RU2660558C2 - Способ получения минерализованных композитных микроскаффолдов для регенерации костной ткани - Google Patents
Способ получения минерализованных композитных микроскаффолдов для регенерации костной ткани Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660558C2 RU2660558C2 RU2016152064A RU2016152064A RU2660558C2 RU 2660558 C2 RU2660558 C2 RU 2660558C2 RU 2016152064 A RU2016152064 A RU 2016152064A RU 2016152064 A RU2016152064 A RU 2016152064A RU 2660558 C2 RU2660558 C2 RU 2660558C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- microscaffolds
- composite
- bone
- mineralized
- scaffold
- Prior art date
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 72
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 51
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 9
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 20
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 abstract description 14
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 abstract description 11
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 abstract description 9
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 abstract description 9
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000411 inducer Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 abstract description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 abstract 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 abstract 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 12
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 12
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 11
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 11
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 10
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 10
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 9
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 9
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 5
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 5
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 5
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 5
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 5
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 4
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 4
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 4
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011173 biocomposite Substances 0.000 description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 4
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 4
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 3
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 3
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000005313 bioactive glass Substances 0.000 description 3
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 description 3
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 3
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000016921 Integrin-Binding Sialoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010028750 Integrin-Binding Sialoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 description 2
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910000394 calcium triphosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- RFWLACFDYFIVMC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl] phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O RFWLACFDYFIVMC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 2
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical class [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 229910014497 Ca10(PO4)6(OH)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical class OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000009890 Osteonectin Human genes 0.000 description 1
- 108010077077 Osteonectin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001872 Spider silk Polymers 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920003232 aliphatic polyester Polymers 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 239000005312 bioglass Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- 230000037118 bone strength Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- WUKWITHWXAAZEY-UHFFFAOYSA-L calcium difluoride Chemical compound [F-].[F-].[Ca+2] WUKWITHWXAAZEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001634 calcium fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001576 calcium mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- MKYNHKOAYQRSBD-UHFFFAOYSA-N dioxouranium;nitric acid Chemical compound O=[U]=O.O[N+]([O-])=O.O[N+]([O-])=O MKYNHKOAYQRSBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 210000001564 haversian system Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 description 1
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N lactide Chemical compound CC1OC(=O)C(C)OC1=O JJTUDXZGHPGLLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ORUIBWPALBXDOA-UHFFFAOYSA-L magnesium fluoride Chemical compound [F-].[F-].[Mg+2] ORUIBWPALBXDOA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001635 magnesium fluoride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000001089 mineralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004663 osteoprogenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000011555 rabbit model Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- -1 silk Polymers 0.000 description 1
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 1
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/58—Materials at least partially resorbable by the body
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения минерализованного композитного микроскаффолда для регенерации костной ткани и применение минерализованного микроскаффолда, полученного данным способом. При этом способ включает стадии подготовки водного раствора фиброина шелка, подготовки водного раствора желатина, формирования скаффолда из смеси растворов фиброина шелка и желатина (7:3) с добавлением 1% ДМСО, криоизмелчения скаффолда с использованием диспергатора, сортировки полученных фрагментов микроскаффолда и получение минерализованных микроскаффолдов путем погружения их в раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 3,5 мМ MgCl2, 21 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0, и последующего погружения в раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 0,7 мМ MgCl2, 10,5 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0 с дальнейшим высушиванием полученного продукта. Изобретения позволяют получать минерализованные композитные микроскаффолды, обладающие усиленной стимуляцией остеогенеза в отсутствие каких-либо индукторов, а также усиленной реорганизацией актинового цитоскелета, необходимой для успешной адгезии и дифференцировки остеобластов при упрощении технологии. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил., 3 пр.
Description
Область техники
Группа изобретений относится к медицине, а именно к способу получения минерализованных композитных микроскаффолдов на основе фиброина шелка, желатина и гидроксиапатита, которые могут быть использованы в частности для регенерации костной ткани.
Уровень техники
Костные трансплантаты используются для усиления и стимулирования образования новой костной ткани в таких случаях, как: заживление переломов костей или пораженных суставов, восстановление и регенерация костей, поврежденных в результате травм или инфекций, улучшение регенерации костной ткани вокруг хирургически имплантированных устройств, таких как искусственные суставы, пластины и винты, используемые для выравнивания костей. Широкая сфера применения таких устройств подтверждается тем, что ежегодно по всему миру для ортопедических процедур используется 2,2 миллиона костных имплантов.
