CN103721292A - 一种新型的多功能介孔生物活性玻璃支架及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多功能介孔生物活性玻璃支架，所述生物活性玻璃支架为无定型玻璃结构，并且90%～99.999%的大孔都是互相连通的；所述生物活性玻璃支架还含有1～15摩尔%的铜，以所述活性玻璃支架CuO-CaO-P2O5-SiO2的总物质的量计算。本发明还提供了多功能介孔生物活性玻璃支架的制备方法，采用溶胶-凝胶法制备了不同铜含量的介孔生物活性玻璃支架；制备出含铜的介孔生物活性玻璃支架具有良好的成血管潜力、成骨性、药物传输和抗菌性。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程领域和材料学领域，具体地涉及一种用于骨修复的多功能介孔生物活性玻璃及其骨组织工程支架。
背景技术
骨组织工程是利用工程和生命科学的原理和方法再生新的骨组织，以修复和替代病变或缺损骨组织，或增进其功能的技术。
在生物材料支架上种植细胞，经过体内或体外培养活体组织，随后将它们植入缺损或病变的部位，以修复缺损或病变骨组织。这是采用组织工程的方法构建新的骨组织，或恢复病变骨组织功能的途径之一。
治疗骨缺损，尤其是由于创伤、感染、肿瘤或遗传性畸形所引起的大段骨缺损仍然是临床治疗中的一个重大的挑战。为了解决这些问题，多孔生物活性支架已被广泛用于修复骨缺损。为了更好的修复大段骨缺损，生物活性支架材料不仅要具备骨传导性(引导的新骨生长)，同时能够促进新骨形成及血管生成。此外，在骨外科重建手术种，常常也伴随着由细菌感染而引起的骨髓炎。
为了更好地治疗大段骨缺损，理想的生物活性多孔支架应具备成骨促进性、诱导成血管化以及抗感染的多功能相结合。然而，据我们所知，目前的生物活性的多孔支架材料很少具有“真正的”多功能特性。因此，如何开发具有多功能特性的生物活性多孔支架材料仍然是一个重大的挑战。
发明内容
本发明的第一目的在于获得一种成骨促进性、诱导成血管化以及抗感染的多功能相结合，同时保持良好物理性能的多孔支架。
本发明的第二目的在于获得一种成骨促进性、诱导成血管化以及抗感染的多功能相结合，同时保持良好物理性能的多孔支架的制备方法。
本发明的第三目的在于获得一种成骨促进性、诱导成血管化以及抗感染的多功能相结合，同时保持良好物理性能的骨移植物。
本发明的第四目的在于获得一种多孔生物玻璃支架的用途，其具有成骨促进性、诱导成血管化以及抗感染的多功能组合，同时保持良好物理性能。
在本发明的第一方面，提供了一种多功能介孔生物活性玻璃支架，
所述生物活性玻璃支架为无定型玻璃结构，并且90%～99.999%的大孔都是互相连通的；
所述生物活性玻璃支架还含有1～15摩尔%的铜，以所述无定型玻璃结构中的CuO-CaO-P2O5-SiO2的总物质的量计算。
在一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的孔隙率不低于85%。
在一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的介孔孔分布是2～9nm，优选5±1nm。
在一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的药物释放可维持3-10天，优选7±1天。
在一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的抗菌效率可达70-90%，优选90%。
在本发明的一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的比表面为300～450m2/g，优选330±10m2/g。
在本发明的一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步骤的方法制备的：
(a)采用溶胶-凝胶法提供溶胶溶液；
所述溶胶溶液含有6～10重量份的介孔模板剂，10～15重量份的硅原料，1～2重量份的磷酸三烷基酯和钙盐，所述磷酸烷基酯和钙盐之间为化学计量比；其中还含有1～15摩尔%的铜，所述铜以CuO-CaO-P2O5-SiO2的总物质的量计；
(b)用所述溶胶溶液浸渍或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅烧去除，得到生物活性玻璃支架的坯体；
