CN112957451A - 生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体及制备方法和应用，属于生物技术领域，解决现有技术中仿生矿化功能多肽凝胶制剂缺乏再矿化所必须的钙磷来源，不能安全保留牙髓牙本质复合体活力和诱导牙本质再生的技术问题。本发明生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体以介孔生物活玻璃为载体负载氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的仿生功能多肽。本发明制备方法包括在缓冲液中加入介孔生物活性玻璃，分散后，加入仿生功能多肽，搅拌均匀，固液分离，所得固体清洗，干燥，即得。本发明生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体不仅具备对硬组织的仿生矿化效应，还能自身提供矿化所需要的钙磷离子来源，进一步地还具有对牙髓细胞的促矿化作用，能进一步促进牙本质修复。

Description

生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及龋齿防治技术和牙本质再生领域，具体涉及生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体及制备方法和应用。
背景技术
龋病、牙髓病是临床常见的口腔疾病，牙本质是构成牙主体的硬组织，由成牙本质细胞分泌并矿化形成。牙本质包绕着髓腔，内含牙髓组织。牙髓中存在成牙本质细胞、牙髓细胞和具备自我更新和多向分化潜能的牙髓干细胞等。在龋病、牙外伤等的外界刺激下，可造成牙本质的破坏，进而造成牙髓的损伤。
目前，经典的治疗方法是去除受影响的牙组织并随后用人工填充材料进行替换。但在牙本质破坏较大的情况下，细菌等刺激可沿牙本质小管进一步感染牙髓组织，导致不可逆的牙髓损伤。如何更好地修复这些牙体组织成为龋病治疗的一大难题。
牙釉质的修复主要依赖硬组织再矿化，而牙本质的修复不仅包括脱矿硬组织的再矿化，牙髓组织中含有的前体细胞还可被定向诱导，分化为成牙本质细胞并形成修复性牙本质。由于现有修复技术及材料的局限性，基于最新的生物活性材料再生受损的牙体组织成为理想的解决方案。目前，开发这种新的替代治疗方法被认为是口腔治疗研究的重要目标。由于牙髓中的前体细胞向成牙本质细胞定向分化的过程中涉及多种细胞信号分子的介导，一些蛋白多肽类生物分子可模拟这一过程从而定向诱导成牙本质细胞分化，成为牙本质再生的新型生物治疗方法。
釉基质蛋白(EMP)是一种牙发育阶段由成釉细胞分泌的调控牙矿化的基质蛋白，其中含量最高的是釉原蛋白，在牙硬组织发育的信号传导和促进矿化晶体成核中起着重要作用。基于EMP的生物学功能，人工设计合成的釉基质蛋白衍生物已被报道具有良好的促釉质再矿化及促进组织愈合能力。根据釉原蛋白中高度保守的QPX序列，我们前期已经设计了由5个Gln-Pro-X重复序列(QPY QPV QPH QPM QPQ)和7个残基亲水链段(TKREEVD)组成的多肽QP5，已被证明能促进脱矿的牙体硬组织再矿化。并且，相较于现有的化学与重要防龋制剂，这种来源于人天然牙基质蛋白的多肽具备更好的安全性与生物相容性。这证明了QP5作为一种新型生物材料在牙体硬组织修复中存在应用潜能。
然而，目前仿生矿化功能多肽常用的凝胶载体制剂在实际口腔应用中，往往本身缺乏再矿化所必须的钙磷来源，并且凝胶制剂还存在边缘封闭性较差、界面结合力弱等问题。并且在深龋的修复中，不仅需要再矿化脱矿的牙体硬组织，如果能诱导牙髓细胞新生牙本质则能达到更好的牙髓保护效果。
在众多的载体材料中，生物活性玻璃(BGs)因具有良好的钙磷储备性、界面结合性及载药释药性能，在作为各类生物活性分子的载体方面表现出明显优势。最经典的45S5BGs由45％SiO2、24.5％Na2O、24.5％CaO及6％P2O5组成，其成分比重可根据具体需求灵活设计。除了充足且可控的钙磷储备性能，BGs与胶原具有良好亲和性，因此可吸附在脱矿牙本质界面。另一方面，由溶胶凝胶法制备的多孔BGs因含规则的孔道结构、90％以上的孔隙率孔体积，具有良好的载药释药性能。因此将其用作仿生功能多肽的载体可能克服前期仿生矿化功能多肽凝胶载体钙磷来源不足、封闭性差、界面结合力弱等问题，有望成为修复龋损的新型生物材料。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体，解决现有技术中仿生矿化功能多肽凝胶制剂缺乏再矿化所必须的钙磷来源，不能诱导牙髓细胞新生的技术问题。
本发明的目的之二在于，提供该生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的制备方法。
