JP2014012702A - 虚血障害の治療方法 - Google Patents
虚血障害の治療方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014012702A JP2014012702A JP2013173875A JP2013173875A JP2014012702A JP 2014012702 A JP2014012702 A JP 2014012702A JP 2013173875 A JP2013173875 A JP 2013173875A JP 2013173875 A JP2013173875 A JP 2013173875A JP 2014012702 A JP2014012702 A JP 2014012702A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sdf
- cells
- tissue
- mcp
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/195—Chemokines, e.g. RANTES
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【解決手段】ストローマ細胞由来因子−1(SDF−1)を、アポトーシス細胞のアポトーシスを阻害するのに有効な量で、前記被験体の虚血組織のSDF−1受容体を発現する前記アポトーシス細胞に投与する。
【選択図】なし
Description
本出願は、2007年3月30日付けで出願した米国仮出願第60/921,044号に基づく優先権を主張する。この文献の主題を本明細書に援用する。
==間葉系幹細胞によりSDF−1を発現させることにより、心筋梗塞後に、心筋細胞が栄養作用により支持される==
前臨床試験および臨床試験において、心筋梗塞の時に、複数のタイプの幹細胞を移植すると、左室の血流および/または機能が改善することが明らかにされている。この方法は、うっ血性心不全(米国人500万人以上が罹患している症状)を予防し治療できる大きな可能性があるとはいえ、この改善の背後に潜むメカニズムは解明されていない。一つの可能性としては、移植された幹細胞が、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞に分化することにより、心筋組織を再生するということである。さらに、検討不足ではあるが、もうひとつの可能性としては、急性心筋梗塞(AMI)時に、幹細胞が心筋に導入されると、未だに不明確な栄養作用によって損傷した組織を支持し、その結果、心筋細胞が保存され、心臓機能が改善される、ということが考えられる。幹細胞の栄養作用が、改善されつつある心臓組織において重要であることが証明されれば、本発明者らは、細胞に基く遺伝子治療戦略によりその作用を激化させる能力を有する。本発明者らは近年、MI直後に、心臓によってストローマ細胞由来因子−1(SDF−1またはCXCL12)が発現され、しかも、MIから一定の期間が経過した後に、SDF−1の発現が再確立され、それにより、損傷した心臓組織への幹細胞のホーミングが再確立され得ることを証明した。CXCR4は、SDF−1の細胞表面受容体であり、初期の造血幹細胞(HSC)および内皮前駆細胞上に発現する。残念ながら、最新のデータでは、これらの細胞タイプが心筋細胞に分化しないことが示されている。SDF−1の発現は、HSCおよび内皮前駆細胞の損傷した心筋へのホーミングを引き起こすが、その一方で、SDF−1は、幹細胞の生存率の増加を含む付加的な非幹細胞動員効果を有し得ることが示唆される。近年、SDF−1は、CXCR4を発現しているMSCにおいて、成長を促し生存期間を延長させる効果をもつことが示された。MSCは通常SDF−1を発現する。したがって、本発明者らは、SDF−1を介する間葉系幹細胞の注入の栄養作用について解明すべく、SDF−1を過剰発現させたMSCを生成した。次いで、生理食塩水、MSC、およびSDF−1を過剰発現するMSCが、MSCの生存、心筋細胞の生存と再生、および心機能に与える効果を比較した。その結果、SDF−1の非幹細胞ホーミング栄養作用が損傷した心筋に与える重要な役割が示された。
LAD結紮:
すべての動物プロトコールが動物研究委員会により承認され、動物はすべてクリーブランドクリニック財団の国際実験動物管理公認協会実験動物施設で飼育した。既に説明した通り、ルイスラットの左冠動脈前下行枝の結紮を行なった。簡潔に述べると、動物に対して、ケタミンとキシラジンの腹腔内投与により麻酔をして、挿管し、圧力サイクル式げっ歯動物用ベンチレーター(ケント・サイエンティフィック社RSP1002、トリントン、コネチカット州)を用いて、室内空気にて75回/分で人工呼吸した。外科用手術顕微鏡(M500、Leica(登録商標)、マイクロシステムズ社、バノックバーン、イリノイ州)を補助的に用いて、左冠動脈前下行枝(LAD)を直接結紮し、前壁心筋梗塞を誘導した。
ラットの骨髄は、0.6mlのDMEM(GIBCO、インビトロゲン社、カールスバード、カリフォルニア州)で大腿骨を洗い流すことにより単離した。20Gの針を用いて、骨髄の塊を穏やかに細分化した。Percoll密度勾配によって細胞を分離した。細胞を260gで10分間遠心分離し、100U/mlペニシリンおよび100g/mlストレプトマイシン(インビトロゲン社、カールスバード、カリフォルニア州)を含有するPBSで、3回交換しながら洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、10%FBSならびに1%抗生物質および抗真菌剤(GIBCO、インビトロゲン社、カールスバード、カリフォルニア州)を含有する低グルコースDMEM(GIBCO、インビトロゲン社、カールスバード、カリフォルニア州)に再懸濁しプレーティングした。これらの細胞を37℃でインキュベートした。3日後に培地を交換することにより、接着していない細胞を除去した。培養物は3〜4日ごとに再培養した。培養物が70%コンフルエンスに達すると、接着していた細胞を、5分間0.05%トリプシンおよび2mM EDTA(INVITROGEN、カールスバード、カリフォルニア州)にてインキュベートした後、剥がし、続いて、継代した。先行の実験では、MSC培養物から、細胞106個あたりPE結合マウス抗ラットCD45一次抗体(販売元:BDバイオサイエンス、サンディエゴ、カリフォルニア州)およびCD34抗体(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア州)を10μlずつ用いて、ネガティブセレクションにより、CD45+細胞およびCD34+細胞を除去した。単球およびマクロファージの非特異的セレクションを予防するため、メーカー(ステムセル・テクノロジーズ社)の使用説明書に従い、EasySep PEセレクションキットを用いて、PE陽性細胞をネガティブセレクションした。コンフルエントに達した細胞を継代し、第11代まで2倍〜3倍希釈でプレーティングした。記載の通り、細胞が、脂肪生成系譜、軟骨形成系譜、および骨形成系譜へ誘導される能力をアッセイした。細胞を、2〜3週間分化培地で維持した。分化は、オイルレッド(脂肪生成系譜)、アルシアンブルー(軟骨形成系譜)またはアルカリフォスファターゼ(骨形成系譜)で細胞を染色することにより確認した。200mlのPBSで回収した200万個の標識した細胞(心繊維芽細胞、MSC、またはSDF−1発現MSC)または200mlのPBSのみを、心筋梗塞24時間後に尾静脈から注入した。
細胞移植「より前の」in vitroでのMSC:
MSC(第6継代)に、ラットSDF−1発現ベクターまたはpcDNA3.1(コントロールベクター)を、安定に導入した。注入3日前に、細胞を、1:3の割合で新たにプレーティングし、細胞移植のための回収「より前の」48時間中に、S期の細胞周期にあるこれらの細胞を標識するために、10μM BrdU(5−ブロモ−2−デオキシウリジン)を含有する完全培地中でインキュベートした。
増殖細胞をin vivoで標識した研究では、細胞移植の2日後から14日間に12時間ごとにBrdU(50mg/kg)を腹腔内注入した。
本発明者らは、EGFPまたはSDF−1を発現するVSVG シュードタイプレンチウイルスを使用した。このレンチウイルスは、クリーブランドクリニックファウンデーションのウイルスコア施設によって4つのプラスミドベクター系を使用して作製された。MSCに、感染多重度(MOI)30で、8μg/mlのポリプレンの存在下で精製したレンチウイルスを8時間にわたり2度形質導入した。培地はトランスフェクション72時間後に交換し、ゼオシン(EGFP)またはゼオシンとブラストサイジン(hSDFlとEGFP)とを含む標準培地と交換した。したがって、ゼオシンおよび/またはブラストサイジン耐性遺伝子を含むウィルスゲノムを組込んだ細胞だけが生存した。
600万個の細胞からRNAを単離した後、Rneasy Mini Kit(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)を使用し、メーカーの使用説明書に従ってRT−PCRを行った。ABI Prism 7700 sequence detector (アプライド・バイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州)を使用し、定量的リアルタイムPCRを行った。反応液にはSYBR Green PCR master mix(アプライド・バイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州)、300nMの各プライマー、および10μlのcDNAが含まれていた。95℃で10分間AmpliTaq Gold(アプライド・バイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州)を活性化した後、95℃で15秒間、60℃で1分間を1サイクルとして、45サイクルを行った。各増幅の解離曲線を解析し、非特異的なPCR産物がなかったことを確認した。CXCR4プライマー配列:フォーワード:ATCATCTCCAAGCTGTCACACTCC(配列番号8);リバース:GTGATGGAGATCCACTTGTGCAC(配列番号9)。
動物を、心筋梗塞96時間後または5週間後に屠殺した。確立しているプロトコールに従い、組織をホルマリンで固定し、パラフィンブロックで包埋した。10mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH 6.0)を用いて、95℃で5分間加熱して、抗原回復を行った。バッファーは新鮮なバッファーと交換してさらに5分間再加熱し、次いで、約20分間冷却した。次いで、スライドを2分間脱イオン水で3回洗浄した。次いで、非特異的なIgGの結合を抑制するため、標本を1% ブロッキング用正常血清を含むPBSで60分間インキュベートした。次いで、スライドを、マウス抗BrdU一次抗体(BDバイオサイエンシーズ社、サンホセ、カリフォルニア州)とともに60分間インキュベートした。最適な抗体濃度は滴定によって決定した。次いで、スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した後、ブロッキング用正常血清を含むPBSで1.5μg/mlに希釈し暗室でインキュベートした、FITC結合二次抗体(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア州)とともに、45分間インキュベートした。PBSでよく洗浄した後に、水溶性封入剤(Vectashield Mounting Medium with DAPI,H−1200;ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州)を用いてカバーガラスで封入した。
