CN102764272A - 经pd-l1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用。本发明可调节免疫状态、具有抑制移植排斥反应的功能、在异体器官移植的临床应用中具有重要的指导意义、为诱导外周免疫耐受奠定了基础以及具有广阔的应用前景。

Description

经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种干细胞在移植排斥反应中的应用，尤其涉及一种经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用。

背景技术

异体复合组织移植因可以提供良好的外形、功能修复，在大面积烧伤、严重畸形或组织缺如患者的治疗中受到越来越多的青睐。然而，移植术后受者对移植物的排斥反应是移植成功的首要障碍。各种免疫抑制剂的应用虽可以预防移植物被机体排斥，但长期应用所带来的机会性感染和恶性肿瘤的风险，以及不可避免的慢性排斥反应严重降低了患者的生存质量、阻碍了这一技术的临床应用。随着干细胞工程和基因工程等技术手段的相关理论、实践的不断完善，基因治疗和细胞治疗逐渐成为促进移植物成活的两个重要手段。

T细胞是参与异体移植排斥反应的关键效应细胞，阻断共激活分子或活化共抑制分子而诱导T细胞无能，可以诱导外周免疫耐受，促进异体移植物成活，对于预防移植排斥反应具有很大的应用前景，有望成为解决移植排斥的新靶点。PD-L1（Programmed death factor-Ligand1，PD-L1，程序性死亡因子配体1）是新近发现的具有免疫负调节作用的B7家族新成员，编码290个氨基酸的跨膜蛋白，包含一个IgV样区、一个IgC样区、一个跨膜疏水区和一个30个氨基酸的胞内尾，胞内区有一个蛋白激酶C的磷酸化位点。其表达在多种组织，在中枢和外周免疫耐受、自身免疫性疾病、炎症反应调节中都起着重要作用。增强细胞表面PD-L1的表达，激活T细胞活化的共抑制信号从而抑制T细胞的活化是诱导外周免疫耐受的新思路。

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是一群具有自我更新能力和多向分化潜能的成体非造血多能干细胞，最早从荷兰猪的骨髓中发现（BoneMarrow Stem Cells，BMSCs），此后发现其广泛存在于体内各组织中。MSCs具有低免疫源性，可以在不同个体间进行移植并发挥生物学效应。其生物学功能丰富，不仅能多向分化、促进组织细胞再生，而且可以调节免疫状态，减轻排斥反应的发生。BMSCs的这些特点使其成为理想的细胞及基因治疗载体。但是，单独应用BMSCs并不能维持移植物的长期存活，其应用于免疫源性更强的异体复合组织移植时并没有取得明显延长移植物存活时间的效果。免疫性疾病的实验研究提示，BMSCs可以通过与免疫细胞间的接触作用而抑制效应性T细胞的活化，发挥免疫抑制作用。因此，有望通过基因工程化间充质干细胞增强目的基因的表达，提高其抑制排斥反应的生物学效能，诱导外周免疫耐受。

慢病毒载体具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点。pLV-puro载体是基于HIV1的慢病毒基因过表达载体，包含了生产慢病毒所必须的病毒原件以及提高病毒滴度及基因表达效率的原件，可以同时表达外源插入基因片段和Puromycin抗性基因，方便地使用Puromycin筛选出稳定过表达目的基因的细胞。Gateway克隆技术具有操作简单、省时高效、可以同时克隆一个或多个基因到任何蛋白表达系统等特点，已成功应用于很多基因表达载体的构建。基于此以及慢病毒载体在哺乳动物细胞上进行基因转染和蛋白表达的高效性，使其在基因治疗研究中受到青睐。

发明内容

为了解决背景技术中存在是上述技术问题，本发明提供了一种可调节免疫状态、具有抑制移植排斥反应的功能、在异体器官移植的临床应用中具有重要的指导意义、为诱导外周免疫耐受奠定了基础以及具有广阔的应用前景的经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用。

本发明的技术解决方案是：本发明提供了一种经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用。

经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在抑制移植排斥反应中的应用。

经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在制备抗移植排斥反应药物中的应用。

经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在制备诱导外周免疫耐受药物中的应用。

上述经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞是将PD-L1基因通过重组慢病毒体外转染骨髓间充质干细胞得到的。

