CN111701076A - 一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111701076A
CN111701076A CN202010627158.7A CN202010627158A CN111701076A CN 111701076 A CN111701076 A CN 111701076A CN 202010627158 A CN202010627158 A CN 202010627158A CN 111701076 A CN111701076 A CN 111701076A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exosome
metal
implant material
calcium phosphate
based implant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010627158.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111701076B (zh
Inventor
刘冰
吕宇鹏
肖桂勇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong University
Original Assignee
Shandong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong University filed Critical Shandong University
Priority to CN202010627158.7A priority Critical patent/CN111701076B/zh
Publication of CN111701076A publication Critical patent/CN111701076A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111701076B publication Critical patent/CN111701076B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/30—Inorganic materials
    • A61L27/32—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/04—Metals or alloys
    • A61L27/047—Other specific metals or alloys not covered by A61L27/042 - A61L27/045 or A61L27/06
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/02—Inorganic materials
    • A61L27/04—Metals or alloys
    • A61L27/06—Titanium or titanium alloys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C23—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; CHEMICAL SURFACE TREATMENT; DIFFUSION TREATMENT OF METALLIC MATERIAL; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL; INHIBITING CORROSION OF METALLIC MATERIAL OR INCRUSTATION IN GENERAL
    • C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
    • C23C22/00—Chemical surface treatment of metallic material by reaction of the surface with a reactive liquid, leaving reaction products of surface material in the coating, e.g. conversion coatings, passivation of metals
    • C23C22/05—Chemical surface treatment of metallic material by reaction of the surface with a reactive liquid, leaving reaction products of surface material in the coating, e.g. conversion coatings, passivation of metals using aqueous solutions
    • C23C22/06—Chemical surface treatment of metallic material by reaction of the surface with a reactive liquid, leaving reaction products of surface material in the coating, e.g. conversion coatings, passivation of metals using aqueous solutions using aqueous acidic solutions with pH less than 6