青色のアルゴンレーザー(DAPI用)、緑色のアルゴンレーザー(Alexa Fluor 488用)、および赤色のクリプトンレーザー(Alexa Fluor 594)を備えた正立型共焦点レーザー走査顕微鏡(モデルTCS−SP;ライカマイクロシステムズ、ハイデルベルク、ドイツ)を用いて、組織を解析した。データは、「ブリードスルー」を最小限に留めるため、連続励起により収集した。画像処理、解析、および共局在化の程度を、Leica Confocal Softwareを使用して評価した。光学切片は、4フレーム間の平均値を取り、画像サイズは1024×1024ピクセルに設定した。画像のデジタル調節はしなかった。
トリプシン/EDTA消化により、MSC培養物を調製した。氷冷(1X)D−PBSで細胞を2回洗浄。次いで、細胞を1X106個/mlの濃度で、1X binding buffer (10mM HEPES、140mM NaCl、2.5mM CaC12、pH 7.4)に再懸濁する。細胞100μL(1X105)を5ml試験管へトランスファーする。次いで、単一細胞懸濁液を、1μLのアネキシンV−PE−Cy5(アビーム社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)または5μLのヨウ化プロピジウム(PI)(BDバイオサイエンシーズ、サンディエゴ、カリフォルニア州)またはアイソタイプ一致コントロール抗体のいずれかと共にインキュベートする。細胞を軽くボルテックスし、15分間室温で暗所でインキュベートする。400mLの1X binding bufferを各試験管に加え、サンプルデータをGuava EasyCyte フローサイトメーター(グアバテクノロジーズ、ヘイワード、カリフォルニア州)を用いて得た。1時間以内にFlowJo(トリースター社、アシュランド、オレゴン州)フローサイトメトリー解析プログラムにより解析した。
アポトーシスの核を検出するためのTUNEL法を、メーカーのプロトコール(ロッシュ、インディアナポリス、インディアナ州)に従い、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を媒介としてイン・シトゥでフルオレセインコンジュゲートdUTPをニックエンドラベルして実施した。特異的にアポトーシス心筋細胞を認識するため、切片を再度、心臓の心室ミオシン重鎖α/βを認識するマウスモノクローナル抗体(ケミコンインターナショナル社)とともにインキュベートした。蛍光染色を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。アポトーシス細胞数をカウントし、全心筋細胞集団に対する割合として表した。
細胞抽出液を、4×reducing Laemmli Buffer(200mM Tris HCl (pH 6.8)、8%SDS、0.1%ブロモフェノールブルー、40%グリセロール)で調製した。確立されたプロトコールに従い、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)ゲルを調製した。タンパク質を10%SDSポリアクリルアミドゲル中で分離した。ブロッティング膜を5%スキムミルク含有1×TBST(トリス塩基−2.42g、NaCl−8g、1M HCl−3.8mL(pHを7.5に調整)、水−1L、Tween 20−2mL)に1時間浸し、次いで、リン酸化Akt(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア州)に対する一次抗体(1×TBSTで1:5000に希釈)でプローブし、その後、ペルオキシダーゼ結合抗マウス二次抗体(5%スキムミルク含有1×TBSTで1:5000に希釈)とともにインキュベートした。可視化には、化学発光(アマシャム・バイオサイエンス社UK、バッキンガムシャー、英国)を用いた。
マウス抗心室ミオシン重鎖アルファ/ベータモノクローナル抗体(ケミコンインターナショナル社)、マウスモノクローナル抗アルファ筋節アクチンIgM(シグマ)、マウス抗トロポニンIモノクローナルIgG2b抗体(ケミコンインターナショナル社)、ウサギ抗GATA 4ポリクローナルIgG抗体(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社)、ヤギ・ポリクローナル抗−Nkx−2.5 IgG抗体(サンタクルーズバイオテクノロジー社)、ウサギ・ポリクローナル抗−MEF−2 IgG抗体(サンタクルーズバイオテクノロジー社)、マウスモノクローナル抗−α−平滑筋アクチン−Cy3結合抗体(シグマ)、ウサギポリクローナル抗ヒトvon willebrand因子、ウサギ抗コネクシン−43ポリクローナルIgG抗体(サンタクルーズバイオテクノロジー社)、ウサギ抗コネクシン45ポリクローナルIgG抗体(サンタクルーズバイオテクノロジー社)、ヤギポリクローナル抗コネクシン−40 IgG抗体(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社)、マウスIgGlモノクローナル抗Akt1抗体(セルシグナリングテクノロジー社)、マウス・モノクローナル抗−Phospho−Akt(ser473) IgG2b抗体(セルシグナリングテクノロジー社)、ウサギポリクローナル抗CXCR4 IgG(Abcam)、ラットモノクローナル抗−BrdU−FITC結合抗体(Abcam)。
ヤギ抗マウスIgGAlexa Fluor 488(モレキュラープローブズ社)、ヤギ抗マウスIgGAlexa Fluor 488(モレキュラープローブズ社)、ロバ抗ウサギIgGAlexa Fluor 488(モレキュラープローブズ社)、ロバ抗ウサギIgGAlexa Fluor 488(モレキュラープローブズ社)、ヤギポリクローナルIgG抗フルオレセイン抗体(モレキュラープローブズ社)、ロバ抗ヤギIgGAlexa Fluor 488(モレキュラープローブズ社)、ロバ抗ヤギIgG抗体Alexa Fluor 488(モレキュラープローブズ社)、ヤギ抗マウスIgMAlexa Fluor 488(モレキュラープローブズ社)
すでに記載した通り、Sequoia C256およびGE Vision 7と接続した15MHzのリニアアレイトランスデューサを用いて、LAD結紮およびMSC移植後の2週目および5週目に、2次元断層心エコー法を行った。左室径および左室壁厚を定量化するため、本発明者らは、乳頭筋直下左室中心部からの2次元クリップ画像およびMモード画像を短軸断面でデジタル記録し、異なるラットの同じ解剖学的位置からの計測値が一致するようにした。超音波検査技師は、どちらが治療群かについて盲検化されていた。計測は独立した2名の盲検化された観察者がProSolve心エコー検査用ソフトウェアを用いてオフラインにて行った。治療群について盲検化された観察者が、記録された5枚のMモードクリップ画像のうち無作為に3枚を選び、動物各個体において、測定をそれぞれ6回ずつ行った。短縮率をMモード記録から算出した。短縮率(%)=(LVEDD−LVESD)/LVEDD×100(ここで、LVEDDは左室拡張末期径を、LVESDは左室収縮末期径を表す)。
データは平均値±標準偏差として示す。群間の比較は、独立スチューデントt検定(血管密度)またはボンフェローニ補正(心エコー検査のデータおよび細胞移植のデータ)を伴う分散分析により適宜行った。
改変したMSCの特性評価:
本発明者らは、CMVプロモーターにより機能するSDF−1発現ベクターを安定に導入したMSCを作製した。我々の研究において使用したMSCは、RTPCR、ウェスタンブロッティング法(図1a)および免疫組織化学(図1b)によって、CXCR4を発現した。我々の研究で使用した、安定的にトランスフェクトしたMSC集団は、コントロール構築物をトランスフェクトしたMSCの5.29±1.25倍のSDF−1 mRNAを発現した。SDF−1発現ベクターをトランスフェクトしても、CXCR4の発現に変化(0.81±0.24、SDF−1およびコントロールMSCのCXCR4 mRNA発現と比較して)はなかった。24時間の培養中、SDF−1を過剰発現しているMSCは、SDF−1を、コントロールベクター(図1c)をトランスフェクトしたMSCより多量に培地中に分泌した。平行して行った心繊維芽細胞の培養では、SDF−1の有意な放出は観察されなかった。前駆細胞において観察されたように、SDF−1を過剰発現したMSCでは、リン酸化Aktがコントロール細胞(図1d)より増大しており、これは、SDF−1が生存促進シグナル伝達のアップレギュレーションを誘導することと整合性がある。
Aktのリン酸化の増加がMSC生存を改善するかを判断するため、本発明者らは、低酸素性条件(1%酸素)下で、コントロールとSDF−1:MSCとを培養し、FACSを用いて細胞障害の痕跡を定量化した。図2aの中のデータは、低酸素性条件下で増殖させたMSCの25%超がアネキシンVを発現することを、SDF−1を過剰発現するMSCでは10%未満であることと比較して示すものである。細胞死のマーカーであるヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合を定量化した際も、同様の結果が認められた(データは示さず)。本発明者らは、心筋梗塞後に、同様の結果がin vivoで観察されるかどうかを調べた。直接のLAD結紮により急性前壁心筋梗塞を誘導し、24時間後に、空のプラスミドを安定に導入した200万個の同系心繊維芽細胞、または空のプラスミドもしくはSDF−1をコードするプラスミドを安定に導入した200万個の同系MSCを、尾静脈注射により注入した。細胞のDNAを標識するため、回収より前に、BrdUを2日間細胞の培地に加えた。コントロールラットには、生理食塩水を静脈注射により投与した。心繊維芽細胞(CF)、コントロールのもしくはSDF−1を発現するMSC、または生食水の注入による処置から72時間後および5週間後、動物を屠殺し、心臓を採取した。心臓内に注入されたCFおよびMSCの存在を、面積あたりのBrdU陽性細胞数として定量化した。いずれの時点でも、心臓中のMSC数がSDF−1の過剰発現(図2b)により有意に増加したことが明らかにされた。ただし、処置72時間後(図2c)と比較して、5週間後の方が、増加は優位に小さかった。注入した心繊維芽細胞の有意なホーミングまたは生着の証拠は観察されなかった(4日目:3.6±2.7個/mm2、および5週目:2.9±2.1個/mm2)。