(c)所述步骤(b)的生物活性玻璃支架的坯体在600～700°C煅烧，去除所述成孔模板，得到烧结的生物活性玻璃支架。
在一个具体实施方式中，包括如下步骤：
采用正硅酸乙酯为Si源原材料，并调整与乙醇溶剂和介孔模板剂P123的比例；
采用盐酸调节溶液的pH值、搅拌、充分水解正硅酸乙酯；
依次加入化学计量比的磷酸三乙酯、硝酸钙和不同含量的氯化铜、搅拌；
采用聚亚胺脂海绵为泡沫模板，将上面制备的溶胶溶液涂覆在泡沫孔壁上；
反复涂覆不同的次数、干燥；
在一定温度下煅烧干凝胶，制备出含铜的介孔生物活性玻璃支架；
对制备的含铜的介孔生物活性玻璃支架的介孔/大孔结构、比表面、孔容、成血管化潜力、成骨性能、药物传输性和抗菌性能进行系统的研究。
本发明的第二方面提供一种本发明所述的多功能介孔生物活性玻璃支架的制备方法，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步骤的方法制备的：
(a)采用溶胶-凝胶法提供溶胶溶液；
所述溶胶溶液含有6-10重量份的介孔模板剂，10～15重量的硅原料，1～2克重量的磷酸三烷基酯和钙盐，所述磷酸三烷基酯和钙盐之间为化学计量比；其中还含有1～15摩尔%的铜，所述铜以所述无定型玻璃结构中的CuO-CaO-P2O5-SiO2的总物质的量计；
(b)用所述步骤(a)的溶胶溶液浸渍或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅烧去除，得到生物活性玻璃支架的坯体；
(c)所述步骤(b)的生物活性玻璃支架的坯体在600-750℃煅烧，去除所述成孔模板，得到烧结的生物活性玻璃支架。
优选地，所述磷酸三烷基酯为磷酸三乙基酯。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用正硅酸乙酯为硅源，
采用醇类溶剂得到溶胶溶液；
所述硅源与醇类试剂的质量比为1：(7-15)。
在一个具体实施方式中，所述醇类溶剂选自C1～C4烷基醇，优选乙醇。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用市售的P123为介孔模板剂，
其与醇类溶剂的质量比为1：(10-20)。
本文中，所述P123为市售得到，其结构为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用盐酸、硝酸作为催化剂，调节后溶液的pH值为2-4。
在本发明的一个具体实施方式中，采用的成孔模板为聚亚胺脂海绵(属于泡沫模板)，涂覆的次数为3-5次。
本发明的第三方面提供一种移植物，所述移植物含有如本发明所述的多功能介孔生物活性玻璃支架和接种于所述生物活性玻璃支架的干细胞，所述干细胞选自骨髓基质干细胞或脂肪干细胞，并且干细胞的接种量为2×106～5×107个细胞/cm3生物活性玻璃支架。
优选的，所述干细胞选自骨髓基质干细胞。
本发明的第四方面提供一种本发明所述的多功能介孔生物活性玻璃支架的用途，其用于制备骨移植物的支架。
附图说明
通过下面的结合附图对本发明所做的详细说明，可以更好地理解上文所述内容。其中所给附图为实例1的结果。
图1为不同铜含量的介孔玻璃支架SEM图，铜含量对于支架大孔结构无显著影响。
图2为不同铜含量的介孔玻璃支架XRD图,获得的支架没有明显结晶，因此是无定型的。
图3为铜含量1和5%的介孔玻璃支架TEM图，支架孔壁内部具有高度有序的纳米介孔孔道结构。
图4为不同铜含量的介孔玻璃支架的N2吸附脱附以及孔分布图，其具有比较一致的介孔吸附脱附曲线和介孔孔分布。
图5为人的骨髓基质干细胞粘附在不同铜含量的介孔玻璃支架上。
图6为不同铜含量的介孔玻璃支架支持骨髓基质干细胞的增殖和ALP活力表达。
图7为含铜的介孔玻璃支架提高了成骨细胞VEGF的分泌以及HIF-1a和VEGF的表达。
图8为含铜的介孔玻璃支架提高了骨髓基质干细胞的成骨相关的基因表达。
图9为含铜的介孔玻璃支架的离子浸提液提高了骨髓基质干细胞的碱性磷酸酶活力。
图10为含铜的介孔玻璃支架的离子浸提液提高了成骨细胞VEGF的分泌以及HIF-1a和VEGF的表达。
图11为含铜的介孔玻璃支架的离子浸提液提高了骨髓基质干细胞的成骨相关的基因表达。
图12为含铜的介孔玻璃支架维持了长时间可持续的药物释放。