    • C23C22/07—Chemical surface treatment of metallic material by reaction of the surface with a reactive liquid, leaving reaction products of surface material in the coating, e.g. conversion coatings, passivation of metals using aqueous solutions using aqueous acidic solutions with pH less than 6 containing phosphates
    • C23C22/08—Orthophosphates
    • C23C22/22—Orthophosphates containing alkaline earth metal cations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2420/00—Materials or methods for coatings medical devices
    • A61L2420/08—Coatings comprising two or more layers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/12—Materials or treatment for tissue regeneration for dental implants or prostheses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Metallurgy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用。包括金属基体、钙磷酸盐转化膜、表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体，金属基体的表面覆盖钙磷酸盐转化膜，钙磷酸盐转化膜与表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体连接，聚乙二醇化磷脂亲水端与钙磷酸盐转化膜形成Ca2+‑O‑PEG络合物，聚乙二醇化磷脂疏水端与外泌体的磷脂双分子结构层结合。提供微纳尺度和粗糙表面来提高外泌体的结合比表面积。增加外泌体的结合量。提高表面生物活性和骨再生能力。

Description

一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用金属材料表面改性技术领域，具体涉及一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
在牙科、骨科等领域，金属基植入材料是常用的承重部位硬组织修复或替换材料。为了使金属与人骨表面发生骨性结合，往往需要对材料进行表面改性，以提高其生物活性。随着种植适用症的不断扩大，对于较为复杂的临床病例，尤其对患有糖尿病、骨质疏松症的患者而言，由于骨缺损局部骨代谢紊乱，成骨细胞活性降低，严重妨碍了植入后材料表面的骨整合。利用生物活性因子修饰材料可迅速提高材料表面生物活性。然而临床应用中发现，较高浓度的人重组骨形态发生蛋白会引起并发症甚至导致肿瘤发生，而且大多数生物活性因子存在半衰期短、免疫原性高且稳定性差等缺陷，活性因子的递送、剂量和价格也是其应用的障碍。因此迫切需要新的策略提高骨质疏松环境下骨缺损部位金属植入材料表面的骨长入能力。
近年来，携带有特异性功能蛋白质和核酸的细胞外囊泡——外泌体，具有低免疫原性、较长半衰期以及高稳定性等特点，引起了研究人员的关注。众多研究表明，细胞分泌的外泌体具有促进细胞增殖分化、调节免疫等功能，依靠其内含的蛋白质和核酸，尤其是mi-RNA，在成骨细胞、破骨细胞和骨髓基质细胞之间的细胞间通讯中发挥至关重要的作用。因此，利用外泌体修饰金属基植入材料表面，可显著缩短植入体表面骨整合时间，对于骨科领域金属基植入材料在促进骨再生和血管新生方面具有极大的应用前景和价值。
发明人发现，国内外目前关于外泌体的修饰多聚焦于聚合物基质，而对于金属材料结合外泌体的报道非常少，主要是缺乏金属表面有效固定外泌体的手段和方法。金属表面一般通过静电作用可吸附少量生物大分子，但这种物理结合效率很低，而且吸附作用极不稳定。也有学者利用聚多巴胺薄膜作为连接材料和功能分子活性基团的过渡层，但是聚多巴胺薄膜无法提供粗糙表面或微纳尺度结构以增加外泌体的结合量。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，一种负载外泌体的金属基植入材料，包括金属基体、钙磷酸盐转化膜、表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体，金属基体的表面覆盖钙磷酸盐转化膜，钙磷酸盐转化膜与表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体连接，聚乙二醇化磷脂亲水端与钙磷酸盐转化膜形成Ca2+-O-PEG络合物，聚乙二醇化磷脂疏水端与外泌体的磷脂双分子结构层结合。
