CN111217523A

CN111217523A - 一种纳米介孔生物活性玻璃及其制备方法

Info

Publication number: CN111217523A
Application number: CN202010044199.3A
Authority: CN
Inventors: 王胜地; 于健飞
Original assignee: Beijing Purism Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Purism Technology Co Ltd
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2040-01-15
Also published as: CN111217523B

Abstract

本发明实施例公开了一种纳米介孔生物活性玻璃，所述纳米介孔生物活性玻璃包含SiO₂、CaO、P₂O₅和纳米ZnO。所述生物活性玻璃在粒度特性和功能性扩展方面得到改进，兼具纳米介孔材料和纳米ZnO的特性，是一种同时具有优异的生物活性和杀菌效果的人体生物相容性材料，不但可作为口腔治疗和齿科修复的材料使用，而且可以作为骨骼修复和创口愈合的材料进行使用。本发明实施例还提供了所述纳米介孔生物活性玻璃的制备方法。

Description

一种纳米介孔生物活性玻璃及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种纳米介孔生物活性玻璃及其制备方法。

背景技术

生物活性玻璃(BioActiveGlass，BAG)是一类十分重要的生物材料，这种材料是由SiO₂、Na₂O、CaO和P₂O₅等基本成分组成的硅酸盐玻璃，具有良好的生物相容性和生物活性，可以在人体体液中进行矿化生成人骨中重要的组成成分——羟基磷灰石。将其作为骨修复材料和支架材料植入人体时，这种材料可以键合骨组织，促进细胞的繁衍、增强成骨细胞的基因表达和骨组织的生长。最早的生物玻璃材料在1969年由美国佛罗里达大学的L.Hench教授发现，这种材料称为45S5玻璃(质量分数为24.5％Na₂O-24.5％CaO-45％SiO₂-6％P₂O₅)，通过高温熔融法获得。但所得材料需要在极高温度下(1300-1500℃)进行反应，且团聚严重，比表面积小，颗粒表面致密无孔，致使这种材料不利于离子的释放和体内降解，同时在制备过程中，因为原料纯度低以及熔融法本身的特点，不可避免地引入了大量的杂质。

由于熔融法制备的生物玻璃存在诸多缺陷，溶胶-凝胶法制备生物玻璃的新技术被开发出来。这种方法可以克服熔融法制备生物玻璃所产生的一系列缺陷，具有能耗低，反应条件温和，工艺易于控制等特点，且所得产物具有高比表面积和有序的介孔孔道，已经成为当前生物玻璃的关键制备技术。但目前这种方法所存在的问题包括产品粒度难以满足多种生物应用方面的需求、材料性能比较单一等，如缺少应用于人体时所需的抗菌性。

因此，需要对现有的生物玻璃材料及其制备方法进行改进，以获得理想的生物玻璃特性，能够满足多种生物应用尤其是人体应用方面的需求，如粒度特性和功能性的扩展等。

发明内容

为克服现有技术中存在的问题，本发明实施例的目的在于提供一种纳米介孔生物活性玻璃，所述生物活性玻璃在粒度特性和功能性扩展方面得到改进，兼具纳米介孔材料和纳米ZnO的特性，是一种同时具有优异的生物活性和杀菌效果的人体生物相容性材料，不但可作为口腔治疗和齿科修复的材料使用，同时也可以作为骨骼修复和创口愈合的材料进行使用。本发明实施例还提供了所述纳米介孔生物活性玻璃的制备方法。

为实现上述目的，本发明实施例的一个方面提供一种纳米介孔生物活性玻璃，所述纳米介孔生物活性玻璃包含SiO₂、CaO、P₂O₅和纳米ZnO，其中以Si、Ca、P和Zn的摩尔比计，SiO₂、CaO、P₂O₅和纳米ZnO的比例为(57～79):(15～38):(2～10):(1～3)。