Разработка имплантата, точно имитирующего костную ткань включает в себя конструирование модели кости, что требует понимания биологии и физиологических процессов, происходящих в костной ткани. Кость можно рассматривать как открытый клеточный композитный материал, состоящий из остеогенных клеток, внеклеточного матрикса, белков, факторов роста, минеральных соединений кальция в виде гидроксиапатита кальция и комплекса кровеносных сосудов. Клетки, входящие в состав костной ткани, составляют около 10% от общего объема кости и включают в себя клетки-предшественники мезенхимального происхождения (остеобласты и остеоциты), а также клетки костной резорбции из системы гемопоэза, к которым относятся остеокласты. Преостеобласты являются клетками-предшественниками костной ткани, они расположены в надкостнице, эндосте и гаверсовых каналах, происходят от мезенхимальных стволовых клеток и дифференцируются под действием факторов роста, таких как, например, костные морфогенетические белки (BMP), 17 трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и интерлейкины, посредством миграции в специфические сайты, где происходит их пролиферация и дифференцировка в остеобласты. Формирование костной ткани происходит в три этапа: (1) пролиферация клеток, (2) созревание матрицы и (3) минерализация матрицы. На этапе пролиферации синтезируются белки внеклеточного матрикса, которые секретируются остеобластами наружу, формируя неминерализованную костную матрицу или остеоид. Затем, на этапе созревания матрицы, происходит сшивка белков остеоида, при этом образуется более прочная и стабильная структура. Сшитые фибриллы коллагена I типа, основного компонента остеоида, становятся основанием, на которое осаждаются неорганические минеральные соединения, формируя минерализованную костную матрицу. В конце этой стадии, остеобласты могут либо встроиться в костную ткань в виде остеоцитов, либо превратиться в неактивные остеобласты, покрывающие зрелую кость, либо пойти по пути программируемой гибели клеток (т.е., апоптоз) [P.Jayakumar and L. Di Silvio. Osteoblasts in bone tissue engineering // Proc. Inst. Mech. Eng. H. 2010. V. 224 (12). P. 1415-1440]. Остеоциты, встроенные в костный матрикс, являются наиболее распространенным типом клеток кости, они формируют сеть, соединяясь друг с другом с помощью длинных цитоплазматических ответвлений, которые расположены в крошечных канальцах. Считается, что с помощью этой сети, которая также включает остеокласты, они функционируют как сенсоры напряжения и деформации, что очень важно для поддержания структуры костной ткани [T.A. Franz-Odendaal, B.K. Hall and P.E. Witten. Buried alive: how osteoblasts become osteocytes // Dev. Dyn. 2006. V. 235 (1). P. 176-190]. Остеокласты - большие, многоядерные клетки, которые крепятся к костной матрице и солюбилизируют ее минеральную составляющую путем ацидофикации. Этот процесс жестко регулируется с помощью совместной паракринной секреции сигнальных молекул остеокластами и остеобластами в процессе, называемом ремоделированием костной ткани. Во внеклеточном матриксе белки обладают способностью самосборки и состоят преимущественно из коллагенов и неколлагеновых белков, которые включают в себя гликопротеины, протеогликаны и факторы роста. Коллагены составляют до 90% от общей массы белков внеклеточного матрикса, и в основном представляют собой коллаген I типа (97%), в меньшей степени - 18 коллагены типов III, V, XI и XIII. Неколлагеновые белки образуют дополнительные 10% костной массы [C.Gentili and R.Cancedda. Cartilage and bone extracellular matrix // Curr. Pharm. Des. 2009. V. 15 (12). P. 1334-1348]. Гликопротеины включают в себя щелочную фосфатазу (ALP), остеопонтин (OPN), костный сиалопротеин (BSP) и остеокальцин (OCN), которые модулируют процесс минерализации, а также остеонектин, который регулирует диаметр фибрилл коллагена. Кости представляет собой резервуар кальция, содержащий 99% кальция в организме. Костное минеральное вещество в основном (на 85%) представлено в виде гидроксиапатитов (Са10(РО4)6(ОН)2) с включениями карбоната кальция (10%), фторида кальция (2-3%) и фторида магния (2-3%). Природные гидроксиапатиты содержат карбонат-ионы в качестве заместителей фосфатных и гидроксильных групп структуры гидроксиапатита. Гидроксиапатиты представляют собой кристаллы диаметром около 20 нм. Повышение прочности и жесткости костей наблюдается вдоль их продольной оси [N.Sasaki, N.Matsushima, T.Ikawa, H.Yamamura and A.Fukuda. Orientation of bone mineral and its role in the anisotropic mechanical properties of bone-transverse anisotropy // J. Biomech. 1989. V. 22 (2). P. 157-1646]. Это связано с тем, что коллаген и минеральные кристаллы обычно ориентированы вместе и именно в этом направлении, причем минеральная составляющая придает кости механическую прочность, а фибриллы коллагена обеспечивают гибкость.