金属基体的外表面覆盖钙磷酸盐转化膜层，钙磷酸盐转化膜层的外表面覆盖聚乙二醇化磷脂层，聚乙二醇化磷脂层的外表面覆盖一层外泌体层。金属基植入材料是基底材料，钙磷酸盐转化膜是涂层材料，外泌体为纳米级囊泡，聚乙二醇磷脂是两亲性分子，它其实是形成胶束，将外泌体封装起来的，然后与磷酸钙膜层形成络合物。金属基植入材料的形状不限。
本发明通过金属基植入材料表面含钙磷酸盐转化膜可固定经聚乙二醇化磷脂修饰的外泌体。
聚乙二醇(PEG)化磷脂对细胞表面具有修饰作用，其脂质端能通过疏水作用固定在细胞的磷脂双分子层上，而不破坏膜结构。而且聚乙二醇化磷脂对细胞无毒性，可从细胞表面释放而不引起细胞内吞。另一方面，聚乙二醇化磷脂溶于水可形成PEG-OH键，与Ca2+可产生络合作用，形成Ca2+-O-PEG络合物。金属基材料表面含钙磷酸盐转化膜一方面可为络合PEG提供Ca2+，另一方面，可提供微纳尺度和粗糙表面来提高外泌体的结合比表面积。
外泌体具有与细胞膜类似的典型磷脂双层结构。
第二方面，上述负载外泌体的金属基植入材料的制备方法，所述方法具体步骤为：
将金属基体浸泡于含有磷源和钙源、氧化性促进剂的磷酸盐化学转化液中，得到金属表面覆盖钙磷酸盐转化膜的金属植入材料；
分别制备外泌体悬液、聚乙二醇化磷脂溶液，并将外泌体悬液和聚乙二醇化磷脂溶液混合，孵育后得到表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体混合溶液；
将表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体混合溶液滴加在覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体的表面，孵育后得到负载外泌体的金属基植入材料。
第三方面，上述负载外泌体的金属基植入材料在牙科、骨科领域中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
本发明公开了一种金属基体表面稳定固定外泌体的方法，且通过金属表面含钙磷酸盐转化膜的微纳尺度和粗糙表面能够提高外泌体的负载量，能够有效解决金属表面难以高效固定外泌体的问题。
利用本发明方法可以制备出负载外泌体的金属基植入材料，赋予材料表面特异性蛋白质、miRNA等生物活性因子，可以显著促进金属基植入材料表面生物活性和骨再生能力。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为一种负载外泌体的金属基植入材料的结构示意图，(a)为外泌体封装于聚乙二醇化磷脂胶束的结构示意图，(b)为金属基底材料表面含钙磷酸盐转化膜层结合聚乙二醇化磷脂修饰的外泌体的结构示意图；
图2为纯钛基底表面微纳结构的羟基磷灰石转化膜负载外泌体的表面形貌图；
图3为成骨细胞在纯钛(bare Ti)和固定外泌体的钛样本(Exo-Ti)表面培养不同时间的细胞计数情况；
图4为成骨细胞在纯钛(bare Ti)和固定外泌体的钛样本(Exo-Ti)表面矿化过程中碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果；
图5为成骨细胞在纯钛(bare Ti)和固定外泌体的钛样本(Exo-Ti)表面培养7天和14天后成骨相关基因表达结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
第一方面，一种负载外泌体的金属基植入材料，包括金属基体、钙磷酸盐转化膜、表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体，金属基体的表面覆盖钙磷酸盐转化膜，钙磷酸盐转化膜与表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体连接，聚乙二醇化磷脂亲水端与钙磷酸盐转化膜形成Ca2+-O-PEG络合物，聚乙二醇化磷脂疏水端与外泌体的磷脂双分子结构层结合。
本发明通过金属基体表面含钙磷酸盐转化膜可固定经聚乙二醇化磷脂修饰的外泌体。
如图1所示，聚乙二醇(PEG)化磷脂对细胞表面具有修饰作用，其脂质端能通过疏水作用固定在细胞的磷脂双分子层上，而不破坏膜结构。而且聚乙二醇化磷脂对细胞无毒性，可从细胞表面释放而不引起细胞内吞，如图1中的(a)所示。另一方面，聚乙二醇化磷脂溶于水可形成PEG-OH键，与Ca2+可产生络合作用，形成Ca2+-O-PEG络合物。金属基体表面含钙磷酸盐转化膜一方面可为络合PEG提供Ca2+，另一方面，可提供微纳尺度和粗糙表面来提高外泌体的结合比表面积，如图1的(b)所示。
外泌体具有与细胞膜类似的典型磷脂双层结构。
在本发明的一些实施方式中，金属基体包括钛及其合金、镁及其合金、316L不锈钢或锌合金。本发明的负载外泌体的金属基体可以适用于多种金属基材料，作为硬组织修复或替换材料，促进金属与人骨表面发生骨性结合，广泛应用于骨科或牙科领域中。
在本发明的一些实施方式中，含钙磷酸盐转化膜的物相成分包括以下一种或几种：羟基磷灰石、磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸锌钙。含钙磷酸盐转化膜主要提供钙离子，金属表面与钙磷酸盐结合的原理为：金属表面在磷酸盐化学转化液中受到游离酸的浸蚀发生阳极溶解从而失去电子，氢离子在阴极通过可溶性盐的水解而放电，从而使金属与溶液界面的酸度降低，由于化学平衡作用，驱使金属表面可溶性钙磷酸盐向不溶性的钙磷酸盐转化，并沉积在金属表面与金属晶格形成结合键，最终形成金属表面钙磷酸盐转化膜。
在本发明的一些实施方式中，外泌体包括骨髓间充质干细胞来源外泌体、脂肪间充质干细胞来源外泌体、成骨细胞来源外泌体、成肌细胞来源外泌体或内皮细胞来源外泌体。外泌体具有促进细胞增殖分化、调节免疫等功能，本发明中结合的外泌体含量较高，有助于缩短骨整合时间，生物活性好。