本发明的目的之二在于，提供该生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体，以介孔生物活玻璃为载体负载仿生功能多肽，其中所述仿生功能多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
QPYQPVQPHQPMQPQTKREEVD。
本发明的如SEQ ID NO.1所示的仿生功能多肽，能够很好地促进早期脱矿的牙釉质(早期龋)再矿化。
本发明的部分实施方案中，每mg多肽复合体中含有25-230μg仿生功能多肽，优选为140μg。
本发明的部分实施方案中，所述介孔生物活玻璃由溶胶-凝胶法制得。
本发明的介孔生物活玻璃由溶胶凝胶法制得，其孔道结构规则、孔隙率高，具有良好的载药释药性能。
本发明所述的一种生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的制备方法，包括以下步骤：在缓冲液中加入介孔生物活性玻璃，分散后，加入所述仿生功能多肽，搅拌均匀，固液分离，所得固体清洗后，干燥，即得所述复合体。
本发明的部分实施方案中，介孔生物活性玻璃与仿生功能多肽的质量比为50：2～70；优选为50：15。
本发明的部分实施方案中，缓冲液中仿生功能多肽的浓度为0.2～7.0mg/mL，优选为1.5mg/mL。
本发明的部分实施方案中，所述缓冲液包括PBS缓冲液。
本发明的部分实施方案中，所述分散为超声分散。
本发明的部分实施方案中，所述搅拌为低温条件下搅拌，优选为2～6℃，更优选为4℃。
本发明的部分实施方案中，所述搅拌为磁力搅拌，搅拌时间为12～48小时，优选为24小时。
本发明的部分实施方案中，所述干燥为低温干燥，优选为真空冷冻干燥。
为了保证仿生功能多肽的活性，其生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的制备过程中，应尽可能在低温条件下操作，故本发明采用低温条件搅拌和冷冻干燥。
本发明的部分实施方案中，所述介孔生物活玻璃由溶胶-凝胶法制得。
本发明的介孔生物活玻璃由溶胶凝胶法制得，其孔道结构规则、孔隙率高，具有良好的载药释药性能。
本发明所述的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体在制备促进牙髓细胞增殖或/和促进牙髓细胞迁移或/和促进牙髓细胞分化出矿化结节或/和再矿化牙本质的药物或材料中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计科学，构思巧妙。本发明创造性地以介孔生物活玻璃负载仿生功能多肽，有效解决了仿生功能多肽应用时缺乏足够的钙磷来源等问题。本发明基于仿生功能多肽促牙本质仿生矿化和修复性再生的潜能，借助生物活性玻璃的载药性、界面结合性及钙磷储备性，构建生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体，使复合体发挥稳定、安全并具有仿生矿化和修复性牙本质再生双重效应。此外，申请人发现，本发明的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体还具有预料不到的促进牙髓细胞增殖迁移和分化的作用，能进一步促进牙本质修复。
附图说明
附图1为生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的红外图谱；
附图2为生物活性玻璃与仿生功能多肽复合体的用量比考察结果图；
附图3为生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的钙离子释放考察图；
附图4为生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体对牙髓细胞的增殖作用结果图；
附图5为茜素红染色实验结果图；
附图6为生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体促进牙髓细胞迁移实验结果图；
附图7为生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体对脱矿牙本质的显微硬度恢复情况结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例中的QP5多肽由浙江昂拓莱司生物技术公司合成。
实施例1
本实施例提供了采用溶胶凝胶法制备介孔生物活玻璃的方法，具体为：
将30mL去离子水及120mL浓度为2M的硝酸溶液预混，然后投入3g的P123表面活性剂溶解，用硝酸调节溶液pH值到1以下，依次加入8.5g正硅酸乙酯(TEOS)、0.98g磷酸三乙酯(TEP)和5.94g硝酸钙，在60℃下搅拌48小时，在100℃烘箱中烘干12h，得到的粉末在马弗炉中600℃煅烧6h，升温速度为1℃/min，获得的产物即为介孔生物活性玻璃。
实施例2
