ES2321915T3 - Composiciones de fibroina y metodos para preparar las mismas. - Google Patents

Abstract

Uso de una disolución o suspensión de fibroína en la fabricación de un medicamento que va a administrarse a un sitio de construcción tisular en una cantidad eficaz para estimular la formación de tejido.

Description

Composiciones de fibroína y métodos para preparar las mismas.

Antecedentes

Esta descripción se refiere al campo de la reparación ósea y tisular y en particular al uso de fibroína según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para la reparación ósea y tisular, a una composición que comprende fibroína, según la reivindicación 10, y a métodos de preparación de una composición de este tipo.

La sustitución y la reparación de hueso y de otros tejidos tras una lesión requieren con frecuencia el uso de procedimientos quirúrgicos. Cada año se implantan más de 300.000 prótesis de cadera en los Estados Unidos y en Europa. Adicionalmente, el 10% de la población padece enfermedad periodontal y el 30% requerirá un implante dental durante su vida. Otros procedimientos quirúrgicos incluyen reparación de cartílagos y cirugía plástica de tejidos blandos. Por tanto, es deseable crear materiales de estructura de base para la reparación o reconstrucción de tejidos, particularmente materiales inyectables que pueden eliminar la necesidad de muchos procedimientos invasivos. Tales materiales deben ser biocompatibles, es decir, no citotóxicos ni que provoquen una reacción adversa en el organismo y deben ser preferiblemente bioactivos, es decir, que proporcionen las señales de desarrollo necesarias para la movilización de la actividad celular requerida para la formación de tejidos. Son además preferiblemente reabsorbibles y pueden resistir los esfuerzos impuestos por la actividad diaria durante la reparación.

Se han sugerido varios enfoques diferentes para estructuras de base para reparación tisular. Los materiales actualmente disponibles para la reparación de tejidos duros tales como hueso desmineralizado, hidroxiapatita, fosfatos tricálcicos y otros materiales inorgánicos no son tan eficaces como las estructuras de base bioactivas derivadas de manera biológica. Se ha usado ácido hialurónico como material de estructura de base tal como se da a conocer en la patente estadounidense nº 5.939.323. Otro enfoque ha sido usar materiales a base de colágeno tal como se da a conocer en la patente estadounidense nº 4.490.984 y en la patente estadounidense nº 5.480.644. Estos materiales, sin embargo, parecen estar limitados en su variedad de posibles usos y aplicaciones debido a las escasas propiedades mecánicas, a tasas de degradación impredecibles y, para el colágeno, al riesgo de reacciones inmunogénicas y peligros relacionados con una posible contaminación.

Se han sugerido membranas, películas y materiales textiles que contienen fibroína, un componente de proteína de la seda de gusanos de seda, como materiales de sustrato para el crecimiento de órganos y tejidos animales. En particular, la solicitud PCT número WO 01/25403 describe la formación de membranas de fibroína fundida en disolución acuosa. Las membranas se fundieron en recipientes a los que se añadían el medio de crecimiento y diversos tipos de células, y la membrana de fibroína soportaba el crecimiento de células tales como osteoblastos, células epiteliales y hepatocitos. También se dan a conocer películas y membranas de fibroína por Tsukada et al., en Journal of Polymer Science: Parte B: Polymer Physics 32: 961-968, 1994; y por Motta et al., en "Third International Symposium on Frontiers in Biomedical Polymers Including Polymer Therapeutics From Laboratory to Clinical Practice", Abstract, Shigha Japón, mayo de 1999. La solicitud PCT WO 02/29141 describe la formación de materiales textiles no tejidos de fibroína preparados tratando capullos de fibroína con ácido fórmico. Los materiales textiles no tejidos de fibroína pueden usarse para cultivar células tales como queratinocitos y fibroblastos. Una desventaja de usar tales membranas, películas o materiales textiles no tejidos de fibroína como estructuras de base para la reparación tisular in vivo es que se requerirían procedimientos quirúrgicos invasivos con el fin de colocar los materiales en el sitio que se va a reparar.

Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad de materiales de estructura de base bioactivos para su uso tanto in vitro como in vivo, particularmente materiales que sean biocompatibles, bioactivos y reabsorbibles. Además, sigue habiendo una necesidad de materiales de estructura de base bioactivos que se apliquen fácilmente al sitio que va a repararse, preferiblemente sin el uso de procedimientos quirúrgicos invasivos.

Sumario de la invención

Las tratadas anteriormente y otras desventajas y deficiencias de la técnica anterior se superan o palian mediante el uso de una disolución o suspensión de fibroína en la fabricación de un medicamento que va a administrarse a un sitio de construcción tisular en una cantidad eficaz para estimular la formación de tejido.

En una realización particular, la disolución o suspensión de fibroína anterior incluye material particulado de formación de poros, en particular partículas de núcleo/corteza.

Las disoluciones y suspensiones de fibroína son biocompatibles, bioactivas y reabsorbibles. En una característica particularmente ventajosa, las disoluciones o suspensiones de fibroína pueden aplicarse a un sitio deseado mediante inyección o implantación, lo que minimiza el uso de procedimientos quirúrgicos invasivos.

También se da a conocer una composición que comprende una suspensión de fibroína y un material particulado de formación de poros que comprende partículas de núcleo/corteza.

La composición según la presente invención puede prepararse mediante el método según las reivindicaciones 23 y 24.

También se da a conocer un método para la formación de un gel de fibroína inyectable y bioactivo, que comprende tratar una disolución de fibroína con un agente que comprende calor, una enzima proteolítica, un polímero biocompatible, o combinaciones que comprenden uno o más de los agentes anteriores y que comprende además añadir un material particulado de formación de poros que incluye partículas de núcleo/corteza.

Las tratadas anteriormente y otras características y ventajas se apreciarán y entenderán por los expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada y los dibujos.

Breve descripción de los dibujos

Con referencia ahora a los dibujos a modo de ejemplo en los que elementos similares están enumerados de manera similar en las diversas figuras:

La figura 1 es un diagrama esquemático de una estructura de base de múltiples componentes en el proceso de reparación tisular.

La figura 2 es una micrografía electrónica de barrido ambiental de una suspensión de fibroína preparada añadiendo una disolución acuosa de ácido cítrico a una disolución acuosa de fibroína.

La figura 3 es una micrografía electrónica de barrido ambiental de una suspensión de fibroína preparada añadiendo glicerol a disoluciones acuosas de fibroína.

La figura 4 es una micrografía óptica de una suspensión de material compuesto de fibroína que comprende partículas de núcleo/corteza de hidroxiapatita/polilactida incrustadas en una matriz de fibroína tras secarse el material compuesto a temperatura ambiente.

La figura 5 es una micrografía óptica de una suspensión de material compuesto de fibroína que comprende partículas de núcleo/corteza de hidroxiapatita/polilactida incrustadas en una matriz de fibroína tras secarse el material compuesto a temperatura ambiente, a mayor ampliación.

La figura 6 es una micrografía óptica de una suspensión de material compuesto de fibroína que comprende partículas de núcleo/corteza de hidroxiapatita/polilactida incrustadas en una matriz de fibroína tras liofilizarse el material compuesto.

La figura 7 es una micrografía óptica de una suspensión de material compuesto de fibroína que comprende partículas de núcleo/corteza de hidroxiapatita/polilactida incrustadas en una matriz de fibroína tras liofilizarse el material compuesto, a mayor ampliación.

