CN114938630A - 用于心脏修复的永生化心脏干细胞 - Google Patents

Abstract

本公开的实施例涉及与从儿童或新生个体获得的包含心脏干细胞的特定永生化细胞有关的组合物和使用方法。在具体实施例中，所述永生化细胞或来自所述细胞的条件培养基或其部分或总分泌组以有效量单独或与心脏干细胞组合提供给有需要的个体。

Description

用于心脏修复的永生化心脏干细胞

技术领域

本公开的领域至少涉及细胞生物学、分子生物学和包含心脏病学的医学领域。

背景技术

成人的心脏病是死亡的主要原因，并且由于用于先天性心脏缺陷的手术技术和术后ICU护理的进步，患有心力衰竭的儿童数量越来越多(Go等人,2014；Go等人,2014)。已知促成广泛医学病状的重要生物学过程中的两个包含炎症和纤维化，所述医学病状包含心脏病的许多根本原因。几个世纪以来，认为与肝脏和皮肤等其它组织相比，心脏是无法再生的末端分化器官(在Buja 2019中综述)。这种模式最近被推翻了，当时它显示成人心脏中的心肌细胞翻转并且以每年约1-2％的小但可检测的速率被替换(在Vujic等人2019中综述)。这激励了学术界和制药公司，以鉴定和靶向心脏再生的基本机制，用于治疗各种心脏病。心脏再生有两种可能的机制：1)心肌细胞复制和2)能够增殖并分化为心肌细胞的内源性心脏干细胞的存在。现在显而易见的是，心肌细胞增殖尽管在如两栖动物、某些鱼类和新生哺乳动物等专门情况下发生，但不促成成年哺乳动物的心脏再生。相比之下，最近在临床研究中已显示，常驻心脏干细胞的移植可以修复/再生/重塑人心肌，使心脏功能的改善，如通过射血分数的改善、疤痕大小减小、末端舒张和收缩体积减小以及生活质量和NYHA类别的改善所指示的(Garbern等人,2013)。

表达细胞表面标志物c-kit(也称为CD117)的心脏干细胞群体在近十五年前描述，并且已示出c-kit+细胞的同质、健康群体提供抗炎和抗纤维化特性。通过磁性选择表达c-kit的心脏细胞，随后在如心肌梗塞等心脏病的动物模型中进行细胞的心脏递送来富集这些细胞指示心脏功能的持续改善。在这些细胞的早期临床测试中也观察到类似的有希望的结果。然而，随着对这些细胞的持续科学研究，两个问题变得非常清楚。首先，这些c-kit+心脏干细胞是许多不同祖细胞的混合物，其中大多数(～90％)是造血和内皮细胞，而不是心源性干细胞(Vicinanza等人2017)。其次，从成人心脏获得的心脏c-kit+细胞中的大多数是衰老的，对心脏修复的贡献非常小，并且甚至可能通过由此类衰老细胞分泌的各种炎性因子而促成心脏损伤(Lewis-McDouggal等人2019)。

因此，本领域需要用于治疗如由受损心肌组织引起的心力衰竭等心脏医学病状以及用于解决在广泛医学病状中观察到的炎性和纤维化过程的组合物和方法。本发明满足这些需求并提供其它相关优点。

发明内容

本公开的实施例涉及与特定的人心脏干细胞(hCSC)有关的方法和组合物，特别是新生心脏干细胞(nCSC)、永生化nCSC(Im-nCSC)(例如，克隆分离株)和由Im-nCSC产生的条件培养基，以用于治疗医学病状。在特定实施例中，医学病状是心脏医学病状。尽管可以用此类组合物和方法治疗任何炎性、纤维化或心脏医学病状，但在具体实施例中，所述病状是将受益于修复、再生或重塑心脏肌肉(心肌)的心脏病状。在某些实施例中，所述方法和组合物促进或增强nCSC的修复、再生或重塑能力。在某些实施例中，所述医学病状是炎性病状或疾病。在更具体的实施例中，炎性病状或疾病选自但不限于缺血性中风、急性和慢性肾病、关节炎病状、皮肤学病状和COVID-19。在其它实施例中，本发明的抗纤维化特性可以改善创伤愈合和特征为慢性纤维化的病状。

本公开的实施例涵盖关于源自如人等哺乳动物，特别是新生儿的心肌的永生化细胞的方法和组合物。在某些具体实施例中，细胞包括永生化新生CD117+心脏干细胞，特别是新生CD117+心脏干细胞的永生化克隆分离株。

在另外的实施例中，本发明的永生化干细胞具有以下细胞表面标志物特性中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或五个或更多个特性：CD90⁺、CD105⁺、CD117⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD47⁺、CD31^-、CD34^-、CD45^-和类胰蛋白酶阴性(例如，图6)。

在其它实施例中，本发明的永生化干细胞可以可逆永生化，任选地通过杀伤开关。

在一些实施例中，永生化心脏干细胞被提供给个体以用于治疗一种或多种心脏医学病状。在其它实施例中，将来自永生化心脏干细胞的条件培养基提供给个体以用于治疗心脏医学病状。在仍其它实施例中，来自细胞的分泌组被提供给个体以用于治疗心脏医学病状。在仍其它实施例中，一种或多种永生化细胞克隆分离株衍生的营养因子被提供给个体以用于治疗心脏医学病状。在某些其它实施例中，上述的任何组合可以用于治疗心脏或其它医学病状。

在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，其包括来自如CD117+永生化新生心脏干细胞等一种或多种永生化新生心脏干细胞(Im-nCSC)的条件培养基(CM)。在某些具体实施例中，永生化新生心脏干细胞是永生化克隆分离株。在其它实施例中，永生化新生心脏干细胞具有以下特性中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或五个或更多个特性：CD90⁺、CD105⁺、CD117⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD47⁺、CD31^-、CD34^-、CD45^-和类胰蛋白酶阴性。在仍其它实施例中，永生化新生心脏干细胞具有所有以下特性：CD90⁺、CD105⁺、CD117⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD47⁺、CD31^-、CD34^-、CD45^-和类胰蛋白酶阴性。在仍其它实施例中，永生化新生心脏干细胞具有以下特性中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个或四个或更多个特性：GATA4-、CD44+、类胰蛋白酶阴性、CD80-、CD86-。在另外的实施例中，永生化新生心脏干细胞具有所有以下特性：GATA4-、CD44+、类胰蛋白酶阴性、CD80-、CD86-。在仍另外的实施例中，永生化新生心脏干细胞具有以下特性中的一个或多个、两个或更多个或所有特性：CD117+、CD45-和Lin^-。在仍另外的实施例中，永生化新生心脏干细胞具有以下特性：CD117⁺和CD45^-。

在本发明的一些实施例中，在永生化之前，从新生个体的心脏分离(例如，从个体的活检)新生心脏干细胞。在某些相关实施例中，干细胞通过单细胞克隆来分离。在仍其它实施例中，通过单细胞克隆来分离干细胞，而不涉及文献中通常执行的任何细胞选择步骤。在一些实施例中，当细胞从个体的心脏获得时(例如，当进行活检时)，衍生出细胞的个体小于30天大。在一些实施例中，分离不包括将细胞与用于细胞选择的抗体接触。在一些实施例中，所述分离不包括使用基于抗体的选择的细胞富集步骤。在一些实施例中，所述细胞是通过有限稀释培养来分离的。在一些实施例中，永生化是通过人端粒酶(hTERT)基因的外源性表达，例如使用如慢病毒表达载体等递送载体来实现的。

在本发明的其它实施例中，提供了包括多个永生化人新生心脏干细胞克隆分离株的组合物。

在仍其它实施例中，本公开提供了一种治疗个体的方法，例如本文所描述的心脏医学病状或其它病状，所述方法包括向个体提供治疗有效量的组合物，所述治疗有效量的组合物包括来自永生化新生心脏干细胞的条件培养基。在一些实施例中，组合物选自本文提供的组合物中的任何一种组合物。

在一些实施例中，本公开提供了一种治疗个体的心脏医学病状的方法，所述方法包括向所述个体提供治疗有效量的包括来自永生化新生心脏干细胞的条件培养基的组合物与包括如永生化新生心脏干细胞等新生心脏干细胞的组合物的组合的步骤。在一些实施例中，包括条件培养基的组合物选自本文提供的组合物中的任何一种。

在仍其它实施例中，本公开提供了一种用于从永生化新生心脏干细胞中分离细胞克隆的方法，所述方法包括从新生心脏组织中分离一种或多种细胞或使所述一种或多种细胞从新生心脏组织中分离以及在合适的培养基中培养一种或多种细胞以促进增殖。在更具体的实施例中，分离步骤不包括将细胞与结合如CD117等特定细胞表面蛋白的部分接触。

在另外的实施例中，根据本公开永生化的分离的细胞分离株在它们分离时具有以下特性中的一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或五个或更多个特性：GATA4-、CD44+、CD47+、CD31-、CD34-、CD45-、类胰蛋白酶-、CD80-、CD86-并且永生化细胞在永生化后保持此类表达模式。

在另外的实施例中，在永生化之前，本公开的永生化细胞最初从新生个体的心脏获得，包含儿童或非儿童个体。在具体实施例中，个体具有心脏医学病状。在某些实施例中，个体具有正常心肌。在一些实施例中，细胞可以来自患有末期心力衰竭的儿童个体的心肌。心肌可以来自患有先天性心脏病的新生个体。

在其它具体实施例中，本公开的永生化细胞分泌作为CD63⁺、CD73⁺、CD47⁺、CD45^-、CD31^-(例如，图8)的外体。永生化细胞分泌促血管生成和血管生成细胞因子；如VEGF-A、HGF、SCF、SDF-1α、IGF、PDGF-B和ANG-1(例如，表1)。

在仍其它实施例中，本发明提供了治疗个体的医学病状的方法，如心脏医学病状或本文所描述的任何其它病状，所述方法包括向所述个体提供本公开的治疗有效量的包括例如永生化新生心脏干细胞、由永生化新生心脏干细胞调节的培养基、由永生化新生心脏干细胞分泌的外体和/或其任何组合的组合物的步骤。在更特定的实施例中，组合物包括来自永生化新生心脏干细胞的独立分泌的蛋白质和/或外体。

在其它具体实施例中，本发明的组合物用于治疗心脏医学病状，如通过在保留细胞的装置中，如通过心肌内注射、静脉内注射、细胞囊封递送组合物，但允许由细胞产生的旁系因子分泌到循环中等。在仍其它具体实施例中，心脏医学病状是心力衰竭、心肌病或先天性心脏病。

在本发明的另外的实施例中，提供了包括来自本公开的永生化细胞的总条件培养基(TCM)和/或其组分的组合物以及以治疗量使用所述组合物治疗本文所描述的医学病状的方法。在仍另外的实施例中，提供了包括来自本公开的永生化细胞的外泌体和/或其组分的组合物以及以治疗量使用所述组合物治疗本文所描述的医学病状的方法。

附图说明

图1示出了用于引发单细胞培养物的nCSC的细胞稀释的说明性方法。

图2示出了96孔板中的单细胞培养物的代表性相衬图像，所述单细胞培养物由通过图1中所展示的方法稀释的细胞引发。

图3示出了使用图1和图2中所示的方法获得的nCSC的七种克隆分离株的流式细胞术分析的表型表征。

图4示出了携带用于永生化通过本文所公开的方法分离的nCSC的hTERT基因的说明性慢病毒载体。

图5示出了nCSC和Im-nCSC的代表性相衬显微图像。

图6示出了在第16代从单细胞培养物增殖的Im-nCSC的流式细胞术分析的结果。

图7示出了大鼠心脏心肌梗塞后心脏功能的改善。通过超声心动图分析左心室射血分数(EF)和缩短分数。

图8示出了来自Im-nCSC衍生的总条件培养基(Im-nCSC TCM)的表征的结果。

图9示出了Im-nCSC TCM在新生大鼠心肌细胞中保护免于过氧化氢诱导的凋亡。

图10示出了Im-nCSC TCM促进血管生成。

图11示出了Im-nCSC TCM促进细胞迁移和体外创伤愈合。

图12示出了通过静脉内注射，通过超声心动图测量的nCSC和Im-nCSC TCM在大鼠心肌梗塞模型中的体内功能活性。

图13示出了在Im-nCSC中观察到的代表性正常核型。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但描述优选的方法和材料。出于本发明的目的，下文定义了以下术语。

冠词“一个/一种(a/an)”在本文中指代冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法宾语。举例来说，“一个要素”意指一个要素或一个以上的要素。

本公开中所使用的术语“和/或”意指“和”或“或”，除非另有指示。

术语“例如(e.g.)”在本文用于意指“例如(for example)”，并且将被理解为暗示包含所陈述的步骤或元素或者步骤或元素的组，但不排除任何其它步骤或元素或者步骤或元素的组。

“约”意指数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考数量、水平、数值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

如本文所使用的，术语“施用”是指向受试者转移、递送、引入或运输如化合物等物质，例如药物化合物或如抗原等其它试剂，的任何模式。施用模式包含口服施用、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内、鼻内或皮下施用。施用与如一种或多种治疗剂等另外的物质“组合”包含以任何次序同时(同步)和连续施用。

