長小鼠之中值存活時間(圖6F-6G )。不幸的是，在4T1-Luc模型及Hepa55.1C模型中，投與抗PD-L1並不顯示任何顯著之治療效應(圖6F-6G )。實例 7 UTTPG 治療增強腫瘤微環境 (TME) 中之免疫性
受治療結果鼓舞，評估4T1腫瘤模型中TME之免疫性質。重要的是，UTTPG可逆轉TME中之免疫衰退。跨越UTTPG治療組及其他治療組，腫瘤浸潤性CD45+ 白血球之百分比存在總體增加(圖7A )。結果揭示，與其他組相比，在UTTPG治療中，CD3+ CD8+ 及CD3+ CD4+ T細胞二者之頻率顯著增加(圖7A )。UTTPG亦誘導Treg之顯著減少(圖7B )，且藉此逆轉腫瘤內CD8+ 及CD4+ T細胞對Treg之比率(圖7C )。另外，TAM之數量因應UTTPG治療而急劇減少(圖7B )，此增加TME中CD8+ 及CD4+ T細胞對TAM之比率(圖7C )。應注意，細胞內顆粒酶B (Grb+ )及Ki67+ 細胞之顯著上調指示UTTPG治療不僅增加抗腫瘤免疫群體，且亦有效地達成TIL之活化及增殖(圖7D )。
圖1A至1G顯示UMSC及UMSC-TRAIL-TK-PD-1之活體外表徵。A. 來自華通氏膠(Wharton’s jelly，WJ)之臍帶間充質幹細胞(UMSC)之細胞形態及生物性質。B. 流式細胞術圖顯示細胞對CD1q、CD3、CD10、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD117及HLA-DR呈陰性，但對CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49b及HLA-ABC呈陽性。C. RFP及PD-1流式細胞術及利用轉基因(UMSC-PD-1及UMSC-TRAIL-TK-PD-1)轉導之結果。D-E . UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc保留螢光素酶表現超過100天，且E 藉由BrdU摻入之細胞增殖分析及藉由transwell分析之遷移揭示在培育14 h後，與未經標記之UMSC相比，遺傳修飾不影響活體外UMSC-TRAIL-TK-PD-1細胞存活率(E-(a) )、細胞增殖(E-(b) )或遷移(E-(c) )。F. UMSC-TRAIL-TK-PD-1展示與無質體標記之普通UMSC類似之行為。G. 藉由利用MAP-2、Tuj-1及GFAP之免疫螢光鑑別UMSC-TRAIL-TK-PD-1之神經膠質細胞分化；結果展現如普通UMSC一樣之折光性細胞體形態以及排列成網絡之延伸神經突樣結構。
圖2A至2D顯示UMSC-TRAIL-TK-PD-1之活體外免疫評價。A. HRP偶聯之PD-1蛋白之結合親和力以劑量依賴性方式顯著增加。B. 門控策略係基於第一門之合理性、藉由FSC-A及FSC-H排除雙聯體、藉由選擇7-AAD+ (R&D Systems)/CD45+ 或FSC-A排除死細胞(B-(a) 及B-(b) )。C. UMSC (在1:1之比率下)顯著抑制CD4+ 及CD8+ T細胞二者之增殖(C-(a) 及C-(b) )。然而，在1:1或1:10之比率下，UMSC-TRAIL-TK-PD-1顯著增加CD4+ 及CD8+ T細胞二者之增殖(C-(a) 及C-(b) )。D. 與UMSC相比，經CD3-CD28刺激之UMSC-TRAIL-TK-PD-1展現CD4+ INF-γ+ 之含量顯著增加(D-(a) )且CD8+ CD122+ 減少(D-(b) )。