在一个实施方案中，以Si、Ca、P和Zn的摩尔比计，SiO₂、CaO、P₂O₅和纳米ZnO的比例为(64～72):(23～31):(4～8):(1～3)。

通过含有上述特定成分及所述成分的特定比例，本发明提供的纳米介孔生物活性玻璃能够展现出优异的生物活性和杀菌效果，兼具纳米介孔材料和纳米ZnO的特性；同时所得材料在物理和机械性质方面也能满足口腔治疗和齿科修复材料的各种要求，也可以作为骨骼修复和创口愈合的材料进行使用，适用范围广。

在一个实施方案中，所述纳米ZnO的粒径为10-30nm，比表面积≥110m²/g。

氧化锌(ZnO)是一种新型无机抗菌材料，因其具有稳定性高和耐久性好的特点，被广泛应用于多个行业。关于ZnO的抗菌性能研究显示，其对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都显示出了优异的抗菌性能。本发明所提供的生物活性玻璃是在特定组成的纳米介孔生物玻璃中掺杂纳米ZnO粒子，使纳米ZnO粒子均匀分布在纳米介孔生物活性玻璃的结构中，这种材料同时具备纳米介孔生物活性玻璃和纳米氧化锌的性质，可以在口腔治疗和齿科材料等领域中得到广泛应用，同时该材料也可以作为骨骼修复和创口愈合的材料进行使用。

在该粒径和比表面积范围内的纳米ZnO能够为本发明的纳米介孔生物活性玻璃提供相适应的机械性能和抗菌性，其中尤其同所述生物活性玻璃的介孔相适配，在避免影响生物活性玻璃的介孔性能和生物活性的情况下，提供优异的抗菌性。

在一个实施方案中，所述纳米介孔生物活性玻璃由多个纳米球状颗粒组成，所述纳米球状颗粒的粒径为40-60nm，优选45-55nm。

本发明实施例的另一个方面还提供一种纳米介孔生物活性玻璃的制备方法，所述方法包括下列步骤：

(1)将水、乙醇、模板剂、催化剂以及硅源、钙源、磷源和纳米ZnO混合并反应，形成纳米介孔生物活性玻璃的前驱物溶胶；其中以Si、Ca、P和Zn的摩尔比计，硅源、钙源、磷源和纳米ZnO的比例为(57～79):(15～38):(2～10):(1～3)；

(2)将所得前驱物溶胶取出并密封，在60℃～80℃陈化1天，然后在90℃～120℃干燥3天，获得纳米介孔生物活性玻璃的前驱物粉末；

(3)将所得前驱物粉末在600℃～800℃热处理2～5h，得到所述纳米介孔生物活性玻璃。

本发明所提供的纳米介孔生物活性玻璃的制备方法，通过使用模板剂作为纳米介孔材料的结构导向剂，并在催化剂的作用下，向其内部加入制备所述生物活性玻璃的各种原料和纳米ZnO，在适当条件下进行自组装，通过生物活性玻璃原料和氧化锌之间的自组装，形成复合材料的前驱物，然后对其进行高温热处理后获得最终材料。

在一个实施方案中，步骤(1)中混合并反应的步骤包括将水、乙醇和模板剂依次加入容器中，不断搅拌后形成均匀混合的溶液，然后加入催化剂，再依次加入硅源、磷源、钙源和纳米ZnO，混合并反应，形成纳米介孔生物活性玻璃的前驱物溶胶。

在一个实施方案中，步骤(1)中模板剂、催化剂、水、乙醇和硅源的摩尔比为模板剂：催化剂：水：乙醇：硅源＝(0.2-1.5)：(0.5-1.5)：1000：400：(2-8)。

