TWI769535B - 基因工程間充質幹細胞及其應用 - Google Patents

Abstract

因此，本揭示提供了一種基因工程間充質幹細胞（MSCs）群，包括一包含Akt或HGF基因和PD-L1基因的表達載體。還提供了一種協同提高間充質幹細胞的生存狀態和免疫調節能力或增強間充質幹細胞增殖的方法，包括用Akt或HGF基因和PD-L1基因轉染間充質幹細胞，以及一種預防、改善和/或治療缺血狀況、增強神經再生或減少神經元死亡的方法，包括向有需要的個體施用有效量的本揭示之基因工程間充質幹細胞群。

Description

基因工程間充質幹細胞及其應用

本發明涉及一種工程化幹細胞及其應用之領域。特別是，該工程化幹細胞至少包含一生存基因和一免疫檢查點基因，並可用於治療或改善缺血狀況，增強神經再生，或減少神經元死亡。

中風和急性心肌缺血（AMI）皆是世界上導致死亡和殘疾的主要原因之一。儘管重組組織纖溶酶原啟動劑（rt-PA）是一種公認且廣泛應用於急性缺血性中風及急性心肌缺血的治療方法，但其狹窄的適用時間窗使溶栓治療的獲益有限。需要一種療效或效益大幅改善的新穎治療方法。

間充質幹細胞具有廣泛的免疫抑制潛能，可以調節固有免疫系統和適應性免疫系統細胞的活性，因此被認為具有治療多種疾病的潛力。然而，對間充質幹細胞行為的理解，在利用它們的能力來幫助治療和相關應用方面，仍然是難以捉摸的。許多涉及間充質幹細胞的治療方法已被測試，但療效甚微。

因此，提高其存活率的方法是間充質幹細胞的治療應用所亟需的。

本揭示基於升高表達水準的Akt或肝細胞生長因子（HGF）和PD-L1的基因工程間充質幹細胞（MSCs）以及使用此MSCs治療和改善缺血狀況、增強神經再生或減少神經元死亡的方法。本揭示的間充質幹細胞和方法使需要治療的個體的損傷恢復和修復得到顯著和意想不到的改善。

在一個方面，本揭示提供了一種於一個體中預防、改善和/或治療的缺血狀況、增強神經再生或減少神經元死亡的方法，包括向該個體施用有效量的包含生存基因（如Akt或HGF）和免疫檢查點基因（如PD-L1）的間充質幹細胞群。還提供了包含生存基因（如Akt或HGF）和免疫檢查點基因（ex.PD-L1）的間充質幹細胞群，在製造於一個體中治療或改善缺血狀況的藥劑的用途。在一個實施態樣中，該間質幹細胞是基因工程化的。

缺血狀況的實例包括但不限於中風和心肌梗塞（myocardial infarction，MI）。在一個實施態樣中，該MI是急性心肌梗塞（acute myocardial infarction，AMI）。在一個實施態樣中，本揭示的施用減輕了MI-誘導的纖維化。在另一個實施態樣中，本揭示的施用還可減少缺血組織上的炎症。在另一個實施態樣中，本揭示的施用可減輕MI後的左心室功能障礙，並減少MI後的梗塞大小。在另一個實施態樣中，本揭示的施用可增加中風後脾臟中T細胞上調節分子的表達，減少中風腦損傷引起的神經元死亡和/或減少炎症反應，但增強缺血腦中CD8 ⁺CD122 ⁺Tregs的積累。

在一個實施態樣中，該施用降低了炎症反應，但增強了缺血組織中CD8 ⁺CD122 ⁺Tregs的積累。較佳地，該缺血組織是缺血的腦組織。

在一個實施態樣中，該施用增加了個體T細胞中調節分子的表達。

在一個實施態樣中，本揭示的有效量基因工程MSCs群升高了Akt或HGF和PD-L1的表達。

本揭示的基因工程MSCs群的有效量的某些實施態樣為從約1×10 ⁵個細胞到約1×10 ⁸個細胞的範圍。在某些實施態樣中，該基因工程MSCs群的有效量範圍為約3×10 ⁵個細胞至約3×10 ⁸個細胞、約5×10 ⁵細胞至約5×108細胞、約7×10 ⁵細胞至約7×10 ⁸細胞、約1×10 ⁶細胞至約1×10 ⁸細胞、約3×10 ⁶細胞至約3×10 ⁸細胞、約5×10 ⁶細胞至約5×10 ⁸細胞、約7×10 ⁶細胞至約7×10 ⁸細胞、約1×10 ⁷細胞至約1×10 ⁸細胞、約3×10 ⁷細胞至約3×10 ⁸細胞、約5×10 ⁷細胞至約5×10 ⁸細胞、約7×10 ⁷細胞至約7×10 ⁸細胞、約1×10 ⁵細胞至約1×10 ⁶細胞、約3×10 ⁵細胞至約3×10 ⁶細胞、約5×10 ⁵細胞至約5×10 ⁶細胞或約7×10 ⁵細胞至約7×10 ⁶細胞。

在某些實施態樣中，施用包括但不限於靜脈注射、頸動脈內注射、動脈內注射或其組合。施用的某一實施態樣是頸動脈內注射組合靜脈注射。另一實施態樣的施用方式是動脈內注射結合靜脈注射。較佳地，靜脈注射在動脈內注射之前進行。在一個特定的實施態樣中，在患有中風或AMI的個體中，施用是頸動脈內注射結合靜脈注射相或動脈內注射結合靜脈注射。在另一個特定的實施態樣中，施用的有效量範圍為頸內注射約1×10 ⁴細胞至約1×10 ⁶細胞，較佳約5×10 ⁴細胞至約5×10 ⁵細胞，靜脈注射有效量範圍為約3×10 ⁴細胞至約1×10 ⁷細胞，較佳約1×10 ⁵細胞至約5×10 ⁶細胞。

另一方面，本揭示提供了一種協同增加MSC的生存狀態和免疫調節能力或增強MSC增殖的方法，包括用Akt或HGF基因和PD-L1基因轉染間充質幹細胞。

在一方面，本揭示提供了一種基因工程間充質幹細胞（MSCs）群，其中該MSCs包含生存基因（例如Akt或HGF）和免疫檢查點基因（例如PD-L1）。在一實施態樣中，該間充質幹細胞是經基因工程化。

在一實施態樣中，本文該的間充質幹細胞選自由臍帶間充質幹細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs）、脂肪衍生間充質幹細胞（adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）和骨髓間充質幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）組成的組。

在一實施態樣中，本文該的程式性死亡配體1（PD-1）或Akt或HGF是用轉座子或載體轉導。在一些實施例中，該生存基因（例如Akt或HGF）和免疫檢查點基因（例如PD-L1）包含在一表達載體中。在一實施態樣中，該表達載體是病毒載體。在某個實施態樣中，該病毒載體是慢病毒載體。

在另一方面，本揭示提供了一種包含本揭示的基因工程MSCs群的醫藥組合物。

除非另有定義，本文中使用的所有科學或技術術語與本發明所屬技術領域的通常知識者所理解的含義相同。任何與本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料都可以被本領域通常知識者理解並用於實踐本發明。

除非另有說明，說明書和請求項中使用的所有表示成分數量、反應條件等的數字都應被理解為在所有情況下為術語「約」所修飾。因此，除非有相反的指示，本發明的說明書和請求項中規定的數字參數是近似的，並且可以根據本發明所尋求的所需特性而變化。為使本發明更容易理解，首先在下文定義某些術語。以下術語之另外定義及其他術語可貫穿本說明書闡述。若以下闡述之術語的定義與以引用之方式併入之申請案或專利中的定義不一致，則應使用本申請案中所闡述的定義來理解該術語之含義。

術語「一」應指本發明該物件中的一個或多個。術語「和/或」是指候選方案中的一個或兩個。術語「一個細胞」或「該細胞」可包括多個細胞。

術語「和/或」用於指兩種事物或該兩種事物中的任一種。

「體內」一詞一般是指在生物體內。術語「體外」一般是指在生物體外，例如在生物體外創造的人工環境中進行的實驗。

術語「基因工程」或「基因工程細胞」是指使用遺傳材料操縱基因，以改變細胞中的基因拷貝和/或基因表達水準。遺傳材料可以是DNA或RNA的形式。遺傳材料可以通過各種方式轉移到細胞中，包括病毒轉導和非病毒轉染。在經過基因工程化後，細胞中某些基因的表達水準可被永久或暫時改變。

術語「轉導」是指使用病毒將遺傳物質輸送到細胞中，其中病毒可以是整合病毒或非整合病毒。本發明中使用的整合病毒可以是慢病毒或逆轉錄病毒。整合病毒允許其編碼基因整合到被病毒顆粒感染的轉導細胞中。非整合病毒可以是腺病毒或仙台病毒。非病毒方法也可用於本揭示中，例如通過將DNA或RNA材料轉染到細胞中。DNA材料可以是PiggyBac、minicircle載體或外顯子質體的形式。RNA材料可以是mRNA或miRNA的形式。