上述重组慢病毒是将PD-L1基因的慢病毒表达载体转染293FT细胞得到的。

上述PD-L1基因，是通过PD-L1表达克隆在慢病毒基因过表达载体pLV-Puro后获得的。

上述PD-L1表达克隆是通过Gateway克隆系统获得的。

本发明的优点是：

1、本发明提供了经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在抑制移植排斥反应、诱导外周免疫耐受中的应用。该充质干细胞不仅保持了BMSCs自身的免疫调节作用，同时又增加了PD-L1对T细胞活化的抑制作用，赋予了该细胞更强的免疫调节作用，使其能够与移植后的T细胞结合，从而减轻或延迟移植排斥反应的发生。

2、本发明利用含目的基因PD-L1的慢病毒转染经体外培养的间充质干细胞移植到接受异体肢体移植的大鼠体内，观察对异体肢体存活情况的影响。体外研究发现PD-L1基因转染的BMSCs可以抑制T细胞的增殖及多种致炎因子的生成，体内应用后可以显著延长肢体存活时间。

3、为增加疗效，本发明的药物可以与其它免疫抑制剂联合应用，减少免疫抑制剂引起的毒副作用。

4、通过在本发明的基础上，增加GFP等报告基因，以进行细胞移植后的细胞示踪，进而探讨其发挥作用的机制。

5、本发明在异体器官移植的临床应用中具有重要的指导意义，并为诱导间充质干细胞介导的外周免疫耐受奠定了基础，应用前景广阔。

附图说明

图1A是经传代培养的大鼠BMSCs图；

图1B是第三代BMSCs进行表面抗原流式细胞术鉴定结果图；

图1C是第三代BMSCs进行诱导分化的结果图；

图2A是大鼠PD-L1基因凝胶电泳结果图；

图2B是大鼠PD-L1与GFP基因共转染大鼠BMSCs后GFP表达的荧光显微镜观察结果图；

图2C是大鼠PD-L1与GFP基因共转染大鼠BMSCs后细胞纯度流式细胞术检测结果图；

图3A是单向混合淋巴细胞反应检测转基因BMSCs的体外免疫抑制功能鉴定结果图；

图3B是大鼠异体肢体移植模型及各组大鼠生存率结果。

具体实施方式

本发明提供了经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用。

尤其是经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在抑制移植排斥反应中的应用。

尤其是经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在制备抗移植排斥反应药物中的应用。

尤其是经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在制备诱导外周免疫耐受药物中的应用。

本发明所采用的经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞是将PD-L1基因通过重组慢病毒体外转染骨髓间充质干细胞得到的。

