CN109890398B - 可用于治疗心脏疾病并含有成纤维细胞的注射用组合物以及用于生产用于治疗用途的成纤维细胞的方法 - Google Patents

可用于治疗心脏疾病并含有成纤维细胞的注射用组合物以及用于生产用于治疗用途的成纤维细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明解决了如下问题：提供一种尚未建立的用于长期彻底治愈坏死的心脏组织区域以恢复心脏功能的有用的技术。该问题可通过注射用组合物来解决，所述组合物含有成纤维细胞并且可用于治疗心脏疾病，其中，所述成纤维细胞包括CD106阳性成纤维细胞，优选CD90阳性成纤维细胞。

Description

可用于治疗心脏疾病并含有成纤维细胞的注射用组合物以及 用于生产用于治疗用途的成纤维细胞的方法
技术领域
本发明涉及用于治疗心脏疾病的可注射组合物，所述组合物包含成纤维细胞；更具体而言，本发明涉及用于治疗心脏疾病的可注射组合物，所述组合物包含表达特定蛋白的成纤维细胞。本发明还涉及用于生产治疗用的成纤维细胞的方法，所述成纤维细胞可用于可注射组合物。
背景技术
由心肌梗死或心肌病引起的心力衰竭后的生存预后非常差，并且目前其根本治疗方法限于心脏移植。然而，目前，世界各地(不仅仅是日本)的患者正苦于捐赠者的数量不足，而不能接受充分的治疗，这是个问题。因此，近年来，通过再生医学治疗心脏疾病正引起关注，并且正在开发其技术。
例如，专利文献1等公开了细胞片层并正在研究此类片层向自体骨骼成肌细胞的发展。专利文献2等研究了用使用诱导多能干细胞的心肌片层治疗心脏疾病。
然而，尽管有这些研究，但还没有关于能长期且显著恢复已丧失的心脏功能的方法的报道，并且需要建立能够长期且从根本上治愈坏死的心脏组织区域以使心脏功能恢复的方法。
在此情况下，本发明人发现使用血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesionmolecule-1(VCAM-1)，CD106)阳性的成纤维细胞可获得功能性心脏细胞片层(参见专利文献3)。
现有技术文献
[专利文献]
[专利文献1]JP 2010-081829 A
[专利文献2]WO 2013/137491
[专利文献3]WO 2016/006262
发明内容
本发明待解决的问题
本发明的目的是提供尚未建立的、可用于实现坏死心脏组织区域的长期和根本治愈以使心脏功能恢复的方法。
解决问题的手段
为了解决上述问题，本发明人进行了研究，结果发现通过将特定种类的成纤维细胞给予(输注)至坏死的心脏组织区域可治疗心脏疾病，从而完成了本发明。本发明包括以下第一方面(发明A)。
(A1)用于治疗心脏疾病的可注射组合物，所述组合物包含成纤维细胞，其中，所述成纤维细胞含有血管细胞粘附分子-1(VCAM-1，CD106)阳性成纤维细胞。
(A2)根据(A1)所述的可注射组合物，其中，所述成纤维细胞含有胸腺细胞抗原-1(Thymus cell antigen-1(Thy-1)，CD90)阳性成纤维细胞。
(A3)根据(A1)或(A2)所述的可注射组合物，其中，所述成纤维细胞含有连接蛋白43(connexin 43，Cx43)阳性成纤维细胞。
(A4)根据(A1)-(A3)中任一项所述的可注射组合物，其中，所述CD106阳性成纤维细胞与所述可注射组合物中含有的成纤维细胞的总量的比(就细胞数而言)不少于0.03％。
本发明还包括以下第二方面(发明B)。
(B1)用于生产治疗用成纤维细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
提供成纤维细胞；以及
从所述成纤维细胞中筛选CD106阳性成纤维细胞。
(B2)根据(B1)所述的生产方法，其中，所述治疗用成纤维细胞用于治疗心脏疾病。
(B3)根据(B1)或(B2)所述的生产方法，所述方法进一步包括从成纤维细胞中筛选CD90阳性细胞的步骤。
(B4)根据(B1)-(B3)中任一项所述的生产方法，其中，所述治疗用成纤维细胞含有连接蛋白43阳性成纤维细胞。
(B5)根据(B1)-(B4)中任一项所述的生产方法，其中，所述CD106阳性成纤维细胞与所述治疗用成纤维细胞的总细胞量的比(就细胞数而言)不少于0.03％。
本发明还包括以下第三方面(发明C)。
(C1)用于治疗心脏疾病的方法，所述方法包括实施以下：将含有成纤维细胞的可注射组合物注射至坏死的心脏组织区域内或其附近；和/或将所述组合物输注至冠状动脉内，其中，所述成纤维细胞含有CD106阳性成纤维细胞。
(C2)根据(C1)所述的用于治疗心脏疾病的方法，其中，所述成纤维细胞含有CD90阳性成纤维细胞。
(C3)根据(C1)所述的用于治疗心脏疾病的方法，其中，所述成纤维细胞含有连接蛋白43阳性成纤维细胞。
(C4)根据(C1)所述的用于治疗心脏疾病的方法，其中，所述CD106阳性成纤维细胞与所述可注射组合物中含有的成纤维细胞的总量的比(就细胞数而言)不少于0.03％。
本发明还包括以下第四方面(发明D)。
(D1)成纤维细胞作为可注射组合物的用途，其中，所述成纤维细胞含有CD106阳性成纤维细胞。
(D2)根据(D1)所述的用途，其中，所述成纤维细胞含有CD90阳性成纤维细胞。
(D3)根据(D1)或(D2)所述的用途，其中，所述成纤维细胞含有连接蛋白43阳性成纤维细胞。
(D4)根据(D1)-(D3)中任一项所述的用途，其中，所述CD106阳性成纤维细胞与所述可注射组合物中含有的成纤维细胞的总量的比(就细胞数而言)不少于0.03％。
发明效果
通过本发明，提供了用于治愈坏死的心脏组织区域以恢复心脏功能的有效手段。
附图说明
图1A示出了说明在CD106阳性小鼠心脏成纤维细胞中VCAM-1蛋白的定位的图表。
图1B示出了CD106阳性小鼠心脏成纤维细胞的VCAM-1阳性免疫荧光图像(代替附图的照片)。
图1C示出了各种类型的成纤维细胞的连接蛋白43阳性免疫荧光图像(代替附图的照片)。
图2A示出了说明注射CD106阳性小鼠心脏成纤维细胞后的心脏功能(射血分数(Ejection Fraction)，左心室射血分数)的图表。
图2B示出了说明注射CD106阳性小鼠心脏成纤维细胞后的心脏功能(缩短分数(Fractional Shortening)，左心室缩短分数)的图表。
图2C示出了大鼠心脏的超声心动描记(echocardiographic)图像(代替附图的照片)。
图3A示出了大鼠心脏中胶原纤维化梗死区域的图像(代替附图的照片)。
图3B示出了显示大鼠心脏中胶原纤维化梗死面积的图表。
图4示出了说明心脏功能(左心室缩短分数(FS)和左心室射血分数(EF))的图表。
图5示出了大鼠慢性心力衰竭模型的心脏功能随访(follow-up)时间表，该随访通过超声心动描记术进行。为了确认CD106阳性大鼠成纤维细胞对慢性心力衰竭的治疗效果，通过超声心动描记术以两周的间隔从给予细胞当日至第18周进行心脏功能的随访。
图6示出了大鼠慢性心力衰竭模型的心脏功能随访时间表，该随访通过超声心动描记术进行。为了确认CD106阳性人成纤维细胞对慢性心力衰竭的治疗效果，通过超声心动描记术以两周的间隔从给予细胞当日至第18周进行心脏功能的随访。为了研究CD106阳性人成纤维细胞的最佳剂量，通过超声心动描记术以两周的间隔从给予细胞当日至第8周进行心脏功能的随访。为了提供对照，在给予培养基后第2周、第4周、第8周、第12周、第16周和第18周通过超声心动描记术进行心脏功能的随访。
图7示出了给予CD106阳性大鼠成纤维细胞(2.0×106个细胞/50μL)对大鼠慢性心力衰竭模型中心脏功能恢复的作用。(A)表示左心室射血分数(LVEF＝(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3)；(B)表示左心室缩短分数(LVFS＝(LVIDd-LVIDs)×100/LVIDd)；(C)表示左心室舒张末期容积(LVEDV)；以及(D)表示左心室收缩末期容积(LVESV)。N＝4。
图8示出了各种心脏成纤维细胞中CD106阳性细胞和CD90阳性细胞的比例(％)。对高加索人胎儿(第21周)心脏来源的成纤维细胞(c21wFCF)、高加索人成年人(50多岁)心脏来源的成纤维细胞(c50yACF)以及黑人成年人(60多岁)心脏来源的成纤维细胞(b60yACF)进行比较分析。