術語「表達載體」是指攜帶外來基因進入細胞進行表達而不降解的媒介。本發明中的表達載體可以是質體、病毒載體和人工染色體。

此處的術語「升高表達」是指與非工程細胞對應的這些基因的表達水準相比，基因工程細胞中感興趣的基因的RNA或蛋白質的表達增加。

此處的細胞「純化」是指利用感興趣的特定細胞所特有的特性來分離並獲得感興趣的細胞。在一些實施例中，獨特的特性是指細胞表面的蛋白質的存在或不存在，在此稱為「表面標記」。在一些實施例中，「陽性標記物」是指在感興趣的細胞上存在或表達的表面標記物。在一些實施例中，「陰性標記物」是指在感興趣的細胞上不存在的表面標記物。

術語「治療」一般指獲得所需的藥理和/或生理效果。該效果可能是預防性的，即完全或部分預防疾病、失調或其症狀，並且可能是治療性的，即部分或完全治癒疾病、失調和/或歸因於此的症狀。本文使用的「治療」涵蓋哺乳動物（較佳人類）疾病的任何治療，並包括（1）抑制個體的疾病、失調或其症狀的發展或（2）緩解或改善個體的疾病、失調或其症狀。

本文中的術語「個體」、「受試者」和「患者」可互換使用，並指需要對其進行診斷、治療或治療的任何哺乳動物個體。

術語「有效量」是指當給需要治療疾病或失調的患者或個體施用時，足以對該疾病或失調產生有益效果的細胞或其衍生後代的量。治療有效量將根據疾病或失調的條件及其嚴重程度而變化。它不限於說明書中該的範圍。確定給定細胞或其衍生後代的治療有效量在本技術領域的通常知識範圍內，並且不需要更多的常規實驗。

本發明的術語「醫藥組合物」包括有效量的活細胞以治療退化性疾病。細胞成分可以是培養細胞的混合物或分離的細胞群，如分化的組織細胞、祖細胞和/或幹細胞。本發明的醫藥組合物為液體形式或細胞懸浮液緩衝液，它可以含有穩定液體懸浮液並幫助細胞存活的藥學上可接受的賦形劑。

本發明中的術語「缺血狀況」是指由缺血性疾病導致或伴隨的條件，其通常特徵是由於不良的血管條件，如血管狹窄或動脈瘤破裂，導致組織或器官的血流量減少。心肌梗塞（MI）、缺血性中風和重症肢體缺血是三種最常見的缺血性疾病。在一些實施例中，缺血狀況包括急性心肌梗塞（AMI）和缺血性中風。在一個實施例中，缺血狀況是由AMI引起的。在另一個實施例中，缺血狀況是由缺血性中風引起的。

術語「PD-L1」指程式性死亡配體1（programmed death-ligand 1），由CD274基因編碼的40 kDa 1型跨膜蛋白。PD-L1與其受體PD-1結合，PD-1存在於活化的T細胞、B細胞和骨髓細胞上。PD-L1也被稱為「CD274」、「B7同源1」和「B7-H1」。

程式性死亡配體1（PD-L1），又稱分化簇274（CD274）或B7同源1（B7-H1），是一種在人類中由CD274基因編碼的蛋白質。PD-L1與其受體PD-1結合後，可抑制T細胞活化，降低增殖和細胞毒性，並誘導細胞凋亡。PD-1表達在活化的T細胞和B細胞的細胞表面，MSCs上表達的PD-L1與PD-1相互作用，提供抑制信號，調節細胞活化和增殖（J Exp Med 2009；206：3015-3029）。此外，發現MSCs通過直接接觸活化的T細胞和間接分泌可溶性PD-L1來抑制效應T細胞的增殖和功能（Stem Cells 2017；35：766-776）。然而，當MSCs被移植到治療梗塞的心臟時，已經觀察到間充質幹細胞的移植效果不佳，心臟功能幾乎沒有改善（Ann Thorac Surg 2003;73:1919-1926）。在梗塞的心臟中也被發現移植的MSCs存活率低，植入後4天只有1%的活力細胞（Circulation 2002;105:93-98）。

蛋白激酶B（PKB），又稱Akt，是一種絲胺酸/蘇胺酸特異性蛋白激酶，在葡萄糖代謝、細胞凋亡、細胞增殖、轉錄和細胞遷移等多種細胞過程中具關鍵作用。Akt通過結合和調節許多下游效應激素，如核激素κB、Bcl-2家族蛋白、主溶酶體調節激素TFEB和鼠雙分2（MDM2）等，調節細胞的生存和代謝。Akt可以直接和間接地促進生長激素介導的細胞生存。研究發現，經將移植細胞的低氧預調，即在移植前對細胞進行短暫的培養，可藉由啟動Akt依賴性途徑以保護人腦內皮細胞免受缺血性凋亡的影響（Am J Transl Res. 2017；9：664-673）。然而，Akt-MSCs在修復和更好地從缺血性損傷中恢復方面仍有改進空間。

本揭示驚人地發現，對MSCs中的Akt或HGF和PD-L1進行遺傳修飾，不僅能提供存活信號，還能發揮抗炎作用，有力地促進缺血狀況的改善。本揭示的基因修飾可以維持和延長植入的MSCs的生存狀態和免疫調節能力，以克服缺血組織的缺氧環境和脾細胞啟動的免疫系統。

因此，本揭示提供了一種基因工程間充質幹細胞群，其包括包含生存基因（如Akt或HGF）和免疫檢查點基因（如PD-L1）的表達載體。還提供了一種協同增加MSCs的生存狀態和免疫調節能力或增強MSCs增殖的方法，包括用Akt或HGF基因和PD-L1基因轉染MSCs，以及一種預防、改善和/或治療缺血狀況、增強神經再生或減少神經元死亡的方法，包括向有需要的個體施用有效量的本揭示的基因工程間充質幹細胞群。

根據本揭示的間充質幹細胞可從不同來源獲得，較佳從臍帶、脂肪組織或骨髓獲得。根據不同來源，間充質幹細胞是臍帶間充質幹細胞（UMSCs）、脂肪衍生間充質幹細胞（ADSCs）和骨髓間充質幹細胞（BMSCs）。在本揭示的一些實施態樣中，從臍帶中分離和純化MSCs，並稱為「臍帶MSC」或「UMSC」。在一些實施例中，確定本揭示中的UMSC與從其他機構分離的MSC表達相同的表面標記，並顯示出相符的活性。

根據本揭示的間充質幹細胞被修飾為表達程式性死亡配體1和Akt或HGF。如本文所使用的，本揭示中的術語「修飾以表達」是指將外源基因或基因片段轉移到間質幹細胞中，使其能夠表達外源基因或基因片段。較佳地，這種修飾不改變間質幹細胞的分化潛能，也不改變間質幹細胞的免疫調節特性。在另一個方面，這種修飾較佳為穩定的修飾，並且表達可以是持久的或可誘導的。根據揭示的間質幹細胞經過修飾，表達程式性死亡配體1和Akt或HGF，並且仍然具有多能分化潛能，例如但不限於脂肪生成、軟骨生成、成骨和血管化，這與沒有PD-L1和Akt或HGF轉導的普通間質幹細胞相似。

用程式性細胞死亡蛋白-1和Akt或HGF修飾間充質幹細胞的方式不受限制。較佳地，程式性死亡配體1或Akt或HGF用轉座子或慢病毒轉導；更較佳地，轉座子為piggyBac轉座子。通過應用piggyBac轉座子，PD-L1和Akt或HGF在100-150天內保持其表達。結果表明，piggyBac轉座子能高效、穩定地轉染骨髓間充質幹細胞，且piggyBac的基因修飾不會改變間充質幹細胞的DNA拷貝數和排列。

本揭示的基因工程間充質幹細胞（MSCs），包含具有Akt或HGF基因和PD-L1基因的表達載體。除了Akt或HGF和PD-L1的序列外，本揭示的載體還包括一個或多個控制序列以調節本揭示的多核苷酸的表達。根據所利用的表達載體，在將分離的多核苷酸插入載體之前對其進行操作可能是可取的或必要的。利用重組DNA方法修飾多核苷酸和核酸序列的技術是本領域眾所周知的。在一些實施態樣中，控制序列包括啟動子、領導序列、多腺苷酸化序列、多肽序列、信號肽序列和轉錄終止子等。在一些實施例中，根據宿主細胞的選擇選擇合適的啟動子。

揭示了本揭示的重組表達載體以及一個或多個表達調節區域，如啟動子和終止子、複製原點等，這取決於它們將被引入宿主的類型。構成性啟動子的非限制性例子包括SFFV、CMV、PKG、MDNU3、SV40、Ef1a、UBC和CAGG。

在一些實施態樣中，將本文該的各種核酸和控制序列連接在一起，以產生重組表達載體，該載體包括一個或多個方便的限制性位點，以允許在這些位點插入或替換本揭示的多核苷酸。另外，在一些實施態樣中，通過將本揭示的多核苷酸或包含該序列的核酸構建體插入適當的表達載體中來表達本揭示的多核苷酸。在涉及創建表達載體的一些實施態樣中，編碼序列位於載體中，以便編碼序列與適當的控制序列可操作地連接以進行表達。重組表達載體可以是任何合適的載體（例如質體或病毒），可以方便地進行重組DNA程式並帶來本揭示的多核苷酸的表達。載體的選擇通常取決於載體與將載體引入其中的宿主細胞的相容性。載體可以是線性或封閉的圓形質體。在一個實施態樣中，該載體是病毒載體。病毒載體的例子包括逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、α病毒載體等。在某些實施態樣中，病毒載體是慢病毒載體。慢病毒載體是基於或衍生自癌病毒（含MLV的逆轉錄病毒亞群）和慢病毒（含HIV的逆轉錄病毒亞群）。這種例子包括但不限於人類免疫缺陷病毒（HIV）、馬傳染性貧血病毒（equine infectious anaemia virus，EIAV）、類比免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV）和貓免疫缺陷病毒（feline immunodeficiency virus，FIV）。另外，還考慮使用其他逆轉錄病毒作為載體主幹的基礎，如鼠白血病病毒（murine leukemia virus、MLV）。

