CN110859991A - 一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法，包括以下步骤：(1)以植酸为前驱体合成的生物活性玻璃(PSC)的制备；(2)PSC的多肽改性；(3)支架外层部分的制备；(4)支架内层部分的制备；(5)双层支架的交联完成：将步骤(4)中获得的支架浸泡于0.1％‑0.5％戊二醛交联剂中，使内外层支架交联形成具有双层结构的复合支架。本发明具有分层诱导能力且顺应牙的根管形态，用于诱导牙髓牙本质复合组织再生的生物活性支架材料；支架内层能够趋化干细胞的迁移爬入，利于牙髓样软组织的生成；支架外层能够进一步诱导细胞成牙本质向分化，促进牙本质样硬组织的生成；最终形成具有类似天然牙齿的特殊软硬组织。

Description

一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法。
背景技术
人类牙齿易受到龋病、外伤或咬合创伤等侵袭，引发牙髓和牙本质的损伤。牙髓损伤难以逆转，易发生坏死，目前临床治疗的主要方法是根管治疗，是清创之后，使用惰性材料严密充填根管。受根管系统复杂解剖结构的限制，根管治疗技术复杂，耗费大量的社会医疗成本；需使用机械和化学药物清创，对根尖周组织有潜在的危害。重要的是，失去牙髓后牙齿无法继续形成继发性牙本质和第三期牙本质，丧失了感受外界刺激和自我保护的能力，也使年轻恒牙的牙根无法继续发育。因此，牙髓牙本质再生一直是牙髓病学的理想方法和发展方向。
对于年轻恒牙的牙髓根尖周病变，现有研究及临床病例尝试使用牙髓血运重建术(revascularization)，即使血液充盈清创后的根管，试图恢复牙髓活力，促进牙根继续发育。虽然影像学显示部分经过治疗的患牙牙根长度增加，根管壁增厚，甚至牙髓活力恢复。但组织学研究发现牙髓血运重建术治疗后的患牙根管内形成的矿化组织与固有牙本质存在间隙，多为牙骨质样或骨样、以及牙周膜样组织，而非牙本质，更未见到牙髓牙本质复合体样结构。牙髓牙本质复合体是维持牙齿感知和防护功能的重要结构，其内层为血管和神经的牙髓软组织，外层是由牙髓中的成牙本质细胞分泌形成的牙本质硬组织。精确调控再生组织的类型和形态，实现牙髓牙本质复合组织的再生是牙髓病治疗需要突破的难点。
现在关于牙髓牙本质再生的支架材料的研究主要包括生物基质成分如胶原、明胶等，高分子聚合材料如PLA(poly(lactic)acid，聚乳酸)、PCL(polycaprolactone，聚己内酯)、PGA(poly glycolic acid，聚乙交酯)、PLGA[poly(lactide-co-glycolide)，聚丙交酯乙交酯等和生物陶瓷类材料如生物活性玻璃、羟基磷灰石等等。但是上述材料效果单一，无法实现分层诱导牙髓牙本质软硬两种组织的目的。因此，构建具有诱导分层诱导能力的多功能复合支架是解决牙髓牙本质复合组织的一种可行途径。
从20世纪90年代后期，学者们开始研究在分子水平上刺激细胞产生特殊应答反应的第三代生物材料，即组织诱导生物材料。组织诱导生物材料具有生物活性、可控降解、并能够在基因或分子水平上调控细胞的生物学行为。Hench教授1969年成功研制生物活性玻璃(bioactive glasses，BG)，并观察到BG可与骨组织直接结合，提出了生物活性的概念。BG是一种生物活性陶瓷材料，其基本组成体系为SiO2-CaO-P2O5，它可在体内先产生快速的离子交换反应，形成具有生物活性的羟基磷灰石(hydroxyl-carbonate-apatite,HCA)，HCA和天然矿化组织非常相似，有利于细胞的黏附和组织的生物结合。申请人前期的研究发现，BG能诱导人牙髓细胞迁移，在BG颗粒表面较好贴附。此外，一定浓度的BG能够促使细胞由静止期向分裂期转变，提高牙髓细胞的增殖活性，增强牙髓细胞成牙本质相关的一些功能蛋白的表达，如DSPP，DMP-1等等。