本发明所采用的重组慢病毒是将PD-L1基因的慢病毒表达载体转染293FT细胞得到的。

本发明所采用的PD-L1基因，是通过PD-L1表达克隆在慢病毒基因过表达载体pLV-Puro后获得的。

本发明所采用的PD-L1表达克隆是通过Gateway克隆系统获得的。

以下结合具体实施对本发明做进一步详细说明。

本发明通过基因工程手段把大鼠PD-L1过表达于骨髓间充质干细胞。该PD-L1的碱基序列如下：

  1  atgaggatat ttgctgtcct tatagtcaca gcctgcagtc acgtgctagc ggcatttacc

 61  atcacagctc caaaggacct gtacgtggtg gagtatggca gcaatgtcac gatggaatgc

121  agattcccag tagaacagaa attggacctg cttgccttag tggtgtactg ggaaaaggaa

181  gacaaggaag ttattcagtt tgtggaggga gaggaggacc tgaagcctca acacagcagc

241  ttcaggggga gagccttctt gccaaaggac cagcttttga aggggaacgc ggtgcttcag

301  atcacagatg tcaagctgca ggacgcaggt gtctactgct gcatgatcag ctatggtgga

361  gcggactaca agcgaatcac attgaaagtc aacgctccat accgcaaaat caaccaaaga

421  atttccatgg atccagccac ttctgagcat gaactaatgt gccaggctga gggttaccca

481  gaagccgaag tgatctggac aaacagtgac caccagtccc tgagtgggga aacaactgtc

541  accacttccc agactgagga gaagcttctc aacgtgacca gcgttctgag ggtcaacgca

601  acagctaatg atgttttcca ctgtacgttc tggagagtac actcagggga gaaccacacg

661  gctgaactga tcatcccaga actgcctgta ccacgtctcc cacataacag gacacactgg

721  gtactcctgg gatccgtcct tttgttcctc atcgtggggt tcaccgtctt cttctgcttg

781  agaaaacaag tgagaatgct agatgtggaa aaatgcggct tcgaagatag aaattcaaag

841  aaccgaaatg atacacagtt cgaggagacg taa

实施例1：骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定

（1）BMSCs体外培养

1.1）4-6周健康lewis大鼠以1%戊巴比妥钠麻醉过量处死，75%酒精浸泡10min。超净工作台内取出双侧股骨、胫骨和肱骨，去除附着肌肉及骨膜等组织，再次用1%呋喃西林溶液浸泡5min。

1.2）PBS液冲洗两遍后，剪去骨的两端，露出骨髓腔，1ml注射器抽取预冷PBS，自骨端沿长轴刺入骨髓腔内，在培养皿中反复冲洗骨髓腔，收集骨髓。

1.3）将所得骨髓悬液用弯头吸管反复轻轻吹打，使其分散为细胞悬液，200目滤网过滤去除沉渣，得单细胞悬液。将所得单细胞悬液移入10ml离心管，室温、1000r/min，离心5min，弃去上清液，含10%FBS的DMEM培养液重悬并稀释至10ml接种于75cm²的培养瓶中，置37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。

1.4）48h后首次换液，加入等量培养基，以后每72h换液一次，每次更换培养基时在倒置显微镜下观察细胞形态。待细胞长至90%融合时，用0.25%的胰酶消化传代，参见图1A，是经传代培养的大鼠BMSCs图；

1.5）留取3-6代细胞冻存于液氮备用，图1B是第三代BMSCs进行表面抗原流式细胞术鉴定结果图；图1C是第三代BMSCs进行诱导分化的结果图。

（2）BMSCs鉴定

2.1）流式细胞仪表面抗原鉴定取第3代细胞，调整浓度为1×10⁶/ml/管，吹打使分散，分别加入荧光标记的抗体Anti-CD31-FITC（检测结果如图2B所示，该图是大鼠PD-L1与GFP基因共转染大鼠BMSCs后GFP表达的荧光显微镜观察结果图），Anti-CD45-PE及Anti-CD29-PE，Anti-CD44-FITC，Anti-CD90-PerCP，Anti-CD105-PE，避光4℃孵育30min，PBS洗去未标记的抗体，1%多聚甲醛固定。上机检测，分析样本中细胞各表面标记的阳性率，其结果如图2C所示，该图是大鼠PD-L1与GFP基因共转染大鼠BMSCs后细胞纯度流式细胞术检测结果图。

2.2）诱导分化能力鉴定取第3代细胞以1×10⁴/孔铺于24孔板，以含10%FBS的DMEM培养液常规培养，待细胞达60%融合时，分别进行成骨和成脂培养，均设对照孔，每组6孔（成骨培养基组分为：DMEM培养基，10%FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μmol/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠；成脂培养基组分为：DMEM培养基，10%FBS，1μmol/L地塞米松，200μmol/L吲哚美辛，0.5mmol/L IBMX，10μg/ml胰岛素；对照培养基组分为：DMEM培养基，10%FBS）。于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔日换液。成脂及成骨诱导及相应对照组分别于诱导2周、3周以油红0染料、碱性磷酸酶染液进行着色鉴定。

实施例2：骨髓间充质干细胞体外基因转染及转染后表型鉴定。

（1）PD-L1基因片段的获取取Noway-Brown大鼠下肢肌肉组织中100mg，应用RNA-Trizol提取RNA。通过Takara反转录试剂盒在500ng的mRNA中合成。获取大鼠总cDNA。GeneBank中大鼠PD-L1基因序列为NM001191954.1，其电泳结果如图2A所示，该图是大鼠PD‐L1基因凝胶电泳结果图。