在一些實施態樣中，已經在各種分化試驗中測試了本揭示的基因工程MSCs，以建立其與從哺乳動物體的其他位置分離的常規MSC的相符性。分化試驗包括脂肪生成分化、成骨分化和軟骨生成分化。在一些實施態樣中，分化測定還包括神經元細胞分化。

本揭示的基因工程MSCs群通過將MSC轉染Akt或HGF基因和PD-L1基因，可以協同提高MSC的生存狀態和免疫調節能力。因此，本揭示提供了一種預防、改善和/或治療缺血狀況、增強神經再生或減少神經元死亡的方法，包括向有需要的個體施用有效量的本揭示的基因工程MSCs群。

在一些實施例中，缺血狀況包括但不限於中風和心肌梗塞（MI）。較佳地，MI是急性心肌梗塞（AMI）。本揭示的施用可減弱MI-誘導的纖維化。本揭示的施用還可減少缺血組織上的炎症。

施用可增加個體T細胞上調節分子的表達，降低炎症反應，但可增強缺血組織中CD8 ⁺CD122 ⁺Tregs的積累。與未受影響的組織相比，用本揭示的基因工程MSCs群處理的缺血組織中，包括CD3 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、CD11b ⁺PD-L1 ⁺巨噬細胞和F4/80+PD-L1 ⁺小膠質細胞在內的有活力的白細胞總數顯著增加，而處理組和對照組之間的細胞總數在任一組織中都沒有變化。

本揭示有效量的基因工程MSCs群可升高Akt或HGF和PD-L1的表達。特別是，本揭示的基因工程MSCs群的有效量範圍為約1×10 ⁵個細胞至約1×10 ⁸個細胞。該量的其它實施例已揭示本文中。

根據本揭示的間充質幹細胞包含在可注射製劑中。可注射製劑可通過公知的方法製備。例如，可注射製劑可通過例如將醫藥組合物溶解、懸浮或乳化在常規用於注射的無菌水介質或油性介質中來製備。注射用的水性介質的例子包括生理鹽水、含有葡萄糖和其它輔助劑的等滲溶液等，可與適當的增溶劑如醇（如乙醇）、多元醇（如丙二醇、聚乙二醇）、非離子表面活性劑[如聚山梨酯80、HCO-50（氫化蓖麻油的聚氧乙烯（50摩爾）加合物）]等結合使用。油性介質的例子包括芝麻油、大豆油等，可與增溶劑如苯甲酸苄酯、苯甲醇等結合使用。這樣製備的注射劑較佳裝入適當的安瓿中。

本發明中MSC的施用途徑取決於需要治療的組織或器官。在一些有心肌梗塞的個體的情況下，MSCs的施用途徑可以是靜脈注射、動脈注射或其組合。含有細胞的溶液可以用合適的稀釋劑如水、乙醇、甘油、液態聚乙二醇、各種油和/或它們的混合物以及本領域技術人員已知的其它稀釋劑來製備。在某一特定實施態樣中，在患有中風或AMI的個體中，施用是頸動脈內注射結合靜脈注射。在另一個特定的實施態樣中，該施用的有效量範圍為頸動脈內注射的約1×10 ⁵個細胞至約3×10 ⁶個細胞和靜脈注射的約3×10 ⁵個細胞至約3×10 ⁶個細胞。

根據本揭示的施用還包括通過動脈內途徑結合靜脈途徑，將間充質幹細胞注射到需要此治療的個體中。在本揭示的一個較佳實施態樣中，動脈內途徑是通過頸動脈。

在本發明的一些實施態樣中，施用MSCs的過程為術語「移植」或「植入」。

在一個實施態樣中，本揭示的工程幹細胞可以與額外的活性劑一起施用。在一些實施例中，工程幹細胞和額外的活性劑可以同時、分別或同時施用。在一個實施態樣中，工程幹細胞和額外的活性劑可以定期施用。

應當理解的是，如果在此提及任何現有技術出版物，這種提及並不構成承認該出版物構成本技術領域普通常識的一部分。

雖然為了理解的明確性，已經通過說明和示例的方式提供了一些細節的揭示，但對於本領域具通常知識者來說，將顯而易見的是，可以在不偏離揭示的精神或範圍的情況下實施各種變化和修改。因此，前述描述和示例不應解釋為限制性的。 實例

方法和材料：

臍帶間充質幹細胞 UMSCs 、臍帶脂肪間充質幹細胞 ADSCs 或骨髓間充質幹細胞 BMSCs 的製備、分離和鑒定

收集經台中中國醫藥大學醫院機構審查委員會（IRB）認可之人類臍帶組織，並用無鈣及無鎂PBS（DPBS，Life Technology）洗滌三次。用剪刀在中線方向切割，使臍動脈、靜脈和外膜血管與沃頓果凍（Wharton’s jelly，WJ）分離。然後將沃頓果凍內容物廣泛切成小於0.5 cm3的小塊，用膠原酶1型（Sigma，St Louis，USA）處理，並在37°C、95%空氣/5%CO ₂增濕空氣中培養3小時。然後將外植體培養在含有10%胎牛血清（FCS）和抗生素的DMEM中，溫度為37°C，環境為95%空氣/5%二氧化碳增濕空氣。接著保持5-7天不受干擾，以允許細胞從外植體遷移。源自臍帶間充質幹細胞（UMSCs）的細胞形態在培養4-8代後變為均勻梭形，並且將來自WJ的細胞表面分子通過流式細胞儀分析進行表徵。細胞在PBS中用2 mM EDTA分離，用含有2%BSA和0.1%疊氮鈉的PBS（Sigma，USA）洗滌，並用結合有異硫氰酸螢光素（FITC）或藻紅蛋白（PE）的相應抗體，包括CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49b、CD1q、CD3、CD10、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD117、HLA-ABC和HLA-DR（BD，PharMingen）共同培養。之後，使用Becton-Dickinson流式細胞儀（Becton Dickinson，San Jose，CA）對細胞進行分析。脂肪間充質幹細胞（ADSCs）和骨髓間充質幹細胞（BMSCs）均購自ATCC（ADSCs，PCS 500-011；BMSCs，PCS 500-012）。

質體構建

將Akt質體（0.1μg）（pCMV6-myc-DDK-Akt，OriGene）、HGF（0.1 μg）（pCMV6-XL4-HGF，OriGene）及PD-L1質體（0.1µg）（pCMV6-myc-DDK-PD-L1，OriGene）中的Akt、PD-L1和GFP cDNA通過特異性限制性酶連接子（TK中的EcoR1和Nhe1，BamH1和PD-1中的Not1）轉入pIRES（Clontech）或pSF-CMV-SbfI（Oxford Genetics）中，構建pSF-PD-L1-Akt、pSF-PD-L1-HGF、pSF-Akt-GFP、pSF-PD-L1-GFP等的構築物，並按照製造商的指示，由XtremeGene HP DNA（Roche）轉染到UMSCs、ADSCs或BMSCs中，以獲得UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、UMSC-Akt-GFP、UMSC-HGF-GFP和UMSC-PD-L1-GFP。

慢病毒質體

獲得慢載體（pLAS3w）和包裝（psPAX2）/包膜質體（pMD2.G）。自pCMV6-myc-DDK-Akt、pCMV6-XL4-HGF、pCMV6-myc-DDK-PD-L1和pRMT-Luc（OriGene）重組取得編碼人類全長的Akt，PD-L1，螢光素酶（Luc）和對照GFP的cDNA，並通過特異性限制性內切酶中轉入pUltra（Addgene）或pSF-CMV-CMV-Sbf1（Oxford Genetics）以獲得pUltra-PD-L1-Akt、pUltra-PD-L1-HGF、pUltra-Akt-GFP、pUltra-HGF-GFP、pUltra-PD-L1-GFP的構築物。隨後，用特異性引物對這些範本進行PCR擴增，並用限制性內切酶將其複製到慢病毒載體主幹質體pLAS3w。為製備攜帶PD-L1-Akt、Akt、PD-L1、Luc及對照GFP的重組慢病毒，將重組質體與包裝及包膜載體以3:3:1的比例轉染293T細胞（XtremeGene HP DNA（Roche） transfection）。36小時後收集含有病毒顆粒的培養上清液，24小時後再次以一半體積收集，然後以15,000 rpm/min離心10 min去除碎屑，然後轉移到36 mL超離心管中，在25℃下進行超離心，25,000 rpm/min 3小時。再懸浮含有慢病毒的顆粒。病毒在定價和細胞轉導前立即解凍。用合適的慢病毒感染骨髓間充質幹細胞，其基因轉移效率至少達到80%。