圖3A至3E顯示UMSC-TRAIL-TK-PD-1-GFP之活體外自殺及旁觀者效應。A. 藉由西方墨點(Western blot)，與UMSC-Akt及UMSC相比，在UMSC-TRAIL-TK-PD-1中發現TK之含量增加。B. GCV自身並不影響UMSC之細胞增殖。根據免疫組織化學，在GCV處理後，磷酸化之GCV在24 h及48 h誘導UMSC-TRAIL-TK-PD-1-GFP中之細胞凋亡樣細胞損傷(白色箭頭) (B-(b) )。UMSC-TRAIL-TK-PD-1-GFP之細胞增殖係以劑量依賴性方式被抑制(B-(a) )。C. 在0 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL GCV存在下，在共培養24 h, 48 h及72 h後，UMSC-TRAIL-TK-PD-1-GFP顯著減弱4T1-Luc細胞(C-(a) 、C-(b) )、Hep55.1C (C-(c) 及C-(d) )、Pan18-Luc (C-(e) 及C-(f) )、CT26-Luc (C-(g )及C-(h) )及GL261-Luc (C-(i) 及C-(j) )之生長。D-E. 在此共培養系統中，因自殺效應所致之細胞死亡率在前兩天期間緩慢達到整個系統之約三分之一，且然後隨後自第3天加速至第6天。相同發現顯示，大多數4T1-Luc細胞自第3天至第5天被殺死。此外，使用流式細胞術，藉由PI/膜聯蛋白-V染色在此旁觀者效應下對凋亡細胞之定量評價顯示GCV劑量依賴性及時間依賴性方式之顯著細胞毒性(E-(a) 至E-(d) )。圖4A至4C顯示表現TRAIL之UMSC-TRAIL-TK-PD-1在4T1-luc及Hep55.1C-Luc細胞中展示活體外抗腫瘤活性。A. 如藉由FACS分析所量測，經遺傳修飾之UMSC-TRAIL-TK-PD-1容許UMSC細胞表面上之相關TRAIL蛋白表現(90%)。B. 表現TRAIL之UMSC-TRAIL-TK-PD-1尤其在共培養後72小時誘導細胞凋亡(4T1-Luc、Hep55.1C-Luc)，細胞凋亡以細胞皺縮、貼壁4T1-Luc細胞之減少(B-(a) )及具有細胞碎片外觀之Hep55.1C-Luc (B-(b) )為代表，其由碘化丙啶染色(PI染色)證實(B-(c) )。C. 定量地，如藉由FACS分析所量測，在24小時、48小時及72小時發生細胞死亡(C-(a) 及C-(b) )，在共培養物中檢測到大量膜聯蛋白-V+ PI+ 死細胞(≥70%)，其中UMSC-TRAIL-TK-PD-1係以劑量依賴性方式存在。
圖5A至5G顯示在一些腫瘤模型中，UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc之腫瘤靶向。A. 如藉由活體外IVIS所量測，生物發光強度以UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc細胞劑量依賴性方式增加。B. UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc存活且重新定位至皮下4T1腫瘤。最初在靜脈內UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc注射後5天觀察到IVIS影像中皮下腫瘤區域之生物發光信號，之後強度逐漸增加，且在第14天達到峰值。C-E. 股動脈內注射後2小時，動脈內UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc移植直接募集至正位4T1腫瘤區域(C )而無肺壓迫(lung entrapment) (亦適用於Hep55.1C (D )及pan18腫瘤區域(E ))。隨後，UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc存活且重新定位至腫瘤部位。F. 如在多個轉移部位中藉由IVIS所量測，來自原始4T1-腫瘤模型之轉移腫瘤顯著募集UMSC-TRAIL-TK-PD-1-Luc，從而增加生物發光強度。G. 根據免疫組織化學分析，在治療後1天，在4T1腫瘤中發現多個GFP+ 螢光素酶+ 細胞，此指示UMSC-TRAIL-TK-PD-1-GFP募集至腫瘤微環境中。