在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise/comprises/comprising)”应理解成暗指包含所陈述步骤或要素或一组步骤或要素，但不排除任何其它步骤或要素或一组步骤或要素。“由…组成”意指包含但不限于，无论在短语“由…组成”之后是什么。因此，短语“由…组成”表示所列元件是必需的或强制性的，并且可以不存在其它元件。“基本上由…组成”意指包含在所述短语后列出的任何元件，并且限于不干扰或促进在本公开中针对所列元件指定的活动或动作的其它元件。因此，短语“基本上由…组成”表示所列元件是必需的或强制性的，但是其它元件是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响所列元件的活动或动作。

当与化合物结合使用时，“有效量”是引发期望的应答所需的化合物的量。在一些实施例中，期望的应答是生物应答，例如在受试者中。在一些实施例中，可以将化合物以有效量施用于受试者，以在受试者中实现生物应答。在一些实施例中，有效量是“治疗有效量”。

术语“治疗有效量”和“治疗剂量”在本文中可互换使用，以指代组合物的量(例如，来自如本文所公开的永生化CSC等新生CSC的条件培养基)，所述组合物在施用于受试者后有效用于治疗如本文所描述的受试者的疾病或病症。

术语“调节”包含“增加”、“增强”或“刺激”以及“减少”或“降低”，通常是以相对于对照物统计学上显著的或生理学上显著的量。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常是“统计上显著”的量，并且可以包含是由无组合物或对照组合物、样品或测试受试者产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数以及其之间且超过1的小数点，如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。“降低的”或“减少的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包含无组合物(不存在药剂或化合物)或对照组合物产生的量减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包含其间的所有整数)。

如本文所使用的，“受试者”或“患者”包含展现出症状或处于展现出症状的风险下的任何动物，所述症状可以用本文所公开的组合物(例如，来自如本文所公开的永生化hCSC等新生CSC的条件培养基)治疗。合适的受试者(患者)包含人类患者。合适的受试者还包含实验用动物(如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物(如猪、马或牛)和家养动物或宠物(如猫或狗)。还包含非人灵长类动物(如猴、黑猩猩、狒狒或恒河猴)。

“基本上”或“实质上”意指几乎完全或完全，例如，某些给定量的95％或更高。

如本文所使用的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包含对疾病或病状的症状或病理学的任何期望的作用，并且甚至可以包含所治疗疾病或病状的一个或多个可测量标志物的微小变化或改善。“治疗”或治疗不一定指示完全根除或治愈疾病或病症或其相关症状。接受这种治疗的受试者是有需要的任何受试者。临床改善的示例性标志物对于本领域技术人员将是显而易见的。

根据本公开，术语“CD117”和“c-kit”可以互换使用，指代与两个名称同义的相同蛋白质。c-kit/CD117蛋白以及编码其的基因已经广泛表征，并且在本领域中是众所周知的(例如，https://www.uniprot.org/uniprot/P10721和UNIPROT登录号P10721)。

除非另外定义，否则本文所使用之所有技术及科学术语具有与本发明所属领域之一般熟习此项技术者通常所理解相同的含义。尽管与本文所描述的那些类似或等同的任何方法、组合物、试剂、细胞可以用于本发明的实践或测试中，但本文描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包含但不限于专利和专利申请，均通过引用整体并入本文，如同明确且单独地指示每个单独的出版物或参考文献都如完全阐述一样通过引用并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也以上文对于出版物和参考文献描述的方式通过引用以其全文并入本文。

如本文所使用的，术语“心脏干细胞”可以定义为源自心脏组织的细胞，并且是集落生成、多能和自我更新的。在具体实施例中，这些心脏干细胞表达以下中的一种或多种：CD117、CD90、CD105、CD73、CD44和CD47，并且对于以下中的一种或多种呈阴性：CD31、C34、CD45和胰蛋白酶。

概述

本公开尤其提供了与人新生心脏干细胞(nCSC)相关的组合物和方法以及分离所述心脏干细胞和使其永生化的方法，以及从此类心脏干细胞的培养物中采集的条件培养基，以及在治疗上使用此类细胞、培养基和/或重悬于条件培养基中的细胞的方法，例如以治疗、修复、再生和/或重塑心脏组织并且治疗由炎性和/或纤维化过程引起的医学病状(例如，心脏医学病状)。

I.本公开的细胞和其条件培养基和分泌组

本公开的实施例涉及为有需要的个体提供治疗功能的哺乳动物细胞或来自细胞的条件培养基。在具体实施例中，细胞是可用于在哺乳动物心脏中实现治疗功能或效果的永生化人新生心脏干细胞(Im-nCSC)。在一些实施例中，细胞是永生化人新生心脏干细胞Im-nCSC，并且它们分泌一种或多种药剂，所述药剂是抗炎、抗纤维化、促血管生成和/或可用于哺乳动物心脏的治疗功能或效果。在具体实施例中，细胞是永生化人新生心脏CSC，其在体内施用于心脏时，本身具有修复、再生或重塑能力的活性，和/或在体内施用于心脏时具有用于促进人心肌中的内源性细胞和/或组织的修复、再生或重塑能力的活性。在具体实施例中，细胞是永生化新生人CSC，并且所述细胞分泌一种或多种抗炎、抗纤维化、促血管生成的蛋白质和/或在体内施用于心脏时具有修复、再生或重塑能力的活性和/或在体内施用于心脏时具有用于促进人心肌中的内源性细胞和/或组织的修复、再生或重塑能力的活性。在具体实施例中，细胞分泌能够引发旁观效应的一种或多种蛋白质，使得从细胞衍生的条件培养基在体内递送到心肌，增强内源性细胞和/或组织的修复、再生或重塑。

在具体实施例中，永生化人新生心脏CSC是通过获得人新生心脏CSC克隆分离株并且通过任何合适的永生化方法对其进行永生化来制备的。本领域已知的许多此类方法适用于本发明，包含例如但不限于通过引入猿猴病毒40大T-抗原的永生化(Kobayashi等人,(2000)《科学(Science)》287:1258-62；Nakamura等人,(1997)《移植(Transplantation)》63(11):1541-47)；针对p53和视网膜母细胞瘤蛋白的反义结构的转染(Werner等人,(2000)《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)》68(1):59-70)；截短的Met蛋白的转基因引入(Amicone等人,(1997)《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》16(3):495 503)以及丙型肝炎病毒核心蛋白的表达(Ray等人,(2000)《病毒学(Virology)》271:197-204)。

在一个特定实施例中，通过用表达人端粒酶(hTERT)的载体(例如，慢病毒载体)稳定地转染本公开的人新生心脏CSC进行永生化。限制人成纤维细胞的体外增殖的机制已示出是随着每次细胞分裂而逐渐缩短端粒(Hayflicket等人,(1961)《实验细胞研究(Exp.Cell Res.)》25:585-621)。端粒构成染色体的末端区域，并且缩短的端粒触发增殖限制。然而，干细胞能够通过使用端粒酶逆转录酶将端粒重复序列添加到染色体末端来避免端粒依赖性增生性限制(Greider等人,(1985)《细胞(Cell)》43:405-413)。实现人新生心脏CSC的端粒酶重构以开发稳定新生心脏源性克隆干细胞系的能力确保细胞一致性并且消除了多个供体产生大量用于治疗用途的这些细胞的需要，所述新生心脏源性克隆干细胞系在体外传代后具有新生心脏干细胞的表型特性，用于例如心脏定向细胞疗法和心脏研究。例如，在一些实施例中，此类细胞可以充当能够产生无限量的条件培养基的细胞工厂，所述条件培养基包括一种或多种分泌因子，例如分泌蛋白，所述分泌因子在体内施用于心脏时具有修复、再生或重塑能力的活性和/或在体内施用于心脏时具有用于促进人心肌中的内源性细胞和/或组织的修复、再生或重塑能力的活性。在其它实施例中，此类细胞可以充当能够产生无限量的条件培养基的细胞工厂，所述条件培养基包括一种或多种分泌因子，例如具有抗炎、抗纤维化和促血管生成特性的分泌蛋白，所述消炎、抗纤维化和促血管生成特性可以在伤口愈合和/或心脏病以外的医学病状方面提供治疗益处。

例如，用于永生化的端粒酶可以由人TERT(hTERT)基因编码。可以使用任何合适的方法用hTERT转染人新生心脏CSC。例如，人新生心脏CSC可以被能够将hTERT基因转移到细胞中的重组病毒感染。在另一个实例中，可以用慢病毒病毒载体感染人新生心脏CSC，并且可以分离和扩增含有hTERT的单个CSC克隆。慢病毒载体可以包括在合适的启动子(例如，CMV启动子)的控制下的hTERT，其说明性实例在图4中示出。

一方面，本发明提供了表达人端粒酶的永生化人细胞群体，其中所述群体在早期传代时展现出新生人心脏干细胞的表型特征，并且继续在晚期传代时在体外表达所述表型特征(例如，在70或更大的范围内的非常大群体倍增水平(PDL))。另一方面，本发明提供了表达人端粒酶的永生化人细胞，其中所述细胞在早期传代时在体外展现出新生人心脏干细胞的表型特征，并且继续在晚期传代时在体外表达所述表型特征。在一个实施例中，可以诱导永生化细胞分化为体外主要类型的心脏细胞(即，内皮、平滑肌、心肌细胞)。

在本发明的另外的实施例中，永生化细胞可以用于产生条件培养基。在某些实施例中，条件培养基可以用于多种适应症中的任何适应症，例如以治疗心脏和其它医学病状，诱导血管新生，抑制炎症，促进心肌细胞抢救和减少体内心肌纤维化。(Ongstad等人2019)

在一些实施例中，永生化细胞表达CD117。在其它实施例中，永生化细胞以高水平表达CD117。在各种实施例中，本文提及“高水平”的CD117表达意指>80％的分析细胞(例如，通过流式细胞术)表达CD117。在仍其它实施例中，本文提及“低水平”的CD117表达意指<80％的分析细胞(例如，通过流式细胞术)表达CD117。

在某些实施例中，永生化之前和之后的细胞形态基本上不改变和/或特征在于未显示衰老的证据(图5)。

在其它实施例中，永生化细胞不表达CD31。在一个实施例中，永生化细胞不表达CD45。在仍其它实施例中，永生化细胞表达CD117，但不表达CD31或CD45。在其它特定实施例中，永生化细胞以高水平表达CD117，但不表达CD31或CD45(图6)。在其它特定实施例中，永生化细胞表达CD117、CD90、CD105、CD44、CD47和CD73，但不表达CD31或CD45(图6)。

可以在永生化之前从任何合适的来源获得新生心脏干细胞。在特定实施例中，永生化心脏干细胞的来源来自新生个体或子宫中的个体。在特定实施例中，细胞不是成年心脏干细胞。可以使用相同细胞的子代从需要治疗用途的个体获得细胞，或者可以从另一个个体获得细胞。细胞可以源自新生个体的捐赠心脏或来自活的新生个体的心脏。细胞可以商业地提供给有需要的个体，或者可以提供给监督有需要的个体的医疗护理的医疗机构或执业者。在特定实施例中，细胞从1天大到30天大的人类受试者获得。例如，人类受试者可以是或可以不超过1；2；3；4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；16；17；18；19；20；21；22；23；24；25；26；27；28；29；或30天大。人类受试者也可以小于一天大。

本公开的实施例涵盖从包含人的哺乳动物的肌心膜细胞衍生的永生化新生CSC。在特定实施例中，人新生心脏CSC可以具有特定基因型和/或表型。在某些实施例中，在确定适用于治疗使用时细胞的预期功能的细胞的特定基因型或表型之后，可以将永生化人新生心脏CSC提供给有需要的个体。然而，在一些优选实施例中，在确定适用于产生具有预期功能的条件培养基的细胞的特定基因型或表型之后，将由培养永生化人新生心脏CSC产生的条件培养基提供给有需要的个体。在具体实施例中，永生化人新生心脏CSC是CD117+细胞，并且在特定实施例中，永生化人新生心脏CSC是CD117+、CD90+、CD105+、CD73+、CD44+、CD47+和CD31-、CD45-。在其它实施例中，永生化人新生心脏CSC还具有以下特性中的一个、两个、三个、四个或五个或更多个特性：GATA4-、CD44+、CD31-、胰蛋白酶-、CD80-、CD45-、CD86-、HLA I+类和HLA II-类。在其它实施例中，永生化人新生心脏CSC还具有以下特性中的一个、两个、三个、四个或五个或更多个特性：GATA4-、CD44+、CD73+、CD47+、CD31-、胰蛋白酶-、CD80-、CD45-、CD86-、HLA I+类和HLA II-类。

在一些实施例中，永生化人新生心脏CSC天然分泌一种或多种有利于局部细胞或组织的修复、再生或重塑的蛋白质或因子。在一些实施例中，本公开提供了通过在永生化人新生心脏CSC分泌一种或多种有利于局部细胞或组织的修复、再生或重塑的蛋白质或因子的条件下培养所述永生化人新生心脏CSC而产生的条件培养基。此类蛋白质或因子可以是任何类型的，但在具体实施例中此类蛋白质或因子是细胞因子、促血管生成因子、生长因子、转录因子、miRNA等。在一些实施例中，细胞分泌VEGF-A、HGF、SCF、SDF-1α、ANG-1、bFGF、PDGFB和IGF-1中的一种或多种或任何组合。在一些实施例中，细胞分泌选自VEGF-A、HGF、SCF、SDF-1α、ANG-1、bFGF、PDGFB和IGF-1中的一种或多种或任何组合的因子，并且在一些实施例中，本公开提供了包括此类因子中的一种或多种此类因子的条件培养基。在某些实施例中，操纵细胞以增加SDF-1α、VEGF-A、PGDF-A和/或FGF-2或其组合的分泌。此类操纵可以通过任何方式，但在具体实施例中，操纵涵盖通过重组技术进行的细胞工程化，以增加这些因子和/或这些细胞未表达但具有治疗价值的其它因子中的一个或多个因子的表达。因此，在一些实施例中，本公开提供了来自此类经基因工程化细胞的条件培养基。考虑用于本发明的另一种操纵是将永生化人新生心脏CSC暴露于热休克因子和/或增加细胞因子分泌的其它药剂。