在一个实施方案中，步骤(1)中混合并反应6-8h，优选7h。

在一个实施方案中，步骤(1)中以Si、Ca、P和Zn的摩尔比计，硅源、钙源、磷源和纳米ZnO的比例为(64～72):(23～31):(4～8):(1～3)。

在一个实施方案中，步骤(1)中所述模板剂为阳离子表面活性剂，在所述前驱物溶胶中的浓度为5.56～41.67mmol/L。

在一个实施方案中，所述模板剂为双十八烷基二甲基氯化铵。

在一个实施方案中，步骤(1)中所述催化剂为弱碱性催化剂，所述前驱物溶胶的pH值为10-11。

在一个实施方案中，所述催化剂为三乙醇胺。

在一个实施方案中，所述硅源为选自正硅酸乙酯、白炭黑和硅酸钠中的至少一种；所述磷源为磷酸三乙酯；所述钙源为选自四水硝酸钙和氯化钙中的至少一种。

在一个实施方案中，步骤(2)在烘箱中进行；步骤(3)在高温炉中进行。

本发明实施例的另一个方面还提供所述纳米介孔生物活性玻璃在口腔治疗和齿科材料中的用途。

本发明实施例的技术方案具有如下优点：

1、本发明实施例的技术方案结合了溶胶-凝胶法和碱催化法的共同优点，通过采用控制模板剂的量来控制所得材料的相貌，使所得材料的组成颗粒状基元保持在纳米球状颗粒的状态，实现了所得材料具有介孔和纳米结构的双层优点。

2、所得材料由于其粒径较小，很容易进入龋齿的龋洞中对其进行封堵，完美地对牙齿进行修复；同时一部分材料可以进入到牙小管中，能有效封堵牙小管神经，产生止痛效果。

3、所得材料具有的介孔结构使其具有很大的比表面积，所以具有非常好的黏附性，可以较好地黏附在牙齿表面，并且持续释放出钙离子，使得溶液中钙离子过饱和度增加，牙釉质在经过再矿化以后，表面沉积了一层新形成的矿物晶体即羟基磷灰石的牙釉质晶体，从而实现牙齿的再矿化。

4、在纳米介孔生物活性玻璃内加入纳米ZnO，能够产生杀菌作用，可以起到清新口气，防止牙菌斑生成的作用；本发明实施例技术方案的纳米介孔生物活性玻璃还可以作为制备新型牙膏(或护牙剂)和牙齿脱敏剂产品的一种极好的材料，同时也可以作为骨骼修复和创口愈合的材料进行使用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例1获得的纳米介孔生物活性玻璃的扫描电镜照片(放大倍率为10万倍)。

图2为本发明实施例1获得的纳米介孔生物活性玻璃的扫描电镜照片(放大倍率为30万倍)。

图3显示了细胞存活率(％)对生物活性玻璃浓度(μg/mL)的曲线(mean±SD,n＝8)。其中左图为Dc001(本发明溶胶-凝胶法制备的纳米级生物玻璃)对HaCat细胞增殖活性的影响；中间图为Dc002(溶胶-凝胶法制备的微米级生物玻璃(酸催化法))对HaCat细胞增殖活性的影响；右图为Dc003(熔融法制备的微米级生物玻璃)对HaCat细胞增殖活性的影响。

图4显示了Dc001(本发明溶胶-凝胶法制备的纳米级生物玻璃)对HaCat细胞形态的影响(n＝8)。

图5显示了Dc002(溶胶-凝胶法制备的微米级生物玻璃(酸催化法))对HaCat细胞形态的影响(n＝8)。

图6显示了Dc003(熔融法制备的微米级生物玻璃)对HaCat细胞形态的影响(n＝8)。

图7显示再矿化实验中原始牛牙的牙釉质的扫描电镜照片。

图8-10显示脱矿液处理48小时后牛牙的牙釉质表面的扫描电镜照片。

图11-14显示再矿化后的牛牙牙釉质表面扫描电镜照片。

图15-16显示牛牙牙齿的纵剖面图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种纳米介孔生物活性玻璃，其制备方法如下：