（2）构建慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PD-L1-IRES-GFP

使用Gateway技术的四载体系统构建慢病毒表达载体pLVpuro/EF1α-PD-L1-IRES-GFP。计含att位点的引物，在上、下游引物5′端分别加上attB1、attB2、attB2r和attB3。pLVpuro/EF1α-PD-L1-IRES-GFP表达克隆的构建和鉴定使用Invitrogen公司的LR重组反应酶，将入门克隆pUp-EF1α，pDown-PD-L1和pTail-IRES-GFP与目的载体pDEST-puromycin重组，取2uL重组反应液转化50uL Stbl3感受态细胞，氨苄西林LB培养板筛选阳性重组克隆并扩增，菌液行PCR扩增验证，挑取构建正确的菌落培养过夜，提取质粒DNA，测序验证。

（3）pLVpuro/EF-1α-PD-L1-IRES-GFP慢病毒包装

提前1天把293FT（5×10⁶个）细胞接种入10cm培养皿内，包装前2h，换入不含抗生素的293FT培养液，在一无菌5mL EP管中，取9ug ViraPower^TM LentiviralPackaging Mix和3ug载体质粒加入到1.5mL的Opti-MEM培养液中，轻轻摇匀，在另一无菌5mL EP管中，取36uL Lipofectamin^TM2000加入到Opti-MEM培养液混合，轻轻混匀，室温孵育20min，将混合物加入到培养皿中，37℃ 5%CO₂培养。12-16h后换液，加入新鲜293FT细胞培养液。72h后收集含病毒的培养上清。4℃3000r/min离心15min，去除细胞碎片，将病毒上清用0.45um滤器过滤转移入告诉离心管仲，4℃7500g告诉离心90min。此时，病毒颗粒沉淀于离心管底部及侧壁，去液体，用200uL1×PBS溶解，-80℃分装储存。

（4）pLVpuro/EF1α-PD-L1-IRES-GFP转染BMSCs

取p3代传代后3d状态良好的细胞，用慢病毒pLVpuro/EF1α-PD-L1-IRES-GFP进行转染。换液时加入1mL培养液于培养箱中预热后，加入病毒悬液20uL和polybrene（6mg/L），置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。12h后去除含病毒的培养液，换为L-DMEM培养液。第2天同样时间，再再1mL培养液中加入20uL病毒悬液和polybrene，12h后换液。连续感染3此后，用L-DMEM培养液继续培养，提取细胞膜蛋白进行鉴定。

（5）PD-L1-IRES-GFP-BMSCs目的基因的表达和细胞功能测定

以BMSCs为对照检测PD-L1-IRES-GFP-BMSCs目的基因的表达和细胞功能的变化，使用流式细胞仪检测细胞表面PD-L1和GFP及细胞周期。

实施例3：PD-L1转染骨髓间充质干细胞诱导免疫耐受

（1）体外实验PD-L1转染的BMSCs体外对T淋巴细胞活化增殖抑制试验麻醉LEWIS和BN（Norway-Brown）大鼠，取出脾脏，制成单细胞悬液，用含10%FBS的RPMI1640培养基将细胞浓度调整至5×106/ml，将BN大鼠脾细胞作为反应细胞备用。以PHA处理去增殖后的LEWIS大鼠脾细胞作为刺激物，体外刺激BN大鼠T细胞增殖。以BMSCs、PD-L1-MSCs为干预措施，检测其对淋巴细胞增殖的抑制作用。结果提示：PD-L1-MSCs体外可以明显抑制PHA刺激引起的淋巴细胞增殖反应。

（2）体内实验PD-L1转染的BMSCs对肢体移植排斥反应的抑制作用

A）大鼠异体后肢模型的建立

供肢准备选BN大鼠为供体，1%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，电推子剔除腹部平面以下体表毛发，75%酒精浸泡消毒5分钟，手术台上铺无菌无折纱布，固定各肢体，截肢平面为大腿中段。从供体大鼠股内侧开始切开皮肤及皮下脂肪组织，暴露骨神经、股动、静脉和腹壁浅动、静脉，结扎腹壁浅动、静脉，于股神经内侧与股血管束外侧间隙作钝性分离，游离髂外血管发出点至腹壁浅血管发出点之间的股动静脉，保护股动、静脉，结扎其向后侧肌群及内侧肌群各发出的一组分支。切断股内侧肌群、坐骨神经及其营养血管，然后切断外侧肌群及后侧肌群，注意保护腘窝内的腘动静脉及其在膝关节周围的各分支，沿骨膜向近端剥离部分骨皮质。肝素利多卡因温盐水（100mlN.S+肝素钠1ml+2%利多卡因5ml）保护血管蒂，湿盐水纱布保护供肢伤口待用。