図3a(24h)は、AMIの24時間後という早期に、梗塞域のCXCR4の発現が増加することを示すものである。これらの細胞は心筋細胞ではない。どちらかと言えば、これらのCXCR4陽性細胞は白血球および内皮細胞である。図3a(24−48h)は、梗塞境界域の心筋細胞がAMIの48時間後という早期にCXCR4を発現し始め、梗塞境界域の心筋細胞のCXCR4発現量が、AMIの96時間後まで増加し続けることを示している。SDF−1を発現するMSCの注入により、梗塞域内でSDF−1を過剰発現させた結果、梗塞境界において心筋細胞のAktリン酸化レベルが亢進した(データは示さず)。このAktリン酸化の亢進に伴い、TUNEL陽性心筋細胞核数が有意に減少した(図3b、c、およびd)。SDF−1発現MSCを投与した動物における心筋細胞アポトーシスの減少に伴い、生理食塩水コントロール(図3eおよびf)と比較して、梗塞域内に生存する束状の心筋細胞の面積に有意な増加がみられた。この時点の梗塞域内の心筋細胞は、BrdU陽性ではなかったため、生着したMSCから再生したものではなかった。どちらかと言えば、それらは、虚血の発作後も生存した天然の心筋細胞であると考えられた。
本発明者らは、LAD結紮1日後に生理食塩水、心繊維芽細胞、または、コントロールのもしくはSDF−1を過剰発現させたMSCを注入した動物における、LAD結紮14日および35日後の左室機能および左室径を定量化した。生理食塩水コントロールと比較して、MSC注入による、統計的に有意な左室拡張の減衰および短縮率の改善が明らかにされた(それぞれ、図4aおよびb)。MSCコントロールおよびSDF−1発現MSCで処置した動物では、短縮率は、生理食塩水コントロールと比較して、それぞれ、71%および238%有意に増加した。生理食塩水注入と心繊維芽細胞注入との間には、有意差は認められなかった。
図3のデータは、MSC、および(より顕著に)SDF−1発現MSCが、梗塞域内の心筋細胞の面積および数を増加させることを示している。図1〜3のデータは、この増加が心臓による保存に起因するという考え方を支持するが、本発明者らは、注入したMSCまたは内因性の心臓幹細胞のいずれかが、どの程度心筋細胞の再生に寄与しているかを明らかにしたいと考えた。生着したMSCの運命を調べるため、本発明者らは、心筋細胞マーカー(心筋ミオシン、トロポニンI、GAT A4、およびコネキシン43)、平滑筋細胞マーカー(SMCα−アクチンおよびコネキシン45)、ならびに内皮細胞マーカー(フォン−ウィルブランド因子およびコネキシン40)について、心筋組織の切片を染色した。心筋に生着したBrdUまたはGFP標識細胞がα−アクチン陽性であることが確認された(図5a)。BrdUまたはGFP陽性であって、vWF陽性である細胞は全く存在せず、心筋ミオシン陽性である細胞も殆ど存在しなかった(<2%)。このことから、SDF−1をトランスフェクトしてもしなくても、MSCは、分化しないか(培養物中では、MSCはSMCα−アクチンである。データは示さず)、あるいは平滑筋細胞に分化するかのどちらかであろうということが示唆された。
AMI後の、幹細胞に基く治療の目標は、(i)心筋細胞の細胞死を最小限にし、(ii)LVリモデリングを最適化し、(iii)血管と心筋細胞を含む心筋の構造を再生することである。近年の研究では、梗塞後間もない心筋中に幹細胞を生着させると、心機能の改善につながる可能性があることが示唆されている。このことが、障害された心筋と置換される内在的に蓄えられた心臓幹細胞により誘導されるのか、障害された心筋へホーミングする骨髄由来の幹細胞により誘導されるのか、あるいはMI後静脈内注入された外因性の細胞より誘導されるのか、明確にはわかっていない。さらに、造血幹細胞の心筋細胞への分化転換能について、議論が続いている。だだ、最近の研究結果を考慮すると、その可能性はきわめて低いと思われる。このような不確実性があるとはいえ、様々な源から様々なタイプの幹細胞タイプを導入することにより、心機能の改善につながることがあり得るのは明らかである。これらの所見は結局のところ、臨床的には非能率的ではあるが、自然に発生する心臓修復系が、探求が可能なある基本的なレベルで存在しているのではないか、ということを示唆している。
本発明者らの研究の目標は、SDF−1が修復過程において担う、潜在的な役割を明らかにし、かつ、梗塞期間の直近において過剰発現するSDF−1が、左室機能の改善をもたらすかを調べることであった。
本発明者らの研究における細胞送達経路は、尾静脈からの注入であった。他の研究においては、骨髄からの動員、カテーテルを用いる冠状動脈内注入、および心筋内注入などの理想的な細胞送達経路を明確化しようと努力が払われてきた。カテーテルを使用する冠状動脈内注入により、イヌの左回旋枝中にMSCを送達した結果、微小梗塞が起こったが、これは、心予備力がきわめて小さい患者にとってはかなり耐え難いと思われる。われわれの研究結果は、単純な静脈注入が、きわめて有効であり、同時に、損傷間もない心筋に対する機械的リスクを最小限に留め得るという事実に焦点を当てている。
文献の報告では、梗塞期間の間近に送達されるMSCが心筋ミオシンを発現する細胞に分化し得ることが示唆されている。心筋梗塞後の心筋において、MSCの生存率を有意に増加させることが可能であるにもかかわらず、MSCは、BrdU標識してもGFP標識しても、心筋細胞フェノタイプを有する細胞の有意な再生を示さなかった。したがって、生着したMSCのひとつの小集団が心筋細胞表現型に分化した可能性はありえるが、われわれのデータは、MSCによる治療の総合的なメリットが、再生というより、どちらかといえば心臓組織の保存から生じるものであり、この効果を仲介する少なくとも1つの因子がSDF−1である、という仮説と一致する。
本発明者らのデータは、天然の再生修復プロセスが存在し、それは梗塞した心筋に生じ、心筋梗塞後の心筋においてSDF−1を過剰発現させることにより促進することができる、という考えに一致する。興味深いことには、本発明者らは、静脈内送達される幹細胞自体の効果とは明らかに無関係の、心筋に対する複数の有益な効果を確認した。この確認された有益な効果とは、むしろ、局所的なパラクリン効果に起因するものかもしれない。また、未分画の骨髄標本の導入により確認される梗塞期間直近の心機能の改善もこれで説明がつくと考えられる。これらの研究は、幹細胞移植が、心筋細胞の再生とは無関係に、心機能対して有意な効果をもたらし得ること、さらに、そのような効果を引き出すために設計される諸方法が、心機能の有意な保存をもたらす可能性があることを示している。いくつかの研究において既に、臨床集団での同種異系および自家MSCの注入の有用性と安全性が示されている。したがって、心筋組織を保存することを目的とするSDF−1に基づく治療を、急性心筋梗塞患者を対象としてデザインすることは可能なはずである。
==MCP−3は心筋間葉系幹細胞ホーミング因子である==
本発明者らは、心筋梗塞(MI)後に、造血幹細胞(HSC)の心臓への一過性のホーミングが起こることを既に実証した。HSCのホーミングが一過性であることは、少なくとも部分的には、SDF−1の一過性の発現に起因する。HSCは心臓組織へ分化転換するとは考えられないが、MSCは心筋細胞のいくつかの特性をin vitroで獲得することができる。MSCはまた、MI後に心臓にホーミングすることも示されていたので、本発明者らは、同様に心筋が一過性に分泌する、MSCを誘引し得るケモカインがあるという仮説をたてた。本研究の目的は、潜在的なMSCホーミング因子を同定し、それがボーダーゾーン内に安定的に発現した場合の、心機能に対するその効果を調べることにあった。
LAD結紮:
動物研究委員会がすべての動物プロトコールを承認し、動物はすべてクリーブランドクリニック財団の国際実験動物管理公認協会実験動物施設で飼育した。既に説明した通りルイスラットの左冠動脈前下行枝の結紮を行なった。簡潔に述べると、動物に対して、ケタミンとキシラジンの腹腔内投与により麻酔をして、挿管し、圧力サイクル式げっ歯動物用ベンチレーター(ケント・サイエンティフィック社RSP1002、トリントン、コネチカット州)を用いて、室内空気にて80回/分で人工呼吸した。外科用手術顕微鏡(M500、Leica、マイクロシステムズ社、バノックバーン、イリノイ州)を補助的に用いて、前壁心筋梗塞を誘導した。
ラットの骨髄は、0.6mlのDMEM(GIBCO、インビトロゲン社、カールスバード、カリフォルニア州)で大腿骨を洗い流すことにより単離した。20Gの針を用いて、骨髄の塊を穏やかに細分化した。Percoll密度勾配によって細胞を分離した。細胞を260gで10分間遠心分離し、100U/mlペニシリンおよび100g/mlストレプトマイシン(インビトロゲン社、カールスバード、カリフォルニア州)を含有するPBSで、3回交換しながら洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、10%FBSならびに1%抗生物質および抗真菌剤(GIBCO、インビトロゲン社、カールスバード、カリフォルニア州)を含有する低グルコースDMEM(GIBCO、インビトロゲン社、カールスバード、カリフォルニア州)に再懸濁しプレーティングした。これらの細胞を37℃でインキュベートした。3日後に培地を交換することにより、接着していない細胞を除去した。14日後に(第4継代)、0.05%トリプシンおよび2mM EDTA(インビトロゲン、カールスバード、カリフォルニア州)と細胞を5分間インキュベートして、細胞を回収した。MSC培養物から、細胞106個あたりPE結合マウス抗ラットCD45一次抗体(販売元:BDバイオサイエンス;カタログ番号:554878)を10μlずつ用いて、ネガティブセレクションにより、CD45+細胞を除去した。メーカー(ステムセル・テクノロジーズ社)の使用説明書に従い、EasySep PEセレクションキットを用いて、PE陽性細胞をネガティブセレクションした。得られたMSC(第6〜12継代)を本発明者らの研究に使用した。注入3日前に、細胞を、1:3の割合で新たにプレーティングし、S期の細胞周期にあるこれらの細胞を標識するために、10μM BrdU(5−ブロモ−2−デオキシウリジン)を含有する完全培地中でインキュベートした。100μlのPBSあたり106個のBrdUで標識されたMSCを回収した。
本発明者らは、67個のターゲットを含むケモカイン・ケモカイン受容体アレイナイロン膜アレイシステム(スーパーアレイバイオサイエンス社)を用いた。1μgの全RNAを用い、ランダムプライマーを使用して逆転写によりcDNAを生成した。cRNAを生成し、メーカーのプロトコールを用いてハイブリダイゼーションを行った。化学発光シグナルを、露光時間20秒で、冷却CCDカメラにより測定した。各フィルターは一度ずつ使用した。LAD結紮から1、3、4、および10日後の各時点について、動物を3個体ずつ用いた。コントロール群としては、外科手術は行わなかったものと、1時間および1週間後に、縫合はするが、LADを縛らない疑似LAD結紮を行ったものがある。
心筋組織中の特異的ケモカインに関する肯定的な結果として、1匹の実験動物における発現がすべてのコントロール動物(疑似結紮したものと、手術はしなかったもの)と比較して3倍に増加した。この発現量は、それ以外のすべての実験動物においても、その時点での各コントロール動物と比較して少なくとも2倍の増加であった。また、それ以外のすべての時点においても、コントロールから増加しているか変化していなかった。