(1)将500.05g水、511.07g乙醇、8.15g双十八烷基二甲基氯化铵和4.14g三乙醇胺依次加入到烧杯中配成混合溶液，所述混合溶液的pH值为10；

然后依次将34.72g正硅酸乙酯、5.06g磷酸三乙酯、18.41g四水硝酸钙和0.44g纳米氧化锌加入到上述混合溶液中，搅拌均匀后，得到纳米介孔生物活性玻璃的前驱物溶胶；

(2)将步骤(1)所得前驱物溶胶取出密封好，放入60℃烘箱中陈化1天；再将其放置于120℃的烘箱中干燥3天，获得烘干后的纳米介孔生物活性玻璃的前驱物粉末；

(3)将所得前驱物粉末放置于高温炉中，在600℃的温度下热处理5h，得到所述纳米介孔生物活性玻璃。

实施例2

一种纳米介孔生物活性玻璃，其制备方法如下：

(1)将500.06g水、511.03g乙醇、3.26g双十八烷基二甲基氯化铵和2.07g三乙醇胺依次加入到烧杯中配成混合溶液，所述混合溶液的pH值为10；

然后依次将3.34g白炭黑、0.63g磷酸三乙酯、2.66g氯化钙和0.21g纳米氧化锌加入到上述混合溶液中，搅拌均匀后，得到纳米介孔生物活性玻璃的前驱物溶胶；

(2)将步骤(1)所得前驱物溶胶取出密封好，放入70℃烘箱中陈化1天；再将其放置于90℃的烘箱中干燥3天，获得烘干后的纳米介孔生物活性玻璃的前驱物粉末；

(3)将所得前驱物粉末放置于高温炉中，在700℃的温度下热处理3h，得到所述纳米介孔生物活性玻璃。

实施例3

一种纳米介孔生物活性玻璃，其制备方法如下：

(1)将500.09g水、511.02g乙醇、6.51g双十八烷基二甲基氯化铵和3.32g三乙醇胺依次加入到烧杯中配成混合溶液，所述混合溶液的pH值为10；

然后依次将31.58g硅酸钠、1.42g磷酸三乙酯、16.74g四水硝酸钙和0.16g纳米氧化锌加入到上述混合溶液中，搅拌均匀后，得到纳米介孔生物活性玻璃的前驱物溶胶；

(2)将步骤(1)所得前驱物溶胶取出密封好，放入80℃烘箱中陈化1天；再将其放置于100℃的烘箱中干燥3天，获得烘干后的纳米介孔生物活性玻璃的前驱物粉末；

(3)将所得前驱物粉末放置于高温炉中，在800℃的温度下热处理2h，得到所述纳米介孔生物活性玻璃。

实施例4

一种纳米介孔生物活性玻璃，其制备方法如下：

(1)将500.03g水、511.06g乙醇、13.03g双十八烷基二甲基氯化铵和4.97g三乙醇胺依次加入到烧杯中配成混合溶液，所述混合溶液的pH值为11；

然后依次将39.47g硅酸钠、2.89g磷酸三乙酯、4.63g氯化钙和0.18g纳米氧化锌加入到上述混合溶液中，搅拌均匀后，得到纳米介孔生物活性玻璃的前驱物溶胶；

(2)将步骤(1)所得前驱物溶胶取出密封好，放入70℃烘箱中陈化1天；再将其放置于110℃的烘箱中干燥3天，获得烘干后的纳米介孔生物活性玻璃的前驱物粉末；

(3)将所得前驱物粉末放置于高温炉中，在700℃的温度下热处理4h，得到所述纳米介孔生物活性玻璃。

实施例5

一种纳米介孔生物活性玻璃，其制备方法如下：

(1)将500.05g水、511.07g乙醇、19.55g双十八烷基二甲基氯化铵和5.82g三乙醇胺依次加入到烧杯中配成混合溶液，所述混合溶液的pH值为11；

然后依次将11.83g白炭黑、2.83g磷酸三乙酯、10.41g四水硝酸钙和0.42g纳米氧化锌加入到上述混合溶液中，搅拌均匀后，得到纳米介孔生物活性玻璃的前驱物溶胶；