圖6A至6G顯示UMSC-TRAIL-TK-PD-1在4T1-Luc模型中之治療效應。A. 藉由IVIS、腫瘤體積及q4dx3 療程方案後之存活時間來評價經基因修飾之UMSC之各種策略治療的表現螢光素酶之荷4T1-Luc及Hep55.1C-Luc腫瘤之小鼠中之殺腫瘤效應。B. 在治療之前，使每組測試細胞於3% O2 中經受低氧預處理培養，此以時間依賴性方式誘導CXCR4過表現(藉由西方墨點)，以增強幹細胞歸巢。C. UMSC-PD-1 (UP)組及UMSC-TRAIL (UT)組展現治療效應，其與如藉由IVIS所量測之IgG對照組之彼等腫瘤體積相比降低腫瘤體積。此外，UMSC-TK-PD-1+GCV (UTPG)組、UMSC-TRAIL-TK+GCV (UTTG)組及UMSC-TRAIL-PD-1 (UTP)組分別顯示更強之抗腫瘤效應且展現對腫瘤生長之抑制。D. 與其他組(D-(a) 至D-(d) )相比，靜脈內UTP顯著延長4T1及Hempa55.1C模型之存活時間。E. 與對照小鼠之肺中超過20個轉移相比，在經UTP治療之小鼠中發現少於5個肺轉移結節。然而，與對照組相比，UMSC-TK (UT)、UP及UTP並不顯示轉移之顯著降低。F-G. 接下來，為驗證動脈內注射UMSC-TRAIL-TK-PD-1是否在q7dx2 療程方案後在4T1-Luc及Hep55.1C-Luc模型中展示顯著強勁之治療效應，分成四個群組(UMSC-TK-PD-1+GCV (UTPG)組、UMSC-TRAIL-TK-PD-1 (UTTP)組及UMSC-TRAIL-TK-PD-1+GCV (UTTPG)組)以檢查腫瘤生長及中值存活時間(F-(a) )。在動脈內注射之分析之前，UMSC-TRAIL-TK-PD-1+GCV (UTTPG)組之靜脈內投與分別顯示較IgG對照、UTPG及UTTP之其他組更強之抗腫瘤效應(F-(b) )。重要的是，動脈內植入揭示強有力優於靜脈內植入之治療效應。此外，在4T1-Luc (F-(c-d) )及Hep55.1C-Luc (G-(a-b) )模型中，UTTPG組分別較IgG對照、UTPG及UTTP之其他組顯著抑制腫瘤生長且延長小鼠之中值存活時間。不幸的是，在4T1-Luc模型中，投與抗PD-L1並不顯示任何顯著之治療效應(F-(c) )。
圖7A至7D顯示UTTPG治療增強腫瘤微環境(TME)中之免疫性。A. 門控策略係基於第一門之合理性、藉由FSC-A及FSC-H排除雙聯體、藉由選擇7-AAD+ (R&D Systems)/CD45+ 或FSC-A排除死細胞(A-(a) )。跨越UTTPG治療組及其他治療組，腫瘤浸潤性CD45+ 白血球之百分比存在總體增加(A-(b) )。與其他組相比，在UTTPG治療中，CD3+ CD8+ 及CD3+ CD4+ T細胞二者之頻率顯著增加(A-(c) 及A-(d) )。B-C. UTTPG誘導Treg及TAM之顯著減少(B-(a) 及B-(b) )，且藉此逆轉腫瘤內CD8+ (C-(b) )及CD4+ (C-(a) ) T細胞對Treg之比率。另外，TAM之數量因應UTTPG治療而急劇減少，此增加TME中CD8+ (C-(d) )及CD4+ (C-(c) ) T細胞對TAM之比率。D. 細胞內顆粒酶B (Grb+ ) (D-(b) )及Ki67+ (D-(a) )細胞之顯著上調指示UTTPG治療不僅增加抗腫瘤免疫群體，且亦有效地達成TIL之活化及增殖。

Claims (25)

  1. 一種工程化幹細胞，其包含載體，該載體包含含有自殺基因之核酸序列、免疫檢查點基因之核酸序列之聚核苷酸及天然細胞毒性觸發受體或TNF相關之細胞凋亡誘導配體(TRAIL)；其中該幹細胞係靶向腫瘤之細胞。