本实施例提供了生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的制备方法，具体为：
在10mL的PBS缓冲液中加入50mg介孔生物活性玻璃，超声分散10分钟后，加入15mgQP5多肽(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，4℃磁力搅拌24h，离心，沉淀用PBS清洗三遍，真空冷冻干燥。本实施例所述的介孔生物活性玻璃为按照实施例1的方法制得。
将本实施例制得的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体进行红外分析，其红外图谱如附图1所示，其中MBG表示生物活性玻璃，QP5表示仿生功能多肽，MBG-Q表示生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体。结果显示，与未载入多肽的生物活性玻璃相比，生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体在1500cm-1波长附近出现了多肽的氨基峰，表明多肽被成功载入。
实施例3
本实施例提供了生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的不同用量比的考察，具体为：
在10mL的PBS缓冲液中加入50mg介孔生物活性玻璃，超声分散10分钟后，加入不同质量的QP5多肽，使50mg的生物活性玻璃粉末悬浮在10mL的不同浓度(0.2～7.0mg/mL)的多肽溶液中,4℃磁力搅拌24小时，离心，收集上清液，采用紫外-可见光分光光度计测量上清液中未载入的游离多肽浓度，由此计算出包封进入生物活性玻璃载体的多肽的包封率以及复合体的载药量。
包封率计算公式如下：EE＝(C0-C1)/C0×100％；
其中EE代表包封率，CO表示投入的多肽总浓度，C1表示上清液中游离的多肽浓度；
载药率计算公式如下：LC＝(W1-W2)/W3×100％，其中W1表示投入的多肽总质量，W2表示上清液中游离的多肽质量，W3表示复合体的总质量。其结果如表1及附图2所示：
表1
Figure BDA0002954107150000051
Figure BDA0002954107150000061
附图2中EE代表包封率，LC代表载药量。结果表明，随着多肽浓度增加，包封率降低而载药量升高，二者成反比。若多肽浓度过高，虽然载药量提高，但是多肽浪费较多；而多肽浓度过低，虽然投入的大部分多肽都被成功包封入载体，但是形成的复合体总体含多肽量少。二者的平衡交叉点出现在多肽浓度为1.5mg/mL左右。因此决定介孔生物活性玻璃与仿生功能多肽的用量比为最优选为50mg介孔生物活性玻璃搭载15mg仿生功能多肽。
本实施例根据文献(Wu C,Zhang Y,Ke X,et al.Bioactive mesopore-glassmicrospheres with controllable protein-delivery properties by biomimeticsurface modification[J].J Biomed Mater Res A,2010,95(2):476-85.)中记载的紫外-可见光分光光度法测量上清液中未载入的游离多肽浓度。
实验例1
本实验例考察了实施例2制得的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的钙离子释放行为，具体为：
1.在pH值为7.4、5.5、4.0的10ml的HEPES缓冲液中分别加入10mg复合体；
2.将样本放入水平振荡器中，温度为37℃，转速为100rpm；
3.在2、4、6、8、10小时时间点，取出样本，5000rpm离心10min，吸取2mL上清液，用作钙离子浓度检测，并立即补充入2mL相同pH值HEPES缓冲液，继续放入水平振荡器中；
4.将每个时间点取出的上清液，按照钙试剂盒(南京建成生物工程研究所)的操作说明，测定钙离子浓度；
5.钙试剂盒具体操作步骤如下：
·按照试剂一：试剂二＝1：2的比例配置工作液；
·将工作液250μL与待测样本10μL混合，静置5分钟后，在波长610nm处用酶标仪测定OD值；
·根据OD值与标准品对照，换算待测样本的出钙浓度。
结果如附图3所示，生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体由于自身包含钙磷，在缓冲溶液中可释放出钙离子，并且其释放具有pH响应性，环境pH越低，钙离子释放浓度越高。
实验例2
本实验例考察了实施例2制得的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体对牙髓细胞的增殖作用，具体为：