(3)将所得前驱物粉末放置于高温炉中，在800℃的温度下热处理3h，得到所述纳米介孔生物活性玻璃。

实施例6

一种纳米介孔生物活性玻璃，其制备方法如下：

(1)将500.02g水、511.08g乙醇、24.44g双十八烷基二甲基氯化铵和6.22g三乙醇胺依次加入到烧杯中配成混合溶液，所述混合溶液的pH值为11；

然后依次将46.36g正硅酸乙酯、1.04g磷酸三乙酯、11.43g四水硝酸钙和0.72g纳米氧化锌加入到上述混合溶液中，搅拌均匀后，得到纳米介孔生物活性玻璃的前驱物溶胶；

(2)将步骤(1)所得前驱物溶胶取出密封好，放入80℃烘箱中陈化1天；再将其放置于120℃的烘箱中干燥3天，获得烘干后的纳米介孔生物活性玻璃的前驱物粉末；

(3)将所得前驱物粉末放置于高温炉中，在600℃的温度下热处理4h，得到所述纳米介孔生物活性玻璃。

性能测试

1、外观(扫描电镜照片)

如图1和图2所示，分别显示了实施例1获得的纳米介孔生物活性玻璃的扫描电镜照片(放大倍率分别为10万倍和30万倍)。从照片中可以看出，所述纳米介孔生物活性玻璃由多个纳米球状颗粒组成，且多个球状颗粒之间形成多个孔隙。更多的孔隙和可观的比表面积使生物玻璃具有更快的降解速度和表面形成羟基磷灰石活性。

2、细胞水平的生物毒性检测实验

2-1、实验方案

细胞系：人永生化上皮细胞HaCat

分组：对照组Ctrl，实验组Dc001、Dc002、Dc003共计四组，每组设8个重复(其中，Dc001为溶胶-凝胶法制备的纳米级生物玻璃，Dc002为溶胶-凝胶法制备的微米级生物玻璃(酸催化法)，Dc003为熔融法制备的微米级生物玻璃)。

铺板密度：96孔板，每孔铺细胞5000个。

剂量梯度：实验组设置0μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1600μg/mL共10个梯度。

检测点及检测指标：细胞贴壁后即添加对应浓度的药物，并分别在加药后、给药1天、给药3天共三个节点各组选2个视野拍清晰图片看细胞形态，并在第三天使用CCK-8或MTT检测体系测细胞活性。

2-2、实验结果

2-2-1、MTT法检测生物活性玻璃对细胞增殖活性的影响

结果见图3显示的细胞存活率(％)对生物活性玻璃浓度(μg/mL)的曲线。根据结果显示，Dc001的半致死浓度为21.63μg/mL，高于Dc002和Dc003，表明Dc001对HaCat的生物毒性低于Dc002和Dc003。

2-2-2、生物玻璃对细胞形态的影响

结果见图4-6显示的Dc001、Dc002和Dc003三个生物活性玻璃对HaCat细胞形态的影响。从细胞形态角度看，三个原料的生物毒性相当，在浓度高于25μg/mL时，细胞形态皱缩，逐渐脱贴壁死亡。

2-3、实验总结

生物活性玻璃在功能型牙膏或护牙剂中的推荐使用剂量为2-5％(2-5g/100mL)，考虑实际刷牙过程中很少量的活性成分才能附着在口腔上皮或入胃或入血，且少量进入体内的活性成分极易被代谢掉。保守按牙膏中活性成分剂量的万分之一(即2-5μg/mL)算，本发明实施例的生物活性玻璃(Dc001)的生物安全性优秀。

Dc001同Dc002和Dc003比较，在细胞水平其安全系数优于后面两种原料。考虑Dc003已经被广泛应用于功能型牙膏或护牙剂中，从细胞水平的生物毒性实验结果看，Dc001和Dc002可应用于牙膏或护牙剂的相关应用。