慢病毒轉導

在6孔盤上進行慢病毒質體轉導。除非另有規定，UMSCs以每孔1×105細胞的形式接種並重複三份，最終體積為1 ml/孔，感染倍數（MOI）為5。添加5 mg/ml魚精蛋白硫酸鹽（Sigma-Aldrich）的儲備溶液（DMEM-LG中，無菌過濾），以獲得所需的最終濃度。將細胞轉導24小時，然後替換為1.5 ml/孔，以獲得UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Akt-GFP、UMSC-Luc和UMSC-PD-L1-GFP。用1.0 mg/ml G418或嘌呤黴素溶液（Sigma）將生長過度的細胞接種到六孔盤上進行藥物篩選。培養基每2天更換一次。根據培養基的顏色和細胞狀態，利用倒置螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白（GFP）的表達。篩選7天后，更換不含嘌呤黴素的完整培養基，繼續培養。

穩定細胞系 piggyBac 轉座子系統的構建

將pPB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro（System Bioscience）的piggyBac載體做為基本載體，其包含多複製位點（MCS）、piggyBac末端重複序列（PB-TRs）、核心絕緣體（CIs）和融合至RFP的嘌呤黴素選擇激素（BSD），以人EF1α驅動。PCR擴增含有PD-L1-Akt、PD-L1-HGF、Akt、HGF或PD-L1的DNA片段（來自pUltra-PD-L1-Akt、pUltra-PD-L1-HGF、pUltra-Akt、pUltra-HGF、pUltra-PD-L1），亞複製到pPB-CMV-MCS-EF1α-RedPuro載體中，位於EF1α編碼區前面。關於載體構建的詳細資訊（pPB-PD-L1-Akt、pPB-PD-L1-HGF、pPB-Akt、pPB-HGF、pPB-PD-L1）可根據要求提供。為了獲得穩定的UMSCs細胞，上述pPB-PD-L1-Akt、pPB-PD-L1-HGF、pPB-Akt、pPB-HGF、pPB-PD-L1載體通過磷酸鈣（Invitrogen）或電穿孔（Amaxa nucleafector II，Lonza）與一個piggyBac轉酶表達載體（System Biosciences）共轉染至UMSCs、ADSCs和BMSCs細胞。在嘌呤黴素存在下篩選出穩定的細胞。

體外增殖、遷移和分化試驗

為了檢測細胞的增殖和遷移，用CFSE染色法和跨孔遷移法對UMSC-PD-L1Akt和UMSCs進行比較。應用CFSE染色法檢測UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs的增殖情況，評價其對其增殖的影響。CFSE染色的UMSC-Akt-PD-L1以2×10 ⁴個細胞/mL的密度接種在37℃和5%的CO ₂中5天。增殖細胞的一般選通策略與PBMC相同。在這個增殖門中測得的螢光與5天實驗中的增殖活性相對應。採集完成後，所有的資料分析都使用FlowJo 8.7軟體進行。

細胞遷移試驗評估根據製造商的說明（Costar，#3421），將100μL UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs置於上室（transwell: 6.5-mm直徑，5.0-mm孔徑）。下室使用SDF-1α（100 ng/mL，R&D System，陽性對照）。在37℃的溫度下，5%二氧化碳培養箱中進行4小時的培養。因為幾乎所有的細胞在遷移後都停留在膜的下方，所以只需對這些細胞進行計數就可以進行定量。如前該，在顯微鏡下對膜下側的粘附細胞進行計數。

誘導成脂分化，將UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs的融合單層細胞培養在包含DMEM高糖（DMEM-HG，Sigma）、100 U/mL青黴素、100 mg/mL鏈黴素、100 mM胰島素（Sigma）、500 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（Sigma）、1 mM地塞米松（Sigma）、100 mM吲哚美辛（Sigma）和10%FCS的成脂分化培養基中生長。使用普通UMSCs培養基中保存的細胞作為陰性對照。成脂分化培養基每週更換3次。為了評估成脂分化，將細胞在室溫下用0.3%油紅O（Sigma）染色10分鐘（以標記細胞內脂質積聚），並用蘇木精複染。

為了誘導成骨分化，在含有100 U/mL青黴素（Sigma）、100 mg/mL鏈黴素（Sigma）、50 mg/mL L-抗壞血酸2-磷酸（Sigma）、10 mM b-甘油磷酸（Sigma）、100 nM地塞米松（Sigma）和10%FCS的DMEM高糖（DMEM-HG，Sigma）中培養融合的單層UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs。以普通UMSCs培養基為陰性對照。成骨分化培養基每週更換3次。用茜素紅S染色法（1%，Sigma）測定成骨水準，以檢測鈣礦化。

使用高密度顆粒細胞培養系統誘導UMSC-Akt-PD-L1或UMSC的軟骨分化。細胞在無血清軟骨分化培養基中洗滌，該培養基包含DMEM-HG、100 U/mL青黴素、100 mg/mL鏈黴素、50 mg/mL L-抗壞血酸2-磷酸、40 mg/mL脯胺酸（Sigma）、100 mg/mL丙酮酸鈉（Sigma）、100 nM地塞米松及ITS加成物（10 mg/mL牛胰島素、5.5 mg/mL轉鐵蛋白、5 mg/mL亞硒酸鈉、4.7 mg/ml亞油酸和0.5 mg/ml牛血清白蛋白（Sigma））。將250,000個細胞的等分試樣重新懸浮在軟骨分化培養基中，以250×g離心，然後加入10 ng/mL的TGF-β1（R&D Systems）。以不含TGF-β1的成軟骨分化培養基為陰性對照。培養基每週更換兩次。用硫酸化蛋白多糖的阿爾辛藍染色（Sigma）從組織學上證實顆粒培養物的軟骨分化。此外，在EBM（Cambrex）中培養UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs 2-3天，在預塗有基質凝膠（300μL/孔；Becton-Dickinson）和血管內皮生長激素（VEGF，10 ng/ml，Sigma）的24孔盤上培養2-3天，誘導內皮細胞分化成血管的管形成。

為了誘導神經細胞分化，將UMSC-Akt-PD-L1或UMSCs與DMEM共孵育，採用三步法。簡單地說，在神經誘導步驟中，細胞被低密度地塗盤在含有纖維連接蛋白（Sigma）的6孔盤上，然後依次暴露於（1）含有10%FCS的DMEM-HG（Sigma）和10 ng/mL bFGF（R&D Systems）中24小時，（2）在神經承諾（neural commitment）步驟中，含有1 mMβ-巰基乙醇（βME，Sigma）的DMEM-HG、10 ng/mL NT-3（R&D Systems）中2天，以及（3）在神經分化階段，含NT-3（10 ng/mL，R&D Systems）、NGF（10 ng/mL，R&D Systems）和BDNF（50 ng/mL，R&D Systems）的DMEM-HG持續3-7天。細胞分化後，留作免疫組化分析。

流式細胞術

為了分析細胞表面標記物的表達，在PBS中用2 mM EDTA分離細胞，用含有BSA（2%）和疊氮鈉（0.1%）的PBS洗滌，然後用分別與異硫氰酸螢光素（FITC）或藻紅蛋白（PE）結合的抗體孵育直到分析。作為對照，用小鼠IgG1同型對照抗體染色。用於流式細胞術的抗PD-1、PD-L1、CD3、CD8、CD4、CD25、Foxp3、CD44、CD45、CD11b、F4/80、IFN-γ、CD206和GFP抗體購自BD Biosciences。細胞分析使用FACScan（BD）和CellQuest Analysis（BD Biosciences）和FlowJo v.8.8軟體（TreeStar）進行。結果用陽性細胞占總細胞數的百分比表示。為了定量比較表面蛋白的表達，每個樣本的螢光強度被表示為中值螢光強度（MFI）。為了Ki-67和顆粒酶B的細胞內染色，TIL在1μg/ml的抗CD3存在下培養48小時。然後在Triton x100滲透前用抗CD8培養細胞，然後用抗Ki-67抗體（Millipore）和Granzyme B染色。使用FACScan（BD）和CellQuest Analysis（BD Biosciences）和FlowJo v.8.8（TreeStar）對資料進行分析。

缺氧程式

UMSC-Akt-PD-L1或UMSC（1×105/mL）在37℃下於5%CO2增濕培養箱中培養，在常氧（21%O ₂）或缺氧條件（1%O ₂）中處理不同時間點。缺氧培養在一個雙氣體培養箱（Jouan，Winchester，Virginia）中培養，該培養箱配有O ₂探針以調節N ₂水準。用台盼藍排斥試驗和TUNEL法評價細胞數量和活力。

過氧化氫誘導細胞死亡的測定

採用MTT法（C，Ndipheyl-N-4，5-二甲基噻唑-2-基四唑溴化銨，Sigma）檢測細胞的活性。UMSCs在96孔盤中培養。用過氧化氫孵育1h後，用MTT溶液（PBS中5mg/mL）代替培養基。繼續孵育4h，然後抽吸去除上清液。加入二甲基亞碸（DMSO，Sigma），在570nm處用微板閱讀器（Molecular Devices）讀取吸光度，得到細胞活力百分比。此外，非極性化合物DCFH-DA（Sigma）進入細胞後，被裂解形成DCFH，並被氧自由基捕獲氧化生成螢光DCF。UMSCs在無血清DMEM中預培養24小時，用H ₂O ₂處理30分鐘，在37℃下用10µM DCFH-DA預載入30分鐘。螢光強度由螢光閱讀器（Finland）使用485nm激發和538nm發射濾光片進行分析。