在一些实施例中，永生化人新生心脏CSC天然表达一种或多种直接或间接有利于局部细胞或组织的修复、再生或重塑的蛋白质或因子。例如，永生化人新生心脏CSC可以表达VEGF-A和/或SDF-1α。另外，类似于人新生心脏CSC，永生化人新生心脏CSC可以具有HSF-1、HSP60和/或HSP70的表达的激活，天然地或通过操纵细胞来增加HSF-1、HSP60和/或HSP70的表达(Sharma等人,2017)。因此，在一些实施例中，本公开提供了由此类细胞产生的条件培养基，所述条件培养基包括VEGF-A和/或SDF-1α。在一些实施例中，本公开提供了由此类细胞产生的条件培养基，包括天然或通过操纵的HSF-1、HSP60和/或HSP70的表达。在一些实施例中，永生化新生心脏干细胞的条件培养基(CM)包括如在表1中详述的预定范围内的旁系因子(例如，细胞因子和生长因子)的独特组合。

进一步地，分析永生化新生心脏干细胞分泌组中外泌体含量表明，直径为137.6nM(众数，SD＝49.1nM)的外泌体数量在1.1e+9±3.81e+7个颗粒/ml的范围内，并且这些外泌体显示表面标志物CD63、CD73⁺、CD47⁺，并且它们对CD31和CD45呈阴性(参见例如，图8)。

永生化人新生心脏CSC可以作为多个细胞存在，并且所述多个细胞可以相对于期望的心脏干细胞100％均匀。或者，在一些实施例中，相对于期望的永生化人新生心脏CSC，多个细胞的均匀性小于100％，如均匀性为99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25％或均匀性至少为所述百分比。当永生化人新生心脏CSC存在于均匀性为100％或均匀性小于100％，如均匀性为99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30或25％的多个细胞中时，其可以用于方法中。

永生化人新生心脏CSC可以在其使用(例如，用于培养以产生本文所公开的条件培养基)之前储存一段时间，包含在合适的培养基、温度和氧气水平条件下，或者它们可以在没有显著储存时间的情况下使用。在具体实施例中，储存细胞培养基包括一个或多个热休克应答诱导剂。

永生化人新生心脏CSC可以用于同种异体疗法，因为它们表达低水平的MHC II类或共刺激蛋白CD88和CD80。当移植到另一个患者的免疫系统中时，这些细胞不引发免疫应答。在这种情况下，细胞可以用作用于临床应用的现成产物。

在特定实施例中，当与源自成人心脏的类似来源的细胞比较时，来自年轻个体的CSC已显示出强修复和/或再生能力(Sharma等人,2017)。在具体实施例中，这些增加的能力部分地归因于由年轻细胞的更强大的分泌组。在至少具体实施例中，这意味着年轻细胞可以是优选的同种异体产物。此外，在一些实施例中，在根据本公开对人新生心脏CSC进行永生化后，维持这些优异的修复和/或再生特性。因此，例如，在一些实施例中，由永生化人新生心脏CSC产生的分泌组优于由从成人心脏细胞衍生的CSC产生的分泌组，以用于诱导受损心脏组织的修复和/或再生。因此，本公开提供了诱导心脏组织损伤的修复和/或再生的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包括来自一种或多种永生化人新生心脏CSC的条件培养基的组合物。在一些实施例中，将人新生心脏CSC群体重悬于包括来自一种或多种永生化人新生心脏CSC的条件培养基的组合物中，并且将包括条件培养基和重悬的人新生心脏CSC的组合物施用于患者。

II.用于分离nCSC的方法

本公开还提供了用于从新生组织中分离CD117+CSC的新型方法，而不需要将收集的细胞暴露于包括具有结合CD117(即，c-kit)的部分的表面的底物。此方法与用于分离CD117+hCSC的现有技术方法相反，所述现有技术方法全部包括将收集的细胞暴露于包括CD117结合部分(例如，抗体)的此类底物(例如，板、珠粒或柱)，以便从样品中存在的细胞的异质性群体中选择CD117+细胞。

本文所公开的方法部分基于令人惊讶的发现，即与成年人心脏相比，新生儿心脏含有同质的心源性CD117+干细胞群体，其中造血和内皮祖细胞的污染非常少或没有污染。进一步地，已经发现，新生儿心脏中的CD117+细胞产生可以在培养中增殖的克隆，即使在最初作为单细胞接种时也是如此，并且它们的增殖率与细胞的CD117阳性水平有关。因此，具有高度CD117+表达的细胞通常比具有CD117的较低表达的细胞增殖快，但是观察到增殖的所有细胞至少在一定程度上表达CD117。此外，当在心肌梗塞的动物模型中测试时，新生心脏组织中的CD117+细胞未显示衰老的证据并且扩展成具有显著心脏修复和再生活性的大细胞数目(参见例如图7)。

因此，至少部分地基于这些令人惊讶的发现，本公开提供了一种直接从新生心脏组织中分离和繁殖人新生心脏CSC(例如，CD117+新生心脏CSC的同质群体)的方法，而无需事先用CD117磁珠(或任何其它CD117+细胞富集程序)进行选择。此方法提供了对由表型CD90⁺、CD105⁺、CD117⁺、CD44⁺、CD73⁺、CD47⁺、CD31^-、CD34^-、CD45^-和类胰蛋白酶阴性定义的独特细胞群体的选择，这在本公开之前尚未公开。另外，此类方法提供优于现有技术方法的显著优点，因为它们提供了单细胞供体和供体在获得大量细胞方面的独立性，确保细胞同质性，并且避免将旨在用于疗法的细胞暴露于非GMP质量材料(即，CD117磁珠)的监管问题。进一步地，此类方法降低了在获得新生心脏样品与提供群体CD117+细胞之间必须发生的加工水平，例如用于治疗目的，用于根据本文公开的方法产生条件培养基和/或用于永生化。

在各个实施例中，本公开还提供了一种用于从新生心脏组织中分离CD117+CSC的方法，所述方法包括从新生心脏组织中分离一种或多种克隆分离细胞或使其从新生心脏组织中分离，并且在合适的培养基中培养所述一种或多种细胞以促进增殖，其中所述分离不包括使所述细胞与结合CD117的部分(例如，CD117抗体)接触。在一些实施例中，所述方法包括引发一个培养物或多个培养物，每个培养物具有来自心脏组织的一个或多个细胞。在一些实施例中，每个培养物或多个培养物中的每个培养物最初仅接种来自心脏组织的一个细胞。这可以通过本领域已知的任何合适的方法来实现，例如通过FACS分选或从新生心脏组织样品获得的细胞的有限稀释培养。

所述方法可以包括监测所述培养物或所述多个培养物中的一个或多个培养物的增殖速度。所述方法可以包括通过将一个培养物或多个培养物的增殖速度与参考样品的增殖速度或已知CD117+表达的参考值进行比较来近似所述培养物或所述多个培养物中的一个或多个的CD117阳性水平。可以选择比其它克隆增殖更快的克隆，用于进一步扩增、表征和/或冷冻保存。可以选择表达比其它克隆更高水平的CD117阳性的克隆，用于进一步扩增、表征和/或冷冻保存。进一步的表征可以包含但不限于执行分泌组分析(例如，通过ELISA、MSD等)，例如对人VEGFA、SDF-1α、PDGFB、IGF-1、ANG-1、bFGF、SCF和/或HGF的分析；表型表征(例如，通过流式细胞术)，例如对标志物(例如，间充质干细胞标志物CD105或CD90、干细胞标志物CD117、内皮细胞标志物CD31、肥大细胞标志物类胰蛋白酶和/或造血细胞谱系标志物CD45)的细胞表面表达的分析；衰老分析；和/或功能表征，例如促进血管生成的能力、对氧化应激的抗性和/或治疗功效，例如在体内心脏损伤模型中。在一些实施例中，此类方法可以进一步包括使用本领域已知的或本文所公开的方法对分离的细胞进行永生化。永生化可以通过任何合适的方式。在一些实施例中，永生化是通过端粒酶的表达。说明性地，端粒酶可以由人TERT(hTERT)基因编码。人新生心脏CSC可以用hTERT转染，用能够将hTERT基因转移到细胞中的重组病毒感染或使用本领域已知的和可获得的任何合适的方法递送到CSC。

在一些实施例中，本公开提供了一种用于近似新生CSC的一个培养物或新生CSC的多个培养物中的CD117阳性水平的方法，所述方法包括确定培养物中的细胞的增殖速度，以及将所述速度与参考样品的增殖速度或已知CD117+表达的参考值进行比较。

在一些实施例中，分离CD117+新生心脏CSC的此类方法(如本文所公开的)用于治疗目的，例如美国专利公开号US2015/0328263中公开的治疗目的，所述美国专利通过引用整体并入本文，包含但不限于向有需要的受试者施用CD117+或以其它方式永生化CSC；将来自永生化CSC的条件培养基施用于有需要的受试者；和/或将永生化CSC和来自永生化CSC的条件培养基的组合施用于有需要的受试者。此类治疗目的通常包含在根据本领域已知的或本文公开的方法对新生CSC进行永生化后向有需要的受试者施用上述组合物中的任何组合物。

本领域技术人员认识到，除了用于从新生心脏组织中分离CD117+CSC的上述方法之外，还存在用于分离期望的nCSC的其它常规方法，并且可以通过任何合适的方式进行分离。例如，用于分离CD117+成人CSC的传统方法包括将收集的细胞暴露于底物，所述底物包括具有结合CD117的部分(如CD117抗体)的表面，以便从样品中存在的细胞群体中拉出CD117+细胞。在一些实施例中，本公开不利用此类方法。

本领域技术人员还认识到，存在从人心肌获得细胞并随后进一步处理细胞的常规方法。在特定实施例中，存在通过获得来自人心肌(如从心脏的右心房附件或“RAA”获得)的组织，包含来自新生心肌的组织，如通过活检来分离期望的人新生心脏CSC的方法。心肌可以来自没有已知心脏异常的个体。心肌可以来自患有末期心力衰竭的个体或来自患有先天性心脏病的个体，并且在这些情况下，心肌可以是正常的，或者可以是不正常的。提取的组织可以暴露于特定培养基，同时将单细胞从其组织中分离，包含通过切割组织，如在存在胶原酶的情况下。在具体实施例中，使组织和组织片段在培养基中沉积，并且获得上清液。可以从上清液收集细胞，并且悬浮于培养基，持续合适的时间段。此后，例如从其分离期望的CD117+人新生心脏CSC。期望的人新生心脏CSC的分离可以通过本文所公开的或本领域已知的任何方式发生。在一些实施例中，通过本文所公开的方法进行分离，所述方法不包括将收集的细胞暴露于包括具有结合CD117的部分(如CD117抗体)的表面的底物。

在某些实施例中，一旦分离期望的人新生心脏CSC，就可以在标准条件下培养它们，包含合适的传代。当细胞被递送到个体时，用于培养细胞的培养基可以与所采用的培养基基本上相同。培养基可以包括或可以不包括一个或多个热休克应答诱导剂。

III.本公开的细胞及其条件培养基和分泌组的使用方法

本公开的方法包含使用某些nCSC(以及在某些具体实施例中，CD117+间充质样细胞)或通过培养此类细胞产生的条件培养基用于有需要的个体的至少一种医学病状的疗法。在一些实施例中，细胞通过本文所述公开的方法分离，其中所述分离不包括将收集的细胞暴露于底物，所述底物包括具有结合CD117的部分(如CD117抗体)或结合任何其它表面蛋白的表面。在一些实施例中，克隆细胞分离株是永生化的(例如，通过hTERT永生化)。在具体实施例中，细胞、通过培养细胞产生的条件培养基或重悬于其条件培养基中的细胞可用于医学病状，其中产生抗炎或抗纤维化效果和/或促进组织修复、再生和/或替代将在治疗上有用。

在特定实施例中，医学病状是心脏医学病状。在具体实施例中，治疗有效量的永生化人新生心脏CSC、来自永生化人新生心脏CSC的条件培养基或重悬于来自本文所描述的永生化人新生心脏CSC的条件培养基中的细胞提供给个体，并且在特定实施例中，通过导管、直接注射或在一些情况下通过局部施用，将条件培养基局部递送到需要治疗的区域。在其它实施例中，将治疗有效量的永生化人新生心脏CSC、来自永生化人新生心脏CSC的条件培养基或重浮于来自本文所描述的永生化人新生心脏CSC的条件培养基中的细胞通过静脉内提供给个体。接受疗法的个体可以是任何性别或年龄的。个体可能会或可能不会被医疗从业者诊断出患有心脏医学病状。在某些实施例中，个体具有心脏医学病状的个人或家族病史。个体可能处于心脏医学病状的风险中，如吸烟、高密度脂蛋白(LDL)血浆水平和/或低高密度脂蛋白(HDL)血浆水平、不受控制的高血压、肥胖(超过个人理想体重的20％)、不受控制的糖尿病、高C反应性蛋白血浆水平或其组合。在具体实施例中，在诊断个体的特定基因型或表型后，向个体提供本公开的一种或多种方法。