La figura 8 compara las histologías tras un mes de implantación en una cavidad perforada en el fémur de un conejo y rellena mediante una suspensión (A) de fibroína inyectable con la de una cavidad vacía usada como control (B).

La figura 9 compara las histologías tras un mes de implantación en una cavidad perforada en el fémur de un segundo conejo rellena mediante una suspensión (A) de fibroína inyectable con la de una cavidad vacía usada como control (B).

La figura 10 muestra la superficie de contacto entre el hueso viejo y el hueso nuevo formado en la cavidad rellena con suspensión de fibroína del implante ilustrado en la figura 9.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La fibroína es un polipéptido conocido que contiene una combinación de 18 aminoácidos diferentes, constituyendo glicina, alanina, serina y tirosina aproximadamente el 90% de la cadena polipeptídica. Generalmente se acepta que la fibroína consiste en dos cadenas principales unidas mediante un puente disulfuro y que tienen pesos moleculares de aproximadamente 350.000 daltons (cadena H) y 25.000 daltons (cadena L). Los estudios disponibles de fibroína muestran que la estructura y la morfología de productos fabricados derivados de fibroína dependen sumamente de las condiciones de procesamiento usadas para formarlos. Se ha descubierto de manera ventajosa en el presente documento que pueden producirse suspensiones de fibroína novedosas a partir de disoluciones de fibroína usando una variedad de técnicas, y que las suspensiones de fibroína producidas de ese modo tienen utilidad en la construcción tisular, incluyendo la formación de tejido en sitios normales en el organismo (es decir, sitios sin lesión) y sitios que necesitan reparación y/o reconstrucción debido, por ejemplo, a una lesión o envejecimiento. Tal como se usa en el presente documento, una "disolución de fibroína" se refiere a una composición que tiene sustancialmente una fase, es decir, una composición que comprende un disolvente en el que la fibroína está sustancialmente disuelta. La fibroína está sustancialmente disuelta cuando más del 95%, preferiblemente más del 98% y lo más preferiblemente más del 99% de la fibroína, en peso, está en disolución. Además, tal como se usa en el presente documento, una "suspensión de fibroína" se refiere a una composición que tiene dos o más fases (es decir, un material de múltiples fases), con al menos una fase que comprende un disolvente y al menos una fase que comprende fibroína. Sin restringirse a la teoría, las suspensiones de fibroína pueden existir en una variedad de formas, por ejemplo, en forma de un coloide, una emulsión, como micelas, un sol o un gel.

Para los fines de describir las suspensiones de fibroína en el presente documento, se hará referencia a "oclusiones de fibroína", "geles de fibroína", "cremas de fibroína" y "pastas de fibroína," que pueden caracterizarse por características físicas fácilmente observables tales como el aspecto y las viscosidades relativas. "Oclusión de fibroína" se refiere a una suspensión de fibroína que es fluida en una superficie de nivel. Las oclusiones son con frecuencia turbias, es decir, muestran cierta opacidad. Por fluido en una superficie de nivel, se quiere decir que una muestra de un centímetro cúbico de la suspensión se deformará esencialmente de manera inmediata cuando se deposite en una superficie de nivel horizontal. Sin restringirse a la teoría, las oclusiones de fibroína pueden estar en forma de coloides, particularmente soles, que comprenden dispersiones de partículas sólidas que tienen dimensiones de 10^{-9} a 10^{-6} metros en una fase continua del disolvente.

Un "gel de fibroína" tal como se usa en el presente documento se refiere a una suspensión de fibroína que tiene características físicas similares al gel, por ejemplo, plasticidad, elasticidad o cierto grado de rigidez. Los geles pueden ser opacos o translúcidos, dependiendo del método usado para formar el gel. A diferencia de una oclusión, un gel no fluye fácilmente cuando se coloca en una superficie de nivel.

Un gel, sin embargo, puede fluir o deformarse cuando se aplican calor o tensión mecánica, tal como presión, es decir, cuando el gel es reversible. Sin restringirse a la teoría, un gel de fibroína puede contener una red tridimensional de fibroína dispersa en el disolvente.

Una "crema de fibroína" tal como se usa en el presente documento se refiere a una suspensión de fibroína que es más viscosa que una oclusión de fibroína. Con es frecuencia blanca y es sustancialmente no fluida en una superficie de nivel. Por sustancialmente no fluido en una superficie de nivel, se quiere decir que una muestra de un centímetro cúbico de la crema de fibroína no se deformará de manera apreciable en el plazo de un minuto de depositarse en una superficie de nivel horizontal. Al igual que los geles de fibroína, las cremas de fibroína pueden deformarse cuando se aplican calor o tensión mecánica al material.

Una "pasta de fibroína" tal como se usa en el presente documento se refiere a una suspensión de fibroína que es sumamente viscosa y no fluida cuando se coloca en una superficie horizontal. Por no fluido en una superficie de nivel, se quiere decir que una muestra de un centímetro cúbico de la pasta de fibroína no se deformará de manera apreciable en el plazo de una hora de depositarse en una superficie de nivel horizontal. Sin embargo, la pasta es deformable con presión mecánica.

De manera alternativa, los diversos tipos de suspensiones de fibroína pueden describirse basándose en la inyectabilidad de la suspensión a través de una abertura (es decir, de una aguja) de un tamaño particular. Una oclusión o un gel de fibroína es fácilmente inyectable a mano a través de una aguja de pequeña abertura tal como una aguja de jeringuilla de calibre 20 que tiene un diámetro de aproximadamente 584 micrómetros. La crema de fibroína es más viscosa, y por tanto es fácilmente inyectable a mano a través de una aguja de jeringuilla de orificio más grande, es decir, una aguja de calibre 18 que tiene un diámetro de aproximadamente 838 micrómetros. Las pastas no son fácilmente inyectables a mano excepto a través de agujas de jeringuilla de orificio muy grande, es decir, aquéllas que tienen un diámetro de más de aproximadamente 2 milímetros. Ha de entenderse que la clasificación de una suspensión de fibroína como una oclusión, un gel, una crema o una pasta es solamente por conveniencia en la descripción del uso de las suspensiones de fibroína.

Las suspensiones de fibroína pueden formarse in vitro o in vivo. La formación in vitro de suspensiones de fibroína puede comprender tratar una disolución de fibroína con un agente eficaz para formar la suspensión, tal como calor, enzimas proteolíticas, o un polímero biocompatible, o sus combinaciones. Se sabe que las suspensiones de fibroína se forman también in vivo tras la inyección u otra administración de una disolución de fibroína a un animal. Sin restringirse a la teoría, se cree que tras la administración a un sitio en el cuerpo de un animal, una disolución de fibroína puede disipar rápidamente el agua en exceso, produciendo de ese modo una suspensión en forma de, por ejemplo, un gel. Las suspensiones de fibroína pueden experimentar también cambios de forma in vivo. Por ejemplo, una oclusión de fibroína, tras la administración in vivo a un sitio en el cuerpo de un animal, puede experimentar una transición para formar un gel de fibroína.