抗原特異性 T 細胞反應的體外分析

將BALB/c小鼠脾細胞（2×10 ⁶）置於RPMI-1640培養基（Gibco）24孔盤上，添加10%FBS（Sigma）、1%青黴素/鏈黴素（Gibco）。然後，以不同比例（10:1或1:1）細胞（2×10 ⁵或2×10 ⁶）共培養脾細胞，以不刺激，或與CD3-CD28微珠（dynabeals，thermal）孵育。對於增殖試驗，脾細胞用羧螢光素琥珀醯亞胺酯（CFSE）（Invitrogen）染色。用增殖指數（PI）來估計細胞的增殖/分裂，公式計算：PI=增殖後的總數/增殖前的總數。培養6天后取細胞進行染色，分析Treg、CD4和CD8-T細胞亞群的增殖情況。或者，為了分析縱貫型樣本中6天培養後的的增殖情況，當中細胞數量為受限的，培養未經CFSE染色的脾細胞，並用Ki67或同型對照抗體染色。增殖倍數變化（FC增殖）計算為UMSC-TRAIL-TK-PD-1條件下的增殖率除以對照條件下的增殖率。

TUNEL 分析

細胞凋亡用免疫組織化學方法，使用商業TUNEL染色試劑盒（DeadEnd fluoremic TUNEL system；Promega）進行檢測。TUNEL標記的百分率表示為TUNEL陽性核數除以DAPI染色的細胞核總數。

動物腦缺血再灌注模型

選用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（體重250-300g）。動物接受三血管結紮。所有手術程式、動物實驗方案和方法均按照機構指南進行，並經台中中國醫藥大學動物與臨床研究機構委員會批准。用水合氯醛（0.4g/kg，ip）麻醉大鼠，並結紮右大腦中動脈（MCA）和雙側頸總動脈（CCA）。雙側CCAs用非創傷性動脈夾夾閉。利用外科顯微鏡，在顴骨與鱗狀骨融合處鑽一個2×2毫米的顱骨切開孔。右側大腦中動脈用l0-0尼龍線結紮。用鐳射多普勒流量計（PF-5010，Periflux system，Sweden）連續測量麻醉動物的皮質血流量。在右額頂葉區域形成一個直徑為1毫米的毛刺孔，以便放置光電探測器。將探頭（直徑0.45 mm）立體定向放置在皮質（後方1.3 mm，囪門外側2.8 mm，硬腦膜下1.0 mm）。缺血90分鐘後，取下MCA上的縫線和CCA上的動脈夾，以允許再灌注。用熱敏電阻探針監測核心體溫，麻醉期間用加熱墊維持在37℃。麻醉恢復後，用加熱燈將體溫維持在攝氏37度。

頸動脈內和 / 或靜脈移植 UMSC-PD-L1-Akt 、 UMSC-PD-L1-HGF 、 ADSC-PD-L1-Akt 或 BMSC-PD-L1-Akt

在腦缺血後2小時，用水合氯醛（0.4g/kg，ip）麻醉成年雄性Sprague-Dawley大鼠（200-250 g），靜脈注射約1×10 ⁶細胞（UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、UMSC-Akt、UMSC-HGF或UMSC-PD-L1）。對照組動物僅給予PBS。頸動脈內注射時，再次暴露同側頸總動脈，頸外動脈用6-0絲結紮，使甲狀腺上動脈和翼齶動脈凝血，在中風後24小時，使用24-G血管導管將1×10 ⁵UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF、UMSC-Akt、UMSC-HGF、UMSC-PD-L1、ADSC-PD-L1-Akt或BMSC-PD-L1-Akt注入頸內動脈。由於間充質幹細胞具有免疫抑制特性，大鼠宿主未接受任何免疫抑制藥物。

神經行為評估

分別於腦缺血前5天、細胞移植後1、7、14、28天進行行為學評估。測試測量了身體不對稱性，運動能力和握力。記錄基線檢測之分數，以使腦缺血後的評分標準化。以抬高身體擺動試驗用於評估大腦中動脈結紮術後的身體不對稱性。最初，動物們被檢查是否有側向運動，它們的身體被尾巴懸在離籠子地板10釐米的地方。在20個連續試驗中，計算缺血側對側的初始頭部擺動頻率，並將其以基線分數標準化。運動活動測量由VersaMax動物活動監測（Accuscan Instruments，Inc.，Columbus，OH）進行約2小時的行為記錄。該儀器包含16個水準和8個垂直紅外感測器。垂直感測器位於離試驗室地板10釐米的地方。運動活動被計算為一隻老鼠在室內的運動所破壞的光束的數量。計算2小時以上垂直項目的三個參數：（i）垂直活動（ii）垂直時間（iii）垂直運動次數。

用磁共振成像（ MRI ）測量梗塞面積

以3.0T的R4成像系統（GE）中對麻醉大鼠進行MRI檢查。以2 mm厚，無縫隙的6-8個冠狀圖像切片掃描大腦。利用自旋回波技術（重複時間4000毫秒；回波時間10 ⁵毫秒）獲得T2加權成像（T2WI）脈衝序列。分別在腦缺血後1、7和28天對每只動物進行圖像採集。為了測量右皮質的梗塞面積，我們從左半球的總皮質面積中減去右皮質的非梗塞區。用手工逐層繪製梗塞面積，然後用內部體積分析軟體（Voxtool，General Electric）計算體積。

生物發光成像

動物用IVIS成像系統200系列（Xenogen）成像以記錄生物發光信號。用異氟醚麻醉動物，腹腔注射D-螢光素（Caliper），劑量為270mg/g體重。在腹腔注射螢光素後15分鐘進行圖像採集。對於BLI分析，使用IVIS系統（Xenogen）確定包括顱內信號區在內的感興趣區域，並記錄總光子通量。為了便於細胞植入率的比較，每只動物的發光評分在第14天根據自己的發光讀數進行標準化，從而使每只老鼠作為自己的對照。

從脾臟和腦中分離白細胞

取單個對照組和治療組大鼠的脾臟，通過將組織穿過100μm尼龍網製備單細胞懸浮液（Fisher Scientific）。用RPMI 1640（Invitrogen）清洗細胞。用1×紅細胞裂解緩衝液（eBioscience）裂解紅細胞，孵育3 min。然後用RPMI 1640沖洗細胞兩次，計數並重新懸浮在含有2%胎牛血清（Gibco）和0.4%β-ME（Sigma-Aldrich）的刺激培養基中。

將大腦分為缺血（右）和非缺血（左）半球，並在3U/mL重組DNA酶I（Roche）和1mg/mL溶組織梭菌膠原酶（Sigma-Aldrich）中酶解，在80% Percoll（GE Healthcare）中重新懸浮，並以1600 rpm（400 g）的速度進行30分鐘的密度梯度離心。從間期提取18個白細胞，用RPMI 1640洗滌兩次，計數後再懸浮於刺激培養基中，並使用流式細胞儀檢測單個大腦半球的炎性細胞。

流式細胞術檢測 T 細胞群

採用多色流式細胞儀分析細胞群。首先，用含有BSA（2%）和疊氮鈉（0.1%）的PBS洗滌細胞。隨後，在分析前，用來自BD的相應抗體（PD-L1、CD3、CD8、CD4、CD25、Foxp3、CD44、CD45、CD11b、F4/80、IFN-γ、7AAD和CD206）培養細胞，然後進行分析。

用小鼠IgG1同型對照抗體染色作為對照。使用FACScan（BD）和CellQuest Analysis（BD Biosciences）和FlowJo軟體v.8.8（TreeStar Inc.），選通策略是基於第一個門的正確認證、以SSC-A和SSC-H排除重複、排除死細胞並進一步選擇為7-AAD+/FSC-A。結果以陽性細胞占總細胞數的百分比表示。兩組間的差異用Newman-Keuls事後檢驗進行方差分析。P值＜0.05被認為是顯著的。

細胞內染色

進行細胞內染色。簡而言之，再懸浮已分離的白細胞（2×106個細胞/mL）並與LPS（10μg/mL，Sigma）、佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸鹽（50 ng/mL，Sigma）、離子黴素（500 ng/mL）和GolgiPlug蛋白轉運抑制劑（BD Biosciences）培養4小時。根據製造商的說明，用固定/滲透緩衝液（BD Biosciences）固定和滲透細胞。用腫瘤壞死激素-α（複製MP6-XT22）、白細胞介素（IL）-10（複製JES5-16E3）、PD-1（複製J43）和FoxP3（複製FJK-16s）染色，然後再懸浮在染色緩衝液中進行採集。同型匹配的單複製抗體作為陰性對照。

細胞激素測定

為檢測TNF-α、VEGF和TGF-β的水準，在腫瘤接種後4周，從以不同劑量IO@FuDex製劑處理的小鼠體內分離TILs。用PRMI-1640培養基和L-穀氨醯胺（2 mM）在6孔盤（2×10 ⁵細胞ml ^-1）中進一步培養TIL 48 h。在分光光度計（Molecular Devices）下用Quantikine ELISA試劑盒（R&D Systems）半定量培養液中的TNF-α、TGF-β與VEGF，並用SOFTmax（Molecular Devices）程式生成標準曲線。