1.将生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体重悬于DMEM细胞培养基中，调整生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体浓度分别为0、10、20、40、60、80、100和200μg/mL。
2.培养第3～5代的人牙髓细胞，并调整浓度为3000个细胞/孔，接种在96孔板中。
3.待细胞融合度达到80％以上时，分别加入100μL上述浓度的复合体悬浊液，与细胞共培养，在培养的第1、3、5、7、9天检测细胞数量。
4.检测细胞数量的方法为CCK-8法，具体操作方法如下：
·每孔中加入100μL CCK-8检测液(CCK-8原液与DMEM以1：9的比例混合)，37℃避光孵育1h；
·酶标仪测定(波长450nm)每孔的吸光度值。
在长达9天的观测中，相较与不含复合体的处理组，复合体在浓度为100μg/mL以下对人牙髓细胞具有良好的细胞相容性，并在浓度为60μg/mL有较稳定的促增殖效果，结果如附图4所示。
实验例3
本实验例考察了实施例2制得的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体茜素红染色实验。
茜素红染色实验：钙盐变化是牙髓细胞成牙分化潜能的标志之一，在特定的诱导培养作用后，牙髓细胞可分化为成牙本质细胞，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节。茜素红染料能与钙盐以鳌和方式形成复合物，产生橘红色沉积，可反映出牙髓细胞分化产生钙结节的量。本实验中，使用三种培养基处理人牙髓细胞，NC为普通培养基，OM为成牙诱导培养基，MBG/QP5组为浓度为60μg/ml的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体。具体步骤如下：
1.细胞铺板和培养：对培养第3-5代生长状况良好的hDPCs，以5.0×104/孔的密度铺板在12孔板中，每孔1ml培养基，复孔3个，待细胞长至60％-70％融合度时，按照以上分组培养及矿化诱导，隔天换液后培养至第14天。
2.细胞洗涤与固定：吸出矿化诱导培养基并用PBS轻柔清洗3次，每次5分钟，4％多聚甲醛固定30分钟，吸出固定液，轻柔清洗3-5次，每次3-5分钟。
3.染色：最后一次洗涤细胞完毕后，去除PBS洗涤液，每孔加入200μl茜素红染也，室温孵育30分钟。去除染液，PBS轻柔洗涤3次终止显色反应。
4.采图：染色结束后，显微镜下观察拍照。
经过3周的培养，经过复合体处理后的牙髓细胞表面沉积了大量钙结节，证明复合体可诱导牙髓细胞成牙分化。结果如附图5所示。
实验例4
本实验例考察了实施例2制得的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体细胞迁移实验。
细胞划痕法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，通过观察周边细胞是否迁移(修复)至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力。本实验将生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体浸泡于细胞培养基中24h，提取复合体的浸泡上清液体，并调整浓度为50μg/mL和100μg/mL，以此模拟复合体应用于龋损处时，其释放出的活性物质是否对牙髓细胞有募集作用。具体操作步骤如下：
1.培养第3-5代生长状况良好的hDPCs，胰酶消化后细胞计数，以5.0×104/孔的密度铺板在6孔板中，复孔3个，待细胞融合到70％左右后处理；
2.划痕：用200μl无菌枪头垂直沿着孔板中线在细胞表面进行划痕，用PBS轻轻清洗孔板去除多余细胞残渣，换用不同浓度的刺激液，实验组为用无血清的DMEM配制的50μg/mL和100μg/mL的复合体溶液，对照组为不含复合体的DMEM液，每组3个复孔，在37℃、5％CO2培养箱中培养；
3.倒置显微镜下(高倍镜×40)拍照记录培养0h、12h、24h后的划痕之间的距离。
实验结果证明，50μg/mL和100μg/mL浓度的复合体浸出液对牙髓细胞有显著的促进迁移作用。结果如附图6所示。
实验例5
本实验例考察了实施例2制得的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体脱矿牙本质的再矿化实验。
使用硬组织切割机对新鲜拔除的牛牙进行冠根分离，并制备尺寸至少为6×6×5mm的牙块。流动水冲洗10分钟、超声荡洗10分钟后，自然晾干，在体式显微镜下观察，去除有龋坏、裂纹或氟牙症的牛牙，剩余牙块置于包埋模具中以环氧树脂进行包埋。待环氧树脂凝固变硬后，在持续水冷却的条件下，用碳化硅打磨纸逐级打磨，对包埋的样本进行磨平、开窗和抛光，建立4×4mm的开窗区。超声荡洗10分钟，用4×4mm封口膜对开窗区进行遮盖，遮盖区之外的区域涂两层耐酸指甲油，待其凝固后，撕去封口膜，暴露出开窗区。样本保存在4℃的环境下，相对湿度为100％。