培養物中の細胞からのほうが、組織の場合と比較して、発現プロフィルの変動が小さいため、本発明者らは培養中の細胞に対して行ったアレイ解析の陽性結果のストリンジェンシーを増加させた。この場合、受容体発現量の有意差は、心繊維芽細胞と比較して、MSCにおける発現が10倍の増加として定義された。各細胞タイプに対し、別々の3つの培養物を調べた。陽性の結果はすべてPCRまたはリアルタイムPCRにより確認した。
600万個の細胞からRNAを単離した後、Rneasy Mini Kit(キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州)を使用し、メーカーの使用説明書に従ってRT−PCRを行った。ABI Prism 7700 sequence detector (アプライド・バイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州)を使用し、定量的リアルタイムPCRを行った。反応液にはSYBR Green PCR master mix(アプライド・バイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州)、300nMの各プライマー、および10μlのcDNAが含まれていた。95℃で10分間AmpliTaq Gold(アプライド・バイオシステムズ社、フォスター市、カリフォルニア州)を活性化した後、95℃で15秒間、60℃で1分間を1サイクルとして、45サイクルを行った。各増幅の解離曲線を解析し、非特異的なPCR産物がなかったことを確認した。
動物を、心筋梗塞72時間後または4週間後に屠殺した。確立しているプロトコールに従い、組織をホルマリンで固定し、パラフィンブロックで包埋した。10mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH 6.0)を用いて、95℃で5分間加熱して、抗原回復を行った。バッファーは新鮮なバッファーと交換してさらに5分間再加熱し、次いで、約20分間冷却した。次いで、スライドを2分間脱イオン水で3回洗浄した。次いで、非特異的なIgGの結合を抑制するため、標本を1% ブロッキング用正常血清を含むPBSで60分間インキュベートした。次いで、スライドを、マウス抗BrdU一次抗体(BDバイオサイエンシーズ社、サンホセ、カリフォルニア州)とともに60分間インキュベートした。最適な抗体濃度は滴定によって決定した。次いで、スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した後、ブロッキング用正常血清を含むPBSで1.5μg/mlに希釈し暗室でインキュベートした、FITC結合二次抗体(サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、サンタクルーズ、カリフォルニア州)とともに、45分間インキュベートした。PBSでよく洗浄した後に、水溶性封入剤(Vectashield Mounting Medium with DAPI,H−1200;ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州)を用いてカバーガラスで封入した。
青色のアルゴンレーザー(DAPI用)、緑色のアルゴンレーザー(Alexa Fluor 488用)、および赤色のクリプトンレーザー(Alexa Fluor 594)を備えた正立型共焦点レーザー走査顕微鏡(モデルTCS−SP;ライカマイクロシステムズ、ハイデルベルク、ドイツ)を用いて、組織を解析した。データは、「ブリードスルー」を最小限に留めるため、連続励起により収集した。画像処理、解析、および共局在化の程度を、Leica Confocal Softwareを使用して評価した。光学切片は、4フレーム間の平均値を取り、画像サイズは1024×1024ピクセルに設定した。画像のデジタル調節はしなかった。
生着したMSCを、高倍率視野あたりのBrdU陽性細胞数として定量化した。血管数は、高倍率視野あたりのvWF陽性血管数として定量化した。梗塞域に沿う少なくとも8高倍率視野を、当該動物の治療について盲検化されていた観察者2名がランダムにカウントした。高倍率視野あたりの細胞数または血管数は、平均して、高倍率視野あたりの測定面積で標準化した。
Sequoia C256およびGE Vision 7と接続した15MHzのリニアアレイトランスデューサを用いて、LAD結紮およびMSC移植後の2週目および5週目に2次元断層心エコー法を行った。左室径および左室壁厚を定量化するため、本発明者らは、乳頭筋直下左室中心部からの2次元クリップ画像およびMモード画像を短軸断面でデジタル記録し、異なるラットの同じ解剖学的位置からの計測値が一致するようにした。超音波検査技師は、どちらが治療群かについて盲検化されていた。計測は独立した2名の盲検化された観察者がProSolve心エコー検査用ソフトウェアを用いてオフラインにて行った。治療群について盲検化された観察者が、記録された5枚のMモードクリップ画像のうち無作為に3枚を選び、動物各個体において、測定をそれぞれ6回ずつ行った。短縮率をMモード記録から算出した。短縮率(%)=(LVEDD−LVESD)/LVEDD×100(ここで、LVEDDは左室拡張末期径を、LVESDは左室収縮末期径を表す)。
心臓組織のパラフィン切片(5μm)を調製した。切片をコラーゲン特異的マッソントリクローム染色法および光顕微鏡法により観察した。繊維性コラーゲンの蓄積(青染色)を評価するため、画像解析ソフトウェアである、Image−Pro Plus バージョン5.1を用いて、コラーゲン含有量の量的評価を行なった。繊維化の大きさは、コラーゲン組織(青)を含むLV面積の百分率により定量化した。実験に用いた心臓はMI8週間後のもので、前壁が著しくひ薄化していたので、リモデリング後の梗塞の大きさの尺度として、コラーゲン組織を有する左室内腔周径の百分率による定量化も行った。
MSCはトリプシン−EDTAで分離し、カウントして、完全培地に再懸濁した。その後、細胞(400μLの中の1x105個)を、24ウェルプレート中に挿入したMillicell培養プレートインサート(孔径8μm; ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州)上にプレーティングし、37℃で一晩付着させた。遊走を開始させるため、走化性因子MCP−3(R&Dシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州)を加えて、あるいは加えずに、1%FBS含有DMEM(600μL)を、下部プレートのウエルに添加した(三つずつ)。細胞は、37℃で4時間、インサートメンブレンを通過して遊走させた。次いで、インサートをPBSで洗浄し、インサートの上部表面に残存する非遊走細胞を、綿球で除去した。遊走細胞を、4%PFAで固定し、0.25%クリスタルバイオレットで染色し、顕微鏡(10X)を用いカウントした。ランダムに選択した4視野における細胞数の中間値(±SEM)を、各処置について計算した。
統計解析:
損傷した心筋におけるMSCの一過性のホーミング:
200万個のBrdUで標識されたMSCを、LAD結紮1日後または14日後にラットの尾静脈へ注入した。MSC注入3日後、ラットを屠殺し心臓を採取した。MSCはmm2あたりのBrdU陽性細胞の数として定量化した。本発明者らのMSC調製物は、急性心筋梗塞後の心筋に一過性にホーミングする、ということを図7のデータに示す。LAD結紮1日後、単位面積当たり有意な数のMSCが確認されたが、LAD結紮14日後には、MSCの注入に起因する梗塞域内の有意なMSCの生着はみられなかった。
図8aは、MSCホーミング候補因子を同定するため、本発明者らが行った戦略およびその結果について描写したものである。本発明者らは、ケモカインとケモカイン受容体のアレイを用いて、2つの異なる集団を同定した。第1の集団は、LAD結紮1時間後という早い時期に発現したケモカインの集団である。その発現は、ピーク時には、疑似手術を施した動物の少なくとも3倍に達したが、LAD結紮10日後までには消滅した(図8a 左側、明るいグレーのグループ)。第2の集団は、心繊維芽細胞と比較して少なくとも10倍の発現量で発現したケモカイン受容体を表す(右側、濃いグレーのグループ)。MSCホーミング候補因子は、左側の円(薄いグレー)に含まれるケモカイン(LAD結紮後に心筋組織により一過性に発現)のうち、右側の円(濃いグレー)に含まれる受容体に結合した(心繊維芽細胞ではなくMSCにより発現)ケモカイン、すなわちこれら2つの集団の共通部分であった(白抜き部分)。図8aの白抜き部分に示されるように、受容体CCR−1およびCCR−2を介する単球走化性タンパク質(1と3)ならびに受容体CCR−5を介するMIP−1αおよびMIP−1βという、2つのケモカインファミリーのみが同定された。
(i)CCR1の発現はMSC中で維持される、また、(ii)時間が経過してもMSCのホーミング能は失われない、という知見に基づき、本発明者らは、MCP−3に着目することにした。MSCホーミング因子を同定するためにあらかじめ定義される、さらにもう1つの基準は、MSCが、目的とするケモカインを発現しないということである。本発明者らは、MSCとCFにおけるMCP−3発現についてリアルタイムPCR解析を行なった。これらのデータは、MSCが有意なレベルのMCP−3を発現しないことを示した(データは示さず)。
本発明者らはLAD結紮1カ月後に、コントロールおよびMCP−3を発現しているCFを移植した。CFの移植に続いて、動物に、CF移植の3日後より、1日おきに12日間、1回あたり100万個のMSC、または生理食塩水を6回注入した。CF移植前のMI1カ月後(基準値)、およびCF移植の1カ月後(MI2カ月後)に、心機能および心臓径を心エコー検査によって定量化した。図11aのデータは、短縮率により測定される心機能が、MCP−3を発現しているCFの投与およびMSCの注入を受けた動物において、有意に増強したことを示す。MCP−3を発現しているCFを投与しMSCを注入しなかった動物の場合は、有意な改善がみられなかった。MCP−3発現CFを投与しかつMSCを注入した動物にさらにMSCを注入1か月後に、明らかにLVEDDが減少し、逆リモデリングが起こっていた。左心内腔のさらなる拡張が、MSCを連続注入したがコントロールCFも投与した動物、またはMSCを連続注入せずMCP−3発現CFを投与した動物に認められた(図11bおよびd)。
MSCは、組織修復のための幹細胞の源として盛んに研究されている。MSCは、複数の臓器の損傷した組織にホーミングすることが知られている。しかし、MSCのホーミングを司る生物学的シグナルについては、これまでに記載されたことがない。本研究でわれわれは、MSCのホーミング因子としてMCP−3を同定した。
Claims (55)
- 被験体の虚血障害を治療する方法であって、ストローマ細胞由来因子−1(SDF−1)を、アポトーシス細胞のアポトーシスを阻害するのに有効な量で、前記被験体の虚血組織のSDF−1受容体を発現する前記アポトーシス細胞に投与することを含む、方法。