免疫組化評估

動物用水合氯醛（0.4 g/kg，ip）麻醉，經心灌注生理鹽水固定腦，再灌注4% PFA。然後收集組織樣本，用4% PFA浸泡進一步固定，在30%蔗糖中脫水，並在乾冰上冷凍。冠狀切片（6μm厚）用低溫恒溫器切割，並用H&E染色，再以光學顯微鏡（E600，Nikon）觀察。採用雙重免疫螢光法檢測螢光素酶+細胞中細胞類型特異性標記的表達。每個冠狀切片首先用一級螢光素酶抗體（1:1000，Novus）、MAP-2（1:200，Millipore）、GFAP（1:500，Millipore）和GFP抗體（1:200，Millipore）染色，然後用特異性抗體處理與第二抗體結合的Cy3（1:500；山羊抗兔IgG，Jackson Immunology Research）或FITC（1:500；山羊抗鼠IgG，Jackson Immunology Research）進行雙重免疫染色，以證明它們在CLSM下在一個細胞中的共定位。

免疫相關不良事件（ irAE ）的評估

在IO@FuDex3和M-IO@FuDex3處理後，評估irAEs，包括：（1）體重監測，（2）組織學，（3）免疫細胞浸潤，（4）肝腎功能。處理期間監測小鼠體重。此外，在腫瘤接種後4周（n=6），對以IO@FuDex製劑處理的小鼠肝臟、肺、脾臟、腎臟和結腸切片進行H&E染色，並進行組織學分析。通過IHC檢查肝、結腸、腎和肺的CD8+和CD4+T細胞浸潤，並計算每平方毫米10個高倍視野中的陽性細胞數量，以進行評分。此外，用Beckman Unicell DxC800分析儀從每組（n=6）的連續時間點（0、5、10、15、20、25和30 d）使用小鼠血清測定ALT、AST、肌酐和葡萄糖的生化特徵。

大鼠急性心肌梗塞模型及治療方案

成年雄性Sprague-Dawley大鼠（SD，200-250 g）通過結紮冠狀動脈左前降支（LAD）以造成AMI。簡而言之，在100%氧氣中用2%異氟醚誘導麻醉後，大鼠使用呼吸機（SN-480-7，Japan）進行人工通氣，呼氣量為1 mL/100 g，呼吸頻率為80/min。使用肋骨牽開器（MY-9454S，Japan）在第4-5肋間進行左開胸手術；用一小塊浸有鹽水的紗布將左肺放氣。然後取出心包，用6-O聚乙烯帶線縫合針在房室溝下方1-2 mm處進行心肌內結紮（Ethicon，UK）。然後在胸腔關閉前重新充氣。除結紮冠狀動脈外，假手術組大鼠接受相同的治療方案。

AK-PD-L1-PD 、 UMSC-PD-L1-HGF 、 AK-PD-L1-Akt 或 BMTID-L1-PD 移植

急性心肌梗塞後2小時，用水合氯醛（0.4g/kg，ip）麻醉大鼠，靜脈注射1×10 ⁶細胞（UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-PD-L1-HGF）。對照組動物僅給予PBS。頸動脈內注射時，暴露左頸總動脈，頸外動脈用6-0絲結紮，甲狀腺上動脈和翼齶動脈凝血，急性心肌梗塞後24小時，用30克血管導管將0.5×10 ⁶UMSC-Akt-PD-L1、UMSC-PD-L1-HGF、ADSC-PD-L1-Akt或BMSC-PD-L1-Akt注入頸內動脈。

心肌組織學及免疫組化分析

實驗大鼠用水合氯醛（0.4g/kg IP）再次麻醉，分別於AMI後3天和28天犧牲。3只未結紮LAD的大鼠作為正常對照。將大鼠心臟固定在4%多聚甲醛中，在30%蔗糖中浸泡3天。用低溫恒溫器從冠狀面上的每個組織塊切下一系列6 μm厚的切片，用H&E染色，並用光學顯微鏡進行分析（Nikon，E600）。使用ImageJ軟體（NIH）對沿長軸的不同水準（心尖、左室中部和基底部）的Masson trichrome（Sigma）染色切片進行分析，以計算梗塞面積、壁厚和纖維化百分比。梗塞面積以心肌梗塞28天后Masson trichrome染色切片的LV周長百分比進行測量。炎症和纖維化的分級採用光學顯微鏡下的評分系統進行盲法檢查：0級，無炎症或纖維化；1級，最多5%的心臟節段有心臟浸潤或纖維化；2級，6%-10%；3級，11%-30%；4級，31%-50%；5級，＞50%。

在梗塞心肌邊緣區隨機選取10個高視野，用一級CD68（1:200，milipore）染色檢測炎性細胞浸潤（CD68陽性），並以個每高倍視野之個數表示。組織切片用Carl Zeiss LSM510鐳射掃描共聚焦顯微鏡進行分析。免疫螢光標記載玻片上的FITC（綠色，1:500；Jackson Immunoresearch）、Cy3（紅色，1:500；Jackson Immunoresearch）和Alexa Fluor 680（藍色，1:1000；Invitrogen）螢光染料分別在488nm、543nm和680nm處激發。

統計分析

所有測量均採用盲法設計。結果用平均 ± SEM表示。採用雙尾Student t檢驗評估對照組和治療組之間的平均差異的顯著性。兩組間的差異用Newman-Keuls事後檢驗進行方差分析。P值＜0.05被認為是顯著的。 實例 1 ： UMSCs 和 UMSC-PD-L1-Akt 的體外特性

從沃頓果凍（WJ）中製備了臍帶間充質幹細胞（UMSCs）的原代培養物，並對細胞形態和生物學特性進行了分析（圖1A）。流式細胞術顯示CD1q、CD3、CD10、CD14、CD31、CD34、CD45、CD49d、CD56、CD117和HLA-DR呈陰性，但CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD49b和HLA-ABC呈陽性（圖1b）。這些觀察結果表明，UMSCs具有與間充質幹細胞（MSCs）相同的表面標記物，與骨髓間充質幹細胞的觀察結果一致。

採用流式細胞儀檢測了UMSC-PD-L1-Akt的RFP螢光和PD-L1的表達水準。轉染後36小時至48小時，通過RFP和PD-L1流式細胞術的結果顯示攝取效率平均為55-65%（圖1C）。隨後，經過3-5天的嘌呤黴素篩選，90%以上的細胞被轉基因完全轉化（圖1C）。在西方墨點法中，在UMSC-PD-L1-Akt上也觀察到Akt轉基因表達的顯著增加（圖1D）。

為了測定UMSC-PD-L1-Akt-Luc在體內的存活率，在試驗範圍內觀察到體內表達Luc信號強度的UMSCs細胞數與體外具直接相關性。UMSC-PD-L1-Akt-Luc在100-150天內仍保持螢光素酶的表達（圖1D）。這些結果表明，piggyBac轉座子能高效、穩定地轉染骨髓間充質幹細胞，且轉座子素基因修飾不會改變間充質幹細胞的DNA拷貝數和排列方式。

為了證明UMSC-PD-L1-Akt是否仍然具有多潛能分化潛能，分析了成脂、成軟骨、成骨和血管的成管形成，結果表明UMSC-PD-L1-Akt表現出與未經PD-L1及Akt轉基因轉導的普通UMSCs相似（圖1G）。 實例 2 ：增強 UMSC-PD-L1-Akt 增殖

為了證明增殖效應，以CFSE分析檢測UMSC-PD-L1-Akt的生物學特性。與UMSC相比，UMSC-PD-L1-Akt中觀察到的增殖顯著增加，與UMSC相比，在CFSE分析中觀察到增殖細胞的百分比，並且不影響細胞活性（圖2A）。 實例 3 ：在 H ₂O ₂ 誘導細胞凋亡中提高 UMSC-PD-L1-Akt 存活率

為了探討H ₂O ₂促進細胞存活的機制，我們在體外觀察了H ₂O ₂對UMSC-PD-L1-Akt細胞凋亡的影響。與UMSC-Luc和對照UMSCs相比，UMSC-PD-L1-Akt以劑量依賴性方式（0、1、10、100 µM）對H ₂O ₂誘導的細胞死亡更具抵抗力（圖2B）。與UMSCs相比，給予過氧化氫後，UMSC-PD-L1-Akt中TUNEL ⁺細胞顯著減少（圖2C）。H ₂O ₂處理後，DCF螢光分析的細胞內活性氧（ROS）水準顯示，與UMSCs相比，UMSC-PD-L1-Akt顯著降低（圖2D）。在西方墨點分析中，UMSCs和UMSC-PD-L1-Akt中的Akt水準在H ₂O ₂後30分鐘內被誘導磷酸化（圖2E）。重要的是，磷酸化Akt水準在UMSCs中恢復到接近基礎水準，但在UMSC-PD-L1-Akt中在3小時後仍然顯著升高（圖2E）。 實例 4 ：頸動脈內聯合靜脈注射 UMSC-PD-L1-Akt 、 UMSC-PD-L1-HGF 、 ADSC-PD-L1-Akt 或 BMSC-PD-L1-Akt 後梗塞體積減少