3、急毒实验

3-1、实验方案

依据的标准和指导原则：按照国家食品药品监督管理总局(CFDA)颁布的《药品注册管理办法》、《药物非临床研究质量管理规范》和《药物单次给药毒性试验技术指导原则》中有关规定，以及袁伯俊等主编的《药物毒理学实验方法与技术》制定本试验方案。

动物：昆明小鼠(3-5周龄)

分组：采用灌胃给药方式。参考相关指导原则资料，本次试验采用最大给药量法，每种给药方式设溶媒对照组Ctrl，实验组Dc001、Dc002、Dc003共计四组(其中，Dc001为溶胶-凝胶法制备的纳米级生物玻璃，Dc002为溶胶-凝胶法制备的微米级生物玻璃(酸催化法)，Dc003为熔融法制备的微米级生物玻璃)。每组设5只小鼠。

灌胃给药剂量：2000mg/kg

给药频率：单次给药

给药要求：给药前禁食12h以上，正常饮水

恢复期：给药结束后，继续观察7天，之后进行剖检

观察频率：给药后密切观察4h；恢复期，笼旁观察每天2次，详细的临床检查每天1次。

观察时间：恢复期每天相同或相近时间

观察例数：全部动物

观察方法及内容：隔笼观察内容包括(但不限于)：外观及被毛、行为活动(如动物步态、姿势、对外界的反应、有无抽搐或惊厥反应及刻板反应，例如过多的梳理、反复转圈或反常行为，例如自残及后退步态)、神经反应、呼吸状态、饮食和饮水情况、疾病及死亡状况、分泌物和排泄物等。取出后观察：给药前隔笼观察完毕后将动物从笼内取出，放在台面上进行近距离观察，查看颈部、头部(包括眼、耳、口、鼻)、下腹部、肛门、会阴、皮肤颜色、肌肉紧张度等有无异常，以及有无外伤等。小鼠剖杀后检测肝肾功能。

3-2、实验结果

a.给予Dc001、Dc002、Dc003后，各组均没有小鼠死亡；

b.给予Dc001、Dc002、Dc003后，各组小鼠外观及被毛、行为活动(如动物步态、姿势、对外界的反应、有无抽搐或惊厥反应及刻板反应，例如过多的梳理、反复转圈或反常行为，例如自残及后退步态)等均无异常；

c.给予Dc001、Dc002、Dc003后，神经反应、呼吸状态、饮食和饮水情况、分泌物和排泄物均无异常；

d.给予Dc001、Dc002、Dc003后，将小鼠放在台面上进行近距离观察，颈部、头部(包括眼、耳、口、鼻)、下腹部、肛门、会阴、皮肤颜色、肌肉紧张度等均无异常。

e.给予Dc001、Dc002、Dc003后，小鼠的肝肾功能与正常对照组无显著性差异。

3-3、实验总结

每组小鼠给予急毒检测的最大指导剂量2000mg/kg，从大体观察、体重、肝肾功能三个角度看生物玻璃在小鼠上无表现出生物毒性；Dc001同Dc002和Dc003比较，无显著性差异。因此，从灌胃给药组的急毒实验结果看，Dc001可应用于牙膏或护牙剂的相关应用。

4、长毒实验

4-1、实验方案

动物：昆明小鼠(3-5周龄)

分组：分为灌胃给药和腹腔注射给药两种方式。每种给药方式设溶媒对照组Ctrl，实验组Dc001、Dc002、Dc003共计四组(其中，Dc001为溶胶-凝胶法制备的纳米级生物玻璃，Dc002为溶胶-凝胶法制备的微米级生物玻璃(酸催化法)，Dc003为熔融法制备的微米级生物玻璃)。每组设5只小鼠，每天给药一次，连续给药14天。

灌胃给药剂量：100mg/kg

腹腔注射剂量：100mg/kg

检测点及检测指标：试验期间动物每日进行一般状态观察；给药期间每周测定动物体重、摄食量。给药结束动物进行肝功能和肾功能检测：ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、ALP(碱性磷酸酶)、T.BIL(总胆红素)、CRE(肌酐)；脏器湿重称量检查。