Una fuente conveniente de fibroína son los capullos del gusano de seda Bombyx mori que contienen tanto proteínas de fibroína como de sericina. Las sedas con proteínas fibrosas producidas por arañas y diferentes insectos, de los que los más conocidos son los gusanos de seda (en particular el gusano de seda Bombyx mori). Las fibras de seda se han usado como suturas, pero se ha encontrado que las suturas de seda trenzadas producen con frecuencia una reacción no inmunológica frente a cuerpos extraños, produciendo granulomas incluso años después de la intervención quirúrgica (Kurosaki et al., Nippon Ika Daigaku Zasshi 66: 41-44, 1999). Sin embargo, se ha confirmado que la reacción no inmunológica frente a cuerpos extraños observada se produce por la presencia de sericina en la seda nativa, y que la fibroína pura no provoca una respuesta inmunológica.

Preferiblemente, se purifica la fibroína para eliminar toxinas u otras sustancias tales como sericina que pueden producir reacciones adversas en el organismo. Puede eliminarse gran parte de la sericina, por ejemplo, mediante desgomado, es decir lavando en carbonato de sodio con o sin dodecilsulfato de sodio a 98ºC.

La fibroína purificada puede disolverse entonces en un disolvente tal como una disolución acuosa de bromuro de litio que contiene aproximadamente el 10% en peso de fibroína por volumen unitario. La disolución de fibroína puede contener opcionalmente otros componentes tales como tampones y otros aditivos que no afectan significativamente de manera adversa a la estructura o la estabilidad de la fibroína. La fibroína puede purificarse de manera adicional preferiblemente hasta más de aproximadamente el 90%, más preferiblemente más de aproximadamente el 95% y lo más preferiblemente más de aproximadamente el 99%. El bromuro de litio se elimina mediante diálisis frente a agua destilada y otras impurezas pueden eliminarse mediante filtración. Una vez purificada, la fibroína puede liofilizarse para dar un polvo y almacenarse. Las suspensiones de fibroína pueden formarse entonces a partir de una disolución de fibroína pura tratando la disolución con calor, enzimas proteolíticas o un polímero biocompatible o su
combinación.

Según una primera realización, la presente invención se refiere al uso de una disolución o suspensión de fibroína en la fabricación de un medicamento que va a administrarse a un sitio de construcción tisular en una cantidad eficaz para estimular la formación de tejido. Preferiblemente, el medicamento se administra mediante inyección o implantación. Aún más preferiblemente, la suspensión de fibroína, tras la inyección in vivo forma una estructura de base porosa.

La suspensión de fibroína puede estar en forma de una oclusión, un gel, una crema o una pasta.

Preferiblemente, la oclusión o el gel de fibroína es inyectable a través de una abertura que tiene un diámetro de aproximadamente 584 micrómetros, la crema de fibroína es inyectable a través de una abertura que tiene un diámetro de aproximadamente 838 micrómetros y la pasta de fibroína es inyectable a través de una abertura que tiene un diámetro de más de aproximadamente 2 milímetros.

La disolución o suspensión de fibroína puede incluir además al menos un material particulado de formación de poros.

Preferiblemente, la disolución o suspensión de fibroína incluye además al menos un agente fisiológicamente activo, escogido del grupo que comprende: células, antibióticos, proteínas morfogenéticas óseas, compuestos que estimulan la regeneración ósea, compuestos que estimulan el crecimiento tisular, compuestos que estimulan la cicatrización o una combinación que comprende uno o más de los agentes anteriores.

Preferiblemente, la fibroína comprende la fibroína del gusano de seda Bombyx mori.

En una segunda realización, la invención se refiere a una composición que comprende una suspensión de fibrina y un material particulado de formación de poros que comprende partículas de núcleo/corteza. Preferiblemente, las partículas de núcleo/corteza comprenden al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de calcio, una fuente de fosfato y una capa reactiva.

Aún más preferiblemente, la corteza comprende un polímero biodegradable.

Preferiblemente, el material particulado de formación de poros comprende una hidroxiapatita, un fosfato tricálcico, un material cerámico, un coral o una combinación que comprende uno o más de los materiales anteriores.

Aún más preferiblemente, el núcleo comprende una hidroxiapatita, un material a base de fosfato de calcio, una carga de vidrio reabsorbible o una combinación que comprende uno o más de los materiales anteriores, y la corteza comprende poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), policaprolactona, poli(carbonato de trimetilo), diacrilatos de polietilenglicol, polianhídridos, poliortoésteres; polifosfacinas, poliacetales, poliésteres, poliureas, policarbonatos, poliuretanos, poli(alfa-hidroxiácidos), poliamidas, poliaminoácidos, un copolímero, o una combinación que comprende uno o más de los polímeros biodegradables anteriores.

La composición de la invención puede estar en forma de una oclusión, un gel, una crema o una pasta y la suspensión de fibroína puede ser inyectable o implantable.

Según una realización preferida de la presente invención, la suspensión de fibroína de la composición comprende además un agente fisiológicamente activo, comprendiendo el agente fisiológicamente activo células, antibióticos, proteínas morfogenéticas óseas, compuestos que estimulan la regeneración ósea, compuestos que estimulan la cicatrización, o una combinación que comprende uno o más de los agentes anteriores.

Pueden usarse diversos aditivos para mejorar la eficacia de las disoluciones y suspensiones de fibroína, por ejemplo, agentes fisiológicamente activos que tienen una actividad fisiológica tal como una actividad terapéutica o de diagnóstico. Por consiguiente, un agente activo puede incluir un marcador detectable (por ejemplo, un marcador radiactivo) que es útil para identificar las ubicaciones del agente liberado in vivo. Los agentes activos incluyen también agentes terapéuticos que son útiles para tratar una enfermedad o un estado. Los agentes fisiológicamente activos incluyen, por ejemplo, antibióticos u otros compuestos que inhiben la infección; agentes terapéuticos para tratar la osteoporosis, otros factores que actúan sobre el hueso y el esqueleto, proteínas morfogenéticas óseas (BMP) y otras citocinas que estimulan la regeneración ósea o la cicatrización. El agente fisiológicamente activo puede ser también una célula, por ejemplo una célula tomada de un sitio del paciente y cultivada en la suspensión de fibroína.

Los antibióticos a modo de ejemplo incluyen tetraciclina, aminoglicósidos, penicilinas, cefalosporinas, fármacos de sulfonamida, succinato sódico de cloranfenicol, eritromicina, vancomicina, lincomicina, clindamicina, nistatina, anfotericina B; amantidina, idoxuridina, ácido p-aminosalicílico, isoniazida, rifampina, antinomicina D, mitramicina, daunomicina, clorexidina, adriamicina, bleomicina, vinblastina, vincristina, procarbazina e imidazol carboxamida.

Los agentes terapéuticos a modo de ejemplo para tratar la osteoporosis y otros factores que actúan sobre el hueso y el esqueleto incluyen calcio, alendronato, péptido GLa óseo, hormona paratiroidea y sus fragmentos activos, péptido de proliferación y formación óseas relacionado con la histona H4 y mutaciones, derivados y análogos de los mismos.

Las citocinas a modo de ejemplo incluyen factores de crecimiento transformante (TGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), péptidos activadores de tejido conjuntivo (CTAP), factores osteogénicos y análogos, fragmentos y derivados biológicamente activos de tales factores de crecimiento. Se prefieren particularmente miembros de la familia de supergenes del factor de crecimiento transformante (TGF), que son proteínas reguladoras multifuncionales. Los miembros de la familia de supergenes de TGF incluyen los factores de crecimiento transformante beta (por ejemplo TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3); proteínas morfogenéticas óseas (por ejemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); factores de crecimiento de unión a heparina (por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de tipo insulina (IGF)); inhibinas (por ejemplo, inhibina A, inhibina B); factores de diferenciación del crecimiento (por ejemplo, GDF-1); y activinas (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB). Los factores de crecimiento pueden aislarse a partir de fuentes nativas o naturales, tales como a partir de células de mamífero, o pueden prepararse sintéticamente, tal como mediante técnicas de ADN recombinante o mediante diversos procesos químicos. Además, pueden usarse análogos, fragmentos o derivados de estos factores, siempre que muestren al menos parte de la actividad biológica de la molécula nativa. Por ejemplo, pueden prepararse análogos mediante la expresión de genes alterados mediante mutagénesis específica de sitio u otras técnicas de ingeniería genética.

El agente fisiológicamente activo puede ser también una célula diferenciada o no diferenciada. Pueden suministrarse células madre mesenquimatosas, por ejemplo, para producir células del mismo tipo que el tejido al que se suministran. Las células madre mesenquimatosas son no diferenciadas y por tanto pueden diferenciarse para formar diversos tipos de nuevas células debido a la presencia de un agente activo o a los efectos (químicos, físicos, etc.) del entorno del tejido local. Los ejemplos de células madre mesenquimatosas diferenciadas incluyen osteoblastos, condrocitos y fibroblastos. Los osteoblastos pueden suministrarse al sitio de un defecto óseo para producir nuevo hueso; los condorcitos pueden suministrarse al sitio de un defecto de cartílago para producir nuevo cartílago; los fibroblastos pueden suministrarse para producir colágeno en cualquier parte que se necesite nuevo tejido conjuntivo; etc. Las células o los genes pueden ser de origen alogénico o xenogénico. Por ejemplo, las células pueden proceder de una especie distinta de la especie huésped que se ha modificado genéticamente.

Los agentes fisiológicamente activos pueden añadirse simplemente a las disoluciones y suspensiones de fibroína o pueden unirse covalentemente a otro componente. De manera alternativa, los agentes fisiológicamente activos pueden añadirse en forma de liberación controlada. Una formulación de liberación controlada contiene el agente activo disperso o encapsulado en un polímero de degradación lenta, no tóxico, no antigénico tal como copoli(ácido láctico/glicólico), tal como se describe por Kent et al. en la patente estadounidense nº 4.675.189. Formulaciones de liberación lenta adicionales serán evidentes para el experto. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978, y R. W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987.

En otra realización, la suspensión de fibroína puede comprender inclusiones orgánicas, inorgánicas y/o de proteínas de composición química y tamaño modificados mediante ingeniería que afectan a factores tales como porosidad y biodegradación. En una realización preferida, la suspensión de fibroína puede comprender además partículas tales como partículas de núcleo/corteza que crean porosidad adicional en el gel, formando de ese modo una estructura de base tras la inyección.

Partículas orgánicas o inorgánicas a modo de ejemplo que pueden ayudar en el crecimiento y la formación del hueso incluyen, por ejemplo, hidroxiapatita, fosfato tricálcico, un material cerámico y partículas derivadas de animales marinos tales como corales.

Una partícula de formación de poros preferida es una partícula de núcleo/corteza en la que un núcleo inorgánico está rodeado por una corteza orgánica biodegradable. Tales partículas pueden servir como una estructura de soporte temporal y como un sustrato interno para conformar la estructura de base. La biodegradación controlada de las cortezas puede proporcionar porosidad adicional a la estructura de base de fibrina. Las partículas de núcleo/corteza se describirán en detalle más adelante.

El núcleo preferido es un núcleo inorgánico. La composición, el tamaño y la forma del núcleo inorgánico pueden variarse para cumplir con las demandas de diferentes aplicaciones. Por ejemplo, el núcleo puede ser hidroxiapatita, fosfato tricálcico o partículas derivadas de animales marinos, tales como corales, para ayudar en el crecimiento óseo. Los núcleos pueden tener dimensiones de desde aproximadamente 1 nanómetro hasta aproximadamente 500 micrómetros en su diámetro mayor y pueden estar en forma de esferas, placas, fibras y similares.

Puede disponerse una capa reactiva opcional sobre el núcleo para potenciar la adhesión del núcleo a la corteza de polímero. Las capas reactivas adecuadas dependen de la composición del núcleo y de la corteza, y se conocen en la técnica. Una clase particularmente útil de compuestos incluye titanatos, zirconatos y silanos reactivos, por ejemplo, gamma-glicidoxipropiltrietoxisilano.

La corteza puede comprender al menos un polímero biodegradable. La composición y el peso molecular del polímero o polímeros pueden escogerse para obtener una tasa apropiada de biodegradación tal como se describe más adelante. Composiciones de polímero biodegradable adecuadas para la corteza comprenden uno o más poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), policaprolactona, poli(carbonato de trimetilo), diacrilatos de polietilenglicol, polianhídridos, poliortoésteres, polifosfacinas, poliacetales, poliésteres, poliureas, policarbonatos, poliuretanos, poli(alfa-hidroxiácidos), poliamidas; poliaminoácidos, un copolímero o una combinación que comprende uno o más de los polímeros biodegradables anteriores.

El polímero biodegradable puede ser o bien un polímero formado previamente o bien puede polimerizarse en el momento de depositarlo en el núcleo. La capa de polímero biodegradable puede unirse a la capa reactiva o al propio núcleo mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo preparando una suspensión de las partículas de núcleo en una disolución orgánica diluida de los monómeros o el polímero reactivos. En una realización, los monómeros o los polímeros de la corteza están modificados químicamente para incluir grupos terminales tales como péptidos que son interactivos con las células dentro del organismo, por ejemplo, grupos terminales que son activos en la estimulación de la reparación tisular o de la regeneración ósea. Tales grupos terminales pueden incluir, por ejemplo, péptidos que contienen secuencias de arginina-glicina-ácido aspártico, moléculas señal y muchos de los agentes fisiológicamente activos descritos previamente tales como, por ejemplo, proteínas morfogenéticas óseas.

La corteza biodegradable puede seleccionarse para proporcionar un equilibrio entre la estabilidad mecánica temporal de la estructura de base y el desarrollo de porosidad interna adicional. La razón en volumen de los componentes de núcleo/corteza puede variar ampliamente desde aproximadamente 95/5 hasta 5/95, con una razón de núcleo/corteza preferida de 20/80.

Tras la adsorción de los polímeros en el núcleo, puede añadirse opcionalmente un agente estabilizante para los sólidos suspendidos. La suspensión de núcleo/corteza puede mezclarse con una disolución acuosa diluida que contiene una pequeña cantidad, por ejemplo desde aproximadamente el 0,5% en peso hasta aproximadamente el 3% en peso, de polietilenglicol o poli(alcohol vinílico) de alto peso molecular.

Cuando las partículas de núcleo/corteza se forman como una suspensión, la suspensión puede mezclarse con una fuente de calcio y opcionalmente con una fuente de fosfato, para formar un recubrimiento en el exterior de la corteza de polímero de las partículas formadas. Precursores a modo de ejemplo para proporcionar la fuente de calcio y de fosfato opcional son una disolución acuosa de alcohol tamponada de una sal de calcio (por ejemplo, acetato de calcio), una sal de calcio y un éster de ácido fosfórico, o un fluido de plasma formulado. Este recubrimiento exterior dopado con iones calcio puede servir como la superficie de contacto con la matriz de fibroína bioactiva.

Las partículas de núcleo/corteza resultantes están en una suspensión relativamente estable en la fase acuosa. Tras el secado, por ejemplo, el liofilizado, las partículas pueden molerse ligeramente para formar un polvo de núcleo/corteza. Una vez formado, el polvo de núcleo/corteza puede mezclarse entonces con la suspensión de fibroína. Puede ajustarse el contenido en agua de la mezcla para mantener la fluidez. Las cantidades relativas de partículas y suspensión de fibroína pueden variar dependiendo de la aplicación particular. Normalmente, la suspensión puede contener de aproximadamente el 10% en volumen a aproximadamente el 50% en volumen (porcentaje en volumen), preferiblemente de aproximadamente el 30% en volumen a aproximadamente el 50% en volumen de la fase de material particulado.

En una tercera realización, la presente invención se refiere a un método para la formación de un gel de fibroína inyectable y bioactivo, que comprende tratar una disolución de fibroína con un agente que comprende calor, una enzima proteolítica, un polímero biocompatible para una combinación que comprende uno o más de los agentes anteriores.

En una realización, las suspensiones de fibroína pueden producirse mediante el tratamiento térmico de una disolución de fibrina. Por ejemplo, para producir un gel, la disolución de fibroína puede mantenerse a aproximadamente -20ºC durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, después calentarse hasta una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 50ºC. La modificación de las condiciones de tratamiento térmico da como resultado suspensiones de diversos atributos tal como se describió anteriormente, que pueden seleccionarse por un experto habitual en la técnica basándose en la aplicación particular.

En otra realización, puede producirse una suspensión de fibroína tratando la disolución de fibroína con enzimas proteolíticas que son específicas para la escisión entre aminoácidos particulares. Tales enzimas proteolíticas incluyen, pero no se limitan a, la proteasa de Streptomyces griseus, papaína, quimiotripsina, o una combinación que comprende una o más de las enzimas proteolíticas anteriores. Sin restringirse a la teoría, se supone que el tratamiento con enzimas proteolíticas puede producir una suspensión reduciendo el peso molecular promedio del polímero de fibroína. Pueden seleccionarse secuencias de aminoácidos específicas para producir fragmentos que tienen pesos moleculares y secuencias de aminoácidos deseados. Los tamaños de los fragmentos pueden adaptarse para que cumplan demandas específicas de aplicaciones particulares, tales como la tasa de degradación y bioactividad del material de fibroína. La selección de un peso molecular promedio particular dependerá de varios factores, incluyendo el uso final, la viscosidad deseada, la adición de otros componentes, la distribución del peso molecular y el tipo de vehículo. Los pesos moleculares promedio de la fibroína tras el tratamiento proteolítico son de aproximadamente 200 a aproximadamente 0,1 kilodaltons (kD), preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 0,2 kD, más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 0,5 kD.

Todavía en otra realización, puede formarse una disolución más viscosa de fibroína mezclando una disolución de fibroína con uno o más polímeros biocompatibles tales como, por ejemplo, polietilenglicol, óxido de polietileno, polivinilpirrolidona o una combinación que comprende uno o más de los polímeros biocompatibles anteriores. Los polímeros biocompatibles deben ser miscibles con la disolución de fibroína en una cantidad de aproximadamente el 2 a aproximadamente el 20% en peso.

Una vez formadas, las disoluciones y/o suspensiones de fibroína pueden usarse in vivo como una estructura de base para la construcción tisular, o pueden administrarse a un animal, por ejemplo, a un mamífero tal como un conejo, perro, gato, caballo y ser humano, para la construcción tisular. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que "construcción tisular" incluya la formación de tejido duro o blando que no es parte del sitio de una lesión, por ejemplo en cirugía plástica, o la reparación o la reconstrucción en el sitio de una lesión.

Si la suspensión de fibroína está en forma de una oclusión o de un gel, la suspensión de fibroína puede administrarse al sitio de construcción tisular mediante inyección. Un gel de fibroína para inyección es un gel reversible, es decir, un gel que puede volverse a un estado menos viscoso, por ejemplo, con la aplicación de calor o tensión mecánica. La tensión mecánica puede incluir la tensión aplicada al gel durante el proceso de inyección. De manera alternativa, si la suspensión de fibroína está en forma de una crema o de una pasta, la suspensión de fibroína puede aplicarse mediante colocación en un sitio de construcción tisular (es decir, en un sitio que necesita reparación tisular) mediante medios tales como colocación quirúrgica o mediante extensión (es decir, administración tópica). Sin restringirse a la teoría, se cree que independientemente del modo de administración, una vez aplicadas, las suspensiones de fibroína pueden formar una matriz o estructura de base que puede permitir la infiltración y el crecimiento de las células usadas en la construcción tisular.

Las disoluciones y suspensiones de fibroína pueden proporcionarse a un médico listas para la inyección u otras formas de administración. Cuando se mezclan con partículas, pueden seleccionarse las características de las disoluciones y suspensiones de fibroína en el momento de la inyección usando una técnica de una o dos jeringuillas. En la técnica de una jeringuilla, el médico proporciona las cantidades relativas de partículas y disolución o suspensión de fibroína dependiendo de la aplicación, luego se mezclan y se colocan en una única jeringuilla tradicional con aguja y se inyectan. De manera alternativa, las partículas y la disolución o suspensión de fibroína pueden proporcionarse en cartuchos separados y mezclarse en una cámara de mezclado antes de su colocación. El uso de un dispositivo que permite el mezclado variable durante la colocación proporciona al médico la capacidad de variar la composición de la estructura de base para ajustar mejor la variación de las propiedades en un sitio dado (por ejemplo, tejido óseo o blando). Se escoge el contenido en agua de los dos componentes para permitir el mezclado y la inyección
rápidos.

En uso, las disoluciones y suspensiones de fibroína pueden administrarse a un ser humano o animal para una variedad de fines, por ejemplo para rellenar cavidades, reemplazar el tejido perdido, o para reparación articular o de tejido blando. La disolución o suspensión de fibroína puede administrase, por ejemplo, mediante inyección o aplicación tópica (es decir, puede aplicarse como una crema a la piel). Sin restringirse a la teoría, en el caso de una disolución, se cree que la disolución puede disipar rápidamente el agua en exceso en el organismo hasta que se establece un cuasiequilibrio entre el material inyectado y los fluidos corporales circundantes, produciendo de ese modo una suspensión que puede formar una estructura de base in vivo. En el caso de una oclusión, se cree que con la colocación en el organismo, la oclusión puede experimentar una transición tal como una transición sol-gel, produciendo de ese modo un gel que puede estar en forma de una estructura de base. En todos los casos, se prefiere que los materiales, una vez inyectados, sean porosos.

Sin restringirse a la teoría, se cree que cuando la disolución o suspensión de fibroína inyectada comprende partículas de núcleo/corteza, la degradación de las cortezas poliméricas a lo largo del tiempo puede generar porosidad adicional dentro de la suspensión, es decir, en forma de un gel, formando una estructura de base que potencia la infiltración y el crecimiento de las células necesarios para la reparación tisular. Una vez inyectada, por ejemplo, la fibroína puede comprender una red tridimensional (o panal) en forma de un gel que encapsula la dispersión de partículas de núcleo/corteza. La figura 1 muestra una representación esquemática de una red tridimensional hipotética en el proceso de la reparación tisular. La fibroína 1 se infiltra mediante células y las partículas de núcleo/corteza 2 experimentan al menos degradación parcial. Las dimensiones y el estado de agregación de las partículas de núcleo/corteza controlan la porosidad adicional de la estructura de base: El tejido 3 recién formado puede experimentar organización en los poros. La composición y la morfología de la matriz de fibroína son los factores principales que controlan la bioactividad.

Una estructura de base porosa de fibroína puede potenciar la adhesión, la proliferación y la activación celulares, mientras que se degrada lentamente durante el proceso de curación. Además, la degradación de la fibroína puede producir péptidos con pesos moleculares en el intervalo de aproximadamente 20 kilodaltons o menos que pueden liberarse al fluido biológico circundante, potenciando así la actividad metabólica de las células circundantes. Sin restringirse a la teoría, se supone además que el tratamiento térmico o con enzimas proteolíticas puede aumentar la tasa de biodegradación de la fibroína exponiendo los sitios activos específicos para su interacción final con factores de crecimiento, moléculas farmacológicas y péptidos específicos para la mediación de la adhesión celular.

Las disoluciones y suspensiones de fibroína descritas anteriormente pueden usarse, por ejemplo, en una variedad de procedimientos de reparación para huesos y tejidos. Procedimientos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, procedimientos quirúrgicos ortopédicos, maxilofaciales, dentales y generales tales como la resección tumoral y la cirugía plástica. Por ejemplo, las disoluciones y suspensiones de fibroína pueden usarse en la reparación de fracturas óseas mediante la unión adhesiva y la rehabilitación de huesos implicados en osteoporosis y osteoartritis, rehabilitando los huesos afectados. Tales materiales también pueden usarse como cementos óseos (para prótesis, por ejemplo), para rellenar o aumentar tejidos, para modificar el tamaño o la forma de tejidos, en cavidades periodontales, como estabilizadores para implantes articulares y dentales, y como rellenos para huecos generados entre las prótesis de cadera, rodilla y otras y el hueso con el fin de lograr la inmovilización de las prótesis y de promover la regeneración ósea. Las disoluciones y suspensiones de fibroína también pueden usarse, por ejemplo, para rellenar los huecos formados alrededor de los dientes de pacientes periodontales, permitiendo así el nuevo crecimiento óseo parcial y reduciendo posiblemente la infección bacteriana; y para rellenar los huecos entre el hueso y un implante tal como, por ejemplo, un implante de cadera o rodilla. Rellenar un hueco de este tipo puede conducir potencialmente a la estabilización de la prótesis y a aumentar la duración de servicio de la prótesis. Las disoluciones y suspensiones de fibroína también pueden usarse para rellenar defectos tisulares tales como los producidos por la intervención quirúrgica frente a tumores óseos y la intervención quirúrgica reconstructiva, y para potenciar la reparación ósea y tisular, por ejemplo para inducir la precipitación de calcio, o la proliferación y la actividad de osteoblastos; con la formación del tejido óseo recién formado.

Las disoluciones y suspensiones de fibroína que comprenden partículas de núcleo/corteza son especialmente útiles para la reparación ósea. Sin restringirse a la teoría, se cree, en este caso, que el proceso de reparación ósea puede producirse tal como sigue. Los primeros componentes que van a degradarse pueden ser las cortezas dopadas con iones calcio de las partículas de núcleo/corteza, permitiendo que los fluidos corporales difundan hacia las capas acuosas ricas en iones calcio que sirven como la zona interfacial entre las cortezas biodegradables y la red de fibroína de encapsulación. La porosidad de la matriz de fibroína y la porosidad adicional creada por la degradación de la corteza permiten la infiltración de los osteoblastos en la estructura de base porosa, que interactúan con la red bioactiva de la estructura de base e inician el nuevo crecimiento tisular y óseo. La siguiente fase es presumiblemente la biodegradación de la capa reactiva, si está presente, por ejemplo mediante la hidratación de enlaces -SiO- que unen la corteza biodegradable con el núcleo mineral, introduciendo así el mineral reabsorbible en el fluido del hidrogel restante. El proceso de reparación va acompañado por la biodegradación de la fibroína a medida que se genera un nuevo hueso. La estructura de base de material compuesto puede mantener la estabilidad mecánica de la red de alta área superficial, mecánicamente estable, tridimensional, al menos durante las primeras fases de la regeneración ósea.

Una característica particularmente ventajosa de las disoluciones y suspensiones de fibroína es que las propiedades mecánicas y de morfología del material se varían fácilmente mediante la modificación de la matriz bioactiva y las partículas biodegradables de núcleo/corteza para cumplir con los requisitos de las aplicaciones específicas. Se contempla que pueden usarse geles y polímeros bioactivos, biodegradables distintos a la fibroína en combinación con las partículas de núcleo/corteza descritas en el presente documento para formar estructuras de base.

Las disoluciones, suspensiones y materiales compuestos de fibroína pueden inducir proliferación en tipos celulares tales como osteoblastos, queratinocitos, fibroblastos, pericitos, células endoteliales y similares. Dado que las disoluciones y suspensiones de fibroína pueden potenciar la proliferación de muchos tipos celulares, también pueden usarse en aplicaciones que implican tejidos distintos del tejido óseo, por ejemplo, para la reconstrucción del tejido blando tal como tras la cirugía plástica, aplicaciones de piel artificial, reparación de cartílago y similares.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de fibroína de seda

Usando técnicas conocidas en la técnica, en primer lugar se desgomaron capullos del gusano de seda Bombyx mori. Se extrajeron proteínas de sericina similares al pegamento mediante lavado repetido con disoluciones acuosas de carbonato de sodio (Na_{2}CO_{3}), tal como sigue. En primer lugar se lavaron los capullos en una disolución acuosa de Na_{2}CO_{3} 1,1 g/l (gramos por litro) a 98ºC durante una hora, y después se enjuagaron en una disolución acuosa que contenía Na_{2}CO_{3} 0,4 g/l a 98ºC durante una hora. Entonces se lavaron los capullos repetidamente en agua destilada a temperaturas decrecientes desde 98ºC hasta temperatura ambiente, dejando atrás la fibroína libre de sericina. La cantidad de fibroína de partida en el agua fue de 10 g/l. Entonces se disolvió la fibroína desgomada a 65ºC en una disolución acuosa 9,3 molar de bromuro de litio (LiBr) durante 3 horas a una composición inicial de 100 g de fibroína/l de disolución. Cuando la disolución fue completa, se diluyó la disolución acuosa hasta el 5% en peso/volumen de fibroína mediante la adición de agua destilada. Se eliminaron por filtración la fibra no disuelta y las impurezas restantes, usando un filtro con un tamaño de poro n.1. Entonces se eliminó la sal de la mezcla de fibroína mediante 72 horas de diálisis frente a agua destilada, usando una membrana de celulosa regenerada con un punto de corte de peso molecular de 3.500. La concentración final de fibroína dializada fue del 1-2% de fibroína de seda pura.

Ejemplo 2 Formación de una suspensión mediante el tratamiento térmico de una disolución acuosa de fibroína

Se vertió una disolución acuosa de fibroína (20 ml (mililitros)) en una cápsula de poliestireno incubada a temperaturas de -20ºC a 50ºC durante periodos de 2 a 24 horas. Las disoluciones incubadas a -20ºC se calentaron hasta y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que se produjo gelatina. Otras disoluciones de fibroína mantenidas a temperaturas constantes de desde 4ºC hasta 50ºC, requirieron periodos de incubación de 2 a 24 horas para que se produjera la gelificación. El contenido en agua de los geles, determinado mediante análisis termogravimétrico, varió desde el 95 hasta el 98% en peso. La consistencia de las suspensiones dependió del tiempo y de la temperatura a la que a la que se incubaron. De esta manera, se demostró que podían variarse las propiedades reológicas de la fibroína mediante tratamiento térmico.

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Ejemplo 3 Tratamiento enzimático de la fibroína de seda

Se trató la mezcla de fibroína acuosa con diversas enzimas proteolíticas que son específicas para la reacción con sitios de enlace de aminoácidos particulares. El objetivo era reducir el peso molecular promedio, aumentar la tasa de biodegradación y exponer sitios activos específicos para la interacción final con péptidos específicos para la mediación con factores de adhesión celular, factores de crecimiento y moléculas farmacológicas. Se estudiaron las siguientes enzimas:

Proteasa (de Streptomyces griseus): Esta enzima hidroliza los enlaces peptídicos en sitios carboxílicos del ácido glutámico. Se ha demostrado que las cadenas peptídicas de la fibroína que tienen grupos de extremo terminales de ácido glutámico dificultan la formación de la estructura beta ordenada de la fibroína de seda. Las reacciones enzimáticas se realizaron a concentraciones de enzima-sustrato de 50 \mul/ml (microlitros/mililitros) y tras una hora a 37ºC la disolución se vuelve de color blanco y más viscosa. El sol que se forma es un material inyectable que puede formar un gel. El calentamiento hasta 50ºC durante 15 minutos desactivó la enzima. Se encontró que el contenido en el aminoácido ácido glutámico dentro de la cadena proteica de fibrina era de aproximadamente el 1%, tal como se determinó mediante análisis electroforético. Hubo una presencia notable de péptidos con peso molecular inferior que estaban presentes en la mezcla de fibroína antes del tratamiento.

Papaína: Esta enzima es específica para la reacción con enlaces químicos de leucina (el 0,5% de la fibroína) y glicina (el 44% de la fibroína). Pueden variarse las condiciones de tratamiento y la razón de concentración de enzima-sustrato para producir diferentes niveles de viscosidad de la disolución o sol de fibroína resultante. En este caso, el producto contiene péptidos con pesos moleculares en el intervalo de 20 kD a 2 kD, tal como se determina mediante análisis electroforético.

Quimiotripsina: El tratamiento con esta enzima produce la hidrólisis del enlace disulfuro que conecta la fracción Cp (pesada) (compuesta principalmente por glicina-alanina-serina) y la fracción Cs (ligera; una mezcla de cadenas peptídicas cortas) que comprende los otros aminoácidos presentes en el material de fibroína pura. Se añadió una disolución enzimática tamponada a la disolución acuosa de fibroína a 40ºC. Se controló el grado de hidrólisis mediante el tiempo de reacción. Diferentes tiempos de tratamiento podían provocar diferentes cantidades de hidrólisis. A la finalización de la reacción, el medio acuoso resultante contenía la fracción Cs o ligera en disolución y un precipitado gelatinoso de la fracción Cp o pesada.

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Ejemplo 4 Formación de una suspensión mediante la adición de ácidos o alcoholes a la disolución de fibroína

Se indujo gelificación mediante la adición de ácido cítrico o glicerol a las disoluciones de fibroína. Se añadió gota a gota ácido cítrico a 10 ml de disoluciones de fibroína, hasta que el pH alcanzó 3,7 (el punto isoeléctrico equivale a 3,8). La gelificación se produjo tras aproximadamente 6 horas, produciendo un gel poroso opaco, blanco que contenía aproximadamente el 95% en peso de agua. La figura 2 muestra una micrografía electrónica de barrido ambiental del material formado.

Cuando se añadieron 3 ml de glicerol a 7 ml de disolución de fibroína, se produjo la gelificación en aproximadamente 20 horas, produciendo un gel translúcido blanco que contenía aproximadamente el 90% en peso de agua. La figura 3 muestra una micrografía electrónica de barrido ambiental del material formado.

Ejemplo 5 Preparación in vitro de una fibroína inyectable. Estructura de base de material compuesto de gel/hidroxiapatita/poli- lactida

Se preparó un polvo de partículas de núcleo/corteza de partículas de hidroxiapatita recubiertas de polímero. Se usó una polilactida (PLA) con un peso molecular de aproximadamente 6.000 como la corteza de polímero biodegradable. Se añadieron dos gramos de hidroxiapatita tratada con silano a 6 gramos de una polilactida en 50 ml de butanol. Se calentó la disolución hasta 70ºC durante 2 horas, se enfrió hasta temperatura ambiente y se mezcló con 50 ml de una disolución acuosa al 2% en peso/volumen de polietilenglicol. La tasa de sedimentación de las partículas recubiertas fue suficientemente lenta como para mantener la uniformidad relativa del proceso de recubrimiento. Se agitó la mezcla de núcleo/corteza, se vertió en una placa Petri de vidrio, se secó a 50ºC y se molió ligeramente hasta obtener un polvo. El material resultante era una distribución de tamaños bastante amplia de agregados esféricos recubiertos de polímero.

Se mezclaron dos gramos del polvo de núcleo/corteza con 10 ml de gel de fibroína. El polvo se dispersó fácilmente en el gel para formar una pasta. La pasta que contenía las partículas de núcleo/corteza se secó de dos formas, concretamente se liofilizó y también se secó lentamente a temperatura ambiente. Las figuras 4 a 7 son micrografías ópticas de las estructuras de base resultantes. Con el secado lento a temperatura ambiente se forma un material de fibroína relleno de partículas con integridad estructural aparente. La muestra liofilizada muestra la estructura morfológica que se podría esperar, concretamente una distribución amplia de partículas recubiertas de fibroína.

Ejemplo 6 Pruebas in vitro de suspensiones de fibroína

Se cultivaron células de tipo osteoblastos humanos (MG63) durante 72 horas en geles de fibroína preparados añadiendo glicerol a una disolución acuosa de fibroína y tratando la disolución acuosa de fibroína a 4ºC. Se evaluaron los parámetros bioquímicos e inmunoenzimáticos de MG63, crecidas en los materiales sometidos a prueba y en un pocillo de poliestireno vacío usado como control, para determinar la proliferación y la actividad celulares.

La proliferación celular en el gel de fibroína pura preparado mediante tratamiento térmico fue significativamente inferior cuando se comparó con el control, pero al mismo tiempo, el gel favoreció la actividad y la diferenciación de los osteoblastos, tal como se demuestra por la actividad ALP (fosfatasa alcalina) (16,71 +/- 1,80 frente al control 10,10 +/- 1,61) y los niveles TGF\beta1 (factor de crecimiento transformante \beta1) (487 +/- 29 frente a control 432 +/- 42) aumentados, respectivamente. La proliferación celular en el gel preparado añadiendo glicerol mostró poca diferencia cuando se comparó con el control.

Ningún gel indujo citotoxicidad, tal como se reveló por el nivel de LDH (lactato deshidrogenasa) (gel de fibroína pura, 14,67 +/- 2,04; gel con glicerol, 18,03 +/- 0,23; control, 14,63 +/- 2,19).

Ejemplo 7 Pruebas in vivo de suspensiones de fibroína

Se implantaron geles de fibroína derivados de ácido cítrico en cavidades (6 mm de diámetro, 10 mm de profundidad) perforadas en el cóndilo femoral de conejos. Se usaron como control cavidades libres de implante. Se sacrificaron los conejos un mes tras la implantación y se compararon los resultados histológicos de los sitios del implante con los de los sitios libres de implante.

Un mes tras la implantación, el orificio en una cavidad rellena con el gel de fibroína se rellenó completamente con el hueso recién formado (figura 8A). Se observó una curación ósea casi completa con algo de fibroína 4 residual. La cavidad sin fibroína añadida no presentó regeneración ósea (véase la figura 8B). Se observaron el hueso 5 original y el defecto 6 vacío. En cuatro de las cavidades rellenas con el gel de fibroína, las cavidades casi se rellenaron con el hueso 7 recién formado, estando todavía presentes pequeñas cavidades 8 residuales (figura 9A). En la figura 9A, la cavidad tiene una anchura de 1,08 milímetros y una longitud de 1,7 milímetros. La figura 10 muestra la superficie de contracto entre el hueso 5 original y el hueso 7 recién crecido. El hueso nuevo formó trabéculas bien organizadas que se propagaron desde las trabéculas óseas originales sin crear ningún hueco entre el hueso recién formado y el original. Se observó una cavidad 8 residual como tejido 9 conjuntivo que experimentaba mineralización. Se observó una leve inflamación, con ausencia de cualquier granuloma y respuesta inmunológica adversa aparente. Sólo eran todavía visibles fragmentos del gel de fibroína original, confirmando la capacidad del gel para degradarse a una tasa que es compatible con la tasa de regeneración tisular, proporcionando así evidencias de que las suspensiones de fibroína son útiles para las aplicaciones propuestas.

Se han dado a conocer suspensiones y materiales compuestos novedosos de fibroína. Las suspensiones de fibroína pueden estar en forma de oclusiones, geles, cremas o pastas. Las suspensiones y los materiales compuestos así como las disoluciones de fibroína tienen utilidad particular para su uso en la construcción, la reparación y la regeneración ósea y tisular. Dado que las disoluciones, las suspensiones y los materiales compuestos de fibroína pueden inyectarse, puede reducirse la necesidad de muchos procedimientos quirúrgicos invasivos, particularmente procedimientos ortopédicos, minimizando así el potencial para la infección, disminuyendo los periodos de recuperación requeridos y reduciendo el coste global de los procedimientos médicos.

Aunque la invención se ha descrito con preferencia a una realización preferida, los expertos en la técnica entenderán que pueden realizarse diversos cambios y que los elementos pueden sustituirse por equivalentes de los mismos sin apartarse del alcance de la invención. Además, pueden realizarse muchas modificaciones para adaptar una situación o material particulares a las enseñanzas de la invención sin apartarse del alcance esencial de la misma. Por tanto, se pretende que la invención no se limite a la realización particular dada a conocer como el mejor modo contemplado para llevar a cabo esta invención, sino que la invención incluirá todas las realizaciones que caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (24)

1. Uso de una disolución o suspensión de fibroína en la fabricación de un medicamento que va a administrarse a un sitio de construcción tisular en una cantidad eficaz para estimular la formación de tejido.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la disolución o suspensión de fibroína incluye además al menos un material particulado de formación de poros.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que la disolución o suspensión de fibroína incluye además al menos un agente fisiológicamente activo.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3, en el que dicho medicamento se administra mediante inyección o implantación.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la suspensión de fibroína está en forma de una oclusión, un gel, una crema o una pasta.

6. Uso según la reivindicación 1, en el que la suspensión de fibroína, tras la inyección in vivo forma una estructura de base porosa.

7. Uso según la reivindicación 3, en el que dicho agente fisiológicamente activo comprende células, antibióticos, proteínas morfogenéticas óseas, compuestos que estimulan la regeneración ósea, compuestos que estimulan el crecimiento tisular, compuestos que estimulan la cicatrización, o una combinación que comprende uno o más de los agentes anteriores.

8. Uso según la reivindicación 5, en el que la oclusión o el gel de fibroína es inyectable a través de una abertura que tiene un diámetro de aproximadamente 584 micrómetros, la crema de fibroína es inyectable a través de una abertura que tiene un diámetro de aproximadamente 838 micrómetros y la pasta de fibroína es inyectable a través de una abertura que tiene un diámetro superior a aproximadamente 2 milímetros.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fibroína comprende la fibroína del gusano de seda Bombyx mori.

10. Composición que comprende una suspensión de fibroína y un material particulado de formación de poros que comprende partículas de núcleo/corteza.

11. Composición según la reivindicación 10, en la que las partículas de núcleo/corteza comprenden al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de calcio, una fuente de fosfato y una capa reactiva.

12. Composición según la reivindicación 10 u 11, en la que la corteza comprende un polímero biodegradable.

13. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en la que la suspensión de fibroína está en forma de una oclusión, un gel, una crema o una pasta.

14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en la que la fibroína comprende la fibroína del gusano de seda Bombyx mori.

15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en la que la suspensión de fibroína es inyectable o implantable.

16. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en la que el material particulado de formación de poros comprende una hidroxiapatita, un fosfato tricálcico, un material cerámico, un coral o una combinación que comprende uno o más de los materiales anteriores.

17. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, en la que el núcleo comprende una hidroxiapatita, un material a base de fosfato de calcio, una carga de vidrio reabsorbible o una combinación que comprende uno o más de los materiales anteriores, y en la que la corteza comprende poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), policaprolactona, poli(carbonato de trimetilo), diacrilatos de polietilenglicol, polianhídridos, poliortoésteres, polifosfacinas, poliacetales, poliésteres, poliureas, policarbonatos, poliuretanos, poli(alfa-hidroxiácidos), poliamidas, poliaminoácidos, un copolímero o una combinación que comprende uno o más de los polímeros biodegradables anteriores.

18. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, en la que la suspensión de fibroína comprende además un agente fisiológicamente activo.

19. Composición según la reivindicación 18, en la que dicho agente fisiológicamente activo comprende células, antibióticos, proteínas morfogenéticas óseas, compuestos que estimulan la regeneración ósea, compuestos que estimulan la cicatrización o una combinación que comprende uno o más de los agentes anteriores.

20. Método para la formación de un gel de fibroína inyectable y bioactivo, que comprende tratar una disolución de fibroína con un agente que comprende calor, una enzima proteolítica, un polímero biocompatible o una combinación que comprende uno o más de los agentes anteriores, y que comprende además añadir un material particulado de formación de poros que incluye partículas de núcleo/corteza.

21. Método según la reivindicación 20, en el que dicho agente es calor y el tratamiento con calor comprende calentar hasta una temperatura de aproximadamente -20ºC a aproximadamente 50ºC.

22. Método según la reivindicación 20, en el que el polímero biocompatible comprende polietilenglicol, poli(óxido de etileno), polivinilpirrolidona o una combinación que comprende uno o más de los polímeros biocompatibles anteriores, y en el que la enzima proteolítica comprende la proteasa de Streptomyces griseus, papaína, quimiotripsina o una combinación que comprende una o más de las enzimas proteolíticas anteriores.

23. Método para preparar una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19, que comprende tratar una disolución de fibroína con un agente que comprende calor, un ácido, una enzima proteolítica, un polímero biocompatible o una combinación que comprende uno o más de los agentes anteriores, y que comprende además añadir un material particulado de formación de poros que incluye partículas de núcleo/corteza.

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicho agente se escoge del grupo que consiste en: ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido láctico y combinaciones de los ácidos anteriores, preferiblemente ácido cítrico.