首先證明靜脈注射或頸動脈內注射UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF（IV-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-HGF、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-HGF）與IV-UMSC-Akt、IA-UMSC-Akt、IV-UMSC-HGF、IA-UMSC-HGF、IV-UMSC-PD-L1、IA-UMSC-PD-L1、IV-UMSCs、IA-UMSCs和TTC染色的載具控制組相比，對減少中風後梗塞體積及最大梗塞面積有更好的效果（圖3A-B）。然後，接受合併頸動脈內注射及靜脈注射UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF（IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt或IA-IV-UMSC-PD-L1-HGF）治療的大鼠在腦缺血3天后通過TTC檢查發現輕度梗塞（圖3C）。定量測量顯示，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療組、IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療組、IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療組和對照組大鼠相比，梗塞體積明顯減小（圖3C）。同樣地，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療的大鼠最大梗塞面積小於IA-IV-UMSC-Akt治療、IA-IV-UMSC-PD-L1治療、IA-IV-UMSCs治療和對照動物的面積（圖3C）。此外，進一步確定中風後3天的神經再生效果，與IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-HGF、IV-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-HGF和對照組相比，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt或IA-IV-UMSC-PD-L1-HGF組的梗塞體積和最大梗塞切片明顯減少（圖3D）。同時，在IA-IV-ADSC-PD-L1-Akt、治療或IA-IV-BMSC-PD-L1-Akt治療的大鼠中也觀察到類似的結果（圖3E-F）。 實例 5 ：頸動脈內合併靜脈注射 UMSC-PD-L1-Akt 、 ADSC-PD-L1-Akt 或 BMSC-PD-L1-Akt 可改善腦中風大鼠的神經行為

腦中風模型顯示了IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt的體內神經再生潛能。在大鼠腦中風前後28天，對兩種神經功能缺損測量方法，包含身體不對稱和運動活動，進行評估。首先將大鼠分為4個治療組，即IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和對照組。在身體不對稱試驗中，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療大鼠的恢復情況優於IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和對照組（圖4A）。此外，與IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和對照組相比，IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt大鼠的神經功能缺損也有顯著改善（圖4B）。這些結果表明IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt對中風具有更高的神經再生潛力。一致地，在IA-IV-ADSC-PD-L1-Akt治療或IA-IV-BMSC-PD-L1-Akt治療大鼠中也觀察到類似的結果（圖4C-D）。 實例 6 ： UMSC-PD-L1-Akt 治療減少腦中風後神經死亡

用TUNEL染色法觀察缺血大鼠腦細胞凋亡。沒有中風的對照組動物大腦的任何部分幾乎沒有TUNEL染色。IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療組大鼠缺血核心周圍的半影區含有的TUNEL+細胞少於IA-IV-UMSC、IA-IV-UMSC-Akt、IA-IV-UMSC-PD-L1和對照組（圖4E）。 實例 7 ：腦中風模型中 UMSC-PD-L1-Akt-Luc 靶向性研究

為了證明UMSC-PD-L1-Akt的歸巢效應利用IVIS對UMSC-PD-L1-Akt-Luc在頸動脈內或靜脈內的生物分佈進行了研究。靜脈注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc移植於注射後6小時，最初被困于肺毛細血管中，顯示肺IVIS增強的生物亮度圖像（圖5A）。而在中風後24小時的頸動脈內注射中，UMSC-PD-L1-Akt-Luc的歸巢在6小時到1周以上的時間內確實存活下來並重新定位到中風區域的右大腦半球，而沒有發生肺攝取（圖5B）。在IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt-Luc組，從6小時到一周以上，跟蹤UMSC-PD-L1-Akt-Luc在右半球和肺中的生物分佈（圖5B）。此外，在共聚焦顯微鏡免疫螢光研究中，位於梗塞周圍區域的螢光素酶+細胞顯示與MAP-2的神經元標記物或GFAP的膠質標記物共定位（圖5C）。 實例 8 ： IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt 治療可減少炎症反應，但可增加缺血腦內 CD8 ⁺CD122 ⁺Tregs 的積聚

為了證明UMSC-PD-L1-Akt是否改變了腦中風後白細胞的組成，檢測了白細胞總數的絕對值。如圖6A-1及6A-2所示執行選通策略。UMSC-PD-L1-Akt治療的大鼠缺血半腦中，其白細胞總數（包括CD3 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、CD11b ⁺PD-L1 ⁺巨噬細胞和F4/80 ⁺PD-L1 ⁺小膠質細胞）均顯著增加，而治療組和對照組在兩個半球的細胞總數沒有變化（圖6B）。UMSC-PD-L1-Akt治療腦中風大鼠可顯著降低缺血半球的活化CD11b ⁺腫瘤壞死激素-α（TNF-α）、CD11b ⁺INF-γ ⁺、CD3 ⁺TNF-α ⁺和CD3 ⁺INF-γ ⁺細胞的百分比（圖6C），從而提高缺血半球總CD8 ⁺、CD8 ⁺CD122 ⁺IL-10 ⁺Treg細胞和CD19 ⁺IL-10 ⁺Breg細胞的百分比（圖6D-2），白細胞介素-10的產量相應增加。抗PD-L1單抗治療MCAO小鼠對CNS浸潤的CD4 ⁺T細胞無影響，但觀察到CD5 ⁺CD1dhi-CD19 ⁺Breg細胞減少。 實例 9 ： IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt 治療增加中風後脾臟 T 細胞調節分子的表達

為評價UMSC-PD-L1-Akt治療後的外周免疫功能，對腦中風動物脾臟進行流式細胞術分析。中風後4小時用UMSC-PD-L1-Akt治療，可顯著抑制96小時中風後所評估的脾臟CD19 ⁺B細胞、CD4 ⁺和CD8 ⁺T細胞、CD11b ⁺單核細胞/巨噬細胞和CD11c ⁺樹突狀細胞（dc）上PD-L1的表達（圖7A-4）。相反地，UMSC-PD-L1-Akt顯著降低脾臟中活化的CD3 ⁺TNF-α ⁺和CD3 ⁺INF-γ ⁺炎性細胞的百分比（圖7B）。此外，在UMSC-PD-L1-Akt治療的中風小鼠中，觀察到脾臟中CD8 ⁺CD122 ⁺Tregs和CD19 ⁺IL-10 ⁺Bregs的百分比增加（圖7C）。在UMSC-PD-L1-Akt治療後，Foxp3 ⁺CD4 ⁺CD25 ⁺Tregs的頻率沒有變化。 實例 10 ：通過頸內組合靜脈注射 UMSC-PD-L1-Akt 、 UMSC-PD-L1-HGF 、 ADSC-PD-L1-Akt 或 BMSC-PD-L1-Akt ，緩解 MI 後的左心室功能障礙，縮小 MI 後的梗塞面積

為了驗證靜脈注射（IV）或動脈內（IA）UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF（IV-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-HGF、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-HGF、IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt或IV-IA-UMSC-PD-L1-HGF）在搶救心肌缺血損傷中的重要作用，檢測了AMI模型中的梗塞面積。在心肌梗塞後28天，IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt治療組或IV-IA-UMSC-PD-L1-HGF治療組的梗塞體積遠小於IV-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-HGF、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-HGF和對照組的梗塞體積（圖8A）。此外，與對照組相比，IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt治療組或IV-IA-UMSC-PD-L1-HGF治療組梗塞壁厚度增加（圖8B）。同時，在IV-IA-ADSC-PD-L1-Akt治療或IV-IA-BMSC-PD-L1-Akt治療的大鼠中也觀察到類似的結果（圖8C-D）。 實例 11 ： UMSC-PD-L1-Akt 對缺血心肌的抗炎作用

為了觀察UMSC-Akt-PD-L1治療是否抑制了MI後的炎症反應，對MI後3天的炎性細胞浸潤進行了免疫組化分析。與IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt和對照組相比，IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt治療組的炎症明顯減輕（圖9A）。與IV-UMSC-PD-L1-Akt組和對照組相比，IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt治療組和對照組在梗塞後3天的梗塞周圍區域的CD68+細胞浸潤明顯減少（圖9B）。 實例 12 ： UMSC-PD-L1-Akt 治療可減輕 MI 誘導的纖維化

與假手術相比，心肌梗塞後28天，三色染色切片觀察到左室纖維化顯著增加（圖9C）。有趣的是，與IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt和對照組相比，我們觀察到IV-IA-UMSC-PD-L1-Akt治療後心肌梗塞後纖維化明顯減輕（圖9C）。 實例 13 ：急性心肌梗塞模型中 UMSC-PD-L1-Akt-Luc 靶向性研究

為了證明UMSC-PD-L1-Akt的歸巢效應，利用IVIS對UMSC-PD-L1-Akt-Luc在頸動脈內或靜脈內的生物分佈進行了研究。靜脈注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc移植於注射後6小時開始初步被困于肺毛細血管中，顯示肺IVIS增強的生物亮度圖像（圖10）。而在心肌梗塞後24小時的頸動脈內注射中，UMSC-Akt-PD-L1-Luc的歸巢在6小時到1周以上的時間內確實存活下來並轉移到心臟區域而無肺攝取（圖10）。

雖然已經結合上述具體實施例描述了本揭示，但對於本領域具通常知識者來說，其許多替代方案及其修改和變化將是顯而易見的。所有這些替代方案、修改和變型都被視為屬於本揭示的範圍。

圖1A展示本揭示臍帶間充質幹細胞（UMSCs）原代培養物細胞形態觀察結果圖。

圖1B展示本揭示臍帶間充質幹細胞原代培養物經流式細胞術分析生物學特性結果圖。

圖1C展示用流式細胞儀檢測UMSC-PD-L1-Akt的RFP螢光和PD-L1的表達水準。

圖1D展示用西方墨點法檢測UMSC-PD-L1-Akt的Akt的表達水準。

圖1E為UMSC-Akt-PD-L1和普通UMSC的脂肪發生、軟骨發生、成骨和血管管形成的顯微觀察結果。

圖2A展示UMSC-PD-L1-Akt及普通UMSCs經CFSE染色檢測增殖結果圖。

圖2B展示H ₂O ₂對UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Luc和UMSCs處理的細胞存活率結果。