在本发明的一些实施方式中，聚乙二醇化磷脂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DMPE-PEG)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DPPE-PEG)。
第二方面，上述负载外泌体的金属基植入材料的制备方法，所述方法具体步骤为：
将金属基体浸泡于含有磷源和钙源、氧化性促进剂的磷酸盐化学转化液中，得到金属表面覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体；
分别制备外泌体悬液、聚乙二醇化磷脂溶液，并将外泌体悬液和聚乙二醇化磷脂溶液混合，孵育后得到表面修饰聚乙二醇的外泌体混合溶液；
将表面修饰聚乙二醇的外泌体混合溶液滴加在覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体的表面，孵育后得到负载外泌体的金属基植入材料。
在本发明的一些实施方式中，磷酸盐化学转化液中的钙源为Ca(H2PO4)2·H2O、Ca(NO3)2·4H2O、CaO中的一种或多种。优选的，磷酸盐化学转化液中Ca(H2PO4)2·H2O的浓度为8-10g/L，Ca(NO3)2·4H2O的浓度为10-11g/L，CaO的浓度为1-1.4g/L。
在本发明的一些实施方式中，磷酸盐化学转化液中的磷源为H3PO4、Ca(H2PO4)2·H2O、Zn(H2PO4)2·2H2O中的一种或多种。优选的，磷酸盐化学转化液中的Ca(H2PO4)2·H2O的浓度为10-12g/L，H3PO4的浓度为6-8ml/L，Zn(H2PO4)2·2H2O的浓度为1-3g/L或25-27g/L。
钙源和磷源通过混合反应得到钙磷酸盐，比如羟基磷灰石、磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸锌钙。磷酸盐化学转化液中加入氧化性促进剂有助于促进磷化的过程。金属表面钙磷酸盐转化膜是由大量结晶良好的不溶性钙磷酸盐晶体组成，原则上，结晶形状和晶体尺度可以通过调整金属表面状态、溶液配方(如浓度、催化剂含量等)以及成膜工艺参数(温度、pH值、反应时间等)来调控。另外，转化液中所含Ca2+能细化晶粒，抑制磷化晶粒的生长，在金属表面形成平滑、排列紧密的短棒状和颗粒状晶体，有效提高膜层的晶体密度和柱状晶体的数量，有利于微纳尺度特征膜层的形成。
在本发明的一些实施方式中，氧化性促进剂的浓度为1.5-4g/L。氧化性促进剂可以为硝酸钠、亚硝酸钠、硝酸镍、柠檬酸。
在本发明的一些实施方式中，覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体的制备过程中的反应条件为：温度为50-80℃，反应时间为20-150min；优选的，温度为55-75℃，时间为30-120min。
在本发明的一些实施方式中，外泌体悬液的制备方法为将外泌体利用PBS缓冲液重悬得到外泌体悬液。外泌体为通过分离方法得到。通过将上述的细胞进行培养，将培养上清液进行差速离心或超速离心法得到。在本发明的一些实施方式中，外泌体悬液的浓度为10-250μg/mL。
在本发明的一些实施方式中，聚乙二醇化磷脂溶液的溶剂为无水乙醇，聚乙二醇化磷脂的质量浓度为1-5mmol/mL；优选为2-3mmol/mL。
外泌体悬液和聚乙二醇化磷脂溶液在孵育的过程中，聚乙二醇化磷脂脂质端通过疏水作用锚定外泌体的磷脂双分子层。在本发明的一些实施方式中，外泌体悬液和聚乙二醇化磷脂溶液孵育的温度为3-6℃，避光孵育10-30min；优选的，孵育的温度为4℃。
在钙磷酸盐转化膜表面滴加表面修饰聚乙二醇的外泌体，络合反应后得到络合物，使钙磷酸盐转化膜与外泌体结合，由于钙磷酸盐转化膜表面的粗糙表面为微纳尺度的结构，使结合的外泌体的含量增多，可以缩短植入体表面骨整合时间，提高骨长入能力。
在本发明一些实施方式中，表面修饰聚乙二醇的外泌体和覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体混合孵育的温度为3-6℃，避光孵育2-24h；优选的，孵育的温度为4℃。
在本发明一些实施方式中，表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体混合溶液与覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体反应后进行超声清洗，然后干燥，超声清洗的时间为10-50s；优选为15-30s。超声清洗去掉金属基体表面未固定的多余外泌体，干燥可以进行室温下干燥。
第三方面，上述负载外泌体的金属基植入材料在牙科和骨科领域中的应用。
下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1
本实施例所记载的一种在纯钛表面固定骨髓间充质干细胞源外泌体的方法，其具体步骤如下：
(1)将经过酸洗活化后的纯钛置于pH值为5.00的含有7ml/L H3PO4，9g/L Ca(H2PO4)2·H2O，2g/L Zn(H2PO4)2·2H2O和4g/L氧化性促进剂的磷酸盐化学转化液中，75℃条件下反应120min，得到纯钛表面具有微纳尺度表面形貌的羟基磷灰石膜层。
(2)收集小鼠骨髓间充质干细胞培养上清液进行差速离心：700g，15min取上清；2000g，20min取上清；16000g，20min弃上清，用适量PBS缓冲液重悬底部沉淀，调整得到终浓度为100μg/mL的外泌体悬液。