受体准备以LEWIS大鼠为受体，消毒备皮后，截肢平面定为大腿中段、结扎股动脉的腹壁浅血管分支、向内侧肌群和后侧肌群的分支，尽量游离股动静脉至腹壁浅血管发出点以远，驱走肢体内血液后，接扎动静脉，以保留足够长度的股动静脉，保证血管回缩后吻合口无张力，切断肌肉、骨骼截除受体肢体。术中切断肌肉的平面低于供肢切取平面，便于与供肢肌肉进行缝合。

肢体移植及术后护理将供肢内残留血液以甘肃利多卡因温盐水彻底冲出至清亮。以1mm克氏钢针固定髓腔，缝合肌肉，在莱卡手术显微镜下，以11-0号线端端吻合股静脉及股动脉。吻合完毕，观察肢体血运供应，并给予估计失血量2.5倍的N.S腹腔缓慢注射以扩容，30分钟后若无血管危象，缝合皮肤，置于37℃电热毯待苏醒。单笼喂养，自由进食。术后一周存活率为100%。术后9-12天肢体出现肿胀、水泡形成、脱毛、肢体皮肤变黑等排斥表现。经病理切片证实成功建立了大鼠肢体移植排斥模型。

B）PD-L1转染的BMSCs经尾静脉移植于受体

肢体移植同时，用0.125%胰蛋白酶消化PD-L1转染的BMSCs，1×10⁶个细胞重悬于1mL 0.9%生理盐水中。待肢体移植完毕后，将其经尾静脉缓慢注射于体内，作为实验组（PD-L1-BMSCs组）。同时设BMSCs组及阴性对照组（1mL 0.9%生理盐水），其检测结果如图3A所示，该图是单向混合淋巴细胞反应检测转基因BMSCs的体外免疫抑制功能鉴定结果图。

C）术后观察及移植肢体存活情况的观察

术后大鼠苏醒好，肢体血运正常，术后均为发现血管栓塞等血管危象，大鼠精神、饮食、活动正常，无移植物抗宿主病表现。阴性对照组及BMSCs组受鼠术后1周后移植肢体逐渐出现肿胀、水泡形成、脱毛、肢体皮肤变黑、血运减少等排斥表现，于术后9-14天被完全排斥。PD-L1-BMSCs组受鼠移植肢体排斥时间明显推迟，术后18天后开始出现排斥反应，移植肢体于21-27天先后被完全排斥。经病理切片证实成功建立了大鼠肢体移植排斥模型。

参见图3B，大鼠异体肢体移植模型及各组大鼠生存率结果证实输注本发明中PD-L1基因修饰的BMSCs减轻受体对移植肢体的排斥反应，延长其存活，因而可以作为制备诱导移植肢体免疫耐受的新药物。

Claims (8)

1.经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用。

2.经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在抑制移植排斥反应中的应用。

3.经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在制备抗移植排斥反应药物中的应用。

4.经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在制备诱导外周免疫耐受药物中的应用。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用，其特征在于：所述经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞是将PD-L1基因通过重组慢病毒体外转染骨髓间充质干细胞得到的。

6.根据权利要求5所述的经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用，其特征在于：所述重组慢病毒是将PD-L1基因的慢病毒表达载体转染293FT细胞得到的。

7.根据权利要求6所述的经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用，其特征在于：所述PD-L1基因，是通过PD-L1表达克隆在慢病毒基因过表达载体pLV-Puro后获得的。

8.根据权利要求7所述的经PD-L1基因修饰的骨髓间充质干细胞在移植排斥反应中的应用，其特征在于：所述PD-L1表达克隆是通过Gateway克隆系统获得的。

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