圖2C展示H ₂O ₂對UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Luc和UMSCs處理，TUNEL+的細胞比例結果圖。

圖2D展示H ₂O ₂對UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Luc和UMSCs處理，DCF螢光分析的細胞內活性氧水準結果圖。

圖2E展示H ₂O ₂對UMSC-PD-L1-Akt、UMSC-Luc和UMSCs處理，在西方墨點分析Akt磷酸化結果圖。

圖3A展示靜脈內注射IgG、UMSCs、UMSC-Akt、UMSC-HGF、UMSC-PD-L1、UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HSF在中風後梗塞區功能變數結果圖。

圖3B展示頸動脈內注射IgG、UMSCs、UMSC-Akt、UMSC-HGF、UMSC-PD-L1、UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HSF在中風後梗塞區功能變數結果圖。

圖3C展示合併靜脈及頸動脈內注射IgG、UMSCs、UMSC-Akt、UMSC-PD-L1或UMSC-PD-L1-Akt中風後梗塞區功能變數結果圖。

圖3D展示靜脈內（IV）、頸動脈內（IA）及合併靜脈與頸動脈內（IV+IA）注射UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-Akt和對照組，中風後梗塞區功能變數結果圖。

圖3E展示靜脈內（IV）、頸動脈內（IA）及合併靜脈與頸動脈內（IV+IA）注射ADSC-PD-L1-Akt和對照組，中風後梗塞區功能變數結果圖。

圖3F展示靜脈內（IV）、頸動脈內（IA）及合併靜脈與頸動脈內（IV+IA）注射BMSC-PD-L1-Akt和對照組，中風後梗塞區功能變數結果圖。

圖4A展示在身體擺動試驗中，以IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和對照組處理大鼠的結果圖。

圖4B展示在垂直運動試驗中，以IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-UMSC-PD-L1-Akt、IV-UMSC-PD-L1-Akt和對照組處理大鼠的結果圖。

圖4C展示在垂直運動試驗中，以IA-IV-ADSC-PD-L1-Akt、IA-ADSC-PD-L1-Akt、IV-ADSC-PD-L1-Akt和對照組處理大鼠的結果圖。

圖4D展示在垂直運動試驗中，以IA-IV-BMSC-PD-L1-Akt、IA-BMSC-PD-L1-Akt、IV-BMSC-PD-L1-Akt和對照組處理大鼠的結果圖。

圖4E展示以IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt、IA-IV-UMSCAkt、IA-IV-UMSC-PD-L1和對照組處理大鼠的神經細胞死亡結果圖。

圖5A展示靜脈、頸動脈內及合併靜脈與頸動脈內注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc的生物分佈IVIS結果圖。

圖5B展示頸動脈內及合併靜脈與頸動脈內注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc後不同時間的生物分佈IVIS結果圖。

圖5C展示合併靜脈與頸動脈內注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc的共聚焦顯微鏡免疫螢光結果圖。

圖6A-1及6A-2展示經IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析大腦半球炎性細胞的選通策略圖。

圖6B展示經IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析大腦半球的CD3 ⁺T細胞、CD4 ⁺T細胞、CD11b ⁺PD-L1 ⁺巨噬細胞和F4/80+PD-L1+小膠質細胞結果圖。

圖6C展示經IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析大腦半球的CD11b ⁺TNF-α ⁺、CD3 ⁺TNF-α ⁺和CD3 ⁺INF-γ ⁺細胞結果圖。

圖6D-1展示經IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析大腦半球炎性細胞的選通策略圖。

圖6D-2展示經IA-IV-UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析大腦半球的CD8 ⁺、CD8 ⁺CD122 ⁺、CD8 ⁺CD122 ⁺IL-10 ⁺和CD19 ⁺IL-10 ⁺細胞結果圖。

圖7A-1至7A-3展示經UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析脾臟細胞的選通策略圖。

圖7A-4展示經UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析脾臟細胞的CD11b ⁺PD-L1 ⁺、CD11c ⁺PD-L1 ⁺、CD19 ⁺PD-L1 ⁺、CD4 ⁺PD-L1 ⁺和CD8 ⁺PD-L1 ⁺細胞結果圖。

圖7B展示經UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析脾臟細胞的CD3 ⁺TNF-α ⁺、CD3 ⁺INF-γ ⁺細胞結果圖。

圖7C展示經UMSC-PD-L1-Akt治療，經流式細胞術分析脾臟細胞的CD8 ⁺CD122 ⁺和CD19 ⁺IL-10 ⁺細胞結果圖。

圖8A展示經靜脈注射（IV）或動脈內（IA）或合併靜脈與動脈內（IV+IA）注射UMSC-PD-L1-Akt細胞在AMI模型中的梗塞面積的結果圖。

圖8B展示經靜脈注射（IV）或動脈內（IA）或合併靜脈與動脈內（IV+IA）注射UMSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF細胞在AMI模型中的梗塞壁厚度結果圖。

圖8C展示經靜脈注射（IV）或動脈內（IA）或合併靜脈與動脈內（IV+IA）注射ADSC-PD-L1-Akt或UMSC-PD-L1-HGF細胞在AMI模型中的梗塞面積及死壁厚度結果圖。

圖8D展示經靜脈注射（IV）或動脈內（IA）或合併靜脈與動脈內（IV+IA）注射BMSC-PD-L1-Akt細胞在AMI模型中的梗塞面積及死壁厚度結果圖。

圖9A展示經靜脈注射（IV）或動脈內（IA）或合併靜脈與動脈內（IV+IA）注射UMSC-Akt-PD-L1，對MI後3天的發炎指數結果圖。

圖9B展示經靜脈注射（IV）或動脈內（IA）或合併靜脈與動脈內（IV+IA）注射UMSC-Akt-PD-L1，對MI後3天的CD68+細胞浸潤結果圖。

圖9C展示經靜脈注射（IV）或動脈內（IA）或合併靜脈與動脈內（IV+IA）注射UMSC-Akt-PD-L1，心肌梗塞後28天，三色染色切片的左室纖維結果圖。

圖10展示頸動脈及靜脈注射UMSC-PD-L1-Akt-Luc後不同時間的生物分佈IVIS結果圖。

Claims (21)

1. 一種基因工程間充質幹細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)群，其中該MSCs包含一個生存基因和一個免疫檢查點基因，其中該MSCs是以Akt或肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)基因和PD-L1基因進行基因工程。
2. 如請求項1的基因工程MSCs群，其中該MSCs是臍帶間充質幹細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs)、脂肪衍生間充質幹細胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)或骨髓間充質幹細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)。
3. 如請求項1或2的基因工程MSCs群，其中該生存基因和免疫檢查點基因係包含在一個載體中。
4. 如請求項3的基因工程MSCs群，其中該載體是慢病毒載體。
5. 一種醫藥組合物，包含如請求項1至4中任一項的基因工程MSCs群。
6. 一種協同增加MSCs的生存狀態和免疫調節能力或增強MSCs增殖的方法，包括以協同有效量之Akt或HGF基因和PD-L1基因轉染MSC。
7. 如請求項6的方法，其中該MSC是UMSC、ADSC或BMSC。
8. 一種如請求項1至5中任一項的基因工程MSCs群之用途，其係用於製造用於預防、改善和/或治療缺血狀況、增強神經再生或減少神經元死亡的藥劑，其中該藥劑為將有效量的基因工程MSCs群施用於需要之個體。
9. 如請求項8的用途，其中該MSC是UMSC、ADSC或BMSC。
10. 如請求項8的用途，其中該有效量範圍為約1×10⁵個細胞至約1×10⁸個細胞。
11. 如請求項8的用途，其中該施用降低炎症反應，但增強了缺血組織中CD8⁺CD122⁺ Tregs的積累。
12. 如請求項8的用途，其中該缺血組織是缺血的腦組織。
13. 如請求項8的用途，其中該施用增加了該個體中T細胞上調節分子的表達。
14. 如請求項8的用途，其中該缺血狀況是中風。
15. 如請求項8的用途，其中該缺血狀況是心肌梗塞(myocardial infarction，MI)。
16. 如請求項15的用途，其中該MI是急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)。
17. 如請求項8的用途，其中該施用是靜脈注射、頸動脈內注射、動脈內注射或其組合。
18. 如請求項8的用途，其中該施用是頸動脈內注射結合靜脈注射或動脈內注射結合靜脈注射。
19. 如請求項8的用途，其中在患有中風或AMI的個體中，該施用是頸動脈內注射結合靜脈注射或動脈內注射結合靜脈注射相。
20. 如請求項19的用途，其中該施用的有效量為頸動脈內注射約1×10⁴細胞至約1×10⁶細胞，靜脈注射約3×10⁴細胞至約1×10⁷細胞。
21. 如請求項8的用途，其中該施用可減輕MI-誘導的纖維化、減少缺血組織上的炎症、減輕MI後的功能障礙和減少MI後的梗塞大小、增加中風後脾臟中T細胞上調節分子的表達、或減少中風腦損傷的神經元死亡。

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