异位移植BG能够诱导成纤维状的牙髓细胞分化形成高柱状的类成牙本质细胞，在BG表面呈极性整齐排列，诱导生成的牙本质与天然的牙本质结构非常相似，可见到牙本质小管在上述类成牙本质细胞下方整齐平行排列，二者构成牙髓牙本质复合体。因此BG可作为诱导细胞成牙本质向分化，促进牙本质硬组织生成的理想材料之一。此外，对BG表面进行氨基化修饰，通过接枝具有调节干细胞行为的特定生物活性因子，如生长因子、多肽或基因片段，能进一步实现对干细胞的生物学行为的调控，使干细胞的定向迁移和成牙向分化具有可行性。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法，具有分层诱导能力且顺应牙的根管形态，用于诱导牙髓牙本质复合组织再生的生物活性支架材料；支架内层能够趋化干细胞的迁移爬入，利于牙髓样软组织的生成；支架外层能够进一步诱导细胞成牙本质向分化，促进牙本质样硬组织的生成；最终形成具有类似天然牙齿的特殊软硬组织。
为了达到上述目的，本发明有如下技术方案：
本发明的一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法，包括以下步骤：
(1)以植酸为前驱体合成的生物活性玻璃(PSC)的制备：PSC以植酸作为磷的前驱体，加入乙醇和水中混匀；在磁力搅拌下，加入正硅酸乙酯(Si(OC2H5)4，tetraethylorthosilicate，TEOS)，四水硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O，calcium nitrate tetrahydrate，CN)，继续搅拌直至形成透明、均一的溶胶；10-35℃室温下静置10-50天形成湿凝胶；湿凝胶置于25-60℃烘箱中陈化2-7天，然后在70-120℃下再干燥1-2周，形成干凝胶；将干凝胶研磨后置入高温炉400-700℃热处理1-5小时，过筛后得到即为植酸制备的生物活性玻璃，即PSC；所得磷硅酸基玻璃中的P2O5的摩尔百分含量为0.5-68％，SiO2的摩尔百分含量为13.2-99％，CaO的摩尔百分含量为0.5-80％，颗粒大小为100-500微米；
(2)PSC的多肽改性：取PSC粉末，以无水甲苯作为分散剂，二者混合后超声震荡辅助分散，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，于氮气保护下80℃加热回流反应24h，离心，依次使用甲苯、无水乙醇、去离子水清洗，低温冻干后制得PSC-NH2；多肽序列枝接：配置2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，调整pH至5.5，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、多肽序列、PSC-NH2，磁力搅拌下室温反应24h，使用去离子水清洗，低温冻干后制得多肽改性PSC；
(3)支架外层部分的制备:将步骤(2)的多肽改性PSC颗粒与水凝胶材料复合，水凝胶浓度为1-5mg/ml，多肽改性PSC与水凝胶的质量体积比范围是0.5-5mg/ml，超声震荡混匀后注入模具中，得到锥形中空的外层支架，尖端外径为0.6-1.0mm,内径0.3-0.5mm,锥度0.04-0.06，长度10-15mm；真空冷冻干获得外层支架；
(4)支架内层部分的制备：将浓度范围为1-5mg/ml水凝胶材料注入步骤(3)中获得的外层支架内，真空冷冻干；
(5)双层支架的交联完成：将步骤(4)中获得的支架浸泡于0.1％-0.5％戊二醛交联剂中，使内外层支架交联形成具有双层结构的复合支架。
其中，所述步骤(2)的多肽序列为RGDS多肽或转化生长因子TGF-β结合多肽或肝素结合多肽。