图9示出了通过由autoMACS的分选所收集的CD106阳性人成纤维细胞中CD106-CD90阳性细胞的比例(％)。
图10示出了：CD106阳性人成纤维细胞中Oct3/4阳性细胞的比例(％)(A)；CD106阳性人成纤维细胞中Nanog阳性细胞的比例(％)(B)；以及CD106阳性人成纤维细胞中Sox2阳性细胞的比例(％)(C)。N＝3。N.S.＝无显著性。
图11示出了CD106阳性人成纤维细胞的细胞特性。对基质细胞/间充质干细胞标志物(波形蛋白)、上皮细胞标志物(细胞角蛋白)以及心肌细胞缝隙连接标志物(连接蛋白43)的定位进行评价。
图12示出了CD106阳性人成纤维细胞中STRO-1阳性细胞的比例(％)。在用FSC-A和SSC-A识别细胞区域后，对CD106(VioBlue-A)和CD90(PE-A)双阳性的细胞群中的STRO-1(FITC-A)阳性细胞的比例(％)进行了评价。使用上述抗体的同种型对照作为阴性对照。
图13示出了给予CD106阳性人成纤维细胞(2.0×106个细胞/50μL)对大鼠慢性心力衰竭模型中心脏功能恢复的作用。(A)表示左心室射血分数(LVEF＝(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3)；(B)表示左心室缩短分数(LVFS＝(LVIDd-LVIDs)×100/LVIDd)；(C)表示左心室舒张末期容积(LVEDV)；以及(D)表示左心室收缩末期容积(LVESV)。N＝4。
图14示出了以不同剂量给予CD106阳性人成纤维细胞对在大鼠慢性心力衰竭模型中心脏功能恢复的作用。(A)表示左心室射血分数(LVEF＝(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3)；(B)表示左心室缩短分数(LVFS＝(LVIDd-LVIDs)×100/LVIDd)；(C)表示左心室舒张末期容积(LVEDV)；以及(D)表示左心室收缩末期容积(LVESV)。N＝4。N.S.＝无显著性。
图15示出了猪慢性心力衰竭模型中心脏功能的评价结果，该评价在给予CD106阳性人成纤维细胞的前一天进行(代替附图的照片)。
图16示出了猪慢性心力衰竭模型中心脏功能的评价结果，该评价在给予CD106阳性人成纤维细胞后4周进行(代替附图的照片)。
图17示出了猪慢性心力衰竭模型中心脏功能的评价结果，该评价在给予CD106阳性人成纤维细胞后8周进行(代替附图的照片)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行详细描述。然而，本发明并不限于所描述的具体实施方式。
本发明的一个实施方式是用于治疗心脏疾病的可注射组合物，所述组合物包含成纤维细胞，其中，所述成纤维细胞含有CD106阳性(下文也称为CD106+)成纤维细胞。
所述成纤维细胞包括最终成为成纤维细胞或肌成纤维细胞的任何细胞。也就是说，本实施方式中的成纤维细胞的范围包括处于分化或成熟过程中并最终成为成纤维细胞或肌成纤维细胞的细胞(即使在细胞在那个时间点不能被认定为成纤维细胞或肌成纤维细胞的情况下)。本实施方式中的成纤维细胞的范围还包括不叫做成纤维细胞的细胞(例如，基质细胞、前体细胞、干细胞和成肌细胞(myoblast))，只要它们是具有与成纤维细胞的功能类似的功能的CD106+细胞即可。
CD106+成纤维细胞的特征在于它们是波形蛋白(其为成纤维细胞和间充质干细胞的细胞骨架标志物)阳性的，以及STRO-1(间充质干细胞(MSC)最著名的分子标志物之一)阴性的。
成纤维细胞的来源不受限制，并且这些细胞可通过以下细胞的分化而获得：多能干细胞或专能干细胞(multipotent stem cell)，例如胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能干细胞(iPS细胞)或Muse细胞；或成体干细胞，例如间充质干细胞。可使用从动物(包括人)收集的原代细胞，或可使用已建立的细胞系。优选使用心脏来源的成纤维细胞，并且更优选使用心外膜来源的成纤维细胞。
特别是，当使用来源于人的成纤维细胞时，通过注射可获得对心脏疾病的高的治疗效果。与小鼠等相比，来源于人的成纤维细胞显示出低得多的CD106+成纤维细胞比例。根据本发明人的研究，该比例为至多约9.1％(就细胞数而言)。因此，本发明还可包括人源成纤维细胞群，其中，通过后面提及的筛选步骤等增加人源CD106+成纤维细胞的比例。例如，本发明的另一方面可为人源成纤维细胞群，其中，在总人源成纤维细胞中人源CD106+成纤维细胞的比例(就细胞数而言)不少于10％。在总成纤维细胞中CD106+成纤维细胞的比例(就细胞数而言)可不少于15％，可不少于20％，可不少于25％，可不少于30％，可不少于40％，可不少于50％，可不少于60％，可不少于70％，可不少于80％，可不少于90％，或者可为100％。本文的人源成纤维细胞群可为人心脏来源的成纤维细胞群，可为人成体心脏来源的成纤维细胞，或者可为人胎儿心脏来源的成纤维细胞群。
通过选择已知为CD106+的细胞，可省略细胞分选过程。
CD106(也称为VCAM-1)是已知在血管内皮细胞等中表达的细胞粘附分子的蛋白。在本实施方式中，将CD106+(即VCAM-1阳性(VCAM-1+))成纤维细胞用作用于治疗心脏疾病的可注射组合物。
用作可注射组合物的CD106+成纤维细胞通过直接注射至坏死的心肌组织区域能够治疗心脏疾病。此外，细胞可注射至坏死的心肌组织区域的附近，可输注至冠状动脉内，或者可输注到静脉、动脉、淋巴结或淋巴管内。向冠状动脉内输注或者向静脉、动脉或淋巴管内输注可通过注射至脉管内或通过导管输注来进行，或者可使用其它已知的方法。
注射方法不受限制，并且可将已知的注射方法(例如针注射或无针注射)应用于此。使用导管输注的方法也不受限制，并且可将已知的方法应用于此。
所述可注射组合物还可含有另一种成纤维细胞或另一组分，只要该组合物含有治疗有效量的CD106+成纤维细胞作为有效组分即可。在含有另一种成纤维细胞的情况下，就细胞数而言，CD106+成纤维细胞与可注射组合物中含有的成纤维细胞的总量的比可不少于0.03％，可不少于0.1％，可不少于1％，可不少于2％，可不少于4％，可不少于5％，可不少于10％，可不少于20％，可不少于30％，可不少于40％，可不少于50％，可不少于60％，可不少于70％，可不少于80％，可不少于90％，可不少于95％，可不少于98％，或可不少于99％。
可注射组合物中所含有的CD106+成纤维细胞可为通过与其它细胞(例如心肌细胞)共培养而制备的细胞。
本实施方式中的心脏疾病的实例包括但不限于由心肌组织的紊乱(disorder)、缺陷、功能障碍等引起的疾病，例如心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗死、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病以及扩张型心肌病。
可注射组合物中所含有的CD106+成纤维细胞可为CD90阳性(CD90+)。也就是说，所述可注射组合物可含有CD90阳性成纤维细胞。CD90(也称为Thy-1)是富含糖链的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)连接分子。CD90在神经组织、结缔组织等的各种基质细胞系中表达，但在心肌细胞中不表达。因此，术语“CD90+成纤维细胞”意指不含心肌细胞。对于本文所使用的术语“不含心肌细胞的CD90+成纤维细胞”而言，存在一定量的心肌细胞是可接受的。就细胞数而言，相对于可注射组合物中含有的总细胞，心肌细胞的量可不多于5％、不多于4％、不多于3％、不多于2％、不多于1％、不多于0.5％、不多于0.1％、或不多于0.01％。
CD106+成纤维细胞中CD90+成纤维细胞的比例(就细胞数而言)可不少于30％，可不少于40％，可不少于50％，可不少于60％，可不少于70％，可不少于80％，可不少于90％，可不少于95％，可不少于98％，或者可为100％。