4-2、实验结果

4-2-1、大体观察

长毒实验期间灌胃及腹腔给药各组小鼠外观及被毛、行为活动(如动物步态、姿势、对外界的反应、有无抽搐或惊厥反应及刻板反应，例如过多的梳理、反复转圈或反常行为，例如自残及后退步态)等均无异常；神经反应、呼吸状态、饮食和饮水情况、分泌物和排泄物均无异常；将小鼠放在台面上进行近距离观察，颈部、头部(包括眼、耳、口、鼻)、下腹部、肛门、会阴、皮肤颜色、肌肉紧张度等均无异常。

4-2-2、体重检测

对长毒实验阶段的小鼠体重统计分析，结果显示灌胃或腹腔注射给药后，与空白对照组比较小鼠的体重无显著性变化。

4-2-3、肝肾功能检测

长毒实验结束后，对收集到的新鲜肝脏组织称量重量并做组间比较，结果显示灌胃或腹腔注射给药后，小鼠肝脏的重量无显著性组间差异。

进一步对收集到的血液做肝肾功能相关的指标含量检测，结果显示灌胃给药后，肝肾功能相关的ALT、AST、ALP、T.BIL及CRE含量与对照组比较无显著性差异。同样，腹腔注射给药后，肝肾功能相关的5个指标的含量与对照组比较无显著性差异。

4-3、实验总结

本次长毒实验分为灌胃给药和腹腔注射给药两种方式，分别对应刷牙时吞咽进入体内和通过牙龈出血部位从血进入体内。给药剂量设为100mg/kg，每组小鼠给予14天连续给药。

用药期间，各组小鼠摄食量无明显变化，无腹泻，未出现躁动不安、竖尾、肌颤等兴奋现象，也未观察到嗜睡、活动减少等抑制现象；各用药组小鼠体重增长在各时点与对照组比，无显著性差异，说明药物不影响小鼠体格发育；给药14天后，与对照组相比，各组小鼠ALT、AST、ALP、T.BIL、CRE均无明显差别，肝脏湿重差别亦无显著性，说明Dc001、Dc002、Dc003不损伤小鼠肝肾功能；同时，与对照组比较，各组小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺甲状腺未发生明显变化。

因此，从大体观察、体重、肝肾功能三个角度看生物玻璃在小鼠上无表现出长期生物毒性。

综上，可得出结论：Dc001的生物安全性好，与已经应用于市场的Dc003相比，二者的生物安全性相当，甚至在某些层面Dc001要优于Dc003。Dc001与Dc002比较，二者的生物安全性相当，无显著性差异。因此，从生物安全性角度讲Dc001可应用于护牙剂的生产。

5、纳米生物活性玻璃对早期龋齿的再矿化作用

将6个牙釉质块建立人工龋模型后，用纳米生物玻璃处理，之后浸泡在人工唾液中。扫描电镜观察再矿化后牙釉质块表面形态变化。

对釉质病损中脱矿和再矿化的结晶学研究可以得到结论，在暴露于口腔的釉质表面，脱矿和再矿化时常发生，它们或者同时发生或者交替发生。健康的牙齿这两个过程始终保持平衡，一旦平衡被打破，就会发生脱矿或再矿化。当脱矿率大于再矿化率时，釉质发生脱矿，当再矿化率大于脱矿率时发生再矿化。

5-1、再矿化实验

(1)原始牛牙的牙釉质面用扫描电镜拍摄照片；

(2)牛牙牙釉质脱矿液处理48小时，用脱矿液处理后牛牙的牙釉质表面用扫描电镜拍摄照片；

(3)脱矿后的牛牙牙釉质每天用纳米生物玻璃处理，每天两次，每次1min，之后浸泡在人工唾液中，放置在摇床内，37℃环境下反应12天，再用扫描电镜观察。

脱矿液配方：2.2mmol·L^-1Ca(NO₃)₂、2.2mmol·L^-1KH₂PO₄、50mmol·L^-1 CH₃-COOH、5.0 mmol·L^-1 NaN₃、0.5 mg·L^-1 NaF(pH4.5)。