В настоящее время для создания костных имплантатов используются материалы следующих групп.
Натуральные полимеры
Инженерия костной ткани сконцентрирована на конструировании трехмерных скаффолдов, имитирующих остеогенный внеклеточный матрикс, способствующий формированию новых костей и при этом деградирующий после завершения образования новой кости. Натуральные полимеры обладают рядом привлекательных свойств для конструирования трехмерных каркасов, таких как биосовместимость и способность к биодеградации. Что важно, управление пористостью, зарядом и механической прочностью может осуществляться за счет изменения концентрации полимеров, условий полимеризации, либо за счет введения различных функциональных групп. На биоактивность можно также влиять путем добавления реагентов, протеинов, пептидов или клеток [S.-H.Lee and H.Shin. Matrices and scaffolds for delivery of bioactive molecules in bone and cartilage tissue engineering // Adv. Drug Deliv. Rev. 2007. V. 59 (4)-(5). Р. 339-359]. Наиболее широко изученными природными полимерами, используемыми в инженерии костей, являются: коллаген/желатин, хитозан, шелк, альгинат, гиалуроновая кислота и пептиды [C.E. Semino. Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration // J. Dent. Res. 2008. V. 87 (7). Р. 606-616].
Коллаген: будучи одним из основных компонентов кости, коллаген (и желатин) - идеальный кандидат для проектирования трехмерных каркасов. По своей сути являясь биосовместимым и биодеградируемым, он стимулирует пролиферацию и дифференциацию клеток, как внеклеточный матрикс. Однако, обладает недостаточными механическими свойствами [B.A. Harley, J.H. Leung, E.C.C.M.Silva and L.J. Gibson. Mechanical characterization of collagen-glycosaminoglycan scaffolds // Acta Biomater. 2007. V. 3 (4). Р. 463-474].
Хитозан: среди природных полимеров хитозан - отличный материал для конструирования трехмерных каркасов. Он биосовместимый, биоразлагаемый, а также обладает антибактериальными, ранозаживляющими и биоадгезивными свойствами [A.R. Costa-Pinto, R.L. Reis and N.M. Neves. Scaffolds based bone tissue engineering: the role of chitosan // Tissue Eng. Part B. Rev. 2011. V. 17 (5). Р. 331-347].
Альгинат: также является привлекательным полимером для конструирования трехмерных каркасов, используемых для регенерации тканей. Он растворим в воде, образует гель при комнатной температуре в присутствии двухвалентных катионов, что позволяет формировать из альгината трехмерные гели [D.
, K.Barnhart, E.Saito, R.Vanderby, S.J. Hollister and W.L. Murphy. Controlled nucleation of hydroxyapatite on alginate scaffolds for stem cell-based bone tissue engineering // J. Biomed. Mater. Res. A. 2010. V. 95(1). Р. 222-234].
Гиалуроновая кислота тоже зарекомендовала себя в качестве потенциального каркасного материала. Это вещество широко распространено в природе, гидрофильно, неиммуногенно и, кроме того, было обнаружено в цитоплазме предшественников костных клеток [P.Pavasant, T.M. Shizari and C.B. Underhill. Distribution of hyaluronan in the epiphysial growth plate: turnover by CD44-expressing osteoprogenitor cells // J. Cell Sci. Pt 1. 1994. V. 107. P. 2669-2677]. Этот биополимер также используется в комбинации с другими материалами, факторами и препаратами для усиления остеогенного эффекта [M.S. Bae, D.H. Yang, J.B. Lee, D.N. Heo, Y.-D. Kwon, I.C. Youn, K.Choi, J.H. Hong, G.T. Kim, Y.S. Choi, E.H. Hwang and I.K. Kwon. Photo-cured hyaluronic acid-based hydrogels containing simvastatin as a bone tissue regeneration scaffold // Biomaterials. 2011. V. 32 (32). P. 8161-8171].