- 前記SDF−1を、前記虚血障害の結果としてアップレギュレートされるSDF−1受容体を含む細胞に、投与することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記SDF−1受容体が、CXCR4を含むことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記アポトーシス細胞のAktリン酸化を増加させるのに有効な量で投与することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記治療中の組織においてSDF−1を発現させるかまたはその発現を促進することにより、投与することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記SDF−1を、治療中の虚血組織と生体適合性を有する細胞から発現させることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記虚血組織の細胞または前記虚血組織の末梢周囲の細胞から発現させることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記SDF−1を発現する前記細胞が、ベクター、プラスミドDNA、エレクトロポレーション、およびナノ粒子の少なくとも1つによって、SDF−1を発現するよう遺伝的に改変されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- MCP−3を、幹細胞および/または前駆細胞を前記虚血組織へ動員するのに有効な量で、前記虚血組織に投与することをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞が、自家および/または同系の間葉系幹細胞を含むとことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記MCP−3を、前記治療中の組織においてMCP−3を発現させることにより投与することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記MCP−3を、治療中の虚血組織と生体適合性を有する細胞から発現させることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- 前記MCP−3を、前記虚血組織の細胞または前記虚血組織の末梢周囲の細胞から発現させることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記SDF−1を発現する前記細胞が、ベクター、プラスミドDNA、エレクトロポレーション、およびナノ粒子のうち少なくとも1つによって、MCP−3を発現するよう遺伝的に改変されることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞が、MCP−3を発現し、SDF−1を発現していることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞に、SDF−1およびMCP−3を発現するバイシストロニックな発現構築物をトランスフェクトすることを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 前記虚血障害が、末梢血管障害、肺塞栓、静脈血栓症、心筋梗塞、一過性脳乏血発作、不安定狭心症、大脳血管虚血、可逆性虚血性神経症候、虚血腎疾病または脳卒中障害のうち少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 組織損傷後の、組織の細胞のアポトーシスを抑制する方法であって、SDF−1受容体を発現している組織のアポトーシス細胞に、前記アポトーシス細胞のアポトーシスを阻害するのに有効な量のSDF−1を投与することを含む、方法。
- 前記細胞が、前記虚血障害の結果としてアップレギュレートされるSDF−1受容体を含むことを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記SDF−1受容体が、CXCR4を含むことを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記細胞のAktリン酸化を増加させるのに有効な量で投与することを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記組織において、SDF−1を発現させるかまたはSDF−1の発現を促進することにより、投与することを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記組織と生体適合性を有する細胞から発現させることを特徴とする、請求項22に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記虚血組織の細胞または前記組織の末梢周囲の細胞から発現させることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記SDF−1を発現する前記細胞が、ベクター、プラスミドDNA、エレクトロポレーション、およびナノ粒子のうち少なくとも1つによって、SDF−1を発現するよう遺伝的に改変されることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- MCP−3を、幹細胞および/または前駆細胞を前記組織の細胞へ動員するのに有効な量で、前記細胞に投与することをさらに含むことを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記幹細胞が、自家および/または同系の間葉系幹細胞を含むことを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記MCP−3を、前記組織中でMCP−3を発現させることにより投与することを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記MCP−3を、前記組織と生体適合性を有する細胞から発現させることを特徴とする、請求項26に記載の方法。
- 前記MCP−3を、前記組織の細胞または前記組織の末梢周囲の細胞から発現させることを特徴とする、請求項28に記載の方法。
- 前記SDF−1を発現する前記細胞が、ベクター、プラスミドDNA、エレクトロポレーション、およびナノ粒子のうち少なくとも1つによって、MCP−3を発現するよう遺伝的に改変されることを特徴とする、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞に、SDF−1およびMCP−3を発現するバイシストロニックな発現構築物をトランスフェクトすることを特徴とする、請求項31に記載の方法。
- 被験体の虚血障害を治療する方法であって、
ストローマ細胞由来因子−1(SDF−1)を、前記被験体の虚血組織に、前記組織のSDF−1受容体を発現する細胞のアポトーシスを阻害するのに有効な量で、投与することと、
MCP−3を、前記虚血組織に、幹細胞および/または前駆細胞を前記虚血組織へ動員するのに有効な量で、投与することと、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記SDF−1を、前記虚血障害の結果としてアップレギュレートされるSDF−1受容体を含む細胞へ投与することを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 前記SDF−1受容体が、CXCR4を含むことを特徴とする、請求項34に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記細胞のAktリン酸化を増加させるのに有効な量で投与することを特徴とする、請求項35に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記治療中の組織においてSDF−1を発現させることにより投与することを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記虚血組織の細胞または前記虚血組織の末梢周囲の細胞から発現させることを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 前記SDF−1を発現する前記細胞が、SDF−1を発現させるために、ベクター、プラスミドDNA、エレクトロポレーション、およびナノ粒子のうち少なくとも1つによって遺伝的に改変されていることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
- 前記幹細胞が、自家および/または同系の間葉系幹細胞を含むことを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 前記MCP−3を、前記治療中の組織中にMCP−3を発現させることにより投与することを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 前記MCP−3を、前記治療中の虚血組織と生体適合性を有する細胞から発現させることを特徴とする、請求項41に記載の方法。
- 前記MCP−3を、前記虚血組織の細胞または前記虚血組織の末梢周囲の細胞から発現させることを特徴とする、請求項41に記載の方法。
- 前記SDF−1を発現する前記細胞が、ベクター、プラスミドDNA、エレクトロポレーション、およびナノ粒子のうち少なくとも1つによって、MCP−3を発現するよう遺伝的に改変されることを特徴とする、請求項43に記載の方法。
- 前記細胞が、MCP−3を発現し、SDF−1を発現していることを特徴とする、請求項44に記載の方法。
- 前記細胞に、SDF−1およびMCP−3を発現するバイシストロニックな発現構築物をトランスフェクトすることを特徴とする、請求項45に記載の方法。
- 前記虚血障害が、末梢血管障害、肺塞栓、静脈血栓症、心筋梗塞、一過性脳乏血発作、不安定狭心症、大脳血管虚血、可逆性虚血性神経症候、虚血腎疾病または脳卒中障害のうち少なくとも1つを含むことを特徴とする、請求項33に記載の方法。
- 治療上有効な量のSDF−1およびMCP−3を含有する、虚血障害を治療するための医薬組成物。
- SDF−1を発現させるためのDNAおよびMCP−3を発現させるためのDNAを含む、バイシストロニックベクター。
- 治療中の被験体に移植される細胞または組織のアポトーシスを抑制する方法であって、
前記治療中の被験体に移植される細胞または組織に、SDF−1を投与することを含み、
前記細胞または組織がSDF−1受容体を発現していることを特徴とする、方法。 - 前記SDF−1を、移植に先立ち、前記治療中の被験体の前記細胞または組織に投与することを特徴とする、請求項50に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記治療中の細胞または組織の移植中および/または移植後に、前記細胞または組織に投与することを特徴とする、請求項50に記載の方法。
- 前記SDF−1受容体が、CXCR4を含むことを特徴とする、請求項50に記載の方法。