在本发明的某些实施方式中，可提供含有CD106+CD90+成纤维细胞的成纤维细胞群。在该成纤维细胞群中，就细胞数而言，CD106+CD90+成纤维细胞的比例可多于8.2％、不少于8.5％、不少于9％、不少于10％、不少于15％、不少于20％、不少于30％、不少于40％、不少于50％、不少于60％、不少于70％、不少于80％、不少于90％、不少于95％、不少于97％、不少于98％、不少于99％或100％。在这些方式中，所述CD106+CD90+成纤维细胞可例如来源于人。在这些实施方式中，所述CD106+CD90+成纤维细胞可例如是心脏来源的成纤维细胞。在这些实施方式中，所述CD106+CD90+成纤维细胞可例如是人心脏来源的成纤维细胞。所述CD106+CD90+成纤维细胞可通过例如使用细胞分选仪等从组织浓缩CD106+CD90+细胞而获得。在这些方式中，成纤维细胞可为从人胎儿收集的成纤维细胞。
CD106+CD90+成纤维细胞能够通过分泌细胞因子等来控制炎症反应，以维持器官的内稳态(homeostasis)。所分泌的细胞因子、趋化因子等形成适于心脏肌肉组织再生的微环境，并促进心肌细胞的生长、对心肌细胞搏动的控制和/或血管生成，从而使心脏功能改善。此外，CD106+CD90+成纤维细胞能够抑制纤维化的进展。
因此，本说明书可包括心脏炎症反应控制剂(或心脏炎症抑制剂)的发明，所述控制剂含有CD106+CD90+成纤维细胞或所述细胞的纯化产物。本说明书还可包括以下发明：用于心脏细胞的细胞因子分泌促进剂，该试剂含有CD106+CD90+成纤维细胞或这些细胞的培养上清液；或细胞因子分泌控制剂，所述控制剂含有CD106+CD90+成纤维细胞的培养上清液或细胞裂解物，或者含有这些细胞的纯化产物。本说明书还可包括用于心脏组织的微环境形成剂的发明，该试剂含有CD106+CD90+成纤维细胞。本说明书还可包括以下发明：心肌细胞生长剂、心肌细胞的搏动控制剂或促进心肌细胞成熟或血管生成的试剂，其中含有CD106+CD90+成纤维细胞。
换句话说，可提供用于控制心脏炎症反应的方法，所述方法包括以下步骤：将CD106+CD90+成纤维细胞注射至坏死的心脏组织区域内或其附近和/或将这些细胞输注至冠状动脉内。此外，可提供用于控制细胞因子分泌的方法或用于促进细胞因子分泌的方法，所述方法包括以下步骤：将CD106+CD90+成纤维细胞注射至坏死的心脏组织区域内或其附近，和/或将这些细胞输注至冠状动脉内。此外，可提供用于在心脏组织中形成微环境的方法，所述方法包括以下步骤：将CD106+CD90+成纤维细胞注射至坏死的心脏组织区域内或其附近和/或将这些细胞输注至冠状动脉内。
细胞因子是负责参与免疫或炎症的信号转导的蛋白，并且所述细胞因子包括已知的细胞因子。
可注射组合物中含有的CD106+成纤维细胞可为连接蛋白43阳性(连接蛋白43+)成纤维细胞。也就是说，所述可注射组合物可含有连接蛋白43阳性成纤维细胞。
连接蛋白43是一种跨膜蛋白，已知在伴有动脉硬化斑块的血管壁上表达，并且作为心肌细胞的缝隙连接与相邻细胞结合以参与传送心脏电兴奋的传送。本发明人认为连接蛋白43能够正向地使电信号在心肌组织中传递，从而改善可注射组合物的治疗效果。
CD106+成纤维细胞中连接蛋白43+成纤维细胞的比例(就细胞数计)可不少于30％，可不少于40％，可不少于50％，可不少于60％，可不少于70％，可不少于80％，可不少于90％，可不少于95％，可不少于98％或者可为100％。
所述可注射组合物可含有生理学上可接受的其它组分作为可注射组成成分。此类其它组分的实例包括生理盐水、细胞保存液、细胞培养基、水凝胶、细胞外基质和冷冻保存液。
可注射组合物中含有的CD106+成纤维细胞的比例可基于例如注射或输注的模式适当地设置，从而使得含有治疗有效量的CD106+成纤维细胞作为有效组分。通常，就细胞数而言，CD106+成纤维细胞与可注射组合物中细胞的总量的比可不少于0.03％、可不少于1％，可不少于5％，可不少于10％，可不少于25％，可不少于50％，可不少于90％，可不少于95％，可不少于98％，或者可为100％。
可注射组合物中含有的CD106+成纤维细胞的数量可为例如不少于1.0×102个细胞/mL、不少于1.0×103个细胞/mL、不少于1.0×104个细胞/mL、不少于1.0×105个细胞/mL、不少于5.0×106个细胞/mL、或不少于1.0×107个细胞/mL。可注射组合物中含有的CD106+CD90+成纤维细胞的数量可为例如不少于1.0×102个细胞/mL、不少于1.0×103个细胞/mL、不少于1.0×104个细胞/mL、不少于1.0×105个细胞/mL、不少于5.0×106个细胞/mL、或不少于1.0×107个细胞/mL。可注射组合物中含有的CD106+成纤维细胞的数量可进一步增加或减少，这取决于心脏疾病的情况。
下面对用于生产可注射组合物中所含的成纤维细胞的方法进行描述。关于用于生产成纤维细胞的方法，可参考本发明人的先前报道(WO 2016/006262)，并且该方法可根据这一报道进行。
(提供成纤维细胞的步骤)
在提供成纤维细胞的步骤中，成纤维细胞的来源不限于如上所述。可采用基于自体移植的实施方式，并且在此种情况下，提供如下细胞：从具有心脏疾病的患者的心脏组织分离的心脏成纤维细胞；或患者的成体(体)干细胞分化后分离的心脏成纤维细胞。成纤维细胞也可为iPS细胞分化后收集的成纤维细胞。此外，可采用基于同种异体移植的实施方式，并且在此种情况下，提供如下细胞：从来源于提供心脏细胞的供体的心脏组织中分离的心脏成纤维细胞，或从使用动物等制备的心脏组织中分离的心脏成纤维细胞；或者供体的成体(体性)干细胞分化后分离的心脏成纤维细胞。所述成纤维细胞也可为来源于供体的iPS细胞分化后收集的成纤维细胞。
(分离成纤维细胞的步骤)
所提供的成纤维细胞通常可使用酶(如分散酶或胶原酶)进行处理，以实现分离用于培养。分离可用酶(如分散酶或胶原酶)或通过其它处理(如机械处理)进行，只要其允许原代培养之前所需的分离即可。
(筛选CD90阳性成纤维细胞的步骤)
可对成纤维细胞进行筛选以增加CD90+成纤维细胞的比例。通过该筛选，可将心肌细胞从成纤维细胞中除去。筛选的实例包括使用抗CD90抗体的细胞分选方法(如流式细胞术、磁珠法、亲和柱法和淘选法)。更具体地，例如可使用磁性细胞分选(MACS)或荧光激活细胞分选(FACS)。抗CD90抗体可为可商购的产品，或者可通过已知的方法制备。可使用单克隆抗体或多克隆抗体，但从特异性的角度，优选使用单克隆抗体。或者，可通过引入用于除去CD90阴性成纤维细胞的药物抗性基因来进行筛选。或者，可引入荧光蛋白编码基因，然后可通过荧光激活细胞分选(FACS)等分离荧光蛋白阳性细胞。
(筛选具有粘附性的细胞的步骤)
成纤维细胞的筛选可通过利用粘附性方面的差异来进行。由于CD90阳性成纤维细胞具有允许其粘附于未经包被的培养皿(未用明胶等进行包被)的特性，通过该步骤可增加成纤维细胞的纯度。更具体地，将成纤维细胞铺在未经包被的培养皿上，并培养例如2小时、4小时、6小时、8小时、12小时或24小时。通过收集粘附于培养皿的成纤维细胞可进行筛选。
(筛选CD106+成纤维细胞的步骤)
为了在可注射组合物中包含CD106+成纤维细胞，通常使成纤维细胞经历筛选CD106+成纤维细胞的步骤。在不进行此类步骤即可获得CD106+成纤维细胞的情况中，可省略该步骤。筛选CD106+成纤维细胞的实例包括使用抗CD106抗体(抗VCAM-1抗体)的细胞分选方法(例如流式细胞术、磁珠法、亲和柱法和淘选法)。更具体地，例如可使用磁性细胞分选(MACS)或荧光激活细胞分选(FACS)。抗CD106抗体可为可商购的产品，或者可通过已知的方法制备。或者，可通过引入用于除去CD106阴性成纤维细胞的药物抗性基因来进行筛选。或者，可引入荧光蛋白编码基因，然后可通过荧光激活细胞分选(FACS)等分离荧光蛋白阳性细胞。可使用单克隆抗体或多克隆抗体，但从特异性的角度，优选使用单克隆抗体。或者，可将例如实时PCR、下一代测序或原位杂交的方法用于确认细胞中CD106基因的表达，然后可对表达CD106基因的组进行分离。