图13为含铜的介孔玻璃支架显示出了优良的抗菌性能。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过改进制备工艺，将铜离子引入到介孔生物活性玻璃支架中去，实现了介孔生物玻璃支架的多功能性。在此基础上完成了本发明。
本发明的技术构思如下：
先前的研究表明，介孔生物活性玻璃具有优良的成骨活性和药物传输特性。铜离子能够诱导细胞的低氧压(Hypoxia),从而提高细胞的成血管化潜力。通过介孔模板、溶胶-凝胶法和大孔模板相结合的方法制备了含铜的介孔生物活性玻璃支架，具有工艺比较简单，条件易于控制等优点。但是本领域并没有如何开发具有多功能特性的生物活性多孔支架材料仍然是一个重大的挑战。
而发明人发现采用含铜的介孔生物活性玻璃支架用作人体硬组织修复和植入材料具有良好的生物活性、成血管诱导性、药物传输和抗菌性等多功能特性。因此，本方面制备的含铜的介孔生物活性玻璃支架具有很强的实用意义。
本发明的技术手段和所获得的效果如下：
本发明采用溶胶-凝胶法制备了含铜的介孔生物活性玻璃多功能支架。更具体地，本发明采用正硅酸乙酯、硝酸钙、磷酸三乙酯、氯化铜和聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(P123)为原材料，以聚亚胺脂海绵泡沫为多孔支架模板，溶胶-凝胶法制备了含铜的介孔生物活性玻璃多功能支架。通过系统研究含铜的介孔生物活性玻璃支架发现其具有良好的成血管潜力、成骨性、药物传输和抗菌性等性能来确定其是否能够用作新型的生物活性植入材料。
含铜的介孔玻璃支架具有有序的纳米介孔结构和连通的大孔结构，高的比表面、孔容。不同铜含量的介孔玻璃支架能够很好地支持人的骨髓基质干细胞粘附，增殖和碱性磷酸酶的表达。随着铜的引入，能够显著地促进骨髓基质干细胞中VEGF的分泌，以及低氧压因子(HIF-1a)的表达。同时，含铜的介孔生物活性玻璃支架显著地提高了骨髓基质干细胞骨相关的基因表达。进一步研究发现，含铜的介孔生物活性玻璃支架释放的含Cu,Ca和Si等离子产物也显著地促进了骨髓基质干细胞VEGF的分泌和低氧压因子(HIF-1a)的表达，同时提高了骨髓基质干细胞骨相关的基因表达。而且，制备的支架具有很好的药物传输能力和显著的抗菌性能。因此，含铜的介孔玻璃支架具有很好的成血管化潜力、成骨特性、药物传输和抗菌性，是一种新型的多功能生物活性支架材料，可能用于大块骨缺损修复。
术语
本发明中，术语“含有”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”或“包括”中。
如本文所用，所述的“烷基”，除非另有说明，指的是含有1-4个碳原子的直链或支链烷烃。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。
术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽。
术语“异种移植”指将所需生物材料(如干细胞)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。
术语“自体移植”指将所需生物材料(如干细胞)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
术语“异体移植”指将所需生物材料(如干细胞)从同一物种的某个体中取出并再施用于另一不同病人的方法。
以下对本发明的各个方面进行详述：
含铜的介孔玻璃支架的制备和表征
在本发明的第一方面，提供了一种多功能介孔生物活性玻璃支架，
所述生物活性玻璃支架为无定型玻璃结构，并且90%～99.999%的大孔都是互相连通的；
所述生物活性玻璃支架还含有1～15摩尔%的铜，以所述无定型玻璃结构中的CuO-CaO-P2O5-SiO2的总物质的量计算。
在一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的孔隙率不低于85%。
在一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的介孔孔分布是2～9nm，优选5±1nm。
在一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的药物释放可维持3-10天，优选7±1天。