(3)将5.6mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)粉末溶于1mL无水乙醇，得到浓度为2mmol/L的DSPE-PEG溶液。
(4)取10μL步骤(2)中的外泌体悬液与步骤(3)中的溶液充分混合均匀，4℃下避光孵育10min。
(5)将步骤(4)中的混合溶液均匀滴加至步骤(1)中的纯钛表面羟基磷灰石膜层上，4℃条件下避光孵育2h。
(6)将步骤(5)中反应后样品用去离子水超声清洗15s，去掉钛表面未固定的多余外泌体，室温下干燥，得到纯钛表面羟基磷灰石膜层固定骨髓间充质干细胞源外泌体的材料。
负载外泌体的金属基植入材料的SEM表征如图2所示，纳米级外泌体囊泡附着在微纳尺度的絮状羟基磷灰石膜层表面。
实施例2
本实施例所记载的一种在钛合金(Ti-6Al-4V)表面固定脂肪干细胞源外泌体的方法，其具体步骤如下：
(1)将经过预处理后的钛合金置于pH值为3.50的含有10g/L Ca(NO3)2·4H2O，26g/L Zn(H2PO4)2·2H2O和1.5g/L氧化性促进剂的磷酸盐化学转化液中，55℃条件下反应30min，得到钛合金表面具有微纳尺度表面形貌的磷酸锌钙膜层。
(2)采用常规超速离心法分离和提取人脂肪干细胞来源的外泌体，用适量PBS缓冲液重悬底部沉淀，调整得到终浓度为10μg/mL的外泌体悬液。
(3)将3.4mg二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DMPE-PEG)粉末溶于1mL无水乙醇，得到浓度为2mmol/L的DMPE-PEG溶液。
(4)取10μL步骤(2)中的外泌体悬液与步骤(3)中的溶液充分混合均匀，4℃下避光孵育20min。
(5)将步骤(4)中的混合溶液均匀滴加至步骤(1)中的钛合金表面磷酸锌钙膜层上，4℃条件下避光孵育12h。
(6)将步骤(5)中反应后样品用去离子水超声清洗20s，去掉钛合金表面未固定的多余外泌体，室温下干燥，得到钛合金表面磷酸锌钙膜层固定脂肪干细胞源外泌体的材料。
实施例3
本实施例所记载的一种在316L不锈钢表面固定成骨细胞外泌体的方法，其具体步骤如下：
(1)将经过预处理后的316L不锈钢置于pH值为4.00的含有7ml/L H3PO4，11g/L Ca(NO3)2·4H2O，1.2g/L CaO和1.5g/L氧化性促进剂的磷酸盐化学转化液中，55℃条件下反应30min，得到316L不锈钢表面具有微纳尺度表面形貌的磷酸钙膜层。
(2)采用常规超速离心法分离和提取成骨细胞来源的外泌体，用适量PBS缓冲液重悬底部沉淀，调整得到终浓度为250μg/mL的外泌体悬液。
(3)将6mg二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DPPE-PEG)粉末溶于1mL无水乙醇，得到浓度为3mmol/L的DPPE-PEG溶液。
(4)取10μL步骤(2)中的外泌体悬液与步骤(3)中的溶液充分混合均匀，4℃下避光孵育30min。
(5)将步骤(4)中的混合溶液均匀滴加至步骤(1)中的316L不锈钢表面磷酸钙膜层上，4℃条件下避光孵育24h。
(6)将步骤(5)中反应后样品用去离子水超声清洗30s，去掉316L不锈钢表面未固定的多余外泌体，室温下干燥，得到316L不锈钢表面磷酸钙膜层固定成骨细胞源外泌体的材料。
试验例
成骨细胞培养的操作过程为冻存的MG63成骨细胞株复苏后置于37℃，5％CO2的饱和湿度恒温箱，用含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM培养液进行培养，每隔48h更换一次培养液并观察细胞生长情况。细胞密度达到80％接触率时，按1：3传代，传代到2-3次后，细胞达到良好生长状态，加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化后，加入5mL DMEM培养液终止消化得到细胞悬浮液。将不同样本经环氧乙烷灭菌后置于24孔板内，以5×104/孔的密度接种于样本表面，每孔加入1mL DMEM培养液，然后置于37℃，5％CO2的饱和湿度恒温箱中，继续培养至试验点。
分别选择实施例1的负载外泌体的金属基植入材料(Exos-Ti)和纯钛(bare-Ti)。得到的结果分别如图3、图4、图5所示。通过图3可以得到，在6、12、24h的时间点上，实施例1的负载外泌体的金属基植入材料相比于纯钛具有更多的成骨细胞数量，说明实施例1的负载外泌体的金属基植入材料更有利于成骨细胞的黏附。
通过图4可以得到，随着培养时间的延长，实施例1的负载外泌体的金属基植入材料相比于纯钛碱性磷酸酶(ALP)活性更高，说明实施例1的负载外泌体的金属基植入材料更有利于促进成骨细胞早期分化。
通过图5可以得到，实施例1的负载外泌体的金属基植入材料相比于纯钛相关基因表达效果更好，其中ALP表示碱性磷酸酶，OCN表示骨钙素，OSX表示成骨相关转录因子抗体，RUNX2表示转录因子，BMP-2表示骨形成蛋白-2，COL-1表示I型胶原。从成骨相关基因表达结果上可以看到，实施例1的负载外泌体的金属基植入材料具有更好的生物活性和骨再生能力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种负载外泌体的金属基植入材料，其特征在于：包括金属基体、钙磷酸盐转化膜、表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体，金属基体的表面覆盖钙磷酸盐转化膜，钙磷酸盐转化膜与表面修饰聚乙二醇化磷脂的外泌体连接，聚乙二醇化磷脂亲水端与钙磷酸盐转化膜形成Ca2+-O-PEG络合物，聚乙二醇化磷脂疏水端与外泌体的磷脂双分子结构层结合。