其中，所述步骤(3)的水凝胶材料为明胶、胶原或壳聚糖。水凝类材料，如胶原、明胶等，拥有较好的生物相容性，制备简单，能够模拟天然细胞外基质，且来源丰富而被广泛应用于组织工程。水凝胶类材料无生物矿化诱导作用，能为牙髓软组织的再生提供支持作用，不会进一步诱导再生的牙髓组织分化形成功能性牙本质。冷冻铸造和冷冻干燥法制得的多孔水凝胶支架其孔径和孔隙率可控，通过对交联剂的种类和交联时间的调控能够进一步控制材料的弹性模量，不仅利于神经、血管生成，还能够进一步的药物装载等，可作为诱导牙髓软组织再生的合适材料。
其中，所述步骤5)获得的支架上有若干个孔隙，孔隙大小为100-500微米。
本发明的优点在于：
(1)本发明制得的双层支架材料具有分层诱导能力，分别诱导软硬组织的形成，符合牙髓牙本质复合结构的特点；内层结构可诱导根尖周来源的干细胞定向迁移，增强髓腔中央新生结缔组织的血管化甚至神经化，促进牙髓样软组织的生成；外层结构可进一步诱导干细胞的成牙本质向定向分化，诱导牙本质样硬组织的生成；这种利用双层结构，诱导不同组织形态特点的牙体复合结构的再生的支架材料，是现有单一性状材料无法实现的。
(2)外层含有的多肽改性生物活性陶瓷材料将是针对牙本质再生设计制备的生物活性诱导材料：在前期研究已经证实生物活性玻璃是具有成牙本质向分化和矿化作用的良好生物活性材料，对生物活性玻璃颗粒表面进行氨基化修饰，以枝接具有诱导干细胞迁移、黏附的多肽片段，或诱导成牙本质向分化的诱导因子，制备出针对牙本质再生需求，具有诱导干细胞成牙本质向分化的生物活性玻璃颗粒；
(3)该复合支架具有合适锥形的预成3D支架材料，能够良好顺应根管形态，方便应用，具有临床应用前景。
附图说明
图1为双层复合支架的结构图；
图2为图1的纵向剖视图；
图3-1为实例1支架内层部分SEM图(电子扫描显像图)；
图3-2为实例1支架外层部分SEM图(电子扫描显像图)
图4-1为实例1支架内层部分细胞矿化结节染色(冯科萨染色图)；
图4-2为实例1支架外层部分细胞矿化结节染色(冯科萨染色图)。
图中，1、生物活性玻璃；2、水凝胶；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
参见图1-4，
实施例1：
(1)制备生物活性玻璃PSC颗粒：该实例中制备的生物活性玻璃成分为：P2O510.8mol％,SiO254.2mol％和CaO35mol％；将植酸(50wt％)3ml，正硅酸乙酯10.95ml，四水硝酸钙7.47g，n水/正硅酸乙酯＝4，n乙醇/正硅酸乙酯＝8混合制成前驱体溶胶溶液，放置到30℃下凝胶25天，55℃陈化5天除去其中的乙醇和少量水；100℃烧结1周去除剩余的溶剂；600℃烘箱1小时后得到生物活性玻璃PSC颗粒；
(2)RGDS多肽改性生物活性玻璃：取200mg PSC粉末，以100ml无水甲苯作为分散剂，二者混合后超声震荡15min辅助分散，加入3ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，于氮气保护下80℃加热回流反应24h，离心，依次使用甲苯、无水乙醇、去离子水清洗，低温冻干后制得PSC-NH2；多肽序列枝接：配置2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，调整pH至5.5，依次加入76.68mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、11.51mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、20mg RGDS多肽序列、200mg PSC-NH2，磁力搅拌下室温反应24h，使用去离子水清洗，低温冻干后制得多肽改性PSC；
(3)外支架外层部分的制备:将改性后PSC颗粒与浓度为3mg/ml的明胶胶溶液复合，PSC颗粒与明胶溶液的质量体积比是0.5mg/ml，超声震荡混匀后注入模具中，得到锥形中空的外层支架，尖端外径为1.0mm，内径0.5mm,锥度0.06，长度15mm；真空冷冻干获得支架外层部分；