在一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的抗菌效率可达70-90%，优选90%。
在本发明的一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架的比表面为300～450m2/g，优选330±10m2/g。
在本发明的一个具体实施方式中，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步骤的方法制备的：
(a)采用溶胶-凝胶法提供溶胶溶液；
所述溶胶溶液含有6～10重量份的介孔模板剂，10～15重量份的硅原料，1～2重量份的磷酸三烷基酯和钙盐，所述磷酸烷基酯和钙盐之间为化学计量比；其中还含有1～15摩尔%的铜，所述铜以CuO-CaO-P2O5-SiO2的总物质的量计；
(b)用所述溶胶溶液浸渍或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅烧去除，得到生物活性玻璃支架的坯体；
(c)所述步骤(b)的生物活性玻璃支架的坯体在600～700°C煅烧，去除所述成孔模板，得到烧结的生物活性玻璃支架。
具体的，所述硅原料优选的是正硅酸乙酯。
优选地，所述磷酸三烷基酯为磷酸三乙基酯。
所述的钙盐是可溶性盐，通常为硝酸钙或氯化钙。
所述的铜通常采用铜盐的方式加入，例如为氯化铜或硝酸铜。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用正硅酸乙酯为硅源，
采用醇类溶剂得到溶胶溶液；
所述硅源与乙醇的质量比为1：(7-15)。
在一个具体实施方式中，所述醇类溶剂选自C1～C4烷基醇，优选乙醇。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用市售的P123为介孔模板剂，
其与醇类溶剂的质量比为1：(10-20)。
本文中，所述P123为市售得到，其结构为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用盐酸或硝酸作为催化剂，调节后溶液的pH值为2-4。
在本发明的一个具体实施方式中，采用聚亚胺脂海绵为泡沫模板，涂覆的次数为3-5次。
需要说明的是，可用于本发明的成孔模板没有特别限制，可以是任何多孔的海绵材料，只要所述成孔模板可在煅烧过程中去除，例如聚亚氨酯海绵、EVC海绵和高弹海绵等。通常，成孔模板的孔隙率为95～99.9%，但不局限于此。
在一个具体实施方式中，包括如下步骤：
采用正硅酸乙酯为Si源原材料，并调整与乙醇溶剂和介孔模板剂P123的比例；
采用盐酸调节溶液的pH值、搅拌、充分水解正硅酸乙酯；
依次加入化学计量比的磷酸三乙酯、硝酸钙和不同含量的氯化铜、搅拌；
采用聚亚胺脂海绵为泡沫模板，将上面制备的溶胶溶液涂覆在泡沫孔壁上；
反复涂覆不同的次数、干燥；
在一定温度下煅烧干凝胶，制备出含铜的介孔生物活性玻璃支架；
对制备的含铜的介孔生物活性玻璃支架的介孔/大孔结构、比表面、孔容、成血管化潜力、成骨性能、药物传输性和抗菌性能进行系统的研究。
发明人还提供一个优选的具体实施方式：
将P123与乙醇按照1：(10-20)质量比混合、溶解，将分析纯正硅酸乙酯与乙醇按1：(7-15)的比例混合，并用盐酸调节pH值为2-4，在室温下充分搅拌60±10分钟，然后加入四水合硝酸钙、和磷酸三乙酯和不同含量的氯化铜(Cu含量：1-15%)。搅拌3-5小时后，用于涂覆聚亚胺脂海绵3-5次，在室温干燥24小时，并在600-750℃中煅烧3-8小时。
通过XRD、TEM、SEM和N2吸附-脱附等手段对不同铜含量的介孔玻璃支架的物相、介孔结构、大孔结构、比表面和介孔孔容等进行系统的表征。
本发明的浸渍、涂覆、干燥、煅烧、和通常还有的冷却步骤可以用本领域常规的设备和方法进行。
干细胞
本发明的第三方面提供一种移植物，所述移植物含有如本发明所述的多功能介孔生物活性玻璃支架和接种于所述生物活性玻璃支架的干细胞，所述干细胞选自骨髓基质干细胞或脂肪干细胞，并且干细胞的接种量为2×106～5×107个细胞/cm3生物活性玻璃支架。
本发明的干细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的干细胞，通常，本发明的干细胞是自体的、或同种异体的干细胞。获取干细胞的部位也没有特别限制，可以是脂肪干细胞、骨髓基质干细胞或其他干细胞。此外，成骨细胞也可替代干细胞用作骨组织工程化构建的种子细胞。