2.如权利要求1所述的负载外泌体的金属基植入材料，其特征在于：金属基体包括钛及其合金、镁及其合金、316L不锈钢或锌合金。
3.如权利要求1所述的负载外泌体的金属基植入材料，其特征在于：含钙磷酸盐转化膜的物相成分包括以下一种或几种：羟基磷灰石、磷酸钙、磷酸氢钙、磷酸锌钙。
4.如权利要求1所述的负载外泌体的金属基植入材料，其特征在于：外泌体包括骨髓间充质干细胞来源外泌体、脂肪间充质干细胞来源外泌体、成骨细胞来源外泌体、成肌细胞来源外泌体或内皮细胞来源外泌体。
5.如权利要求1所述的负载外泌体的金属基植入材料，其特征在于：聚乙二醇化磷脂为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。
6.如权利要求1-5任一所述的负载外泌体的金属基植入材料的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
将金属基体浸泡于含有磷源和钙源、氧化性促进剂的磷酸盐化学转化液中，得到金属表面覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体；
分别制备外泌体悬液、聚乙二醇化磷脂溶液，并将外泌体悬液和聚乙二醇化磷脂溶液混合，孵育后得到表面修饰聚乙二醇的外泌体混合溶液；
将表面修饰聚乙二醇的外泌体混合溶液滴加在覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体的表面，孵育后得到负载外泌体的金属基植入材料。
7.如权利要求6所述的负载外泌体的金属基植入材料的制备方法，其特征在于：磷酸盐化学转化液中的钙源为Ca(H2PO4)2·H2O、Ca(NO3)2·4H2O、CaO中的一种或多种；
或，磷酸盐化学转化液中的磷源为H3PO4、Ca(H2PO4)2·H2O、Zn(H2PO4)2·2H2O中的一种或多种；
或，覆盖钙磷酸盐转化膜的金属植入材料的制备过程中的反应条件为：温度为50-80℃，反应时间为20-150min；优选的，温度为55-75℃，时间为30-120min；
或，外泌体悬液的制备方法为将外泌体利用PBS缓冲液重悬得到外泌体悬液。
8.如权利要求6所述的负载外泌体的金属基植入材料的制备方法，其特征在于：聚乙二醇化磷脂溶液的溶剂为无水乙醇，聚乙二醇化磷脂的质量浓度为1-5mmol/mL；优选为2-3mmol/mL；
或，外泌体悬液和聚乙二醇化磷脂溶液孵育的温度为3-6℃，避光孵育10-30min；优选的，孵育的温度为4℃；
或，表面修饰聚乙二醇的外泌体和覆盖钙磷酸盐转化膜的金属基体混合孵育的温度为3-6℃，避光孵育2-24h；优选的，孵育的温度为4℃。
9.如权利要求6所述的负载外泌体的金属基植入材料的制备方法，其特征在于：表面修饰聚乙二醇的外泌体混合溶液与覆盖钙磷酸盐转化膜的金属植入材料反应后进行超声清洗，然后干燥，超声清洗的时间为10-50s；优选为15-30s。
10.如权利要求1-5任一所述的负载外泌体的金属基植入材料在牙科、骨科领域中的应用。
CN202010627158.7A 2020-07-02 2020-07-02 一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用 Active CN111701076B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010627158.7A CN111701076B (zh) 2020-07-02 2020-07-02 一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010627158.7A CN111701076B (zh) 2020-07-02 2020-07-02 一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111701076A true CN111701076A (zh) 2020-09-25
CN111701076B CN111701076B (zh) 2021-03-16

Family

ID=72545720

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010627158.7A Active CN111701076B (zh) 2020-07-02 2020-07-02 一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111701076B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113440653A (zh) * 2021-07-01 2021-09-28 山西医科大学口腔医院 一种促进骨结合的钛基种植体及其制备方法和应用
CN113999399A (zh) * 2021-10-11 2022-02-01 苏州大学 一种双功能化mof材料及其制备和应用
CN115501387A (zh) * 2022-09-23 2022-12-23 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法
CN115518194A (zh) * 2022-09-19 2022-12-27 西南交通大学 联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法及其产品和应用