(4)支架内层部分的制备：将浓度为3mg/ml明胶材料注入外层支架内，真空冷冻干；
(5)双层支架的交联完成：将步骤(4)中获得的支架浸泡于0.1％戊二醛交联剂中交联24小时，使内外层支架交联形成具有双层结构的复合支架。
实施例1的生物学评价：
将实施例1中得到的支架与人骨髓间充质细胞共培养，2周后进行扫描电镜和矿化结节冯科萨染色观察，结果见图3和图4。可见材料支架内层及外层均具有较好的细胞相容性，添加有生物活性玻璃PSC的支架外层能够显著促进矿化的生成。
如上所述，便可较为充分的实现本发明。以上所述仅为本发明的较为合理的实施实例，本发明的保护范围包括但并不局限于此，本领域的技术人员任何基于本发明技术方案上非实质性变性变更均包括在本发明包括范围之内。

Claims (4)

1.一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以植酸为前驱体合成的PSC的制备：PSC以植酸作为磷的前驱体，加入乙醇和水中混匀；在磁力搅拌下，加入正硅酸乙酯，四水硝酸钙，继续搅拌直至形成透明、均一的溶胶；10-35℃室温下静置10-50天形成湿凝胶；湿凝胶置于25-60℃烘箱中陈化2-7天，然后在70-120℃下再干燥1-2周，形成干凝胶；将干凝胶研磨后置入高温炉400-700℃热处理1-5小时，过筛后得到即为植酸制备的生物活性玻璃，即PSC；所得磷硅酸基玻璃中的P2O5的摩尔百分含量为0.5-68％，SiO2的摩尔百分含量为13.2-99％，CaO的摩尔百分含量为0.5-80％，颗粒大小为100-500微米；
(2)PSC的多肽改性：取PSC粉末，以无水甲苯作为分散剂，二者混合后超声震荡辅助分散，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于氮气保护下80℃加热回流反应24h，离心，依次使用甲苯、无水乙醇、去离子水清洗，低温冻干后制得PSC-NH2；多肽序列枝接：配置2-吗啉乙磺酸缓冲液，调整pH至5.5，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、多肽序列、PSC-NH2，磁力搅拌下室温反应24h，使用去离子水清洗，低温冻干后制得多肽改性PSC；
(3)支架外层部分的制备:将步骤(2)的多肽改性PSC颗粒与水凝胶材料复合，水凝胶浓度为1-5mg/ml，多肽改性PSC与水凝胶的质量体积比范围是0.5-5mg/ml，超声震荡混匀后注入模具中，得到锥形中空的外层支架，尖端外径为0.6-1.0mm,内径0.3-0.5mm,锥度0.04-0.06，长度10-15mm；真空冷冻干获得外层支架；
(4)支架内层部分的制备：将浓度范围为1-5mg/ml水凝胶材料注入步骤(3)中获得的外层支架内，真空冷冻干；
(5)双层支架的交联完成：将步骤(4)中获得的支架浸泡于0.1％-0.5％戊二醛交联剂中，使内外层支架交联形成具有双层结构的复合支架。
2.根据权利要求1所述的一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法，其特征在于：所述步骤2)的多肽序列为RGDS多肽或转化生长因子TGF-β结合多肽或肝素结合多肽。
3.根据权利要求1所述的一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法，其特征在于：所述步骤3)的水凝胶材料为明胶、胶原或壳聚糖。
4.根据权利要求1所述的一种诱导牙髓牙本质组织再生的双层复合支架制备方法，其特征在于：所述步骤5)获得的支架上有若干个孔隙，孔隙大小为100-500微米。
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