优选的，所述干细胞选自骨髓基质干细胞。
可用于本发明的干细胞可以来自任何脊椎动物，较佳地是哺乳动物，更佳地是灵长类动物，尤其是人。
尽管自体的干细胞是优选的，但异体的干细胞的来源更为常用。研究已表明，不同生长、发育阶段的同种异体干细胞，可以在有组织相容性差异并且具有完全免疫功能的同种异体动物体内形成干细胞组织。
分离和获得干细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是密度梯度离心法和酶消化法。
干细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将干细胞在37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+5～20%胎牛血清；2)DMEM培养基+5～20%小牛血清；3)DMEM培养基+5～20%自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进干细胞生长的细胞因子等)、各种抗生素、各种诱导因子。
适用于本发明的干细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的干细胞是体外培养的骨髓基质干细胞。
骨移植物
由于本发明的多功能介孔生物活性玻璃支架与骨髓基质干细胞和脂肪干细胞特别是骨髓基质干细胞的相容性非常好，因此特别适合作为骨修复的支架材料。
将体外培养扩增的骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞接种到生物相容性优异的多功能介孔生物活性玻璃支架形成干细胞—生物活性玻璃复合物，将这一“干细胞—生物活性玻璃”复合物植入到缺损部位，随着生物活性玻璃的逐渐降解吸收，新骨形成，达到修复骨缺损的目的。
本发明的组织工程骨移植物的制备方法简便，将一定数量的骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞接种于生物活性玻璃即可。
本发明的组织工程化骨移植物的形状没有特别限制，可以按照组织缺损的形状任意塑形。通常，移植物为长条形。
本发明组织工程化骨中的骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞浓度通常约为0.5×106/cm3(陶瓷支架体积)至5×108/cm3或更高，较佳地为1×106/cm3至1×108/cm3，更佳地为5×106/cm3至5×107/cm3生物活性玻璃。通常，以培养液调整骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞浓度，然后与可降解材料混合。混合时，培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的培养液最大量为宜。
此外，在本发明的组织工程化骨移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种抗生素，从而保持骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞表型、促进骨髓基质干细胞和/或脂肪干细胞生长，以及促进组织工程化骨在体内生长。
除了将组织工程化骨移植物植入体内之外，还将其置于体外生物反应器内培养，从而进行组织工程化骨的构建，在体外形成具有一定组织学结构、生化组成与生物力学强度的组织工程化骨。
用本发明方法形成的组织工程化骨移植物，可直接植入体内的骨缺损处。
如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行(例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比，所述的聚合物分子量为数均分子量。
除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
下面结合实例对本发明作进一步说明，但它们并不是对本发明作任何限制。
实例1：