人工唾液配方：1.5mmol·L^-1CaCl₂、0.9mmol·L^-1KH₂PO₄、130mmol·L^-1KCl、1.0mmol·L^-1NaN₃、20mmol·L^-1HEPES(pH7.0)。

见图7，显示原始牛牙的牙釉质的扫描电镜照片，牙釉质表面很致密,光滑，均一。

人工龋的形成：见图8-10，显示脱矿液处理48小时后牛牙的牙釉质表面的扫描电镜照片，可以看到明显的牙釉柱脱落现象。其中图8显示脱矿后牙釉质表面的照片：牙釉质表面变得非常疏松。图9-10显示脱矿后牙釉质表面局部放大的扫描电镜照片，可以看到明显牙釉柱的脱落。

再矿化：见图11-14，显示再矿化后的牛牙牙釉质表面扫描电镜照片。其中图11显示脱矿后的牙釉质表面用纳米生物玻璃处理后在人工唾液中再矿化12天后牙釉质表面的整体效果。图12显示再矿化后牙釉质表面的整体效果；中间斑块部分显示，随着矿化时间延长，逐渐形成越来越平整、致密的牙釉质表面。图13-14可以看到，再矿化后的牙釉质表面有致密的类似于天然牙釉柱的柱状羟基磷灰石晶体生成。

图15-16显示牛牙牙齿的纵剖面图，可以看到牙釉质上生长一层致密的羟基磷灰石晶体(牙釉质的主要成分)。

本发明实施例提供的纳米介孔生物活性玻璃在粒度特性和功能性扩展方面得到改进，兼具纳米介孔材料和纳米ZnO的特性，是一种同时具有优异的生物活性和杀菌效果的人体生物相容性材料。所述纳米介孔生物活性玻璃由多个纳米球状颗粒组成，且多个球状颗粒之间形成多个孔隙。更多的孔隙和可观的比表面积使生物玻璃具有更快的降解速度和表面形成羟基磷灰石活性。该纳米介孔生物活性玻璃安全无毒，具有优异的封堵和再矿化效果，适宜用于牙膏或护牙剂的相关应用，同时本发明也可以用作骨骼修复和创口愈合的材料进行使用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种纳米介孔生物活性玻璃，其特征在于，所述纳米介孔生物活性玻璃包含SiO₂、CaO、P₂O₅和纳米ZnO，其中以Si、Ca、P和Zn的摩尔比计，SiO₂、CaO、P₂O₅和纳米ZnO的比例为(57～79):(15～38):(2～10):(1～3)。

2.根据权利要求1所述的纳米介孔生物活性玻璃，其特征在于，所述纳米ZnO的粒径为10-30nm，比表面积≥110m²/g。

3.根据权利要求1所述的纳米介孔生物活性玻璃，其特征在于，所述纳米介孔生物活性玻璃由多个纳米球状颗粒组成，所述纳米球状颗粒的粒径为40-60nm。

4.一种纳米介孔生物活性玻璃的制备方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中模板剂、催化剂、水、乙醇和硅源的摩尔比为模板剂：催化剂：水：乙醇：硅源＝(0.2-1.5)：(0.5-1.5)：1000：400：(2-8)。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中混合并反应6-8h。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纳米ZnO的粒径为10-30nm，比表面积≥110m²/g。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述模板剂为阳离子表面活性剂，在所述前驱物溶胶中的浓度为5.56～41.67mmol/L。

9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述催化剂为弱碱性催化剂，所述前驱物溶胶的pH值为10-11。

10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述硅源为选自正硅酸乙酯、白炭黑和硅酸钠中的至少一种；所述磷源为磷酸三乙酯；所述钙源为选自四水硝酸钙和氯化钙中的至少一种。