  2. 如請求項1之工程化幹細胞，其中該自殺基因係胞嘧啶去胺酶基因、水痘帶狀疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基還原酶基因、大腸桿菌(Escherichia coli)gpt基因、大腸桿菌Deo基因、胸苷激酶基因(TK)、半胱天冬酶1、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、Fas或胞嘧啶去胺酶(CD)。
  3. 如請求項1之工程化幹細胞，其中該自殺基因係TK。
  4. 如請求項3之工程化幹細胞，其中該TK基因包含如SEQ ID NO：1或2中所示之序列。
  5. 如請求項1之工程化幹細胞，其中該免疫檢查點基因係E3泛素連接酶Cbl-b、CTLA-4、PD-1、TIM-3、殺手細胞抑制性受體(KIR)、LAG-3、CD73、Fas、芳烴受體、Smad2、Smad4、TGF-β受體、ILT-3、IDO、KIR或LAG3。
  6. 如請求項1之工程化幹細胞，其中該免疫檢查點基因係PD-1。
  7. 如請求項6之工程化幹細胞，其中該PD-1基因具有如SEQ ID NO：3中所示之序列。
  8. 如請求項1之工程化幹細胞，其中該天然細胞毒性觸發受體係NCR1、NCR2或NCR3。
  9. 如請求項1之工程化幹細胞，其中該天然細胞毒性觸發受體係NCR3。
  10. 如請求項9之工程化幹細胞，其中該NCR3基因包含如SEQ ID NO：4中所示之序列。
  11. 如請求項1之工程化幹細胞，其中該TRAIL係TIC10。
  12. 如請求項1之工程化幹細胞，其中該TRAIL包含如SEQ ID NO：5中所示之序列。
  13. 如請求項1之工程化細胞，其中該幹細胞選自由以下組成之群：胚胎幹細胞、骨髓基質細胞、造血幹細胞及神經幹細胞。
  14. 如請求項13之工程化細胞，其中該幹細胞係MSC。
  15. 一種組合，其包含如請求項1至14中任一項之工程化細胞及視情況另一活性劑。
  16. 一種如請求項1至14中任一項之工程化細胞或如請求項15之組合之用途，其用於製造用於治療個體之癌症或增強腫瘤內免疫性之藥劑。
  17. 如請求項16之用途，其中該癌症係乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、皮膚癌、腦癌、膀胱癌、子宮內膜癌、腎癌、胰臟癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、白血病、纖維肉瘤、肉瘤、腺癌或神經膠質瘤。
  18. 如請求項17之用途，其中該癌症係轉移性癌症。
  19. 如請求項16之用途，其中有效量係在100,000(1×105)至2,000,000(2×106)個細胞範圍內。
  20. 如請求項16之用途，其中該藥劑經由增加具有中樞記憶潛能之腫瘤特異性CD8+IFN-γ+CD44+ T細胞來增強腫瘤微環境(Tumor MicroEnvironment；TME)中之免疫性。
  21. 如請求項16之用途，其中該藥劑誘導調節性T淋巴球(Treg)之顯著減少，且藉此逆轉該等腫瘤內CD8+及CD4+ T細胞對Treg之比率，該藥劑亦 減少腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之數量，此增加該TME中CD8+及CD4+ T細胞對TAM之比率。
  22. 如請求項16之用途，其中如請求項1至14中任一項之工程化幹細胞或如請求項之15組合可經靜脈內或動脈內投與該個體。
  23. 如請求項16之用途，其中該工程化幹細胞可與另一活性劑組合投與。
  24. 如請求項16之用途，其中該另一活性劑係更昔洛韋(ganciclovir；GCV)。
  25. 如請求項16之用途，其中該工程化幹細胞及另一活性劑係分開、同時或並行投與。
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