将P123与乙醇按照1：15质量比混合、溶解，将分析纯正硅酸乙酯与乙醇按1：8.7的比例混合，并用盐酸调节pH值为2，在室温下充分搅拌60分钟，然后加入四水合硝酸钙、和磷酸三乙酯和不同含量的氯化铜(Cu摩尔含量：0，1，2，5%)。搅拌5小时后，用于涂覆聚亚胺脂海绵3次，在室温干燥24小时，并在650℃中煅烧5小时。
然后进行材料表征、成血管化、成骨性、药物传输和抗菌性能研究，如图1～13所示。
所述含铜的介孔玻璃支架的多功能性研究得到如下结论：
(1)含铜的介孔玻璃支架的成血管化潜力
将不同铜含量的介孔玻璃支架与人的骨髓基质干细胞培养，然后用ELISA方法测试细胞的VEGF的分泌、用WESTERN方法测试HIF-1a和VEGF的表达。同时，进一步通过研究支架释放的离子产物对细胞的VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表达。结果表明，含铜的介孔玻璃支架显著提提高了VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表达。含铜的介孔玻璃支架具有非常优良的成血管化潜力。
(2)含铜的介孔玻璃支架的细胞相容性和成骨促进性
将不同铜含量的介孔玻璃支架或其浸提液与人的骨髓基质干细胞培养，研究材料对骨髓基质干细胞的粘附、增殖、碱性磷酸酶活性以及成骨相关的基因表达。结果表明含铜的介孔玻璃支架及其释放的离子产物能够显著地促进牙骨髓基质干细胞的成骨分化，具有成骨促进性。
(3)含铜的介孔玻璃支架的药物传输和抗菌性
将含铜的介孔玻璃支架浸泡在布洛芬药物溶液中12小时，测试药物传输，发现含铜的介孔玻璃支架能够有效地装载药物，并维持长时间的药物传输。
同时采用E.coli菌与含铜的介孔玻璃支架作用，发现引入铜在介孔生物活性玻璃支架中显著地抑制了细菌的活力，显示出良好的抗菌性能。
实例2：
将P123与乙醇按照1：15质量比混合、溶解，将分析纯正硅酸乙酯与乙醇按1：10的比例混合，并用盐酸调节pH值为2，在室温下充分搅拌60分钟，然后加入四水合硝酸钙、和磷酸三乙酯和不同含量的氯化铜(Cu摩尔含量：0，1，2，5%)。搅拌5小时后，用于涂覆聚亚胺脂海绵5次，在室温干燥24小时，并在700℃中煅烧5小时。
然后进行材料表征、成血管化、成骨性、药物传输和抗菌性能研究。
将不同铜含量的介孔玻璃支架与人的骨髓基质干细胞培养，然后用ELISA方法测试细胞的VEGF的分泌、用WESTERN方法测试HIF-1a和VEGF的表达。同时，进一步通过研究支架释放的离子产物对细胞的VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表达。结果表明，含铜的介孔玻璃支架显著提提高了VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表达。含铜的介孔玻璃支架具有非常优良的成血管化潜力。
将不同铜含量的介孔玻璃支架或其浸提液与人的骨髓基质干细胞培养，研究材料对骨髓基质干细胞的粘附、增殖、碱性磷酸酶活性以及成骨相关的基因表达。结果表明含铜的介孔玻璃支架及其释放的离子产物能够显著地促进牙骨髓基质干细胞的成骨分化，具有成骨促进性。
将含铜的介孔玻璃支架浸泡在布洛芬药物溶液中12小时，测试药物传输，发现含铜的介孔玻璃支架能够有效地装载药物，并维持长时间的药物传输。
同时采用E.coli菌与含铜的介孔玻璃支架作用，发现引入铜在介孔生物活性玻璃支架中显著地抑制了细菌的活力，显示出良好的抗菌性能。
实例3：
将P123与乙醇按照1：12质量比混合、溶解，将分析纯正硅酸乙酯与乙醇按1：10的比例混合，并用盐酸调节pH值为4，在室温下充分搅拌60分钟，然后加入四水合硝酸钙、和磷酸三乙酯和不同含量的氯化铜(Cu摩尔含量：0，1，2，5%)。搅拌5小时后，用于涂覆聚亚胺脂海绵8次，在室温干燥24小时，并在600℃中煅烧5小时。
然后进行材料表征、成血管化、成骨性、药物传输和抗菌性能研究。
将不同铜含量的介孔玻璃支架与人的骨髓基质干细胞培养，然后用ELISA方法测试细胞的VEGF的分泌、用WESTERN方法测试HIF-1a和VEGF的表达。同时，进一步通过研究支架释放的离子产物对细胞的VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表达。结果表明，含铜的介孔玻璃支架显著提提高了VEGF的分泌、HIF-1a和VEGF的表达。含铜的介孔玻璃支架具有非常优良的成血管化潜力。