Пептидные гидрогели: самособирающиеся пептидные гидрогели - новый класс материалов, исследуемый в настоящее время для применения в тканевой инженерии. Их можно легко модифицировать с целью придания им определенной биоактивности, а их структурные единицы биосовместимы и биоразлагаемы. Такие гидрогели состоят из самокомплементарных амфифильных пептидов и, образуя гель, они обеспечивают трехмерную структуру, имеющую много сходств с внеклеточным матриксом [T.C. Holmes. Novel peptide-based biomaterial scaffolds for tissue engineering // Trends Biotechnol. 2002. V. 20 (1). Р. 16-21].
Шелк: фиброин шелка - природный биополимер, также нашедший широкое применение в тканевой инженерии. Этот материал обладает впечатляющими механическими свойствами, устойчивостью, биосовместимостью, морфологической гибкостью, при этом деградируется управляемым протеолизом. В настоящий момент считается одним из наиболее перспективных биополимеров для создания скаффолдов для регенеративной медицины [C.Vepari and D.L. Kaplan. Silk as a biomaterial // Prog. Polym. Sci. 2007. V. 32. Р. 991-1007].
Синтетические полимеры
Полиэфиры: алифатические полиэфиры, такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота, поликапролактон, - наиболее широко используются в тканевой инженерии. Продукты их деградации являются естественными метаболитами и легко выводятся из организма человека. Трехмерные матриксы из таких материалов можно получить разнообразными методиками, а изменение молярных соотношений этих полимеров способно повлиять на механические свойства и скорость деградации материала [D.-X.Wang, Y.He, L.Bi, Z.-H. Qu, J.-W. Zou, Z.Pan, J.-J. Fan, L.Chen, X.Dong, X.-N. Liu, G.-X. Pei and J.-D. Ding, Enhancing the bioactivity of Poly(lacticco-glycolic acid) scaffold with a nano-hydroxyapatite coating for the treatment of segmental bone defect in a rabbit model // Int. J. Nanomedicine. 2013. V. 8. P. 1855-1865]. Сополимеры: в целом, сополимеры весьма привлекательны для тканевой инженерии, ввиду того, что их физико-химическими свойствами легко управлять. Динамика формирования гелей, плотность сшивки, механические свойства, скорость деградации - всем этим можно управлять, меняя молекулярные массы компонентов, структуры блоков, способы сшивки и вводя легко разрушаемые связи [J.L. Drury and D.J. Mooney. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications // Biomaterials. 2003. V. 24 (24). P. 4337-4351].
Керамика.
В течение последних четырех десятилетий керамика использовалась в медицинских целях для реконструирования, замены поврежденных частей тела, а также для восстановления скелета. Такой материал получил название биокерамика; она подразделяется на биоинертную и биоактивную, последняя делится на поглощающую и непоглощающую [J.E. Lemons. Ceramics: past, present and future // Bone. 1996. V.19 (1 Suppl). P. 121S-128S].
Биостекло обладает такими достоинствами, как: контролируемая скорость деградации, прекрасная остеокондуктивность, биоактивность и способность доставлять клетки, однако уступает по механическим свойствам, таким как прочность и жесткость [Q.Fu, E.Saiz, M.N. Rahaman and A.P. Tomsia. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives // Mater. Sci. Eng. C. Mater. Biol. Appl. 2011. V. 31 (7). Р. 1245-1256].
Более перспективным является использование композитных матриксов, обладающих широкой функциональностью, например, поверхностной активностью и биоактивностью, механической прочностью и способностью доставлять препараты и факторы роста. Они обладают преимуществом по сравнению с другими материалами за счет эффекта синергии получаемых на выходе свойств [M.M. Erol, V.
, P.Newby, X.Chatzistavrou, J.A. Roether, L.Hupa and A.R. Boccaccini. Copper-releasing, boron-containing bioactive glass-based scaffolds coated with alginate for bone tissue engineering // Acta Biomater. 2012. V. 8 (2). Р. 792-801]. В общем случае, композитные каркасы получают, используя различные типы матрицы с дисперсной фазой, например, полимер/керамика, керамика/металл, полимер/металл [Y.Liu, J.Lim and S.-H. Teoh. Review: development of clinically relevant scaffolds for vascularised bone tissue engineering // Biotechnol. Adv. 2012. V.31 (5). Р. 688-705].