CN115957378A (zh) * 2023-02-08 2023-04-14 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种骨修复组合物及其制备方法和应用
WO2024076329A1 (en) * 2022-10-05 2024-04-11 Bilecik Seyh Edebali Universitesi Exosome-based biocompatible implant

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017025359A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 FECKL, Johann Mesoporous calcium phosphate-citrate nanoparticles and uses thereof
CN107913408A (zh) * 2017-11-16 2018-04-17 中南大学 一种外泌体‑核酸适配体脂质体复合载药系统及其制备方法和应用
WO2019039179A1 (ja) * 2017-08-22 2019-02-28 国立大学法人広島大学 エクソソームの単離方法およびエクソソームの単離キット
CN109939269A (zh) * 2019-03-06 2019-06-28 郑州大学 一种血管支架材料表面修饰方法、及其修饰后得到的血管支架材料和应用
CN110237311A (zh) * 2019-06-18 2019-09-17 郑州大学 一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用
CN110917215A (zh) * 2019-12-04 2020-03-27 陕西佰傲再生医学有限公司 复合体、组织修复材料及其制备方法和应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017025359A1 (en) * 2015-08-11 2017-02-16 FECKL, Johann Mesoporous calcium phosphate-citrate nanoparticles and uses thereof
WO2019039179A1 (ja) * 2017-08-22 2019-02-28 国立大学法人広島大学 エクソソームの単離方法およびエクソソームの単離キット
CN107913408A (zh) * 2017-11-16 2018-04-17 中南大学 一种外泌体‑核酸适配体脂质体复合载药系统及其制备方法和应用
CN109939269A (zh) * 2019-03-06 2019-06-28 郑州大学 一种血管支架材料表面修饰方法、及其修饰后得到的血管支架材料和应用
CN110237311A (zh) * 2019-06-18 2019-09-17 郑州大学 一种聚多巴胺-外泌体核壳结构纳米颗粒、及其修饰后制得的血管支架材料和应用
CN110917215A (zh) * 2019-12-04 2020-03-27 陕西佰傲再生医学有限公司 复合体、组织修复材料及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
樊丁等: "金属基磷酸钙陶瓷涂层的界面研究进展", 《中国表面工程》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113440653A (zh) * 2021-07-01 2021-09-28 山西医科大学口腔医院 一种促进骨结合的钛基种植体及其制备方法和应用
CN113999399A (zh) * 2021-10-11 2022-02-01 苏州大学 一种双功能化mof材料及其制备和应用
CN113999399B (zh) * 2021-10-11 2022-12-16 苏州大学 一种双功能化mof材料及其制备和应用
CN115518194A (zh) * 2022-09-19 2022-12-27 西南交通大学 联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法及其产品和应用
CN115518194B (zh) * 2022-09-19 2024-02-27 西南交通大学 联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法及其产品和应用
CN115501387A (zh) * 2022-09-23 2022-12-23 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法
CN115501387B (zh) * 2022-09-23 2023-07-07 山东第一医科大学(山东省医学科学院) 一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法
WO2024076329A1 (en) * 2022-10-05 2024-04-11 Bilecik Seyh Edebali Universitesi Exosome-based biocompatible implant
CN115957378A (zh) * 2023-02-08 2023-04-14 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种骨修复组合物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111701076B (zh) 2021-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111701076B (zh) 一种负载外泌体的金属基植入材料及其制备方法和应用