使用维氏显微硬度仪，选择等距离的五点，在50g压力下测量15秒，取其平均值记为SMH0，舍弃偏离平均范围较大的样本，完成表面显微硬度基线的筛选。
将牙釉质样本置于含有50mM乙酸(pH 4.5)、2.2mMCa(NO3)2、2.2mM KH2PO4、5.0mMNaN3和0.5ppmNaF的脱矿液中，在37℃恒温摇床(100rpm)下脱矿3天。之后，如上所述测量样品的脱矿后硬度SMH1。用4×2mm封口膜对开窗区进行遮盖，遮盖区之外的区域涂两层耐酸指甲油，待其凝固后，撕去封口膜，暴露出再矿化区。应用生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体(BQ)、单独生物活性玻璃(BG)、单独QP5多肽以及去离子水(DDW)处理脱矿的牙釉质，后置于人工矿化液中，每日更换新鲜配置的再矿化液，7天后，记录其表面硬度恢复情况。实验证明相较于去离子水，三种处理组都一定程度恢复了牙釉质的硬度，达到了再矿化的效果，其中复合体组比单一组分达到了更好的硬度恢复作用。结果如附图7所示。
用硬组织切割机切割釉质样本，约300μm厚，同时包括脱矿区及再矿化区，之后抛光到大约100μm的厚度。切片放在载玻片上，浸入去离子水中，用偏光显微镜检查。结果显示复合体能够对脱矿釉质实现再矿化。
将牙本质进行35％磷酸脱矿，并记录其硬度值。应用生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体(BQ)、单独生物活性玻璃(BG)、单独QP5多肽以及去离子水(DDW)处理脱矿的牙本质7天后，记录其表面硬度恢复情况。实验证明相较于去离子水，三种处理组都一定程度恢复了牙本质的硬度，达到了再矿化的效果，其中复合体组比单一组分达到了更好的硬度恢复作用。结果如附图7所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；也就是说，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体及制备方法和应用
<130> 20200226
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Pro Tyr Gln Pro Val Gln Pro His Gln Pro Met Gln Pro Gln Thr
1 5 10 15
Lys Arg Glu Glu Val Asp
20

Claims (10)

1.一种生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体，其特征在于，以介孔生物活玻璃为载体负载仿生功能多肽，其中所述仿生功能多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体，其特征在于，每mg多肽复合体中含有25-230μg仿生功能多肽，优选为140μg。
3.根据权利要求1或2所述的一种生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体，其特征在于，所述介孔生物活玻璃由溶胶-凝胶法制得。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在缓冲液中加入介孔生物活性玻璃，分散后，加入所述仿生功能多肽，搅拌均匀，固液分离，所得固体清洗后，干燥，即得所述复合体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，介孔生物活性玻璃与仿生功能多肽的质量比为50：2～70；优选为50：15。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液包括PBS缓冲液；或/和所述分散为超声分散。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌为低温条件下搅拌，优选为2～6℃，更优选为4℃。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌为磁力搅拌，搅拌时间为12～48小时，优选为24小时。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述干燥为低温干燥，优选为真空冷冻干燥。
10.权利要求1-3任意一项所述的生物活性玻璃/仿生功能多肽复合体在制备促进牙髓细胞增殖或/和促进牙髓细胞迁移或/和促进牙髓细胞分化出矿化结节或/和再矿化牙本质的药物或材料中的应用。
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