Биокерамика (гидроксиапатит, трифосфат кальция и биоактивные стекла) рассматривается как перспективный материал для тканевой инженерии кости. Поскольку указанные соединения присутствуют в костной ткани они характеризуются хорошей биосовместимостью и остеоиндуктивными свойствами. Но применение биокерамики в чистом виде ограничивается плохими механическими свойства, в частности, хрупкостью. Идеальный скаффолд для регенерации фрагментов костей должен имитировать структуру костной ткани. Способность костных имплантатов поддерживать регенерацию тканей определяется их способностью привлекать остеогенные клетки, такие как остеобласты, остеоциты, а также мезенхимальные стволовые клетки (МСК), стимулировать рост клеток на поверхности матрикса и стимулировать в процессе формирования кости дифференцировку МСК в преостеобласты. Биомедицинские свойства фиброина шелка, такие как биосовместимость, хорошая проницаемость для воды и кислорода, нетоксичность, морфологическая гибкость позволяет рассматривать его в качестве перспективного материала для изготовления имплантатов для тканевой инженерии. Различными исследовательскими группами показано, что трансплантаты на основе фиброина успешно поддерживают регенерацию кишечника, восстановление нервной и костной ткани [Vepari С, Kaplan DL. Prog Polym Sci. 2007]. Показано, что скаффолд из фиброина шелка усиливает образование микрокапилляров вокруг и внутри матрикса при восстановлении костной ткани [Unger et al. J. Biomaterials. 2010]. В исследованиях регенерации костной ткани показали важность минерализации фиброинового скаффолда или использование его в виде композитного материала с фосфатами кальция или с гидроксиапатитом кальция. Композитный скаффолд с трифосфатом кальция имеет улучшенную пористую структуру и значительно увеличивает экспрессию остеогенных маркеров (ALP, коллагена 1 типа и остеокальцина) по сравнению с чистым фиброином. В другом исследовании было показано, что минерализация скаффолдов гидроксиапатитом повышает остеокондуктивную активность и механические свойства скаффолдов [Bhumiratana et al., G. Biomaterials. 2011]. Сравнительный анализ регенерации с использованием децеллюляризованной губчатой кости и минерализованного фиброинового скаффолда показал, что через определенное время восстанавливается костная ткань, увеличивается количество трабекул и расстояния между ними. Данные показатели при этом соответствовали децилляризованной кости в скаффолдах с 3,1% и 4,6% гидроксиаппатита. Остеогенные свойства субстратов могут модулироваться за счет растворимых остеогенных факторов. Таким фактором является BMP (костный морфогенетический белок). Опыты на животных и широкое клиническое применение рекомбинантных BMP продемонстрировали их эффективность в качестве активного стимулятора остеогенеза [Reddi et al., Biochem. Soc. Trans. 2000]. В настоящее время общепризнанным технологическим принципом применения BMP является его соединение с биодеградируемыми носителями, в качестве которых могут быть использованы природные полимеры. Перспективным системами для направленной доставки биологически активных веществ, стимулирующих регенерацию являются контейнеры из биоразлагаемых полимеров бактериального происхождения - полиоксиалканоатов (ПОА). Наличие высокопродуктивного бактериального штамма-продуцента ПОА и оригинальных технологий и высокотехнологичного оборудования для инкапсулирования лекарственных веществ позволяет в промышленных масштабах создавать контейнеры для биостимуляторов остеогенеза (например, ростовой фактор ВМР-2) и лекарственных веществ.
Из уровня техники известен многофункциональный биодеградируемый композит, выполненный на основе сополимера лактида и гликолида, применяемый в частности для регенерации костной ткани (см. патент ЕР 1646410 B1, BIORETEC OY [FI]). Данный композит может быть произведен в форме кости, хряща или мягкой ткани. В состав композита может быть включен активный агент, стимулирующий регенерацию ткани. Достоинством данного продукта, присущем также предлагаемому изобретению, является возможность включения в имплантат активных агентов. Недостатком, как было указано выше, является использование полилактогликолида, ухудшающего биологические свойства полученного продукта.