将不同铜含量的介孔玻璃支架或其浸提液与人的骨髓基质干细胞培养，研究材料对骨髓基质干细胞的粘附、增殖、碱性磷酸酶活性以及成骨相关的基因表达。结果表明含铜的介孔玻璃支架及其释放的离子产物能够显著地促进牙骨髓基质干细胞的成骨分化，具有成骨促进性。
将含铜的介孔玻璃支架浸泡在布洛芬药物溶液中12小时，测试药物传输，发现含铜的介孔玻璃支架能够有效地装载药物，并维持长时间的药物传输。
同时采用E.coli菌与含铜的介孔玻璃支架作用，发现引入铜在介孔生物活性玻璃支架中显著地抑制了细菌的活力，显示出良好的抗菌性能。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种多功能介孔生物活性玻璃支架，其特征在于，
所述生物活性玻璃支架为无定型玻璃结构，并且90%～99.999%的大孔都是互相连通的；
所述生物活性玻璃支架还含有1～15摩尔%的铜，以所述无定型玻璃结构中的CuO-CaO-P2O5-SiO2的总物质的量计算。
2.如权利要求1所述的生物活性玻璃支架，其特征在于，所述生物活性玻璃支架的比表面为300～450m2/g，优选330±10m2/g。
3.如权利要求1所述的生物活性玻璃支架，其特征在于，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步骤的方法制备的：
(a)采用溶胶-凝胶法提供溶胶溶液；
所述溶胶溶液含有6～10重量份的介孔模板剂，10～15重量份的硅原料，1～2重量份的磷酸三烷基酯和钙盐，所述磷酸烷基酯和钙盐之间为化学计量比；其中还含有1～15摩尔%的铜，所述铜以CuO-CaO-P2O5-SiO2的总物质的量计；
(b)用所述溶胶溶液浸渍或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅烧去除，得到生物活性玻璃支架的坯体；
(c)所述步骤(b)的生物活性玻璃支架的坯体在600～700°C煅烧，去除所述成孔模板，得到烧结的生物活性玻璃支架。
4.一种如权利要求1所述的多功能介孔生物活性玻璃支架的制备方法，其特征在于，所述生物活性玻璃支架是采用含有如下步骤的方法制备的：
(a)采用溶胶-凝胶法提供溶胶溶液；
所述溶胶溶液含有6-10重量份的介孔模板剂，10～15重量的硅原料，1～2克重量的磷酸三烷基酯和钙盐，所述磷酸三烷基酯和钙盐之间为化学计量比；其中还含有1～15摩尔%的铜，所述铜以0.4-0.6克的总物质的量计；
(b)用所述步骤(a)的溶胶溶液浸渍或是涂覆成孔模板，所述的成孔模板可煅烧去除，得到生物活性玻璃支架的坯体；
(c)所述步骤(b)的生物活性玻璃支架的坯体在600-750℃煅烧，去除所述成孔模板，得到烧结的生物活性玻璃支架。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用正硅酸乙酯为硅源，
采用醇类溶剂得到溶胶溶液；
所述硅源与醇类试剂的质量比为1：(7-15)。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用市售的P123(聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物)为介孔模板剂，
其与醇类溶剂的质量比为1：(10-20)。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)的所述溶胶-凝胶法中，
采用盐酸或硝酸作为催化剂，调节后所述溶液的pH值为2-4。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的成孔模板采用泡沫模板，更优选采用聚亚胺脂海绵，涂覆所述成孔模板的次数为3-5次。
9.一种移植物，其特征在于，所述移植物含有如权利要求1所述的多功能介孔生物活性玻璃支架和接种于所述生物活性玻璃支架的干细胞，所述干细胞选自骨髓基质干细胞或脂肪干细胞，并且干细胞的接种量为2×106～5×107个细胞/cm3生物活性玻璃支架。
10.一种如权利要求1所述的多功能介孔生物活性玻璃支架的用途，其特征在于，用于制备骨移植物的支架。
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