- 前記SDF−1を、前記アポトーシス細胞のAktリン酸化を増加させるのに有効な量で投与することを特徴とする、請求項50に記載の方法。
- 前記細胞が、SDF−1受容体を発現する幹細胞および/または前駆細胞を含むことを特徴とする、請求項50に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US92104407P | 2007-03-30 | 2007-03-30 | |
US60/921,044 | 2007-03-30 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501222A Division JP2010523496A (ja) | 2007-03-30 | 2008-03-27 | 虚血障害の治療方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014012702A true JP2014012702A (ja) | 2014-01-23 |
Family
ID=39808660
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501222A Pending JP2010523496A (ja) | 2007-03-30 | 2008-03-27 | 虚血障害の治療方法 |
JP2013173875A Pending JP2014012702A (ja) | 2007-03-30 | 2013-08-23 | 虚血障害の治療方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010501222A Pending JP2010523496A (ja) | 2007-03-30 | 2008-03-27 | 虚血障害の治療方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20140170116A9 (ja) |
EP (1) | EP2142206B1 (ja) |
JP (2) | JP2010523496A (ja) |
AU (1) | AU2008232739B2 (ja) |
CA (1) | CA2682469A1 (ja) |
ES (1) | ES2520044T3 (ja) |
WO (1) | WO2008121719A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050271639A1 (en) * | 2002-08-22 | 2005-12-08 | Penn Marc S | Genetically engineered cells for therapeutic applications |
ES2520044T3 (es) | 2007-03-30 | 2014-11-11 | The Cleveland Clinic Foundation | SDF-1 para su uso en el tratamiento de trastornos vasculares periféricos isquémicos |
WO2009079451A2 (en) * | 2007-12-14 | 2009-06-25 | The Cleveland Clinic Foundation | Compositions and methods of promoting wound healing |
JP5856059B2 (ja) | 2009-08-28 | 2016-02-09 | ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション | 虚血組織を治療するためのsdf−1送達 |
US9308277B2 (en) | 2010-02-25 | 2016-04-12 | Mesoblast International Sàrl | Protease-resistant mutants of stromal cell derived factor-1 in the repair of tissue damage |
US20130078224A1 (en) * | 2010-03-30 | 2013-03-28 | Life Sciences Research Partners Vzw | Induction/monitoring of arteriogenesis using sdf1 and pdgfb or inhibition of phd2 |
WO2012025925A1 (en) | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Methods of improving transplantation using sdf-1alpha |
WO2012037083A2 (en) * | 2010-09-15 | 2012-03-22 | The Cleveland Clinic Foundation | Compositions and method for promoting musculoskeletal repair |
CA2838155C (en) | 2011-06-07 | 2021-10-19 | Provasculon, Inc. | Methods for repairing tissue damage using protease-resistant mutants of stromal cell derived factor-1 |
MX2016005006A (es) | 2013-10-22 | 2016-07-14 | Viromed Co Ltd | Composicion para prevenir a tratar la esclerosis lateral amiotrofica usando dos o mas isoformas del factor de crecimiento de hepatocito. |
ES2822924T3 (es) * | 2014-09-26 | 2021-05-05 | Helixmith Co Ltd | Composición para prevenir o tratar una enfermedad arterial periférica utilizando el factor de crecimiento de hepatocitos y el factor 1a derivado de células del estroma |
WO2016197491A1 (en) * | 2015-06-12 | 2016-12-15 | Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences | A three-dimensional tissue scaffold with stem cell attracting element and use thereof |
KR102545746B1 (ko) * | 2020-12-03 | 2023-06-20 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 유도만능줄기세포 유래 혈관세포 및 SDF1a를 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 심장 재생용 조성물 |
Family Cites Families (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3773919A (en) * | 1969-10-23 | 1973-11-20 | Du Pont | Polylactide-drug mixtures |
WO1992008796A1 (en) | 1990-11-13 | 1992-05-29 | Immunex Corporation | Bifunctional selectable fusion genes |
US5197985A (en) * | 1990-11-16 | 1993-03-30 | Caplan Arnold I | Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells |
WO1994028143A1 (en) | 1993-05-21 | 1994-12-08 | Targeted Genetics Corporation | Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene |
US5602301A (en) * | 1993-11-16 | 1997-02-11 | Indiana University Foundation | Non-human mammal having a graft and methods of delivering protein to myocardial tissue |
CN100569297C (zh) * | 1995-02-28 | 2009-12-16 | 加利福尼亚大学董事会 | 基因转移介导的血管形成疗法 |
US5792453A (en) * | 1995-02-28 | 1998-08-11 | The Regents Of The University Of California | Gene transfer-mediated angiogenesis therapy |
US6121246A (en) * | 1995-10-20 | 2000-09-19 | St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. | Method for treating ischemic tissue |
US5980887A (en) * | 1996-11-08 | 1999-11-09 | St. Elizabeth's Medical Center Of Boston | Methods for enhancing angiogenesis with endothelial progenitor cells |
CA2289665C (en) * | 1997-06-13 | 2005-08-09 | Genentech, Inc. | Protein recovery by chromatography followed by filtration upon a charged layer |
MXPA00003885A (es) | 1997-10-22 | 2004-04-23 | Inst Genetics Llc | Quimiocinas con modificiaciones de la terminacion amino. |
EP1053326A2 (en) * | 1998-02-06 | 2000-11-22 | Collateral Therapeutics | Variants of the angiogenic factor vascular endothelial cell growth factor: vegf |
AU766238B2 (en) | 1998-03-09 | 2003-10-09 | Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. | Compositions and methods for modulating vascularization |
US6676937B1 (en) * | 1998-03-09 | 2004-01-13 | Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston Inc. | Compositions and methods for modulating vascularization |
NZ507161A (en) | 1998-03-30 | 2003-12-19 | Northwest Biotherapeutics Inc | Theraupeutic and diagonistic applications based on the role of the CXCR-4 gene in tumorigenesis |
US20020107195A1 (en) * | 1998-07-21 | 2002-08-08 | Smithkline Beecham Corporation | Method for inducing chemotaxis in endothelial cells by administering stromal cell derived factor-1alpha |
IL125532A0 (en) * | 1998-07-27 | 1999-03-12 | Yeda Res & Dev | Hematopoietic cell composition for use in transplantation |
AU5241099A (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-21 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Use of inhibitors of the activation of cxcr4 receptor by sdf-1 in treating rheumatoid arthritis |
WO2000015285A1 (en) | 1998-09-14 | 2000-03-23 | Mirus Corporation | A process for delivering nucleic acids to cardiac tissue |
DE19844479C1 (de) | 1998-09-28 | 2000-04-13 | Siemens Ag | Integrierter Speicher mit einem differentiellen Leseverstärker |
US7399751B2 (en) * | 1999-11-04 | 2008-07-15 | Sertoli Technologies, Inc. | Production of a biological factor and creation of an immunologically privileged environment using genetically altered Sertoli cells |
EP1154780A2 (en) | 1999-02-26 | 2001-11-21 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Bone marrow transplantation for hepatic regeneration and repair |
EP1041148A1 (en) | 1999-04-02 | 2000-10-04 | Mogen International N.V. | Pathogen inducible promoter |
JP2003502282A (ja) * | 1999-04-08 | 2003-01-21 | ザ ゼネラル ホスピタル コーポレーション | ヒト転移性細胞の作用因子源から離れた意図された移動 |
US7125856B1 (en) * | 1999-04-15 | 2006-10-24 | St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. | Angiogenic growth factors for treatment of peripheral neuropathy |
US6358697B2 (en) * | 1999-04-21 | 2002-03-19 | Children's Hospital Medical Center | Intracellular pharmaceutical targeting |
WO2001094420A1 (en) * | 2000-06-05 | 2001-12-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Identification and use of human bone marrow-derived endothelial progenitor cells to improve myocardial function after ischemic injury |
AU2001284695A1 (en) * | 2000-07-31 | 2002-02-13 | New York Medical College | Methods and compositions for the repair and/or regeneration of damaged myocardium |
US7402567B2 (en) * | 2000-10-27 | 2008-07-22 | The Regents Of The University Of California | Treatment of disease by inducing cell apoptosis |
AU2002235168A1 (en) * | 2000-11-05 | 2002-05-15 | University Of Florida | Targeting pluripotent stem cells to tissues |
ES2234928T3 (es) * | 2000-11-14 | 2005-07-01 | Universite Libre De Bruxelles | Generacion y uso de celulas dendriticas. |
WO2002043758A2 (en) * | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Schering Corporation | Uses of mammalian genes and related reagents |
AR027161A1 (es) | 2001-05-15 | 2003-03-19 | Bio Sidus S A | Metodo para inducir la proliferacion neovascular y regeneracion tisular |
US7399740B2 (en) * | 2001-06-28 | 2008-07-15 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Poly-Glu,Tyr for neuroprotective therapy |
WO2003014336A1 (fr) | 2001-08-07 | 2003-02-20 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Procede de preparation de cellules souches hematopoietiques multipotentes |
JP4906231B2 (ja) * | 2001-09-14 | 2012-03-28 | ステム セル セラピューティクス インコーポレイテッド | プロラクチン誘導性の神経幹細胞数の増加ならびにその治療用途 |
US7402724B2 (en) * | 2002-01-04 | 2008-07-22 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Longevity and PAPP-A |
WO2003059375A1 (fr) | 2002-01-17 | 2003-07-24 | Cardio Incorporated | Therapie complexe pour la regeneration des tissus |
FR2843697B1 (fr) | 2002-08-26 | 2005-12-09 | Sod Conseils Rech Applic | L'heterocarpine, une proteine d'origine vegetale aux proprietes anticancereuses |
US7396537B1 (en) * | 2002-02-28 | 2008-07-08 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Cell delivery patch for myocardial tissue engineering |
WO2003077864A2 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Department Of Veterans Affairs, Rehabilitation R & D Service | Methods and compositions for directing cells to target organs |
US20030199464A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-10-23 | Silviu Itescu | Regeneration of endogenous myocardial tissue by induction of neovascularization |
US20040037811A1 (en) | 2002-08-22 | 2004-02-26 | The Cleveland Clinic Foundation | Stromal cell-derived factor-1 mediates stem cell homing and tissue regeneration in ischemic cardiomyopathy |
US20050271639A1 (en) * | 2002-08-22 | 2005-12-08 | Penn Marc S | Genetically engineered cells for therapeutic applications |
JP2004099471A (ja) | 2002-09-05 | 2004-04-02 | Cardio Corp | 心筋梗塞および心不全の治療薬 |
US7393628B2 (en) | 2002-10-08 | 2008-07-01 | American National Red Cross | Method for enriching adherent monocyte populations |
US20040258669A1 (en) * | 2002-11-05 | 2004-12-23 | Dzau Victor J. | Mesenchymal stem cells and methods of use thereof |
JP4672370B2 (ja) * | 2002-12-05 | 2011-04-20 | ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ | 虚血の細胞ベースの治療 |
AU2003902037A0 (en) | 2003-04-24 | 2003-05-15 | Mclachlan, Craig | Method for tissue growth |
US7396680B2 (en) * | 2003-10-31 | 2008-07-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Stem cell-specific promoters and their use |
IL158868A0 (en) | 2003-11-13 | 2004-05-12 | Yeda Res & Dev | Methods of generating and using stem cells enriched with immature primitive progenitor |
US7293628B2 (en) * | 2004-05-17 | 2007-11-13 | Calsonic Kansei Corporation | Shell main body for muffler |
EP1771196B1 (en) * | 2004-06-21 | 2012-03-28 | The Cleveland Clinic Foundation | Ccr ligands for stem cell homing |
CA2584553A1 (en) | 2004-09-17 | 2006-03-23 | Cellgentech, Inc. | External agent for treatment of skin ulcer |
US20060105950A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-05-18 | Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. | Morphogen compositions and use thereof to treat wounds |
US7854944B2 (en) * | 2004-12-17 | 2010-12-21 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Tissue regeneration |
WO2006083394A2 (en) * | 2004-12-21 | 2006-08-10 | Ethicon, Inc. | Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making, culturing, and using the same |
US20070173471A1 (en) * | 2006-01-24 | 2007-07-26 | Losordo Douglas W | Morphogen compositions and methods of use thereof to treat heart disorders |
US7405195B2 (en) * | 2006-03-27 | 2008-07-29 | Natural Beauty Bio-Technology Limited | Cosmetic compositions |
ES2520044T3 (es) | 2007-03-30 | 2014-11-11 | The Cleveland Clinic Foundation | SDF-1 para su uso en el tratamiento de trastornos vasculares periféricos isquémicos |
WO2009079451A2 (en) * | 2007-12-14 | 2009-06-25 | The Cleveland Clinic Foundation | Compositions and methods of promoting wound healing |
JP5856059B2 (ja) | 2009-08-28 | 2016-02-09 | ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション | 虚血組織を治療するためのsdf−1送達 |
WO2012037083A2 (en) | 2010-09-15 | 2012-03-22 | The Cleveland Clinic Foundation | Compositions and method for promoting musculoskeletal repair |
WO2012094512A2 (en) | 2011-01-05 | 2012-07-12 | The Cleveland Clinic Foundation | Myocardial tissue targeting peptides |
-
2008
- 2008-03-27 ES ES08732933.0T patent/ES2520044T3/es active Active
- 2008-03-27 AU AU2008232739A patent/AU2008232739B2/en not_active Ceased
- 2008-03-27 CA CA002682469A patent/CA2682469A1/en not_active Abandoned
- 2008-03-27 JP JP2010501222A patent/JP2010523496A/ja active Pending
- 2008-03-27 WO PCT/US2008/058461 patent/WO2008121719A1/en active Application Filing
- 2008-03-27 EP EP08732933.0A patent/EP2142206B1/en not_active Not-in-force
- 2008-03-27 US US12/594,026 patent/US20140170116A9/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-08-23 JP JP2013173875A patent/JP2014012702A/ja active Pending
-
2014
- 2014-11-10 US US14/536,819 patent/US9226978B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6012026015; Circulation vol.107, no.9, 2003, p.1322-1328 * |
JPN6012026018; Regulatory Peptides vol.125, no.1-3, 2005, p.1-8 * |
JPN6012026021; Lancet vol.362, no.9385, 2003, p.697-703 * |
JPN6012026027; Circulation vol.110, no.17, Suupl., 2004, p.111 * |
JPN6014038700; MEDICAL HYPOTHESES VOL.68, NO.6, 20070102, P.1268-1271 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2142206A4 (en) | 2011-08-17 |
EP2142206B1 (en) | 2014-07-30 |
JP2010523496A (ja) | 2010-07-15 |
EP2142206A1 (en) | 2010-01-13 |
US20140170116A9 (en) | 2014-06-19 |
US9226978B2 (en) | 2016-01-05 |
AU2008232739B2 (en) | 2014-03-27 |
WO2008121719A1 (en) | 2008-10-09 |
ES2520044T3 (es) | 2014-11-11 |
US20100166717A1 (en) | 2010-07-01 |
AU2008232739A1 (en) | 2008-10-09 |
US20150139967A1 (en) | 2015-05-21 |
CA2682469A1 (en) | 2008-10-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9226978B2 (en) | Method of treating ischemic disorders | |
JP4280708B2 (ja) | 虚血性心筋症において幹細胞のホーミングおよび組織再生を仲介するストローマ細胞由来因子−1(sdf−1) | |
JP5095403B2 (ja) | 治療的応用法のための遺伝的に改変された細胞 | |
JP5269411B2 (ja) | 幹細胞をホーミングさせるためのccrリガンド | |
US20040161412A1 (en) | Cell-based VEGF delivery | |
US20240082357A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of ischemia and cardiomyopathy | |
AU2008200822A1 (en) | Stromal cell-derived factor-1 mediates stem cell homing and tissue regeneration in ischemic cardiomyopathy |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140916 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20141204 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20141209 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150116 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20150216 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150526 |