Lin et al. Structure and properties of hydroxyapatite for biomedical applications
US7247288B2 (en) Method of manufacturing hydroxyapatite and uses therefor in delivery of nucleic acids
Zhou et al. Improving osteogenesis of three-dimensional porous scaffold based on mineralized recombinant human-like collagen via mussel-inspired polydopamine and effective immobilization of BMP-2-derived peptide
JP3310291B2 (ja) 骨組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成のための生物活性物質テンプレート
Qu et al. Nano-structured gelatin/bioactive glass hybrid scaffolds for the enhancement of odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells
CN111150882B (zh) 银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架及其制备方法与应用
CN103721292A (zh) 一种新型的多功能介孔生物活性玻璃支架及其制备方法和用途
CN102886075B (zh) 人体硬组织修复材料及其制备方法
US20070048737A1 (en) Calcium phosphate ceramics and particles for in vivo and in vitro transfection
CN101716382B (zh) 一种质粒dna/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法
Deng et al. 3D printed strontium–zinc-phosphate bioceramic scaffolds with multiple biological functions for bone tissue regeneration
CN112569403A (zh) 一种基于聚多巴胺/氧化石墨烯/胶原纳米膜生物活性缓释涂层构建方法
Ming et al. Biomimetic design and fabrication of sericin-hydroxyapatite based membranes with osteogenic activity for periodontal tissue regeneration
CN110494098A (zh) 在等离子电解氧化工序中含有金属和硅的电解质组合物及利用其组合物来涂敷有含有金属离子和硅离子的羟基磷灰石的牙科用植牙的制造方法
CN115501387B (zh) 一种可缓释微量元素与外泌体的钛植入体及其制备方法
EP3988137A1 (en) Nucleic acid-calcium phosphate nanoparticle complex and application thereof in biomineralization
Qi et al. Sonochemical synthesis of fructose 1, 6-bisphosphate dicalcium porous microspheres and their application in promotion of osteogenic differentiation
Parra-Torrejón et al. Bioinspired mineralization of engineered living materials to promote osteogenic differentiation
Yuan et al. Three Birds, One Stone: An Osteo‐Microenvironment Stage‐Regulative Scaffold for Bone Defect Repair through Modulating Early Osteo‐Immunomodulation, Middle Neovascularization, and Later Osteogenesis
CN110251722A (zh) 磷酸镁基骨修复材料、原料组合物及其制备方法、应用
CN113144290B (zh) 一种促成骨和免疫调节的骨科材料表面涂层及其制备方法
JP2984176B2 (ja) 骨髄細胞の培養方法、培養用混合物および硬組織欠損部への移植用材料
CN114642630A (zh) 一种负载牙龈间充质干细胞外泌体的矿化胶原凝胶及其制备方法
CN107412860A (zh) 一种基于羟基磷灰石复合支架材料的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant