CN115518194B - 联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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- C23C—COATING METALLIC MATERIAL; COATING MATERIAL WITH METALLIC MATERIAL; SURFACE TREATMENT OF METALLIC MATERIAL BY DIFFUSION INTO THE SURFACE, BY CHEMICAL CONVERSION OR SUBSTITUTION; COATING BY VACUUM EVAPORATION, BY SPUTTERING, BY ION IMPLANTATION OR BY CHEMICAL VAPOUR DEPOSITION, IN GENERAL
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Abstract
本发明公开了一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法，包括多孔金属基材料经过物理和化学装载后获得装载外泌体的金属基植入材料；物理装载的步骤包括将多孔金属基材料浸没在外泌体溶液中，沉淀后外泌体连接到金属基材料的孔隙中，获得装载外泌体的金属基植入材料；化学装载的步骤包括将接枝有生物素和亲和素的多孔金属基材料加入生物素‑外泌体溶液中，生物素‑外泌体与金属基材料上的亲和素连接，然后获得装载外泌体的金属基植入材料。上述方法既能保证负载量又能连续释放外泌体到周围病灶部位，同时具备高效性及长期稳定性。采用本发明的装载方法，为医用植入人体材料领域提供了新的思路，有望应用于金属体内植入器械及经皮器械领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体而言，涉及联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法及其产品和应用。
背景技术
外泌体，是细胞外囊泡(EV)的一类，是一种由细胞分泌并可以被受体细胞吸收的内源性小膜泡(30-150nm)，它们携带核酸、蛋白质、脂质和代谢物，具有磷脂双分子层结构。由于外泌体能参与细胞通讯等过程，具有毒性低、免疫原性低、生物相容性高、可穿过血脑屏障等特点，使其成为高效药物载体，并为向靶细胞输送治疗物质提供了一种独特的途径。
口腔疾病是影响国民健康的常见病和多发病。伴随着人民生活质量的改善以及对口腔的保健意识的加强，各种牙科疾患的治疗和口腔的卫生保健逐渐受到人们的重视。口腔领域对外泌体的研究主要集中在外泌体介导细胞间通讯和调节免疫活性方面。牙周致病菌来源的外泌体是牙周免疫的一个新方向，也可以被用作牙周疫苗的开发。而且在牙科治疗中，干细胞外泌体可促进牙周膜干细胞的体外增殖并向成骨分化，从而促进牙周组织缺损的再生修复，能有效治疗牙齿疾病。外泌体研究在口腔领域是一个新的方向，为口腔疾病的治疗和诊断提供了新的思路，同时也需要更多更深入的研究，以期未来能够造福于临床。
目前，大多数用于注射治疗的外泌体虽然使用方便，效果确切，但不能对炎症及感染部位进行早期预防及靶向治疗，而通过表面改性植入材料使携带外泌体到靶向部位，达到精准治疗，成为研究热点。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法及其产品和应用。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法，包括多孔金属基材料经过物理和化学装载后获得装载外泌体的金属基植入材料；
物理装载的步骤包括将多孔金属基材料浸没在外泌体溶液中，沉淀后外泌体黏附到金属基材料的孔隙中，获得装载外泌体的金属基植入材料；
化学装载的步骤包括将接枝有生物素和亲和素的多孔金属基材料加入生物素-外泌体溶液中，生物素-外泌体与金属基材料上的亲和素连接，然后获得装载外泌体的金属基植入材料。
第二方面，如上述联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法制备得到的装载外泌体的金属基植入材料。
第三方面，如上述装载外泌体的金属基植入材料在在牙科、骨科领域中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种联合装载外泌体的种植体表面，在阳极氧化多孔表面结合直接装载和亲和素、生物素固定两种方法。上述方法既能保证负载量又能连续释放外泌体到周围病灶部位，同时具备高效性及长期稳定性。采用本发明的金属种植体表面联合装载方法，为医用植入人体材料领域提供了新的思路，有望应用于金属体内植入器械及经皮器械领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例中对比例2-3制备的金属基植入材料的释放率结果对比；
图2为实验例中对比例4-5制备的金属基植入材料的释放率结果对比；
图3为实验例中实施例2与对比例1制备的金属基植入材料的释放率结果对比；
图4为实验例中实施例2与对比例1-5制备的金属基植入材料的释装载量结果对比。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法，包括以下步骤：将金属基材料置于电解装置中，对其进行氧化处理，然后获得多孔金属基材料，然后将多孔金属基材料经过物理和化学装载后获得装载外泌体的金属基植入材料。
其中，物理装载的步骤包括将多孔金属基材料浸没在外泌体溶液中，沉淀后外泌体黏附到金属基材料的孔隙中，获得装载外泌体的金属基植入材料。
化学装载的步骤包括将接枝有生物素和亲和素的多孔金属基材料加入生物素-外泌体溶液中，生物素-外泌体与金属基材料上的亲和素连接，然后获得装载外泌体的金属基植入材料。
在本发明中，化学装载是利用亲和素与生物素结合的方法，通过在生物素上连接亲和素，亲和素再连接偶联有外泌体的生物素，形成生物素-亲和素-生物素-外泌体的连接结构，从而使得外泌体装载在金属基植入材料上。
在本发明中，化学装载与物理装载的顺序不做限定，即可以先进行物理装载，后进行化学装载；也可以先进行化学装载，后进行物理装载。
在一些实施例中，多孔金属基材料的制备方法包括将金属基材料置于电解装置中，对其进行氧化处理，然后获得多孔金属基材料。
此处对金属基材料进行阳极氧化处理是为了获得多孔材料，获得的多孔表面大大扩大了金属基材料的表面积，提高装载效率，本发明中经过阳极氧化处理后所得的孔径大小是依据所装外泌体的大小而选择的，使外泌体能够有效装入。
在一些实施例中，金属基材料包括钛箔和铁箔。对于钛箔或铁箔的纯度以及厚度，较为优选地，纯度99.5％，厚度0.05mm；但并不仅限于前述纯度与厚度，可以根据实际情况进行调整。
在一些实施例中，多孔金属基材料制备步骤中的电解装置的阳极接有上述金属基材料，如钛箔或铁箔，负极接有石墨片。
在一些实施例中，多孔金属基材料制备步骤中电解液包括H2SO4溶液；H2SO4溶液的浓度为0.5-2M。较为优选地，H2SO4溶液的浓度为1M。
在一些实施例中，多孔金属基材料制备步骤中电压为50-300V；较为优选地，电解步骤中电压为90-150V。
在本发明中，不同阳极氧化电压下会呈现不同的多孔结构及孔径大小，电压太小，制备的多孔金属基材料的孔隙率小，电压过大，易将多孔金属基材料击穿。
在一些实施例中，多孔金属基材料制备步骤中电解时间为0.5-1.5min；较为优选地，电解时间为1min。
在一些实施例中，接枝有生物素和亲和素的多孔金属基材料的制备方法包括：在硅烷化偶联剂的作用下，将多孔金属基材料表面硅烷化，然后接枝生物素，再以生物素连接亲和素。
在一些实施例中，硅烷化偶联剂为带有胺基的硅烷偶联剂，主要是靠硅烷偶联剂的氨基与生物素的羧基之间的化学键合。硅烷化偶联剂可以为3-氨丙基三乙氧基硅烷，其浓度可以根据实际情况进行调整。
在一些实施例中，接枝步骤中的生物素包括生物素-N-羟基丁二酰亚胺活化脂；所述亲和素包括链酶亲和素。
在一些实施例中，生物素的溶液浓度为30-100ug/mL；较为优选地，生物素的溶液浓度为50ug/mL。
在一些实施例中，亲和素的溶液浓度为6-20ug/mL；较为优选地，亲和素的溶液浓度为10ug/mL。
在一些实施例中，化学装载步骤中的生物素-外泌体的溶液浓度为30-100ug/mL；较为优选地，生物素-外泌体的溶液浓度为50ug/mL。
在本发明中，外泌体的浓度不做限定，只要能够生成上述浓度的生物素-外泌体即可。较为优选地，外泌体的浓度为7.5-300ug/mL。
在一些实施例中，化学装载的反应条件为：2-8℃下孵育10-15h。较为优选地，化学装载的反应条件为：4℃下孵育12h。
在一些实施例中，物理装载的反应条件为：2-8℃下孵育时间为10-15h。较为优选地，物理装载的反应条件为：4℃下孵育12h。
在一些实施例中，物理装载中所使用的外泌体溶液浓度与化学装载中所使用的外泌体溶液浓度一致，均可以根据不同情况进行浓度调整。
本发明不选择生物素与外泌体直接连接，而是选择生物素-亲和素系统是因为其可以更多的结合外泌体，具有高亲和力、特异性强和稳定性好等优点，其主要原理在于链霉亲和素是一种四聚体蛋白，可以和4个生物素分子亲密结合，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体，从而使反应效率放大。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法，具体步骤如下：
1.钛表面阳极氧化：
1)将钛箔(纯度99.5％，厚度0.05mm)剪成合适的大小(2.5㎝×4㎝)，再放入超声清洗仪中，用无水乙醇和去离子水分别清洗三次,每次5min；
2)将清洗好的钛箔放入烘箱中调节适当温度(37℃)进行烘干；
3)配置浓度为1M的H2SO4电解液作为阳极氧化的电解液；
4)采用可调直流稳压电源(MAISHENG/迈胜)，连接阳极氧化的实验装置，在阳极氧化电极的阴极接上一块石墨片(3㎝×6㎝)，然后将一片烘干好的钛箔接在电极的阳极，在直流电压90V、1M的H2SO4电解液下阳极氧化处理1min；
5)将反应完成的钛箔从电极上取下，用RO水将样品正反面冲洗几遍之后，放入超声清洗仪中，保证样品反面向上，分别用无水乙醇和去离子水清洗三遍；
6)将清洗好的样品放入烘箱中设置合适温度烘干备用；
2.阳极氧化钛表面联合装载外泌体
2.1钛表面化学分子的接枝
1)钛表面硅烷化将阳极氧化的钛片置于体积分数为5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶剂为无水四氢呋喃的溶液中，室温，回流5h取出样品，在无水四氢呋喃中继续回流5h超声清洗，真空干燥备用。
2)硅烷化样品接枝生物素将已完成硅烷化的样品浸没在50ug/mL生物素-N-羟基丁二酰亚胺活化脂溶液(溶剂PBS)中，氮气保护，于室温反应4h后，用去离子水超声清洗，真空干燥。
3)生物素-链霉亲和素结合。将上述已生物素化的样品与链酶亲和素(10μg/mL)在室温下孵育2小时，然后用PBS洗涤。
2.2化学固定外泌体
1)生物素-外泌体的制备将提取的外泌体与生物素-N-羟基丁二酰亚胺混合，外泌体浓度100ug/mL，生物素-N-羟基丁二酰亚胺浓度为50ug/mL，在室温下孵育2h。
2)随后将浓度为50μg/mL的生物素-外泌体滴入底物表面直至浸没整个试件表面，4℃孵育12h。
2.3物理装载外泌体
1)上述化学固定孵育完成后，吸掉装载液，用PBS轻轻漂洗，然后加入与2.2中相同浓度的外泌体溶液浸没钛表面，4℃孵育12h。
2)最后吸掉装载溶液。即完成一次联合装载。
实施例2
本实施例提供了一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法，具体步骤如下：
1.钛表面阳极氧化：
1)将钛箔(纯度99.5％，厚度0.05mm)剪成合适的大小(2.5㎝×4㎝)，再放入超声清洗仪中，用无水乙醇和去离子水分别清洗三次,每次5min；
2)将清洗好的钛箔放入烘箱中调节适当温度(37℃)进行烘干；
3)配置浓度为1M的H2SO4电解液作为阳极氧化的电解液；
4)采用可调直流稳压电源(MAISHENG/迈胜)，连接阳极氧化的实验装置，在阳极氧化电极的阴极接上一块石墨片(3㎝×6㎝)，然后将一片烘干好的钛箔接在电极的阳极，在直流电压150V、1M的H2SO4电解液下阳极氧化处理1min；
5)将反应完成的钛箔从电极上取下，用RO水将样品正反面冲洗几遍之后，放入超声清洗仪中，保证样品反面向上，分别用无水乙醇和去离子水清洗三遍；
6)将清洗好的样品放入烘箱中设置合适温度烘干备用；
2.阳极氧化钛表面联合装载外泌体
2.1钛表面化学分子的接枝
1)钛表面硅烷化将阳极氧化的钛片置于体积分数为5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶剂为无水四氢呋喃的溶液中，室温，回流5h取出样品，在无水四氢呋喃中继续回流5h超声清洗，真空干燥备用。
2)硅烷化样品接枝生物素将已完成硅烷化的样品浸没在50ug/mL生物素-N-羟基丁二酰亚胺活化脂溶液(溶剂PBS)中，氮气保护，于室温反应4h后，用去离子水超声清洗，真空干燥。
3)生物素-链霉亲和素结合。将上述已生物素化的样品与链酶亲和素(10μg/mL)在室温下孵育2小时，然后用PBS洗涤。
2.2化学固定外泌体
1)生物素-外泌体的制备将提取的外泌体与生物素-N-羟基丁二酰亚胺混合，外泌体浓度100ug/mL，生物素-N-羟基丁二酰亚胺浓度为50ug/mL，在室温下孵育2h。
2)随后将浓度为50μg/mL的生物素-外泌体滴入底物表面直至浸没整个试件表面，4℃孵育12h。
2.3物理装载外泌体
1)上述化学固定孵育完成后，吸掉装载液，用PBS轻轻漂洗，然后加入与2.2中相同浓度的外泌体溶液浸没钛表面，4℃孵育12h。
2)最后吸掉装载溶液。即完成一次联合装载。
实施例3
本实施例提供了一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法，具体步骤如下：
1.铁表面阳极氧化：
1)将铁箔(纯度99.5％，厚度0.05mm)剪成合适的大小(2.5㎝×4㎝)，再放入超声清洗仪中，用无水乙醇和去离子水分别清洗三次,每次5min；
2)将清洗好的铁箔放入烘箱中调节适当温度(37℃)进行烘干；
3)配置浓度为1M的H2SO4电解液作为阳极氧化的电解液；
4)采用可调直流稳压电源(MAISHENG/迈胜)，连接阳极氧化的实验装置，在阳极氧化电极的阴极接上一块石墨片(3㎝×6㎝)，然后将一片烘干好的铁箔接在电极的阳极，在直流电压90V、1M的H2SO4电解液下阳极氧化处理1min；
5)将反应完成的铁箔从电极上取下，用RO水将样品正反面冲洗几遍之后，放入超声清洗仪中，保证样品反面向上，分别用无水乙醇和去离子水清洗三遍；
6)将清洗好的样品放入烘箱中设置合适温度烘干备用；
2.阳极氧化铁表面联合装载外泌体
2.1铁表面化学分子的接枝
1)铁表面硅烷化将阳极氧化的铁片置于体积分数为5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶剂为无水四氢呋喃的溶液中，室温，回流5h取出样品，在无水四氢呋喃中继续回流5h超声清洗，真空干燥备用。
2)硅烷化样品接枝生物素将已完成硅烷化的样品浸没在50ug/mL生物素-N-羟基丁二酰亚胺活化脂溶液(溶剂PBS)中，氮气保护，于室温反应4h后，用去离子水超声清洗，真空干燥。
3)生物素-链霉亲和素结合。将上述已生物素化的样品与链酶亲和素(10μg/mL)在室温下孵育2小时，然后用PBS洗涤。
2.2化学固定外泌体
1)生物素-外泌体的制备将提取的外泌体与生物素-N-羟基丁二酰亚胺混合，外泌体浓度100ug/mL，生物素-N-羟基丁二酰亚胺浓度为50ug/mL，在室温下孵育2h。
2)随后将浓度为50μg/mL的生物素-外泌体滴入底物表面直至浸没整个试件表面，4℃孵育12h。
2.3物理装载外泌体
1)上述化学固定孵育完成后，吸掉装载液，用PBS轻轻漂洗，然后加入与2.2中相同浓度的外泌体溶液浸没钛表面，4℃孵育12h。
2)最后吸掉装载溶液。即完成一次联合装载。
实施例4
本实施例提供了一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法，具体步骤如下：
1.钛表面阳极氧化：
1)将钛箔(纯度99.5％，厚度0.05mm)剪成合适的大小(2.5㎝×4㎝)，再放入超声清洗仪中，用无水乙醇和去离子水分别清洗三次,每次5min；
2)将清洗好的钛箔放入烘箱中调节适当温度(37℃)进行烘干；
3)配置浓度为1M的H2SO4电解液作为阳极氧化的电解液；
4)采用可调直流稳压电源(MAISHENG/迈胜)，连接阳极氧化的实验装置，在阳极氧化电极的阴极接上一块石墨片(3㎝×6㎝)，然后将一片烘干好的钛箔接在电极的阳极，在直流电压150V、1M的H2SO4电解液下阳极氧化处理1min；
5)将反应完成的钛箔从电极上取下，用RO水将样品正反面冲洗几遍之后，放入超声清洗仪中，保证样品反面向上，分别用无水乙醇和去离子水清洗三遍；
6)将清洗好的样品放入烘箱中设置合适温度烘干备用；
2.阳极氧化钛表面联合装载外泌体
2.1钛表面化学分子的接枝
1)钛表面硅烷化将阳极氧化的钛片置于体积分数为5％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶剂为无水四氢呋喃的溶液中，室温，回流5h取出样品，在无水四氢呋喃中继续回流5h超声清洗，真空干燥备用。
2)硅烷化样品接枝生物素将已完成硅烷化的样品浸没在50ug/mL生物素-N-羟基丁二酰亚胺活化脂溶液(溶剂PBS)中，氮气保护，于室温反应4h后，用去离子水超声清洗，真空干燥。
3)生物素-链霉亲和素结合。将上述已生物素化的样品与链酶亲和素(10μg/mL)在室温下孵育2小时，然后用PBS洗涤。
2.2物理装载外泌体
1)上述接枝后的样品用PBS轻轻漂洗，然后加入浓度100ug/mL的外泌体溶液浸没钛表面，4℃孵育12h。
2)吸掉装载溶液。
2.3化学固定外泌体
1)生物素-外泌体的制备将提取的外泌体与生物素-N-羟基丁二酰亚胺混合，外泌体的浓度与2.2中所使用的外泌体浓度相同，生物素-N-羟基丁二酰亚胺浓度为50ug/ml，在室温下孵育2h。
2)随后将浓度为50μg/mL的生物素-外泌体滴入底物表面直至浸没整个试件表面，4℃孵育12h，然后用PBS洗涤，即完成一次联合装载。
对比例1
与实施例2的区别在于，本对比例不包括步骤1：钛表面阳极氧化，即本对比例中的钛表面未经过氧化处理。
对比例2
与实施例2的区别在于，本对比例不包括步骤2.2：化学固定外泌体，即本对比例只进行物理装载外泌体。
对比例3
与实施例2的区别在于，本对比例不包括步骤1和2.2；即钛表面阳极氧化和化学固定外泌体，即本对比例钛表面未经过氧化处理，且只进行物理装载外泌体。
对比例4
与实施例2的区别在于，本对比例不包括步骤2.3：物理装载外泌体，即本对比例只进行化学固定外泌体。
对比例5
与实施例2的区别在于，本对比例不包括步骤1和2.3；即钛表面阳极氧化和物理固定外泌体，即本对比例钛表面未经过氧化处理，且只进行化学固定外泌体。
实验例
将实施例2与对比例1-5制备得到的装载外泌体的金属基植入材料用于释放率性能测试，操作步骤如下：
1)将装载完成的试件捞出，放置新的24孔板中。
2)然后每孔加入PBS将试件浸没，放入摇床/超声，一次清洗为37℃，摇床2h；二次清洗为室温，100Hz，超声10s；三次清洗为室温，100Hz,超声20s；四次清洗为室温，100Hz，超声30s。
3)每孔取出溶液移入孔板测取吸光度值，用BCA蛋白分析试剂盒换算为蛋白浓度，以此为外泌体浓度。
在本实验例中，释放率是在经过第一、二、三、四次清洗后进行的测试，测试结果如图1-3所示。
对比例2和对比例3的测试结果如图1所示，从图1中可以得出：每次清洗后阳极氧化后的表面外泌体释放率均低于纯钛表面，具有明显的“截留”外泌体的能力。
对比例4和对比例5的测试结果如图2所示，从图2中可以得出：纯钛表面与阳极氧化处理表面的外泌体释放结果可以看出，第一次摇床清洗中，阳极氧化表面释放率低于未化学接枝的纯钛表面，第二次采用超声清洗时，阳极氧化表面释放率高于纯钛表面，但在接下来第三次、第四次清洗的阳极氧化钛表面外泌体释放均低于纯钛组，这表明化学固定的外泌体有效结合在表面，不易出现爆发性释放。
实施例2和对比例5的测试结果如图3所示，从图3中可以得出：联合装载方式下，钛和阳极氧化处理的钛表面清洗的结果，第一次与第二次清洗下，阳极氧化表面的外泌体的释放率较大。然而到第三次第四次清洗后，对比钛表面外泌体的释放，阳极氧化表面释放率明显降低或者不释放，且第四次清洗后钛表面外泌体几乎被清洗干净，而阳极氧化的表面仍有极少数的释放。
实施例2与对比例1-5制备得到的装载外泌体的金属基植入材料用于装载量测试，具体步骤如下：
试件表面外泌体装载完成后将试件捞出，取剩余液体移入孔板检测吸光度值。根据BCA蛋白分析试剂盒提供的方法测得蛋白浓度。
外泌体实际装载浓度＝装载液浓度-反测浓度(装载之后将试件捞出，所剩的外泌体浓度
测试结果如图4所示。从图4中可以得出：相比于单独的物理装载或化学装载，联合装载的方式呈现“1+1>2”的装载优势。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：
S1.钛表面阳极氧化：
1）将钛箔剪成合适的大小，再放入超声清洗仪中，用无水乙醇和去离子水分别清洗三次，每次5min；
2）将清洗好的钛箔放入烘箱中调节到37ºC进行烘干；
3）配置浓度为1M的H2SO4电解液作为阳极氧化的电解液；
4）采用可调直流稳压电源，连接阳极氧化的实验装置，在阳极氧化电极的阴极接上一块石墨片，然后将一片烘干好的钛箔接在电极的阳极，在直流电压150V、1M的H2SO4电解液下阳极氧化处理1min；
5）将反应完成的钛箔从电极上取下，用RO水将样品正反面冲洗几遍之后，放入超声清洗仪中，保证样品反面向上，分别用无水乙醇和去离子水清洗三遍；
6）将清洗好的样品放入烘箱中设置合适温度烘干备用；
S2.阳极氧化钛表面联合装载外泌体
S2.1钛表面化学分子的接枝
1）钛表面硅烷化将阳极氧化的钛片置于体积分数为5%的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）溶剂为无水四氢呋喃的溶液中，室温，回流5 h取出样品，在无水四氢呋喃中继续回流5h超声清洗，真空干燥备用；
2）硅烷化样品接枝生物素 将已完成硅烷化的样品浸没在50μg /mL溶剂为PBS的生物素-N-羟基丁二酰亚胺活化脂溶液中，氮气保护，于室温反应4 h后，用去离子水超声清洗，真空干燥；
3）生物素-链霉亲和素结合 将上述已生物素化的样品与10μg/mL的链酶亲和素在室温下孵育2小时，然后用PBS洗涤；
S2.2 化学固定外泌体
1）生物素-外泌体的制备 将提取的外泌体与生物素-N-羟基丁二酰亚胺混合，外泌体浓度100μg /mL，生物素-N-羟基丁二酰亚胺浓度为50μg /mL，在室温下孵育2h；
2）随后将浓度为 50μg/mL的生物素-外泌体滴入底物表面直至浸没整个试件表面，4℃孵育12h；
S2.3 物理装载外泌体
1）上述化学固定孵育完成后，吸掉装载液，用PBS轻轻漂洗，然后加入与S2.2中相同浓度的外泌体溶液浸没钛表面，4℃孵育12h；
2）最后吸掉装载溶液，即完成一次联合装载。
2.如权利要求1所述的联合装载外泌体的金属基植入材料的制备方法制备得到的联合装载外泌体的金属基植入材料。
3.如权利要求2所述的联合装载外泌体的金属基植入材料在制备牙科植入物、骨科植入物中的应用。
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