例如通过本文所公开的方法从源个体分离期望的细胞后，并且在将所述期望的细胞递送到有需要的个体或将条件培养基从细胞递送到个体之前，所述细胞可以被进一步修饰，如通过基因工程操纵以重组表达一种或多种表达构建体，从而进一步培养和/或富集等，其中所述分离不包括将收集的细胞暴露于底物，所述底物包括具有结合CD117(即，c-kit)的部分(如CD117抗体)的部分或结合另一种细胞表面蛋白的部分的表面。此类进一步修饰还可以包括如本文所描述的细胞的永生化。此类实践在本领域中是常规的。转染到细胞中的表达构建体可以是任何类型的，但在具体实施例中，构建体表达细胞因子、促血管生成因子、生长因子、转录因子等。在具体实施例中，构建体表达VEGF-A、HGF、SCF、SDF-1α、ANG-1、HSF-1、PGDF-A、FGF-2或其组合和/或表达直接或间接增加其表达的另一种蛋白质。细胞可以暴露于一种或多种药剂以增加某些蛋白质的分泌和/或表达。

在某些实施例中，如本文所描述的治疗有效量的细胞用于一种或多种治疗方法中，但是在一些优选的实施例中，个体反而从细胞接收治疗有效量的条件培养基；来自细胞的所有分泌组的一部分；来自细胞的一个或多个分泌的蛋白质或其它因子(如外泌体、细胞外媒剂、miRNA等)；或其组合。在一些实施例中，来自细胞的条件培养基与一种或多种人新生心脏CSC组合施用于个体。在具体实施例中，这些组分或组合中的任何一种的使用促进内源性心肌细胞的增殖。在某些实施例中，这些组分或组合中的任何一种的使用允许修复、再生或重塑心肌。在某些实施例中，这些组分或组合中的任何一种的使用促进或增强所治疗的个体的内源性CSC的增殖、修复、再生或重塑能力。

在特定实施例中，治疗有效量的细胞、通过培养细胞(或永生化人新生心脏CSC)产生的条件培养基或重于其条件培养基中的细胞可以在数小时、数天、数周或数月的时间段内施用多于一次。治疗有效剂量可以在连续施用的过程中增加或降低。

在特定实施例中，当细胞被提供给个体时，所述细胞可以与(在相同或不同组合物中)结合或与另一个治疗部分同时提供。也就是说，在具体实施例中，将细胞与一种或多种药剂基本上同时施用于个体，所述一种或多种药剂在体内施用时增强细胞功能。此类药剂可以是任何类型的，但在具体实施例中，所述药剂是一种或多种热休克应答诱导剂。

尽管在一些情况下，将一种或多种药剂与细胞基本上同时提供给个体，但在具体实施例中，在将细胞递送到个体之前，将其暴露于一种或多种药剂，其中药剂在体内递送时增强细胞功能。在具体实施例中，将细胞在培养的同时暴露于一种或多种药剂。可以将细胞暴露于药剂一次或多次，并且当细胞在培养物中传代时，药剂可以或可以不存在于后续培养基中。在具体实施例中，药剂通过增加一种或多种基因的表达、增加一种或多种蛋白质或其它因子(如miRNA)的分泌或其组合来增强细胞的治疗用途。在特定实施例中，基因或蛋白质是细胞因子、促血管生成因子、生长因子、转录因子、miRNA和外泌体(含有浓缩蛋白和miRNA的小的携带媒剂)等。在某些实施例中，药剂是热休克应答诱导剂。

在一个实施例中，将向个体提供特定且治疗上有效数目的细胞。例如，在一些实施例中，向个体提供少于1亿个，例如100万到4000万个或100万到5000万个细胞。在具体实施例中，提供100万到2000万个细胞，但在一些实施例中，数百万个细胞的数目是例如100万-1900万、100万-1800万、100万-1700万、100万-1600万、100万-1500万、100万-1400万、100万-1300万、100万-1200万、100万-1100万、100万-1000万、100万-900万、100万-800万、100万-700万、100万-600万、100万-500万、100万-400万、100万-300万、100万-200万、200万-2000万、200万-1900万、200万-1800万、200万-1700万、200万-1600万、200万-1500万、200万-1400万、200万-1300万、200万-1200万、200万-1100万、200万-1000万、200万-900万、200万-800万、200万-700万、200万-600万、200万-500万、200万-400万、200万-300万、300万-2000万、300万-1900万、300万-1800万、300万-1700万、300万-1600万、300万-1500万、300万-1400万、300万-1300万、300万-1200万、300万-1100万、300万-1000万、300万-900万、300万-800万、300万-700万、300万-600万、300万-500万、300万-400万、400万-2000万、400万-1900万、400万-1800万、400万-1700万、400万-1600万、400万-1500万、400万-1400万、400万-1300万、400万-1200万、400万-1100万、400万-1000万、400万-900万、400万-800万、400万-700万、400万-600万、400万-500万、500万-2000万、500万-1900万、500万-1800万、500万-1700万、500万-1600万、500万-1500万、500万-1400万、500万-1300万、500万-1200万、500万-1100万、500万-1000万、500万-900万、500万-800万、500万-700万、500万-600万、600万-2000万、600万-1900万、600万-1800万、600万-1700万、600万-1600万、600万-1500万、600万-1400万、600万-1300万、600万-1200万、600万-1100万、600万-1000万、600万-900万、600万-800万、600万-700万、700万-2000万、700万-1900万、700万-1800万、700万-1700万、700万-1600万、700万-1500万、700万-1400万、700万-1300万、700万-1200万、700万-1100万、700万-1000万、700万-900万、700万-800万、800万-2000万、800万-1900万、800万-1800万、800万-1700万、800万-1600万、800万-1500万、800万-1400万、800万-1300万、800万-1200万、800万-1100万、800万-1000万、800万-900万、900万-2000万、900万-1900万、900万-1800万、900万-1700万、900万-1600万、900万-1500万、900万-1400万、900万-1300万、900万-1200万、900万-1100万、900万-1000万、1000万-2000万、1000万-1900万、1000万-1800万、1000万-1700万、1000万-1600万、1000万-1500万、1000万-1400万、1000万-1300万、1000万-1200万、1000万-1100万、1100万-2000万、1100万-1900万、1100万-1800万、1100万-1700万、1100万-1600万、1100万-1500万、1100万-1400万、1100万-1300万、1100万-1200万、1200万-2000万、1200万-1900万、1200万-1800万、1200万-1700万、1200万-1600万、1200万-1500万、1200万-1400万、1200万-1300万、1300万-2000万、1300万-1900万、1300万-1800万、1300万-1700万、1300万-1600万、1300万-1500万、1300万-1400万、1400万-2000万、1400万-1900万、1400万-1800万、1400万-1700万、1400万-1600万、1400万-1500万、1500万-2000万、1500万-1900万、1500万-1800万、1500万-1700万、1500万-1600万、1600万-2000万、1600万-1900万、1600万-1800万、1600万-1700万、1700万-2000万、1700万-1900万、1700万-1800万、1800万-2000万、1800万-1900万或1900万-2000万个。

在特定实施例中，可以通过培养本文所公开的永生化人新生心脏CSC来分离蛋白质、miRNA或条件培养基内的任何其它因子。在具体实施例中，从条件培养基，将分泌组本身或如蛋白质和外泌体等分泌组的一个或多个组分提供给个体。外泌体本身具有非常强的修复和/或再生能力，并且可以治疗性地提供给个体而不是细胞。在具体实施例中，将条件培养基治疗性地提供给个体而不是细胞。

IV.心脏医学病状

本公开的实施例涉及用由本文所描述的培养永生化新生CSC制备的条件培养基和/或通过本文所公开的方法分离的新生心脏CSC治疗一种或多种心脏医学病状。此类实施例的特定方面导致一种或多种心脏医学病状的逆转或一种或多种心脏医学病状的至少一种症状的改善。在示例性实施例中，心脏医学病状是心力衰竭。心力衰竭可以是一种或多种原因的结果，包含冠状动脉疾病、心脏病发作、高血压、故障心脏瓣膜、心肌病(如由疾病、感染、酒精滥用和药物如可卡因或用于化学疗法的一些药物的毒性作用引起)、先天性心肌病、先天性心脏病和/或遗传因素。

本公开的实施例的具体但示例性适应症至少包含用于心力衰竭的应用，包含充血性心力衰竭；预防心室重塑；和/或心肌病。其它适应症还可以包含冠状动脉疾病、缺血性心脏病、瓣膜性心脏病、继发于结构心脏干预的中风等。在具体实施例中，本公开的方法和组合物提供足以治疗包含逆转如心肌病或充血性心力衰竭等已建立的心脏医学病状的心肌修复和/或再生。

在个体患有心力衰竭的情况下，患者可以具有保留的射血分数(EF)或减小的射血分数(EF)。射血分数的特征在于微血管稀疏和广泛心肌纤维化，两者均可以用治疗有效量的细胞、来自永生化人新生心脏CSC的条件培养基或重悬于来自永生化人新生心脏CSC的条件培养基中的细胞来改善，因为使用异戊二烯醇诱导的心肌病模型进行的先前研究表明CSC改善啮齿动物模型中的心脏功能(Sharma等人；2017)。

在个体患有心肌病的情况下，心肌病可以是缺血性或非缺血性心肌病。心肌病可以由长期高血压、心脏瓣膜问题、来自先前心脏病发作的心脏组织损伤、慢性快速心率、代谢障碍、营养缺陷、怀孕、酒精滥用、药物滥用、化学疗法、病毒感染、血致变色、遗传病状、胆固醇水平升高或其组合引起。心肌病也可能没有确定的原因，即，先天性心肌病。

治疗有效量或数目的细胞、来自永生化人新生心脏CSC的条件培养基或重悬于来自永生化人新生心脏CSC的条件培养基中的细胞可以防止化学疗法诱导的心脏毒性。所公开的本发明也可以用于在器官替换程序中在运输期间的延伸器官保存。

V.炎性疾病

本公开的实施例提供了组合物，其包括新生心脏CSC的组合物、永生化新生心脏CSC、来自新生心脏CSC或永生化新生心脏CSC的条件培养基和重悬于来自c-新生心脏CSC或永生化人新生CSC的条件培养基中的新生心脏CSC，这些中的每一种都具有抗炎和抗凋亡特性，并且可以用于治疗一种或多种疾病，其中疾病过程的主要组分涉及炎性过程。涉及炎性组分并且可以用本公开的此类组合物治疗的此类疾病的非限制性实例包含肾病症(急性肾损伤和慢性肾病两者)、缺血性中风、关节炎、干眼症、包含帕金森氏病(Parkinson'sdisease)的神经退化性疾病、严重肢体缺血、COVID-19肺炎和其它炎性疾病。因此，在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，其包括新生心脏CSC、永生化新生心脏CSC、来自新生心脏CSC或永生化新生心脏CSC的条件培养基和重悬于来自新生心脏CSC或永生化新生CSC的条件培养基中的新生心脏CSC，用于治疗炎性疾病。在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，其包括新生心脏CSC、永生化新生心脏CSC、来自新生心脏CSC或永生化新生心脏CSC的条件培养基和重悬于来自新生心脏CSC或永生化新生CSC的条件培养基的新生心脏CSC，用于治疗选自肾病症(急性肾损伤和慢性肾病两者)、缺血性中风、关节炎、干眼症、神经退行性疾病、帕金森氏病和严重肢体缺血的疾病。在一些实施例中，本公开提供了一种治疗炎性疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的组合物，所述组合物包括新生心脏CSC、永生化新生心脏CSC、来自新生心脏CSC的条件培养基或永生化新生心脏CSC和重悬于来自新生心脏CSC或永生化新生CSC的条件培养基中的新生心脏CSC。在一些实施例中，本公开提供了一种治疗肾病症(急性肾损伤和慢性肾病两者)、缺血性中风、关节炎、干眼症、神经退行性疾病、帕金森氏病或严重肢体缺血的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效剂量的组合物，所述组合物包括新生心脏CSC、永生化新生心脏CSC、来自新生心脏CSC的条件培养基或永生化新生心脏CSC和重悬于来自新生心脏CSC或永生化新生CSC的条件培养基中的新生心脏CSC。

VI.伤口愈合

纤维化和炎症是伤口愈合的两个重要途径。因此，本公开的一些实施例提供了组合物，其包括新生心脏CSC、永生化新生心脏CSC、来自新生心脏CSC或永生化新生心脏CSC的条件培养基和重悬于来自新生心脏CSC或永生化新生CSC的条件培养基中的新生心脏CSC，这些中每一种都可以用于治疗伤口和促进伤口愈合。在特定实施例中，可以在通过培养本文所公开的永生化新生CSC制成的条件培养基内分离蛋白质、miRNA或任何其它因子，并且可以将此类分离的蛋白质、miRNA或因子施用于具有伤口的受试者以治疗伤口。在具体实施例中，永生化新生CSC、条件培养基、分泌组本身或如蛋白质和外泌体等分泌组的一个或多个组分可以用于促进伤口的进展和解决，所述蛋白质和外泌体负责调节组织纤维化和细胞功能如增殖、迁移和基质合成。

VII.组合疗法

在一些实施例中，还为已经接受本公开的疗法或正在接受或将要接受本公开的疗法的个体提供了针对靶向医学病状的另一种疗法。例如，在一些实施例中，还为已经接受本公开的疗法以治疗心脏医学病状或正在接受或将要接受本公开的疗法以治疗心脏医学病状的个体提供了用于心脏医学病状的另一种疗法。本公开的疗法可以在其它治疗之前或之后。本公开的疗法可以在其它治疗之前或之后，间隔范围为数分钟到数小时到数天或数月。在其中其它药剂和即时疗法单独给予个体的实施例中，通常将确保每次递送时间之间的相当长时间段不过期，使得本公开的疗法和另外的疗法仍能够对个体施加有利的组合效果。在此类情况下，经考虑可以例如同时或在彼此的数分钟内或在彼此的约1-12、6-12或12-24小时内使个体与两种模式接触。在一些情况下，可以期望显著延长治疗时间段，然而，其中在相应投与之间需要若干(2、3、4、5、6或7)天到若干(1、2、3、4、5、6、7或8)周的时间。

在具体实施例中，同时提供本公开的疗法和另外的疗法。在具体实施例中，在不同时间提供本公开的疗法和另外的疗法。分开的实体可以在相同的组合物内，或者它们可以包括在单独的组合物中。在其中在不同时间提供本公开的疗法和第二疗法的情况下，所述疗法可以按任何合适的时间范围分开，如分钟、小时、天、周或月。在其中单独提供疗法的实施例中，两种(或更多种)疗法的递送顺序可以是任何合适的顺序，包含在另一种疗法之前、与其同时或之后的细胞、分泌组和/或条件培养基的递送。

与本公开的疗法一起使用的其它治疗的实例包含以下中的一种或多种：ACE抑制剂、醛固酮抑制剂、血管生成素II受体阻断剂(ARB)；β-阻滞剂、钙通道阻滞剂、胆固醇降低药物、地高辛(Digoxin)、利尿剂、肌力疗法、钾或镁、血管扩张剂、抗凝血药物、阿司匹林、外科手术、VAD植入、VAT、冠状动脉旁路、经皮冠状动脉介入(PCI)或其组合。

VIII.本公开的试剂盒

本文所描述的永生化新生心脏CSC中的任何一种或来自此类CSC的条件培养基可以包括在试剂盒中。试剂盒可以另外包括用于心脏医学病状的疗法的其它药剂。

试剂盒的组分可以以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置将通常包含组分可以放置有于其中并且优选地是适当等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置。当试剂盒中存在多于一种组分时，试剂盒通常还将含有第二、第三或其它另外的容器，另外的组分可以单独放置于其中。然而，小瓶中可以包括组分的各种组合。本公开的试剂盒还将通常包含用于以紧密封闭的方式容纳一种或多种组合物以供商业销售的装置。此类容器可以包含将期望的小瓶保留在其中的注射或吹气模制的塑料容器。在具体实施例中，将细胞在冷冻状态下递送，并且可以在或可以不在塑料小瓶中提供。

所述组合物可以被调配成可注射的组合物。在这种情况下，容器装置本身可以是注射器、移液器和/或其它类似设备，所述调配物可以从其施加到身体的受影响区域，注射到动物中和/或甚至施加到试剂盒的其它组分和/或与所述试剂盒的其它组分混合。然而，试剂盒的组分也可以作为干燥粉末提供。当试剂和/或组分以干燥粉末的形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重组粉末。设想了也可以在另一个容器装置中提供溶剂。

本公开的试剂盒通常还将包含用于以紧密封闭的方式容纳小瓶以供商业销售的装置，例如期望的小瓶保留在其中的注射和/或吹塑成型的塑料容器。

在特定实施例中，试剂盒包括用于确定个体患有心脏医学病状的试剂和/或工具。在一些实施例中，试剂盒包括用于心脏相关医学病状的一种或多种另外的疗法，如ACE抑制剂、醛固酮抑制剂、血管生成素II受体阻断剂(ARB)中的一种或多种；β-阻滞剂、钙通道阻滞剂、胆固醇降低药物、地高辛、利尿剂、肌力疗法、钾、镁、血管扩张剂、抗凝血药物、阿司匹林、TGF-β抑制剂和其组合。

VII.药物组合物

本公开的药物组合物的实施例包括有效量的来自分散在药学上可接受的载体中的此类细胞的新生心脏CSC或条件培养基。有效量的新生CSC可以包含任何合适数量的细胞。在一些实施例中，有效量小于1亿个细胞，例如100万到4000万个细胞或100万到5000万个细胞。在一些实施例中，有效量包括提供100万到2000万个细胞，但在一些实施例中，数百万个细胞的数目是例如100万-1900万、100万-1800万、100万-1700万、100万-1600万、100万-1500万、100万-1400万、100万-1300万、100万-1200万、100万-1100万、100万-1000万、100万-900万、100万-800万、100万-700万、100万-600万、100万-500万、100万-400万、100万-300万、100万-200万、200万-2000万、200万-1900万、200万-1800万、200万-1700万、200万-1600万、200万-1500万、200万-1400万、200万-1300万、200万-1200万、200万-1100万、200万-1000万、200万-900万、200万-800万、200万-700万、200万-600万、200万-500万、200万-400万、200万-300万、300万-2000万、300万-1900万、300万-1800万、300万-1700万、300万-1600万、300万-1500万、300万-1400万、300万-1300万、300万-1200万、300万-1100万、300万-1000万、300万-900万、300万-800万、300万-700万、300万-600万、300万-500万、300万-400万、400万-2000万、400万-1900万、400万-1800万、400万-1700万、400万-1600万、400万-1500万、400万-1400万、400万-1300万、400万-1200万、400万-1100万、400万-1000万、400万-900万、400万-800万、400万-700万、400万-600万、400万-500万、500万-2000万、500万-1900万、500万-1800万、500万-1700万、500万-1600万、500万-1500万、500万-1400万、500万-1300万、500万-1200万、500万-1100万、500万-1000万、500万-900万、500万-800万、500万-700万、500万-600万、600万-2000万、600万-1900万、600万-1800万、600万-1700万、600万-1600万、600万-1500万、600万-1400万、600万-1300万、600万-1200万、600万-1100万、600万-1000万、600万-900万、600万-800万、600万-700万、700万-2000万、700万-1900万、700万-1800万、700万-1700万、700万-1600万、700万-1500万、700万-1400万、700万-1300万、700万-1200万、700万-1100万、700万-1000万、700万-900万、700万-800万、800万-2000万、800万-1900万、800万-1800万、800万-1700万、800万-1600万、800万-1500万、800万-1400万、800万-1300万、800万-1200万、800万-1100万、800万-1000万、800万-900万、900万-2000万、900万-1900万、900万-1800万、900万-1700万、900万-1600万、900万-1500万、900万-1400万、900万-1300万、900万-1200万、900万-1100万、900万-1000万、1000万-2000万、1000万-1900万、1000万-1800万、1000万-1700万、1000万-1600万、1000万-1500万、1000万-1400万、1000万-1300万、1000万-1200万、1000万-1100万、1100万-2000万、1100万-1900万、1100万-1800万、1100万-1700万、1100万-1600万、1100万-1500万、1100万-1400万、1100万-1300万、1100万-1200万、1200万-2000万、1200万-1900万、1200万-1800万、1200万-1700万、1200万-1600万、1200万-1500万、1200万-1400万、1200万-1300万、1300万-2000万、1300万-1900万、1300万-1800万、1300万-1700万、1300万-1600万、1300万-1500万、1300万-1400万、1400万-2000万、1400万-1900万、1400万-1800万、1400万-1700万、1400万-1600万、1400万-1500万、1500万-2000万、1500万-1900万、1500万-1800万、1500万-1700万、1500万-1600万、1600万-2000万、1600万-1900万、1600万-1800万、1600万-1700万、1700万-2000万、1700万-1900万、1700万-1800万、1800万-2000万、1800万-1900万或1900万-2000万个，包含其间的任何整数个细胞。例如，在一个特定实施例中，本公开的药物组合物包括分散在药学上可接受的载体中的1000万个新生心脏CSC。在一个特定实施例中，本公开的药物组合物包括来自培养的新生CSC的1000万个新生CD117+CSC和条件培养基。在一些实施例中，从其采集条件培养基的培养的新生心脏CSC是永生化新生人新生心脏CSC。

在一个特定实施例中，本公开的药物组合物包括有效量的新生CSC(例如，1000万个细胞)和存在于来自培养的新生CSC的条件培养基中的分泌因子的浓缩制剂。可以例如通过过滤来自细胞的条件培养基以去除一些或全部培养基，同时保留存在于培养基中的所有或一些分泌因子来制备分泌因子的此类浓缩制剂。此类浓缩因子可以沉淀物形式储存。此类浓缩因子可以重悬于药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、表面活性剂和/或媒剂中，用于储存或施用于受试者。浓缩因子可以单独或与新生心脏CSC群体(例如，有效剂量的CSC)组合重悬于药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、表面活性剂和/或媒剂中。在一些实施例中，从其采集条件培养基以制备分泌因子的浓缩制剂的培养的新生CSC是永生化新生CSC。在一些实施例中，施用于受试者和/或包含在本文所公开的药物组合物中的CSC不被永生化。

可以调配条件培养基用于施用于受试者。在一些实施例中，将条件培养基中存在的生物活性因子富集(例如，通过过滤条件培养基)，并且将生物活性因子在包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、表面活性剂和/或媒剂的药物组合物中重新调配。短语“药学上或药理学上可接受的”是指视情况在向动物例如人物施用时不产生不利反应、过敏反应或其它不良反应的分子实体和组合物。根据本公开，本领域的技术人员已知包括细胞的药物组合物的制备，如《雷明登氏药学全书(Remington:The Science and Practiceof Pharmacy)》,第21版,利平科特威廉姆斯(Lippincott Williams)和威尔金斯(Wilkins),2005中例示的，所述文献通过引用并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应当理解的是，制剂应符合无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准，如FDA生物标准办公室(FDA Office of Biological Standards)所要求的标准。

如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包含如本领域普通技术人员已知的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、像这类的材料和其组合。除了任何常规载体与所述活性成分不相容的情况之外，设想了其在药物组合物中的用途。

在一些实施例中，本公开提供了一种药物组合物，其包括根据本文所公开的方法分离的一种或多种人新生心脏CSC，所述组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、表面活性剂和/或媒剂。例如，在一些实施例中，组合物包括多个根据本文所公开的方法分离的在PlasmaLyte(伊利诺伊州迪尔菲尔德百特公司(Baxter,Deerfield,IL))中调配的人新生心脏CSC。在一些实施例中，人新生心脏CSC是永生化的。在一些实施例中，永生化是通过hTERT表达。

在一些实施例中，本公开提供了一种药物组合物，其包括来自根据本文所公开的方法分离的人新生心脏CSC的培养物的条件培养基，所述组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、表面活性剂和/或媒剂。可以调配条件培养基用于直接施用于受试者。在特定实施例中，条件培养基通过过滤富集生物活性因子，并且将富集的因子在包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、表面活性剂和/或媒剂的药物组合物中重新调配。例如，在一些实施例中，所述组合物包括来自条件培养基的富集的生物活性因子，所述条件培养基来自根据本文所公开的方法分离的在PlasmaLyte(伊利诺伊州迪尔菲尔德百特公司)中调配的多个人新生心脏CSC的培养物。在一些实施例中，人新生心脏CSC是永生化的。在一些实施例中，永生化是通过hTERT表达。

实例

包含了以下实例以说明本发明的优选实施例。本领域的技术人员应当理解，以下实例中所公开的技术表示由诸位发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用并且因此可以被认为构成本发明的优选实践模式的技术。然而，根据本公开，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施例进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。

实例1：新生CD117阳性心脏祖细胞的分离

包含心力衰竭的心脏医学病状和炎性疾病对任何年龄的患者，包含婴儿、儿童和成人都需要有效的疗法。特别地，需要用于再生患有例如由受损心肌组织引起的心脏病等心脏医学病状的成人和儿童的功能性心肌的组合物和方法。

此实例描述了一种用于分离和永生化可以用于产生条件培养基的CD117+nCSC的新型方法，所述条件培养基可以施用于有需要的患者以治疗受损心肌。

已发现与成年人心脏相比，新生儿心脏含有同质的心源性CD117+干细胞群体，其中造血和内皮祖细胞的污染非常少或没有污染。进一步地，已发现这些新生人心脏源性干细胞未显示衰老的证据，产生克隆，当在心肌梗塞的动物模型中测试时，所述克隆可以增殖并扩增成具有显著的心脏修复和再生活性的大细胞数目。因此，部分地基于这些观察，已确定可以直接从新生心脏组织中获得这些新生心脏干细胞，而没有事先选择CD117磁珠，如迄今为止在文献中所做的那样。这是显著的优点，因为它避免了将旨在用于疗法的细胞暴露于非GMP质量材料(即，CD117磁珠)的监管问题。

在此，描述了关于在无CD117抗体富集的情况下获得的人新生心脏干细胞克隆的分离和功能表征的方法和某些数据。

此研究获得了马里兰大学医学院的机构审查委员会和动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。在给予家长或患者同意书后，在常规心脏手术期间从新生儿(1天到30天)获得来自右心房附件(RAA)的样本(20±40mg)。

1.将RAA组织转移到填充有盐水溶液的100mm Petri培养皿中以将所述组织进行洗涤。将此步骤重复两次。在Steri 250(艾诺泰克公司(Inotech))中灭菌的钳子用于从心脏样本中切除纤维化组织和脂肪。然后将样品转移到Ham's F12培养基中，并且切成1-2mm²切片。

2.将组织片段转移到50ml管中并将其沉淀。去除上清液并且将沉淀的碎片重悬于5-10ml II型胶原酶CSL2(沃辛顿公司(Worthington)#4177)中。根据组织大小和类型，在Ham's F12培养基中以1-2mg/ml的浓度溶解胶原酶。随后，将样品在振荡器上在37℃下以200rpm温育30-45分钟。

3.在胶原酶处理之后，将管从振荡器移除，将未消化的碎片沉淀，并且将含有释放细胞的上清液在15℃下以1000rpm离心10分钟，重悬于生长培养基中(补充有10％FBS、0.2mM L-谷胱甘肽、10ng/ml bFGF、0.005U/ml EPO的Ham's F12营养混合物)，并且铺板于含有生长培养基的T25烧瓶中，并且将烧瓶置于37℃下、5％CO2下的培养箱中。72小时后，通过抽吸去除非粘附细胞，将粘附细胞用PBS进行洗涤，并且添加新鲜生长培养基。一旦细胞达到90-95％汇合度，就移除生长培养基，并且通过使用3ml TrypLE^TM来分离细胞。在细胞分离后，添加生长培养基并且将细胞悬浮液转移到50ml试管中，在15℃下以1000rpm离心10分钟，并且丢弃上清液以收集细胞托盘并获得细胞计数。

4.如图1所示，将10,000个细胞用于连续稀释以获得克隆的单细胞分离株。使用大约8个细胞/毫升获得单细胞分离株。将来自8个细胞/毫升悬浮液的50ul等分在96孔板中的单独孔中。通过显微镜下的目视检查将具有多于一个细胞的孔从实验中排除。

5.对细胞数目进行手动计数，并且使用下式计算群体倍增水平(PDL)：PDL＝3.32(log(收获时总细胞/接种时总细胞))。进行继代培养，直到克隆达到衰老为止，并且未观察到PDL从一个继代培养到下一个继代培养的变化。

在总共80个孔中，用一个细胞检测到24个孔。在24个铺板的单细胞中，18个形成主动增殖克隆(克隆效率75％)。图2示出了单细胞培养物中的一些的代表性图像。

增殖克隆用4％多聚甲醛固定，并且用对间充质干细胞标志物CD105和CD90具有特异性的荧光染料偶联的一级抗体标记，通过流式细胞术在百克顿-迪金森(Becton-Dickinson)Fortessa上对干细胞标志物CD117、内皮细胞标志物CD31、肥大细胞标志物类胰蛋白酶、造血细胞谱系标志物CD45以及CD44和CD47进行评估，收集了10,000个事件/样品。

FACS分析表明，虽然所有18个增殖克隆都是CD117阳性的，但只有7个是高度(>80％)CD117阳性(图3)，而其余11个克隆阳性较低(<74％)。

另外，这些高CD117阳性克隆比低CD117阳性克隆(数据未示出)增殖快约2倍，并且对于CD31和CD45呈阴性。

总而言之，这些结果表明，与来自动物和成人心脏的CD117+细胞相比，人新生心脏CD117+细胞出人意料地没有污染的内皮和造血祖细胞，这不仅是生物学上的独特和非预期的，而且也与文献中目前所做的一样。

实例2：新生CD117阳性心脏祖细胞的永生化

新生CD117+CSC分泌诱导受损心肌的修复、再生和/或重塑并改善心脏功能的蛋白质。这些CD117+新生CSC的永生化将使得能够产生无限供应的包括此类分泌蛋白的条件培养基。本发明实例提供此类永生化。

根据上文实例1中公开的方法分离新生CD117+CSC克隆，并且在培养物中扩增克隆。通常，表达高水平CD117的克隆是永生化的，然而，在一些情况下，表达低水平CD117的克隆也是永生化的。

通过用表达hTERT的慢病毒载体转染人新生CD117+心脏CSC克隆来实现永生化，并且分离、传播和储存表达hTERT的克隆以供长期使用。图4示出了用于根据本发明的新生CD117+人新生心脏CSC的永生化的构建体的非限制性实例。

另外，可以通过将图4所示的永生化基因与可以用于基因切除的序列侧接来构建可逆永生化新生CD117+CSC克隆，例如根据Hu,X.等人,《肿瘤靶标(Oncotarget)》,2017,第8卷,(第67期),第111847-111865页中描述的方法，所述文献通过引用整体并入本文。在一个实例中，永生化基因侧接有FRT位点：一个位点位于CMV启动子的5'端并且一个位点位于嘌呤霉素抗性盒的3'端。FLP重组酶然后可以用于促进永生化盒的切除，由此逆转永生化。除了用于产生大量条件培养基之外，此类细胞还可以用于在将细胞递送给患者前使永生化被逆转之后直接施用于患者，任选地与由细胞制成的条件培养基组合。

杀伤开关对照任选地通过例如掺入单纯疱疹病毒(HSV-TK)的胸苷激酶的基因而掺入载体中。HSV-TK使前药更昔洛韦(ganciclovir，GCV)，即鸟苷核苷的类似物磷酸化。将磷酸化的GCV掺入宿主DNA中并且终止DNA链的伸长，导致细胞死亡。因此，治疗已经接受此类可逆永生化新生心脏CSC与GCV一起施用的患者导致所施用的表达HSV-TK的细胞死亡，从而确保药物安全。其它杀伤开关是本领域已知的，并且可以用于本文公开的构建体中。

实例3新生CSC和其培养基的表征

a.端粒和端粒长度

为了计算人新生心脏CSC克隆的端粒长度，使用荧光原位杂交和来自达科公司(Dako)的用于流式细胞术的荧光素缀合的PNA探针(端粒PNA试剂盒/FITC)(目录号K5327)进行流式细胞术分析。使用为四倍体并且具有长端粒(>30kbp)的细胞系1301作为对照。使用以下公式计算相对端粒长度(RTL)。

b.衰老相关的β-半乳糖苷酶染色

根据制造商的说明书，使用β半乳糖酶染色试剂盒(目录号9860，马萨诸塞州波士顿细胞信号传导技术公司(Cell Signaling technology,Boston,MA))评估细胞衰老。简言之，将永生化(5.0X10⁴)之前和之后的人新生心脏CSC铺板在24孔中。从细胞中取出24小时的生长培养基后，将细胞用PBS冲洗，并且在室温下用1x固定溶液固定15分钟。将细胞与1mlβ半乳糖酶染色溶液一起温育过夜，并且在第二天成像。结果表明这些新生人心脏源性干细胞未显示衰老的证据。(图5)

c.旁分泌因子分泌

永生化新生CSC在完全无异种性培养基中生长，直到它们达到85-90％汇合度为止。将细胞用温热血清和无生长因子基础Ham's F12培养基洗涤两次，之后添加基础Ham'sF12，并且在37C小时下温育48小时以获得总条件培养基(TCM)。通过以1000g离心30分钟，然后以20,000g离心30分钟以去除微泡(MV)，随后使用3KDa过滤器(美国马萨诸塞州比勒利卡密理博公司(Millipore Inc,Billerica,MA))浓缩，将TCM预清除细胞碎片和颗粒物质。使用TCA-NLS方法，随后双辛宁测定(BCA)方法(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔公司(Thermofisher,Waltham,MA))对总蛋白含量进行定量。Im-nCSC衍生的TCM外观清晰、透明且无凋亡体(图8)。IM-nCPC TCM为0.2-0.4ng/ml，不含dsDNA(允许限值高达200ng/ml)。TCM为90-99.0％CD63⁺，并且对CD45和CD31呈阴性(图)。

为了归一化蛋白质含量，使用了以下公式：

(浓度因子)x(培养基的总体积)/条件培养基的总蛋白含量

使用TCA-NLS方法，随后BCA方法，对条件培养基进行定量，并且相对于总的1mg蛋白质归一化。根据制造商的方案，使用Meso-Scale Discovery装置\分析8个旁系因子：VEGFA、SDF-1α、PDGFB、IGF-1、ANG-1、bFGF、SCF和HGF。结果表明，Im-nCSC TCM分泌表1中所示的水平的所有8个旁系因子。

因子	平均值(pg/ml)	CV总和	范围(pg/ml)
				Ang-1	587.1	4.3	587.1-618.3
bFGF	7.1	4.3	7.1-7.4
				HGF	223.6	0.3	223.6-265.4
IGF-1	14.6	13.4	14.6-31.3
				PDGF-B	2.9	10.4	2.9-3.9
SCF	1.2	21.3	1.2-1.9
				SDF-1a	591.7	15.3	591.7-736.3
VEGF-A	433.9	5.5	353.1-433.9

表1.永生化nCSC分泌组中的心脏保护/抗炎/血管生成/抗凋亡因子

实例4——永生化新生CSC和其培养基的功能活性

a.体外活性

a1.血管生成活性

为了测试TCM对血管形成的促血管生成作用，将HMEC细胞使用Im-nCPC衍生的TCM(Im-nCSC TCM)和IMDM基础培养基作为阴性对照进行体外标准血管生成测定，其中HMEC完全培养基作为阳性对照。简言之，进行管测定形成以评估CM的血管生成潜力。如先前所描述的，在基质胶涂布的24孔板(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD Biosciences,SanJose,CA))中评估管状结构的形成。简言之，对人微血管内皮细胞(HMEC-1，

CRL-3243^TM)进行计数并且以20,000个细胞/mm2的密度接种，所述细胞铺板在含有还原生长因子的基质胶(产品编号354230，加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司)，其中添加(i)内皮完整细胞培养基(龙沙公司(Lonza))作为阳性对照；(ii)来自Im-nCSC的条件培养基或(iii)基础培养基(IMDM)作为阴性对照。在6-12小时后对细胞成像，并且重建每个孔的完整图像。然后使用ImageJ64，NIH(http://rsb.info.nih.gov/ij)测量总管长度。

结果表明IMDM中不存在HMEC形成复杂和成熟的内皮管网络的能力，但在存在Im-nCSC TCM的情况下，HMEC形成成熟的管，如图10所示。

a2.伤口愈合活性

为了评估Im-nCSC TCM的伤口愈合潜力，进行体外伤口愈合测定以评估用总条件培养基处理的细胞的相对迁移潜力。将HMEC(HMEC-1

CRL-3243^TM)接种在12孔板中，以产生汇合的单层。在用基础培养基进行12小时的血清饥饿后，使用1mL移液管尖端沿细胞单层产生线性刮擦以模拟伤口。通过用基础培养基洗涤细胞一次来去除细胞碎片。用从Im-nCSC衍生的总条件培养基、作为阴性对照的PBS和作为阳性对照的VEGF-A(3.0ug/ul)处理细胞。在处理后的时间0小时和22小时，沿着刮擦在特定的参考点拍摄每个伤口的图像。用钙粘蛋白AM细胞渗透染料(赛默飞世尔科技公司)对HMEC进行染色，并且用从Im-nCSCTCM获得的条件培养基对预处理前和处理后进行成像。使用ImagePro软件测量治疗之前和之后的伤口总面积以计算伤口闭合的变化百分比。结果示出，与阴性对照相比，Im-nCSC衍生的TCM显著增加了创伤愈合过程(图11)。

a3.防止H2O2诱导的细胞凋亡

使用膜联蛋白V凋亡检测试剂盒(目录号556547，BD pharmingin)进行响应于氧化应激的凋亡的评估。简言之，新生大鼠心肌细胞(NRCM)购自龙沙沃克斯维尔公司(LonzaWalkersville,Inc)(RCM-561)，并且根据制造商的说明书进行培养。简言之，大鼠心肌细胞生长培养基(RCGM)的所有组分在冷室中解冻过夜并混合。用硝酸纤维素/甲醇混合物(溶解于1.0ml甲醇中的0.1cm2硝酸纤维素)涂布24孔板中的10孔，并且将每瓶大鼠心肌细胞悬浮于10ml完全RCGM中。在过夜温育后，将I ml细胞悬浮液转移到每个孔(3x10⁵个细胞/孔)中，在不存在或存在Im-nCSC衍生的条件培养基(50μM)的情况下，在无血清基础培养基(n＝4个技术重复)中用100μM过氧化氢处理NRCM，持续6小时，然后使用BD Pharmingen FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I(目录号556547)对膜联蛋白V/PI进行流式分析。数据示出，Im-nCSCTCM显著降低了早期凋亡标志物膜联蛋白V的表达(图9)。这些结果表明，Im-nCSC衍生的TCM降低氧化应激诱导的凋亡。

b.体内活性

b1.大鼠心肌梗塞(MI)模型中的细胞移植

在免疫缺陷的雄性大鼠中，通过左前降(LAD)冠状动脉的永久连接诱导心肌梗塞(重量，250-300g)。将心脏通过左胸切开术暴露，并且连接近端LAD。之后，将悬浮于100μL媒剂(IMDM)中的100万个nCSC和Im-nCSC细胞注射到梗塞的四个相邻部位处的心肌中，并且将100μL媒剂(IMDM)作为对照。基线超声心动图在心肌梗塞外科手术前1天获得。还在第7天和在心肌梗塞后28天进行超声心动图检查。使用VisualSonics Vevo 2100超声单元(加拿大多伦多VisualSonics公司(VisualSonics,Toronto,Canada)，www.visualsonics.com)进行二维和M型超声心动图，并且评估分度面积变化(FAC)。图像是从中间乳突水平的胸骨旁长轴和胸骨旁短轴获得的。心肌活力评估如下。为了计算梗塞大小，分析了沿着长轴不同水平的马松三色(Masson Trichrome)染色切片的胶原沉积。如先前所描述的，使用中线技术确定梗塞大小。通过ImagePro软件分析染色切片。简言之，使用沿着长轴不同水平的马松三色染色切片计算梗塞大小。为了计算活组织和非活组织，计算红色像素(活组织)和蓝色像素(非活组织)的数目，并且呈现非活组织/像素的整体数目的比率。数据示出，nCSC和nCSC衍生的永生化克隆两者都具有功能性，如图中所示，在nCSC或nCSC衍生的永生化克隆的移植后，射血分数和缩短分数显著增加。这些结果表明永生化不影响nCSC衍生的克隆的功能性电位(图7)。

b2.Im-nCPC衍生的TCM在大鼠MI模型中的功能活性

为了确定Im-nCSC衍生的总条件培养基(TCM)的功能电位，通过用缝合线的LAD连接使大鼠经受前位MI。在大鼠麻醉并且处于仰卧位置时对大鼠进行超声检查，并且将超声探针直接置于胸壁上。在MI之前，左心室射血分数(LVEF)为约80％。在MI后约十分钟后，使用尾静脉来静脉内施用治疗(nCSC、Im-nCSC衍生的TCM和IMDM)。24小时后，用基线超声心动图评估心脏功能。五天后，向治疗组施用另一剂量的治疗。nCSC和Im-nCSC衍生的TCM注射动物从MI后2天到MI后4周未示出LV功能的显著恶化。在4周时，nCSC治疗组中的LVEF显著高于安慰剂组(图12)。当与安慰剂组比较时，包含缩短分数(FS)和降低的收缩末期体积(ESV)的其它参数也显著改善，并且包含心脏输出/体重和后壁厚度的其它LV功能参数趋向于改善和正常重塑的心脏。在4周终点期间，nMSC益处显著持续存在。(图12)

等效方案

尽管已经结合上文陈述的具体实施例描述了本发明，但许多替代方案、修改和其其它变化对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。所有这种替代方案、修改和变化都旨在落入本发明的精神和范围内。在本说明书中引用和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开以全文引用的方式并入本文。如果有必要，则可以修改实施例的各方面以采用各个专利、申请和公开的概念来提供又另外的实施例。鉴于以上详细描述，可以对实施例作出这些和其它改变。一般而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所公开的具体实施例，而是应当被解释为包含所有可能的实施例连同此类权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求书并不受本公开限制。

参考文献

Roger V L.心力衰竭的流行病学(Epidemiology of heart failure.)《循环研究(Circ Res.)2013；113:646-659

Go A S、Mozaffarian D、Roger V L、Benjamin E J、Berry J D、Blaha M J、DaiS、Ford E S、Fox C S、Franco S、Fullerton H J、Gillespie C、Hailpem S M、Heit J A、Howard V J、Huffman M D、Judd S E、Kissela B M、Kittner S J、Lackland D T、LichtmanJ H、Lisabeth L D、Mackey R H、Magid D J、Marcus G M、Marelli A、Matchar D B、McGuire D K、Mohler E R,3rd,Moy C S、Mussolino M E、Neumar R W、Nichol G、Pandey DK、Paynter N P、Reeves M J、Sorlie P D、Stein J、Towfighi A、Turan T N、Virani S、Wong N D、Woo D、Turner M B.心脏病和中风统计——2014年更新：美国心脏协会的报告(Heart disease and stroke statistics—2014update:A report from the americanheart association.)《循环(Circulation)》.2014；129:e28-e292

Rossano J W、Kim J、Decker J A、Price J F、Zafar F、Graves D E、Morales DL、Heinle J S、Bozkurt B、Towbin J A、Denfield S W、Dreyer W J、Jefferies J L.美国儿童心力衰竭相关住院的患病率、发病率和死亡率：一项基于群体的研究。(Prevalence,morbidity,and mortality of heart failure-related hospitalizations in childrenin the united states:A population-based study.)《心力衰竭杂志(Journal ofcardiac failure)》.2012；18:459-470

Porrello E R、Mahmoud A I、Simpson E、Hill J A、Richardson J A、Olson E N、Sadek H A.新生小鼠心脏的瞬时再生潜力(Transient regenerative potential of theneonatal mouse heart.)《科学》.2011；331:1078-1080

Messina E、De Angelis L、Frati G、Morrone S、Chimenti S、Fiordaliso F、Salio M、Battaglia M、Latronico M V、Coletta M、Vivarelli E、Frati L、Cossu G、Giacomello A.从人和鼠心脏中分离和扩增成人心脏干细胞(Isolation and expansionof adult cardiac stem cells from human and murine heart.)《循环研究》.2004；95:911-921

Beltrami A P、Barlucchi L、Torella D、Baker M、Limana F、Chimenti S、Kasahara H、Rota M、Musso E、Urbanek K、Leri A、Kajstura J、Nadal-Ginard B、AnversaP.成人心脏干细胞是多能的并且支持心肌再生(Adult cardiac stem cells aremultipotent and support myocardial regeneration.)《细胞》.2003；114:763-776

Smith R、Barile L、Cho H C、Leppo M K、Hare J M、Messina E、Giacomello A、Abraham M R、Marban E.从经皮心内膜心肌活检样本中扩增的心肌球衍生细胞的再生潜力(Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded frompercutaneous endomyocardial biopsy specimens.)《循环》.2007；115:896-908

Matsuura K、Nagai T、Nishigaki N、Oyama T、Nishi J、Wada H、Sano M、Toko H、Akazawa H、Sato T、Nakaya H、Kasanuki H、Komuro I.成人心脏sca-1阳性细胞分化为跳动的心肌细胞(Adult cardiac sca-1-positive cells differentiate into beatingcardiomyocytes.)《生物化学杂志(The Journal of biological chemistry)》.2004；279:11384-11391

He J Q、Vu D M、Hunt G、Chugh A、Bhatnagar A、Bolli R.从心房附件中分离的人心脏干细胞稳定地表达c-kit(Human cardiac stem cells isolated from atrialappendages stably express c-kit.)《公共科学图书馆综合(PloS one.)》2011；6:e27719

Stolzing A、Sethe S、Scutt AM.应激干细胞：老化间充质干细胞的温度应答(Stressed stem cells:Temperature response in aged mesenchymal stem cells.)《干细胞和开发(Stem cells and development)》.2006；15:478-487

Mishra R、Vijayan K、Colletti E J、Harrington D A、Matthiesen T S、SimpsonD、Goh S K、Walker B L、Almeida-Porada G、Wang D、Backer C L、Dudley S C,Jr.、Wold LE、Kaushal S.先天性心脏病患者心脏祖细胞的表征和功能(Characterization andfunctionality of cardiac progenitor cells in congenital heart patients.)《循环》.2011；123:364-373

Sharma、Mishra R、Bigham E.G、Wehman B、Khan M、Xu H、Saha P、Goo Ah.G、DatlaR.S、Chen L、Tulapurkar E.M、Taylor S.B、Yang P、Karathanasis S、Goodlett R D、Kaushal S.深度蛋白质组分析将完整的分泌组鉴定为人心脏祖细胞的功能单位(A DeepProteome Analysis Identifies the Complete Secretome as the Functional Unit ofHuman Cardiac Progenitor Cells.)《循环研究》2017；120:816-834

Bu L、Jiang X、Martin-Puig S、Caron L、Zhu S、Shao Y、Roberts D J、Huang PL、Domian I J、Chien K R.人isl1心脏祖细胞生成多种多能心血管细胞谱系(Human isl1heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.)《自然(Nature)》.2009；460:113-117

Bolli R、Chugh A R、D'Amario D、Loughran J H、Stoddard M F、Ikram S、BeacheG M、Wagner S G、Leri A、Hosoda T、Sanada F、Elmore J B、Goichberg P、Cappetta D、Solankhi N K、Fahsah I、Rokosh D G、Slaughter M S、Kajstura J、Anversa P.缺血性心肌病患者的心脏干细胞：随机1期试验的初步结果(scipio)(Cardiac stem cells inpatients with ischaemic cardiomyopathy(scipio):Initial results of arandomised phase 1trial.)《柳叶刀(Lancet)》.2011；378:1847-1857

Makkar R、Smith R、Cheng K、Malliaras K、Thomson L E、Berman D、Czer L S、Marban L、Mendizabal A、Johnston P V、Russell S D、Schuleri K H、Lardo A C、Gerstenblith G、Marban E.用于心肌梗塞后心脏再生的冠状动脉内心脏球衍生的细胞(caduceus)：一项前瞻性随机1期试验(Intracoronary cardiosphere-derived cells forheart regeneration after myocardial infarction(caduceus):A prospective,randomised phase 1trial.)《柳叶刀》.2012；379:895-904

Simpson D L、Mishra R、Sharma S、Goh S K、Deshmukh S、Kaushal S.源自新生心脏的心脏干细胞的强再生能力(A strong regenerative ability of cardiac stemcells derived from neonatal hearts.)《循环》.2012；126:S46-53

Kajstura J、Leri A、Finato N、Di Loreto C、Beltrami C A、Anversa P.人终末期心力衰竭中的肌细胞增殖(Myocyte proliferation in end-stage cardiac failurein humans.)《美利坚合众国国家科学院论文集(Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America).1998；95:8801-8805

Anversa P、Kajstura J.心室肌细胞在成年哺乳动物心脏中没有终末分化(Ventricular myocytes are not terminally differentiated in the adultmammalian heart.)《循环研究》.1998；83:1-14

Rajabi M、Kassiotis C、Razeghi P、Taegtmeyer H.返回胎儿基因程序保护应激心脏：一个强有力的假设(Return to the fetal gene program protects the stressedheart:A strong hypothesis.)《心力衰竭综述(Heart failure reviews)》.2007；12:331-343

Malliaras K、Makkar R、Smith R、Cheng K、Wu E、Bonow R O、Marban L、Mendizabal A、Cingolani E、Johnston P V、Gerstenblith G、Schuleri K H、Lardo A C、Marban E.心肌梗塞后的冠状动脉内心脏球衍生的细胞：caduceus试验的最后1年结果中治疗性再生的证据(心脏球衍生的自体干细胞逆转心室功能障碍)Intracoronarycardiosphere-derived cells after myocardial infarction:Evidence oftherapeutic regeneration in the final 1-year results of the caduceus trial(cardiosphere-derived autologous stem cells to reverse ventriculardysfunction).)《美国心脏病学会杂志(Journal of the American College ofCardiology)》.2014；63:110-122

Zaruba M、Soonpaa M、Reuter S、Field L J.从新生和成年小鼠心脏衍生的c-kit(+)表达性细胞的心肌生成潜力(Cardiomyogenic potential of c-kit(+)-expressingcells derived from neonatal and adult mouse hearts.)《循环》.2010；121:1992-2000

Simpson D、Liu H、Fan T H、Nerem R、Dudley S C、Jr.祖细胞递送的组织工程化方法导致显著的细胞植入和改善的心肌重塑(A tissue engineering approach toprogenitor cell delivery results in significant cell engraftment and improvedmyocardial remodeling.)《干细胞(Stem Cells)》.2007；25:2350-2357

Chimenti I、Smith R、Li T S、Gerstenblith G、Messina E、Giacomello A、Marban E.直接再生与移植到梗塞小鼠中的人心脏球衍生的细胞的旁分泌效果的相对作用(Relative roles of direct regeneration versus paracrine effects of humancardiosphere-derived cells transplanted into infarcted mice.)《循环研究》.2010；106:971-980

Zhang X、Wang X、Zhu H、Kranias E G、Tang Y、Peng T、Chang J、Fan G C.Hsp20作为新型心脏因子通过激活vegfr2促进血管生成(Hsp20functions as a novelcardiokine in promoting angiogenesis via activation of vegfr2.)《公共科学图书馆综合》.2012；7:e32765

Miyata S、Minobe W、Bristow M R、Leinwand L A.肌球蛋白重链异构体在衰竭和非衰竭人心脏中的表达(Myosin heavy chain isoform expression in the failing andnonfailing human heart.)《循环研究》.2000；86:386-390

Razeghi P、Young M E、Alcorn J L、Moravec C S、Frazier O H、Taegtmeyer H.胎儿和衰竭人心脏中的代谢基因表达(Metabolic gene expression in fetal andfailing human heart.)《循环》.2001；104:2923-2931

Afanasiev S A、Falaleeva L P、Rebrova T U、Suslova T E、Popov S V、KarpovR S.心肌梗塞后心脏重塑背景下应激蛋白对心肌内移植后骨髓间充质干细胞存活率的效果(Effect of stress-proteins on survival of bone marrow mesenchymal stemcells after intramyocardial transplantation against the background ofpostinfarction heart remodeling.)《实验生物学和医学通报(Bulletin ofexperimental biology and medicine)》.2008；146:111-115

Genth-Zotz S、Bolger A P、Kalra P R、von Haehling S、Doehner W、Coats A J、Volk H D、Anker S D.慢性心力衰竭患者的热休克蛋白70：与疾病严重程度和存活率的关系(Heat shock protein 70 in patients with chronic heart failure:Relation todisease severity and survival.)《国际心脏病学杂志(International journal ofcardiology)》.2004；96:397-401

Wang Y、Chen L、Hagiwara N、Knowlton A.热休克蛋白60和72在衰竭心脏中表达的调节(Regulation of heat shock protein 60 and 72 expression in the failingheart.)《分子和细胞心脏病学杂志(Journal of molecular and cellularcardiology)》.2010；48:360-366

Reynolds B A、Weiss S.从成年哺乳动物中枢神经系统的分离细胞中生成神经元和星形胶质细胞(Generation of neurons and astrocytes from isolated cells ofthe adult mammalian central nervous system.)《科学》.1992；255:1707-1710

Rietze R L、Reynolds B A.神经干细胞分离和表征(Neural stem cellisolation and characterization.)《酶学方法(Methods in enzymology)》.2006；419:3-23

Mirotsou M、Jayawardena T M、Schmeckpeper J、Gnecchi M、Dzau V J.心脏干细胞修复和再生作用的旁分泌机制。(Paracrine mechanisms of stem cell reparativeand regenerative actions in the heart.)《分子和细胞心脏病学杂志》.2011；50:280-289

Angelini A、Castellani C、Ravara B、Franzin C、Pozzobon M、Tavano R、LiberaL D、Papini E、Vettor R、De Coppi P、Thiene G、Vescovo G.肺动脉高压和右心衰竭实验模型中的干细胞疗法：旁分泌和神经激素环境在重塑过程中的作用(Stem-cell therapyin an experimental model of pulmonary hypertension and right heart failure:Role of paracrine and neurohormonal milieu in the remodeling process.)心肺移植杂志：国际心脏移植学会官方公开物(The Journal of heart and lungtransplantation:the official publication of the International Society forHeart Transplantation)》.2011；30:1281-1293

McGinley L M、McMahon J、Stocca A、Duffy A、Flynn A、O'Toole D、O'Brien T.慢病毒载体介导的热休克蛋白27表达增强了梗塞心脏中的间充质干细胞存活率(Mesenchymal stem cell survival in the infarcted heart is enhanced bylentivirus vector-mediated heat shock protein 27expression.)《人基因疗法(Humangene therapy)》.2013；24:840-851

Feng Y、Huang W、Meng W、Jegga A G、Wang Y、Cai W、Kim H W、Pasha Z、Wen Z、Rao F、Modi R M、Yu X、Ashraf M.热休克提高sca-1+干细胞存活率，并且通过外泌体转移将缺血性心肌细胞引导朝向促存活表型：hsfl/mir-34a/hsp70途径的关键作用(Heatshock improves sca-1+stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytestoward a prosurvival phenotype via exosomal transfer:A critical role forhsfl/mir-34a/hsp70 pathway.)《干细胞》.2014；32:462-472

Cesselli D、Beltrami A P、D'Aurizio F、Marcon P、Bergamin N、Toffoletto B、Pandolfi M、Puppato E、Marino L、Signore S、Livi U、Verardo R、Piazza S、MarchionniL、Fiorini C、Schneider C、Hosoda T、Rota M、Kajstura J、Anversa P、Beltrami C A、Leri A.年龄和心力衰竭对人心脏干细胞功能的影响(Effects of age and heartfailure on human cardiac stem cell function.)《美国病理学杂志(The Americanjournal of pathology)》.2011；179:349-366

Laflamme M A、Chen K Y、Naumova A V、Muskheli V、Fugate J A、Dupras S K、Reinecke H、Xu C、Hassanipour M、Police S、O'Sullivan C、Collins L、Chen Y、MinamiE、Gill E A、Ueno S、Yuan C、Gold J、Murry C E.源自人胚胎干细胞的促生存因子中的心肌细胞增强了梗塞大鼠心脏的功能(Cardiomyocytes derived from human embryonicstem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.)《自然生物技术(Nature biotechnology)》.2007；25:1015-1024

Kannaiyan R、Shanmugam M K、Sethi G.源自雷公藤的雷公藤红素的分子靶标：在治疗炎性病症和癌症中的潜在作用(Molecular targets of celastrol derived fromthunder of god vine:Potential role in the treatment of inflammatory disordersand cancer.)《癌症通讯(Cancer letters)》.2011；303:9-20

Salminen A、Lehtonen M、Paimela T、Kaarniranta K.雷公藤红素：雷公藤的分子靶标(Celastrol:Molecular targets of thunder god vine.)》《生化和生物物理研究通讯(Biochemical and biophysical research communications)》.2010；394:439-442

Go A S、Mozaffarian D、Roger V L、Benjamin E J、Berry J D、Blaha M J等人执行摘要：心脏病和中风统计——2014年更新：美国心脏协会的报告(Executive summary:heart disease and stroke statistics—2014update:a report from the americanheart association.)《循环》.2014；129(3):399-410.电子版2014年1月22日.doi:10.1161/01.cir.0000442015.53336.12。PubMed PMID:24446411。

Go A S、Mozaffarian D、Roger V L、Benjamin E J、Berry J D、Blaha M J等人心脏病和中风统计——2014年更新：美国心脏协会的报告《循环》.2014；129(3):e28-e292.电子版2013年12月20日.doi:10.1161/01.cir.0000441139.02102.80。PubMed PMID:24352519。

Garbern J C、Lee R T.心脏干细胞疗法和心脏再生的前景(Cardiac stem celltherapy and the promise of heart regeneration.)《细胞干细胞(Cell stem cell.)》2013；12(6):689-98.电子版2013年6月12日.doi:10.1016/j.stem.2013.05.008。PubMedPMID:23746978；PubMed中心PMCID:PMC3756309。

Bolli R、Chugh A R、D'Amario D、Loughran J H、Stoddard M F、Ikram S等人缺血性心肌病患者的心脏干细胞(SCIPIO)：一项随机1期试验的初步结果(Cardiac stemcells in patients with ischaemic cardiomyopathy(SCIPIO):initial results of arandomised phase 1trial.)《柳叶刀》.2011；378(9806):1847-57.电子版2011年11月18日.doi:10.1016/S0140-6736(11)61590-0.PubMed PMID:22088800；PubMed中心PMCID:PMC3614010。

Bolli R、Tang X L、Sanganalmath S K、Rimoldi O、Mosna F、Abdel-Latif A等人自体心脏干细胞的冠状动脉内递送改善慢性缺血性心肌病的猪模型中的心脏功能(Intracoronary delivery of autologous cardiac stem cells improves cardiacfunction in a porcine model of chronic ischemic cardiomyopathy.)《循环》.2013；128(2):122-31.电子版2013年6月13日.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.001075.PubMed PMID:23757309；PubMed中心PMCID:PMC3807652。

Tang X L、Rokosh G、Sanganalmath S K、Yuan F、Sato H、Mu J等人心脏祖细胞的冠状动脉内施用减轻30天大梗塞大鼠的左心室功能障碍(Intracoronary administrationof cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in ratswith a 30-day-old infarction.)《循环》.2010；121(2):293-305.电子版2010年1月6日.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.109.871905.PubMed PMID:20048209；PubMed中心PMCID:PMC2814341。

Beltrami A P、Barlucchi L、Torella D、Baker M、Limana F、Chimenti S等人成人心脏干细胞是多能的并支持心肌再生(Adult cardiac stem cells are multipotentand support myocardial regeneration.)《细胞》.2003；114(6):763-76.电子版2003年9月9日.PubMed PMID:14505575。

Chugh A R、Beache G M、Loughran R I、Mewton N、Elmore J B、Kajstura J等人缺血性心肌病患者的心脏干细胞的施用：SCIPIO试验：外科手术方面和通过磁共振对心肌功能和活力进行中期分析(Administration of cardiac stem cells in patients withischemic cardiomyopathy:the SCIPIO trial:surgical aspects and interimanalysis of myocardial function and viability by magnetic resonance.)《循环》.2012；126(11增刊1):S54-64.电子版2012年9月9日.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.092627.PubMed PMID:22965994；PubMed中心PMCID:PMC3448934。

Pagani F D、DerSimonian H、Zawadzka A、Wetzel K、Edge A S、Jacoby D B等人移植到人体缺血受损心肌中的自体骨骼成肌细胞(Autologous skeletal myoblaststransplanted to ischemia-damaged myocardium in humans.)细胞存活率和分化的组织学分析(Histological analysis of cell survival and differentiation.)《美国心脏病学会杂志》.2003；41(5):879-88.电子版2003年12月3日.PubMed PMID:12628737。

Bergmann O、Bhardwaj R D、Bernard S、Zdunek S、Barnabe-Heider F、Walsh S等人人心肌细胞更新的证据(Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.)《科学》.2009；324(5923):98-102.电子版2009年4月4日.doi:10.1126/science.1164680.PubMedPMID:19342590；PubMed中心PMCID:PMC2991140。

Kajstura J、Rota M、Cappetta D、Ogorek B、Arranto C、Bai Y等人衰老和衰竭的人心脏的心肌发育(Cardiomyogenesis in the aging and failing human heart.)《循环》.2012；126(15):1869-81.电子版2012年9月8日.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.118380.PubMed PMID:22955965；PubMed中心PMCID:PMC3477474

Ongstad L.E、Mishra R、Belkhodja M、Sharma S、Gaddipati R、Phipps S、Kaushal S、Karathanasis S.人新生C-kit+心脏祖细胞的永生化在高传代时保留了其表型和功能(Immortalization of Human Neonatal C-kit+Cardiac Progenitor CellsPreserves Their Phenotype and Function at High Passage.)《循环》2019；

Buja,M.心脏修复和干细胞的假定作用(Buja,M.Cardiac repair and theputative role of stem cells.)《分子和细胞心脏病学杂志》128(2019)96-104。

Vujic,A.等人,心脏再生的分子机制(Molecular mechanisms of heartregeneration.)《细胞发育生物学研讨会(Semin Cell Dev Biol.)》2019年10月3日.pii:S1084-9521(19)30170-3。

Vincinanza,C等人,成人心脏干细胞是多能的和强健肌原性的：c-kit表达是必要的，但不足以鉴定它们(Adult cardiac stem cells are multipotent and robustlymyogenic:c-kit expression is necessary but not sufficient for theiridentification.)《细胞死亡与分化(Cell Death Differ.)》2017年12月；24(12):2101-2116。

Lewis-McDougall FC等人,衰老的细胞会导致心脏再生受损(Aged-senescentcells contribute to impaired heart Regeneration.)《老化细胞(Aging Cell)》.2019年6月；18(3):e12931。

Claims (28)

1.一种组合物，其包括来自一种或多种永生化新生CD117+心脏干细胞的条件培养基。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞具有以下特性中的一个或多个特性：CD90+、CD105+、CD31-、CD34-、CD45-和/或类胰蛋白酶阴性；以及药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述细胞具有以下特性中的一个或多个特性：CD44+、CD47+和/或CD73+。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的组合物，其中所述细胞具有以下特性中的一个或多个特性：GATA4、CD80-、CD86-和/或Lin-。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中在永生化之前，从小于30日龄的新生个体的心脏中分离所述新生CD117+心脏细胞。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述分离不包括使所述细胞与抗体接触。

7.根据权利要求5所述的组合物，其中所述分离不包括使用基于抗体的选择的细胞富集步骤。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞是通过有限稀释培养来分离的。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述永生化是通过hTERT的外源性表达来实现的。

10.一种组合物，其包括永生化人新生CD117+心脏干细胞。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述细胞具有以下特性中的一个或多个特性：CD90+、CD105+、CD31-、CD34-、CD45-和/或类胰蛋白酶阴性；以及药学上可接受的载体。

12.根据权利要求10到11中任一项所述的组合物，其中所述细胞具有以下特性中的一个或多个特性：CD44+、CD47+和/或CD73+。

13.根据权利要求10到12中任一项所述的组合物，其中所述细胞具有以下特性中的一个或多个特性：GATA4、CD80-、CD86-和/或Lin-。

14.根据权利要求10所述的组合物，其中在永生化之前，从小于30日龄的新生个体的心脏中分离所述新生CD117+心脏细胞。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述分离不包括使所述细胞与抗体接触。

16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述分离不包括使用基于抗体的选择的细胞富集步骤。

17.根据权利要求10中任一项所述的组合物，其中所述细胞是通过有限稀释培养来分离的。

18.根据权利要求10所述的组合物，其中所述永生化是通过hTERT的外源性表达来实现的。

19.一种治疗个体的心脏医学病状的方法，所述方法包括向所述个体提供治疗有效量的包括来自永生化新生CD117+心脏干细胞的条件培养基的组合物的步骤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述组合物选自根据权利要求1到9中任一项所述的组合物中的任何一种组合物。

21.一种治疗个体的心脏医学病状的方法，所述方法包括向所述个体提供治疗有效量的包括来自永生化新生CD117+心脏干细胞的条件培养基的组合物与包括多个新生CD117+心脏干细胞的组合物的组合的步骤。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述包括所述条件培养基的组合物选自根据权利要求1到9中任一项所述的组合物中的任何一种组合物。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述包括多个新生CD117+心脏干细胞的组合物选自根据权利要求10到18中任一项所述的组合物中的任何一种组合物。

24.一种用于修复或重塑有需要的受试者的心肌组织的方法，所述方法包括使所述受试者的所述心肌组织与根据权利要求1到9中任一项所述的组合物、根据权利要求10到18中任一项所述的组合物或其组合接触。

25.一种用于从新生心脏组织中分离CD117+干细胞的方法，所述方法包括从新生心脏组织中分离一种或多种细胞或使所述一种或多种细胞从新生心脏组织中分离以及在合适的培养基中培养所述一种或多种细胞以促进增殖，其中所述分离不包括使所述细胞与结合CD117的部分接触。

26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述分离不包括使所述细胞与抗体接触。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述分离不包括使所述细胞与CD117抗体接触。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述分离是通过直接克隆来实现的，而不需要针对内皮和/或造血细胞的阴性选择。

Images