(培养步骤)
出于例如获得期望的细胞数和/或使细胞具有期望功能的目的，可使成纤维细胞经历培养步骤。培养条件不受限制，并且可通过已知的细胞培养方法进行培养。
可适当地设置用于培养的培养基，这取决于例如待培养的细胞类型。可使用的培养基的实例包括DMEM、α-MEM、HFDM-1(+)以及RPMI-1640。可向培养基中添加营养物质(如FCS和FBS)、生长因子、细胞因子、抗生素等。
出于例如获得期望的细胞数和/或使细胞具有期望功能的目的，可适当地设置培养期的天数。培养期的实例包括例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、1个月、2个月、3个月和6个月的时期。
可适当地设置培养温度，这取决于待培养的细胞类型。培养温度可为例如不低于10℃、不低于15℃、不低于20℃、不低于25℃、或不低于30℃、并且可为例如不高于60℃、不高于55℃、不高于50℃、不高于45℃、或不高于40℃。
培养步骤可进行多次。例如，在每次通过筛选增加期望的成纤维细胞的纯度时可进行培养。
(收集步骤)
通过收集步骤对培养的成纤维细胞进行收集。在收集步骤中，使用蛋白酶(如胰蛋白酶)可使细胞脱离，然后收集。或者，可使用温度反应性培养皿，并且可通过改变温度来使细胞脱离，然后收集细胞。
在本发明的另一实施方式中，可提供用于生产治疗用的成纤维细胞的方法，所述方法包括上述描述的步骤之中的筛选CD106+成纤维细胞的步骤。
此外，可提供用于生产治疗用的成纤维细胞的方法，所述方法包括上述描述的步骤之中的筛选CD106+成纤维细胞的步骤以及筛选CD90+成纤维细胞的步骤。
此外，可提供用于生产治疗用的成纤维细胞的方法，所述方法包括上述描述的步骤中的一个或者两个以上的任意组合。
在本发明的另一实施方式中，可提供用于治疗心脏疾病的方法，所述方法包括：将含有成纤维细胞的可注射组合物输注至坏死的心脏组织区域内或其附近，和/或输注至冠状动脉，或静脉、动脉、淋巴结或淋巴管中；其中，所述成纤维细胞含有CD106+成纤维细胞。
此外，可提供成纤维细胞作为可注射组合物的用途，其中，所述成纤维细胞含有CD106+成纤维细胞。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行更详细地描述。然而，本发明的范围不限于此。
[通过给予CD106+小鼠成纤维细胞改善心脏功能]
<动物和试剂>
野生型C57BL/6小鼠和野生型Slc：SD大鼠购自日本SLC Inc.(Shizuoka，日本)。
以下抗体用于免疫荧光染色和荧光激活细胞分选(FACS)：小鼠单克隆抗CD106(VCAM-1)-PE(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国)、兔多克隆抗连接蛋白43(Cellsignaling technology，MA)、小鼠单克隆抗波形蛋白(Abcam，Cambridge，UK)；以及Hoechst33258溶液(St.Louis，MI)。
二抗购自Jackson Immuno Reserch Laboratories(West Grove，PA)。
<成纤维细胞和心肌细胞>
根据先前的报道(Matsuura K等，Biomaterials.2011；32：7355-7362)从野生型C57BL/6小鼠(新生，1日龄)获得小鼠心脏成纤维细胞。在10cm培养皿中将所获得的细胞培养于高葡萄糖DMEM+10％ FBS中。培养开始后3-5天，用0.05％胰蛋白酶/EDTA使细胞脱离，然后在另一10cm培养皿中进行传代培养。
来源于小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的心肌细胞(Cor.AT)购自Axiogenesis AG(Cologne，德国)。根据说明书进行向心肌细胞的分化以及细胞的纯化。
<CD106+小鼠心脏成纤维细胞的荧光激活细胞分选(FACS)>
小鼠心脏成纤维细胞(2×107个细胞/实验)用小鼠抗CD106(VCAM-1)-PE抗体进行染色。根据说明书进行染色。通过S3e细胞分选仪(Bio-Rad，PA)分离CD106+成纤维细胞。
<免疫荧光染色>
如在先前的报道(Matsuura K等，Biomaterials.2011；32：7355-7362)中所描述，将细胞用4％多聚甲醛固定，然后进行免疫荧光染色。使用IN Cell Analyzer 2200(GEHealthcare，Buckinghamshire，UK)和IN Cell Developer Toolbox 1.9.2(GEHealthcare)对染色的样品进行分析。
<手术处理程序>
通过以下方式诱导大鼠心力衰竭：在吸入麻醉下使冠状动脉左前降支(LAD)闭塞30分钟，然后使血流再灌注。更具体而言，首先提供11天至12周龄的雄性Slc：SD大鼠(369.0g-506.5g，日本SLC Inc.，Shizuoka)。提供含有0.15mg/kg盐酸美托咪啶、2mg/kg咪达唑仑和2.5mg/kg酒石酸布托啡诺的混合物，然后用生理盐水稀释。将所得的稀释液以10mL/kg的体积腹膜内给予至每只大鼠以进行麻醉，然后剪掉并移除胸部周围的毛发。移除毛发后，经口插入气管导管，并使用用于小动物的呼吸机(型号SN-480-7×2T，ShinanoManufacturing Co.,Ltd)进行人工呼吸(潮气量：2.0-2.5mL/冲程，呼吸速率：75冲程/分钟)。使用吸入麻醉装置(型号KN-1071，Natsume Seisakusho Co.,Ltd)用2％异氟烷维持麻醉，并且以仰卧位或侧卧位固定大鼠。
用Isodine溶液将切口部位消毒，然后喷洒利多卡因以缓解疼痛。在胸部侧面通过胸廓切开术使心脏暴露，并在必要时肌内给予硫酸阿托品(0.02mg/kg)以防止心律失常。使用无创伤针(6-0VICRYL)(Johnson&Johnson，NJ)，使冠状动脉左前降支(LAD)闭塞30分钟。通过监测心电图，基于ST电位升高以及心脏肌肉变白(目视观察)，探究闭塞(发生心肌缺血)存在与否。在出现心室纤维性颤动(VF)的情况下，进行复苏(使用环钳直接刺激心脏)以终止心室纤维性颤动。在闭塞30分钟后使血流再灌注，制备了缺血-再灌注模型。
再灌注后，进行心肌内注射。然后，将胸部关闭，用无创伤针(3-0VICRYL)(Johnson&Johnson，NJ)缝合，然后用Isodine溶液将缝合部位消毒。
将大鼠分成以下四个处理组。
(S1)注射CD106+小鼠成纤维细胞和小鼠心肌细胞(含有4×105个成纤维细胞和1.6×106个心肌细胞的50μL高葡萄糖DMEM+10％新生牛血清(NBCS))
(S2)注射CD106+小鼠成纤维细胞(含有2×106个成纤维细胞的50μL高葡萄糖DMEM+10％ NBCS)
(S3)仅进行手术处理的组
(S4)未进行手术处理的组
在损伤区域附近的两个位置处进行细胞注射(25μL/注射)。
<心脏功能的评价>
为了比较评价所制备的模型大鼠的左心室功能，在注射细胞后以2周的间隔从第0周至第10周通过进行心脏超声扫描术(超声心动描记术)对心脏功能进行监测。
使用超声诊断装置(Nolus，Hitachi，Ltd)进行心脏超声扫描术(超声心动描记术)。更具体地，将浅表线性探针置于大鼠的胸部上，并通过M模式对如下项目进行测量：左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室前壁舒张末期厚度(LVAWd)、左心室游离壁舒张末期厚度(LVPWd)和左心室游离壁收缩末期厚度(LVPWs)。作为左心室舒张末期容积(LVEDV)和左心室收缩末期容积(LVESV)，采用由回声装置自动计算的值。此外，基于绘制的M模式图像，对左心室心外膜表面(D2)的位移进行测量。计算左心室伸展性指数(An index for the left ventricular extensibility)EMI＝(LVPWs-LVPWd)/(LVPWs×D2)及其简化指数DWS＝(LVPWs-LVPWd)/LVPWs。此外，根据以下等式和图4，计算左心室缩短分数(FS)和左心室射血分数(EF)。
左心室缩短分数(FS)＝(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100
左心室射血分数(EF)＝(LVEDV-LVESV)/LVEDV)×100
<组织学实验>
通过浸入10％缓冲的福尔马林溶液中将取出的心脏的左心室固定。在短轴方向上将左心室分成三部分，从而使得将在结扎的正下方位置和心尖之间的长轴方向上的长度等分成三份。将心脏肌肉的各个部分包埋在一个石蜡块中，从而将起始侧定位于包埋面。制备薄切片之后，进行Masson三色染色。将Masson三色染色后的样品图像捕获至图像分析仪(通用图像处理器“Win ROOF 5.5版本”，Mitani Corporation)中，并由该图像分析仪测量三个部分中的每一个的心肌梗死面积(％)。
<统计分析>
心脏功能的评见结果表示为平均值±SE(标准误差)。所有其它数据表示为平均值±SD(标准偏差)。通过单因素方差分析计算三组或更多组之间的变化差异。随后，通过Tukey-Kramer多重比较检验计算三组之间的显著性差异。当p值小于0.05时，假定差异的显著性。所有统计计算均使用Statcel软件进行。
<小鼠心脏成纤维细胞中VCAM-1蛋白的定位>
为了分离CD106+成纤维细胞(其改善心肌细胞的生长和迁移)，探究了小鼠心脏成纤维细胞中VCAM-1蛋白的表达(图1A)。对CD106+成纤维细胞区域进行严格选择以除去阴性细胞。约39.2％的心脏成纤维细胞是CD106+成纤维细胞。随后，为了评价CD106+成纤维细胞是否长期均匀地表达VCAM-1，将CD106+成纤维细胞体外培养直至第18周，以评价VCAM-1蛋白的表达(图1B)。在所有的CD106+成纤维细胞中，VCAM-1蛋白的高表达水平在整个18周内得以维持。此外，CD106+成纤维细胞高表达连接蛋白43(即用于心肌电网络传递的缝隙连接蛋白)(图1C)。基于这些发现，可以理解的是CD106+成纤维细胞具有持续表达VCAM-1蛋白以及传送心脏电兴奋的能力。
<心肌梗死后通过CD106+小鼠成纤维细胞改善心脏功能>
根据超声心动描记术，在注射后第2周至第10周，相比于S3组和S4组，S1组和S2组显示出左心室射血分数(EF)和左心室缩短分数(FS)改善。另一方面，S1组和S2组之间的EF或FS没有显著差异(图1A，图2B)。因此，可以理解的是给予CD106+成纤维细胞引起由心肌梗死损伤的心脏的泵送能力改善。心肌细胞的存在对可注射组合物的组成成分而言并不重要。
<通过CD106+小鼠成纤维细胞改善胶原纤维化梗死区域>
在注射后第10周，制备心脏的病理组织标本，并进行Masson三色染色。结果，可以确认S1组和S2组中的胶原纤维化梗死区域显著小了(图3A)。此外，使用图像分析软件测量胶原纤维化梗死面积(％)的结果是，发现纤维化区域在S2中显著小了(图3B)。因此，可以理解的是，给予CD106+成纤维细胞不仅引起由心肌梗死等损伤的心脏的收缩功能的改善，而且还引起对胶原纤维化的显著抑制。心肌细胞的存在对可注射组合物的组成成分而言并不重要。
通过上述实验，首先证明了VCAM-1阳性成纤维细胞对缺血性心脏病的有效治疗而言的重要性，并且可以理解的是，给予CD106+成纤维细胞可在心脏疾病的治疗中产生期望的结果。给予VCAM-1阳性成纤维细胞可用于有效缓解缺血性心脏病的治疗。此外，由于给予表达VCAM-1的心脏成纤维细胞的结果是发现显著改善心脏功能以及明显抑制胶原纤维化，可以理解所述给予对于其它心脏疾病的治疗也有效。
[通过给予CD106+大鼠成纤维细胞改善心脏功能]
随后，探究了通过向大鼠给予CD106+大鼠成纤维细胞对心脏功能的改善。
<成纤维细胞和心肌细胞>
从Slc：SD胚胎大鼠(胚胎第20天)收集心脏，并使用gentleMACS(MiltenyiBiotec)将其组织进行匀浆，然后基于与基础培养-材料表面的粘附性方面的差异收集大鼠心脏成纤维细胞。在10cm培养皿中将所获得的细胞培养于高葡萄糖DMEM(补充有10％NBCS)中。培养开始后3-5天，用0.05％胰蛋白酶/EDTA使细胞脱离，然后在另一10cm培养皿中进行传代培养。
<细胞分选>
用CD106(VCAM-1)-生物素抗体，大鼠(Miltenyi Biotec)对细胞进行初次免疫染色，然后用抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)进行二次免疫染色。通过autoMACS(MiltenyiBiotec)从染色的细胞中单独收集CD106阳性的细胞，以提供CD106+大鼠成纤维细胞。
<慢性心力衰竭大鼠模型的制备和超声心动描记测量>
8周龄的雄性裸大鼠(F344/N Jcl-rnu/rnu)购自CLEA Japan,Inc.(Tokyo，日本)。在适应1周后，使用用于实验动物的吸入麻醉装置(Soft Lander(Shin-ei Industries,Inc.，Saitama，日本))用2％异氟烷(麻醉剂佐剂；笑气:氧＝7:3)对每只动物进行吸入麻醉，然后剪掉毛发。之后立即进行气管插管，并将0.5％-2％的异氟烷(麻醉剂佐剂；笑气:氧＝7:3)吸入麻醉气体直接引入呼吸机以维持麻醉。在人工呼吸管理下，以仰卧位将动物固定，并且在左侧第三肋骨和第五肋骨之间的两根或三根肋骨、肋软骨处通过纵向切割进行胸廓切开术。使用牵开器扩大手术区，并剥离围心膜以使心脏暴露。举起左心房，并使用用于血管的无创伤弱弯曲圆针(6-0:Nescosuture)将线穿过左心室约2mm的深度、4-5mm的长度。将线的两端结合在一起，并穿过用聚乙烯管(PESO，Becton Dickinson)制备的勒除器。使用动脉钳(勒除器法)将线收紧以引起冠状动脉缺血30分钟。此后进行再灌注。在情况稳定后，确认不存在出血，进行胸腔引流，然后缝合肌肉层和皮肤。对于皮肤，进行皮下缝合。当进行正常缝合时，根据所监测的术后情况进行缝线拆除。在模型制备后一周(即给予细胞前一天)，使用超声成像诊断装置(Xario SSA-660A，Toshiba Medical SystemsCorporation，Tochigi，日本)进行超声心动描记测量。将具有不多于55％的左心室射血分数(LVEF＝(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3)的个体视为慢性心力衰竭模型，并且进行CD106+人成纤维细胞给予实验。
<向慢性心力衰竭大鼠模型给予CD106+大鼠成纤维细胞>
在给予测试当日，用高葡萄糖DMEM+10％ NBCS稀释CD106+人成纤维细胞，并且就活细胞数而言，将2.0×106个细胞/50μL的细胞悬浮液给予至每个个体。对于对照，仅给予50μL的DMEM+10％ NBCS。以N＝4提供各组。
以与模型制备中相同的方法维持麻醉，同时在人工呼吸管理下，使用具有30-G针的导管分别在梗死区域的两个位置处向动物给予总量50μL的细胞悬浮液。在情况稳定后，确认不存在出血或给予液体的渗漏，进行胸部引流，然后缝合肌肉层和皮肤。对于皮肤，进行皮下缝合。当进行正常缝合时，根据所监测的术后情况进行缝线拆除。
<通过超声心动描记术评价慢性心力衰竭模型大鼠的心脏功能>
对向其给予CD106+大鼠成纤维细胞的慢性心力衰竭模型进行随访，同时根据图5中所示的时间表使用超声成像诊断装置(Xario SSA-660A，Toshiba Medical SystemsCorporation，Tochigi，日本)进行超声波心动描记术测量。更具体地，用理发剪剪掉动物胸部上的毛发，并将探针放在胸部以通过M模式测量以下项目。作为主要项目，测量左心室射血分数(LVEF＝(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3)、左心室缩短分数(LVFS＝(LVIDd-LVIDs)×100/LVIDd)、左心室舒张末期容积(LVEDV)以及左心室收缩末期容积(LVESV)。作为次要项目，测量左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室前壁舒张末期厚度(LVAWd＝IVSTD)、左心室后壁舒张末期厚度(LVPWTd)以及心率(HR)。除HR之外的心脏功能值表示为小数点后一位(通过舍入至小数点后一位)，而HR(次要项目)表示为小数点后两位(通过舍入至小数点后两位)。
[通过给予CD106+人成纤维细胞改善心脏功能]
随后，探究了向大鼠或猪给予CD106+人成纤维细胞对心脏功能的改善。
<细胞和抗体>
心脏成纤维细胞购自以下制造商：
高加索人胎儿(第21周)心脏来源的成纤维细胞(c21wFCF，Cell Applications，San Diego，CA)
高加索人成年人(50多岁)心脏来源的成纤维细胞(c50yACF，Cell Applications，San Diego，CA)
黑人成年人(60多岁)心脏来源的成纤维细胞(b60yACF，Lonza，Basel，Switzerland)
<细胞分选>
用CD106(VCAM-1)-生物素抗体，人(Miltenyi Biotec)对细胞进行初次免疫染色，然后用抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)进行二次免疫染色。通过autoMACS(MiltenyiBiotec)从染色的细胞中仅收集CD106阳性细胞，以提供CD106+人成纤维细胞。
抗体购自以下制造商：
BV421大鼠IgG2a，同种型对照RUO(BD Biosciences)
PE-REA对照(S)同种型对照(Miltenyi Biotec)
Oct3/4-PE(Miltenyi Biotec)
Nanog-PE(Miltenyi Biotec)
Sox2-PE(Miltenyi Biotec)
兔多克隆抗连接蛋白43(Cell signaling technology)
人STRO-1Alexa Fluor 488-缀合抗体(R&D Systems，Minneapolis，MN)
所有其它抗体均购自Abcam。
二抗购自Jackson Immuno Reserch Laboratories。
关于识别细胞膜表面蛋白的抗体，将细胞用4％多聚甲醛固定，然后进行免疫荧光染色。关于Oct3/4-PE、Nanog-PE和Sox2-PE，将CD106+人成纤维细胞用0.1％ Triton-X(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)进行细胞膜透化处理30分钟(室温)，然后进行免疫荧光染色。
<流式细胞术>
将免疫荧光染色后的细胞制备成1.0×106个细胞/每个试验的密度，然后用流式细胞仪(MACSQuant，Miltenyi Biotec)进行分析。用FSC-A和SSC-A识别细胞区域后，评价每种标志物蛋白的阳性细胞比例(就细胞数而言，％)。
<慢性心力衰竭大鼠模型的制备和超声心动描记测量>
通过上述所述的相同方法，制备慢性心力衰竭模型，并进行超声心动描记测量。
<向慢性心力衰竭大鼠模型给予CD106+人成纤维细胞>
在给予测试当日，用高葡萄糖DMEM+10％ NBCS稀释CD106+人成纤维细胞，并且就细胞数而言，向每个个体给予2.0×106个细胞/50μL或5.0×105个细胞/50μL的细胞悬浮液。以N＝4提供各组。通过上述相同的方法进行每只动物的麻醉维持、细胞给予方法以及缝合和缝线拆除。
<通过超声心动描记术评价慢性心力衰竭模型大鼠的心脏功能>
对向其给予CD106+人成纤维细胞的慢性心力衰竭模型进行随访，同时根据图6中所示的时间表以2周的间隔使用超声成像诊断装置(Xario SSA-660A，Toshiba MedicalSystems Corporation，Tochigi，日本)进行超声心动描记测量。具体方法与上述相同。
<慢性心力衰竭猪模型的制备和超声心动描记测量>
购买LWD品种的SPF驯养猪(35kg-40kg)(Okayama JA LivestockCo.,Ltd.，Okayama，日本)。通过如下方式来制备猪心力衰竭模型：使用气囊导管使左前降支周边充气60分钟，然后在30分钟的间隔后，使左前降支的中间部分再次充气60分钟。
在制备模型后一周(即给予细胞前一天)，使用MRI进行超声心动描记测量。将左心室射血分数(EF)少于45％的个体视为慢性心力衰竭模型，并进行CD106+人成纤维细胞给予实验。
<向慢性心力衰竭猪模型给予CD106+人成纤维细胞>
在诱导麻醉后，将制备的猪心力衰竭模型以仰卧位固定在操作台上。以与上述慢性心力衰竭猪模型的制备中相同的方式，从腹股沟插入6Fr套管，并将前面为0.035英寸导丝的6Fr导引导管插入升主动脉部分中。移除0.035英寸的导丝，然后移除导引导管中的空气，然后使得在左主干中接合(engament)。接合后，在中线和LAO 30°角进行确认成像，以确认冠状动脉的状态。沿着0.014英寸的导丝，在紧接着左前降支的开口部分的位置插入微导管。将预先填充有CD106+人成纤维细胞(2.0×107个细胞/40mL)的50mL注射器设置在注射泵中，然后与插入的微导管连接，随后以1mL/min的流速实施给予40分钟。在给予细胞后，以相同的流速给予5mL生理盐水以对微导管进行冲洗。完成所有给予后，移除导管和套管。在套管插入部位压迫止血后，使猪从麻醉中恢复，并回到笼中。以N＝1进行CD106+人成纤维细胞的给予。
<通过MRI评价慢性心力衰竭模型猪的心脏功能>
在给予细胞当日之前、给予后4周以及给予后8周对猪进行MRI扫描。在深度麻醉下，将猪放在MRI室中的检查台上。将猪(处于仰卧位)与麻醉装置管道系统和气管导管连接。将心电图电极附着于胸部。安装线圈使得线圈覆盖胸部，并将猪放置在MRI主体(SignaEXCITE XI TwinSpeed 1.5T Ver.11.1，GE Healthcare)的圆筒中，随后进行成像。更具体地，首先，将MRI电影(cine MRI)用于沿着体轴横截面(轴向横截面)覆盖心脏的区域的2DFiesta成像。随后，由获得的数据，在穿过心尖和左心室的长轴的横截面上进行每次心跳20个切片的2D Fiesta成像。从成像数据选择处于舒张期的切片，并且在穿过心尖和二尖瓣附近的长轴横截面上进行2D Fiesta成像。此外，选择处于舒张期的切片，并且在垂直于左心室的长轴的横截面上以6mm-8mm宽度的间隔进行2DFiesta成像，从心尖起10-12个切片(短轴横截面)。使用软件应用Cardiac VX对通过成像获得的数据进行分析。作为心脏功能的评价项目，计算LVEF(左心室射血分数，％)、SV(搏出量，mL)、EDV(舒张末期容积，mL)和ESV(收缩末期容积，mL)。作为与速率相关的指数，计算HR(心率，bpm)、PFR(peak filling rate(高峰充盈率)，mL/s)和PER(peak ejection rate(高峰射血率)，mL/s)。此外，计算质量ED(g)、心输出量(L/min)、质量(g)、质量ES(g)、舒张末期心外膜容积(mL)和收缩末期心外膜容积(mL)。
此外，进行心肌时间变化分析(灌注)和LGE分析，用于定量计算心脏肌肉异常部位中存在的梗死/纤维化区域。在心肌时间变化分析(灌注)中，首先，通过快速浓注(bolusinjection)由静脉途径(静脉内)静脉内给予造影剂(静脉内注射用Omniscan静脉内注射剂32％)，并对造影剂首次通过心脏肌肉的过程进行成像(短轴横截面)。使用软件应用Cardiac VX对成像获得的数据进行分析。在LGE分析中，首先，静脉内给予造影剂(静脉内注射用Omniscan静脉内注射剂32％，0.25mL/kg)。然后，在这之后的10-20分钟进行快速GRE成像(短轴横截面)。使用软件应用Cardiac VX对通过成像获得的数据进行分析。由于梗死区域和纤维化区域出现高信号，通过感兴趣区域(ROI)分析定量计算它们与正常区域的差异。类似于左心室功能分析，对数个特定点进行自动测量。然而，当看起来是对明显错误的区域进行测量时，实施修正。也将心脏肌肉组织中梗死部位的比例表示为百分比。
<统计分析>
体外测试数据表示为平均值±SD(标准偏差)。体内测试数据表示为平均值±SE(标准误差)。通过student’s t检验计算两组之间的显著性差异。通过单因素方差分析计算三组或更多组之间的变化差异。随后，通过Tukey-Kramer多重比较检验计算三组之间的显著性差异。当p值小于0.05时，假定差异为显著性。
实验结果如下。
<CD106+大鼠成纤维细胞对大鼠慢性心力衰竭模型的疗效>
向大鼠慢性心力衰竭模型心肌内给予细胞分选后所收集的CD106+大鼠成纤维细胞，并且在给予细胞后评价对慢性心力衰竭恢复的作用18周。结果在图7中示出。发现相比于对照，在给予后第18周，其中给予CD106+大鼠成纤维细胞的组显示出EF改善32.9％以及FS改善12.4％。在给予后整个18周内，没有发现LVEDV极度增加/减少，也没有发现LVESV增加。主要项目(LVEF、LVFS、LVEDV和LVESV)的结果以及次要项目(LVIDd、LVIDs、IVSTd、LVPWTd和HR)的结果在表1至表9中示出。
[表1]
表1：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室射血分数(LVEF)的趋势
[表2]
表2：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室缩短分数(LVFS)的趋势
[表3]
表3：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室舒张末期容积(LVEDV)的趋势
[表4]
表4：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室收缩末期容积(LVESV)的趋势
[表5]
表5：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室舒张末期内径(LVIDd)的趋势
[表6]
表6：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室收缩末期内径(LVIDs)的趋势
[表7]
表7：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室前壁舒张末期厚度(LVAWd＝IVSTd)的趋势
[表8]
表8：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室后壁舒张末期厚度(LVPWTd)的趋势
[表9]
表9：给予CD106+大鼠成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的心率(HR)的趋势
通过上述实验，证明了VCAM-1阳性成纤维细胞对于有效治疗慢性心力衰竭的重要性，并且可以理解，给予CD106+成纤维细胞可在治疗慢性心力衰竭方面产生期望的结果。由于注射VCAM-1阳性成纤维细胞不仅能够治疗慢性心力衰竭，并且如上所述还能够治疗心肌梗死，因此认为其对其它心脏疾病的治疗也有效。
<人心脏成纤维细胞之中CD106+人成纤维细胞的定位>
提供了从人胎儿心脏(FCF)收集的心脏成纤维细胞和从人成年人心脏(ACF)收集的两种心脏成纤维细胞，并通过流式细胞术分别针对人CD106和人CD90(其与小鼠CD106和小鼠CD90具有同源性)的表达水平进行评价。结果在图8中示出。考虑到表观遗传学的影响，提供了两种ACF。结果，关于c21wFCF发现以下定位：CD106阳性细胞比例，9.13％；CD90阳性细胞比例，24.5％；双阳性细胞(CD106+人成纤维细胞)比例，8.20％。关于c50yACF发现以下定位：CD106阳性细胞比例，12.53％；CD90阳性细胞比例，5.79％；双阳性细胞(CD106+人成纤维细胞)比例，1.79％。关于b60yACF发现以下定位：CD106阳性细胞比例，5.55％；CD90阳性细胞比例，96.39％；双阳性细胞(CD106+人成纤维细胞)比例，5.43％。所有上述阳性细胞比例均是就细胞数而言的值。
由这些结果可清楚地看出，所有心脏成纤维细胞均含有定位于其中的CD106+人成纤维细胞。
<CD106+人成纤维细胞的细胞分选>
为了由从人心脏收集的心脏成纤维细胞中收集高纯度的CD106+人成纤维细胞，通过autoMACS进行CD106+人成纤维细胞的细胞分选。对通过由autoMACS的分选获得的CD106+人成纤维细胞的细胞特性进行评价。结果在图9中示出。发现所收集的CD106+人成纤维细胞含有95.98％的CD106阳性细胞、92.28％的CD90阳性细胞以及89.15％的双阳性细胞。由此可清楚地看出几乎所有细胞为CD106和/或CD90(它们是指示CD106+人成纤维细胞群的标志物蛋白)阳性的。所有上述阳性细胞比例均是就细胞数而言的值。
为了评价CD106+人成纤维细胞是否是多能干细胞和致肿瘤性(tumorigenicity)的标志物阳性的，用Oct3/4、Nanog和Sox2对CD106+人成纤维细胞进行免疫荧光染色，并对阳性细胞比例(％，就细胞数而言)进行评价。结果在图10中示出。CD106+人成纤维细胞是上述标记物阴性的，并且不具有多能干细胞或致肿瘤性的特性。
<CD106+人成纤维细胞的细胞特性>
针对波形蛋白(成纤维细胞和间充质干细胞的细胞骨架标志物)、细胞角蛋白(上皮细胞标志物)以及连接蛋白43(心肌细胞缝隙连接标志物)的CD106+人成纤维细胞免疫荧光染色的结果是，发现所有CD106+人成纤维细胞均显示出表达波形蛋白和连接蛋白43。结果在图11中示出。
此外，通过流式细胞术评价CD106+人成纤维细胞的STRO-1表达率的结果，发现关于STRO-1CD106+人成纤维细胞有0.29％阳性，因此几乎没有CD106+人成纤维细胞显示STRO-1表达。结果在图12中示出。“STRO-1(间充质干细胞(MSC)最著名的分子标志物之一)是一种单次跨膜蛋白，其定位随着细胞内钙的损失从内质网变至细胞膜(BarkhordarianA，Sison J，Cayabyab R，等，Epigenetic regulation of osteogenesis:human embryonicpalatal mesenchymal cells.Bioinformation2011；5：278-281.)。已知具有高集落形成能力和多能性的细胞群可通过从骨髓基质细胞中分离STRO-1阳性、血型糖蛋白A阴性的细胞级分而获得(Simmons PJ，Torok-Storb B.Identification of stromal cell precursorsin human bone marrow by a novel monoclonal antibody，STRO-1.Blood 1991；78:55-62.，Tomohiko Kazama.Basic Research and Clinical Application in MesenchymalStem Cells.Journal of Nihon University Medical Association.2016；75(2)：61-66.)。”
<CD106+人成纤维细胞对大鼠慢性心力衰竭模型的治疗效果>
向大鼠慢性心力衰竭模型心肌内给予分选后收集的CD106+人成纤维细胞，并且在给予细胞后评价对慢性心力衰竭恢复的作用18周。结果在图12中示出。发现相比于对照，在给予后第18周，其中给予的CD106+人成纤维细胞的组显示出EF改善32.60％以及FS改善17.85％。在给予后整个18周内，没有发现LVEDV极度增加/减少，也没有发现LVESV增加。主要项目(LVEF、LVFS、LVEDV和LVESV)和次要项目(LVIDd、LVIDs、IVSTd、LVPWTd和HR)的结果在表10-表18中示出。就对照的结果而言，使用通过关于CD106+大鼠成纤维细胞对大鼠慢性心力衰竭模型的治疗效果的实验所获得的结果。
[表10]
表10：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室射血分数(LVEF)的趋势
[表11]
表11：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室缩短分数(LVFS)的趋势
[表12]
表12：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室舒张末期容积(LVEDV)的趋势
[表13]
表13：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室收缩末期容积(LVESV)的趋势
[表14]
表14：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室舒张末期内径(LVIDd)的趋势
[表15]
表15：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室收缩末期内径(LVIDs)的趋势
[表16]
表16：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室前壁舒张末期厚度(LVAWd＝IVSTd)的趋势
[表17]
表17：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的左心室后壁舒张末期厚度(LVPWTd)的趋势
[表18]
表18：给予CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的大鼠心力衰竭模型的心率(HR)的趋势
<CD106+人成纤维细胞的剂量研究>
以两种浓度(2.0×106个细胞/50μL和5.0×105个细胞/50μL)向大鼠慢性心力衰竭模型心肌内给予分选后收集的CD106+人成纤维细胞，并在给予细胞后评价对心力衰竭恢复的作用8周。结果在图14中示出。发现与对照相比，在给予后第8周，其中给予CD106+人成纤维细胞(2.0×106个细胞/50μL)的组显示EF改善30.18％以及FS改善15.65％。在给予后整个8周内，没有发现LVEDV极度增加/减少，也没有发现LVESV增加。发现与对照相比，在给予后第8周，其中给予CD106+人成纤维细胞(5.0×105个细胞/50μL)的组显示EF改善26.90％以及FS改善13.63％。在给予后第8周，在其中给予CD106+人成纤维细胞(2.0×106个细胞/50μL)的组和其中给予CD106+人成纤维细胞(5.0×105个细胞50μL)的组之间没有发现在EF或FS方面的显著性差异。然而，可以清楚地看出，随着剂量的增加，可更早地发现对心力衰竭的治疗效果。就对照的结果而言，使用通过关于CD106+大鼠成纤维细胞对大鼠慢性心力衰竭模型的治疗结果的实验所获得的结果。就其中给予CD106+人成纤维细胞(2.0×106个细胞/50μL)的组的结果而言，使用表2中获得的结果。
主要项目(LVEF、LVFS、LVEDV和LVESV)的结果以及次要项目(LVIDd、LVIDs、IVSTd、LVPWTd和HR)的结果在表19至表27中示出。
[表19]
表19：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的左心室射血分数(LVEF)的趋势
[表20]
表20：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的左心室缩短分数(LVFS)的趋势
[表21]
表21：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的左心室舒张末期容积(LVEDV)的趋势
[表22]
表22：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的左心室收缩末期容积(LVESV)的趋势
[表23]
表23：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的左心室舒张末期内径(LVIDd)的趋势
[表24]
表24：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的左心室收缩末期内径(LVIDs)的趋势
[表25]
表25：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的左心室前壁舒张末期厚度(LVAWd＝IVSTd)的趋势
[表26]
表26：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的左心室后壁舒张末期厚度(LVPWTd)的趋势
[表27]
表27：归因于CD106+人成纤维细胞(在表中表示为“VCF”)的剂量差异的大鼠心力衰竭模型的心率(HR)的趋势
<CD106+人成纤维细胞对猪慢性心力衰竭模型的治疗效果>
随后，使用猪(据报道其心脏在解剖学和生理学上接近于人的心脏)制备慢性心力衰竭模型，并且评价CD106+人成纤维细胞对心力衰竭的治疗效果。结果在图15、图16和图17中示出。在给予CD106+人成纤维细胞前一天，LVEF为43％；SV为30.4mL；EDV为70.5mL；ESV为40.0mL；HR为100bpm；PFR为231mL/s；以及PER为161mL/s。通过ROI分析计算的梗死重量(纤维化区域重量)为10.2g，并且左心室心脏肌肉重量为78.1g，因此发现梗死区(纤维化区域，％)为13.1％。
另一方面，在给予CD106+人成纤维细胞后第4周，LVEF为58％；SV为38.6mL；EDV为66.9mL；ESV为28.2mL；HR为98bpm；PFR为232mL/s；以及PER为215mL/s。可以清楚地看出，在给予CD106+人成纤维细胞后第4周可实现LVEF改善15％，以及SV改善8.2mL。此外，由于ESV减少11.8mL而PER增加54mL/s，可清楚地看出心脏功能得以改善。此外，由于通过ROI分析计算的梗死重量(纤维化区域重量)为8.23g，并且左心室心脏肌肉重量为89.2g，因此发现梗死区(纤维化区域，％)为9.23％。由该结果可以清楚地看出，给予CD106+人成纤维细胞使得梗死重量(纤维化区域重量)降低了1.97g。
在给予CD106+人成纤维细胞后第8周，LVEF为52％；SV为35.9mL；EDV为69.2mL；ESV为33.3mL；HR为92bpm；PFR为263mL/s；以及PER为156mL/s。可以清楚地看出，在给予CD106+人成纤维细胞后第8周可实现LVEF改善8％。此外，通过ROI分析计算的梗死重量(纤维化区域重量)为8.51g，并且左心室心脏肌肉重量为91.6g，因此发现梗死区(纤维化区域，％)为9.29％。由该结果可以清楚地看出，在给予后8周内，给予CD106+人成纤维细胞使得梗死重量(纤维化区域重量)降低了1.69g。梗死/纤维化区域(％)与移植后第4周几乎没有变化。由该结果可以明显地看出，CD106+人成纤维细胞对于猪心力衰竭(据报道其在解剖学和生理学上接近于人)中的心脏功能恢复也是非常有效的。

Claims (5)

1.成纤维细胞在制备用于治疗心脏疾病的可注射组合物中的用途，其中，所述成纤维细胞含有CD106阳性且CD90阳性的成纤维细胞，所述可注射组合物包含生理学上可接受的组分作为可注射组成成分，所述可注射组合物被注射至坏死的心脏组织区域的附近，和/或被注射至冠状动脉。
2.成纤维细胞在制备用于治疗心脏疾病的可注射组合物中的用途，其中，所述成纤维细胞含有通过分选从天然成纤维细胞而来的CD106阳性且CD90阳性的成纤维细胞数增加的成纤维细胞群，所述可注射组合物被注射至坏死的心脏组织区域的附近，和/或被注射至冠状动脉。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述成纤维细胞含有连接蛋白43阳性成纤维细胞。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，就细胞数而言，所述CD106阳性成纤维细胞与所述可注射组合物中含有的成纤维细胞的总量的比不少于70％。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中，就细胞数而言，所述CD106阳性且CD90阳性的成纤维细胞与所述可注射组合物中含有的成纤维细胞的总量的比为60％以上。
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