Также в уровне техники выявлены биоразлагаемые костно-хрящевые имплантаты различной формы, различного размера, содержащие пористую верхнюю и нижнюю части, разделенные барьером, непроницаемым для оказывающих вредное воздействие на регенерацию хряща агентам (US 2009164014 A1, ARTIMPLANT АВ [SE]). Имплантат или его верхняя часть могут иметь симметричную форму или форму параллелепипеда и содержат упругий полимерный материал, такой, как полиуретан мочевина. Имплантаты также могут быть выполнены в виде листового материала, из которого можно вырезать объект заданной формы. Анализируя преимущество предлагаемого изобретения, стоит отметить, что фиброин шелка обладает лучшей биосовместимостью по сравнению с полиуретан мочевиной, а его минерализация приводит к повышению остеокондуктивной активности и механических свойств имплантатов.
Патент ЕА000309 В1, действующий на территории РФ, раскрывает способ получения рассасываемого материала для замещения кости, содержащий низкокристаллический гидроксиапатит (ЭТЕКС КОРПОРЕЙШН (US)). Недостатком данного способа является применение гидроксиапатита в чистом виде, что приводит к ухудшению механических свойств имплантата.
На территории Российской Федерации также действует патент на гель для регенерации костной ткани, включающий полиэтиленгликоль в виде геля и дистиллированную воду, отличающийся тем, что он дополнительно содержит композицию ортофосфатов кальция. Достоинством данного изобретения является возможность его доставки в костный дефект закрытым способом. К недостаткам можно отнести, что данный способ не позволяет создавать трансплантата необходимой формы.
Еще один патент раскрывает способ получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения (RU 2396342). Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения. Данный способ предусматривает ковалентное связывание гистонов с поверхностью предварительно активированных биосовместимых полимерных микросфер из кристаллизованного декстрана. Затем проводят осаждение центрифугированием микросфер с ковалентно связанными гистонами. Полученный слой микросфер на поверхности субстрата с нанесенными на него клетками используют в качестве основы для получения тканеподобных клеточных структур. Представленное изобретение позволяет повысить надежность структуры и стабильность белкового слоя трехмерной матрицы, а также упростить и удешевить способ получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения, но обладает одним существенным недостатком, а именно, модификацию проводят природными катионными белками -гистонами из ткани тимуса телят, что повышает риск возникновения инфекционных заболеваний и/или иммунной реакции организма в ответ на трансплантацию и, как следствие, отторжение имплантата.
Еще одним примером носителя для осуществления восстановительных процессов после повреждения является следующее изобретение «Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения», RU 2519326. Предложенный биокомпозит содержит носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию. Предложены способы получения вышеуказанного биокомпозита и набор для его приготовления. Предложены также способ обеспечения заживления повреждения у млекопитающего и способ доставки нуклеиновой кислоты. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективную регенерацию тканей после повреждения у млекопитающего за счет использования трехкомпонентного биокомпозита, состоящего из носителя, по меньшей мере, одной нуклеиновой кислоты и клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию. Данное изобретение обладает значительными преимуществами, но при этом есть явные недостатки, в том числе данный способ является более сложным, т.к. включает стадии, осуществляемые методами молекулярной биологии, скорее всего, имеет более высокую стоимость по сравнению заявляемым, а также хранение такой многокомпонентной сложной системы предполагает строгие специфические условия.
Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения является продукция компании INION OY (FI), включающая пластины, сетки, винты для фиксации костных отломков, а также синтетический заменитель костного трансплантата для заполнения костных дефектов, не требующих стабилизации костной структуры, выполненная из полилактогликолида, раскрытая в патентных документах WO 2004108180 А1, WO 2008099190 А2. Данные изделия стимулируют костные клетки на этапе использования их как временного каркаса. Высокая пористость обеспечивает приток жидкости, клеток и питательных веществ к месту регенерации. Основным недостатком полилактогликолида как материала является локальное закисление продуктами его распада - молочной и гликолевых кислот, вследствие чего развивается асептическое воспаление и замедляются процессы остеогенеза. Предлагаемое изобретение лишено вышеуказанного недостатка.
Раскрытие изобретения
Задачей группы изобретений является разработка способа получения минерализованных композитных микроскаффолдов.
Поставленная задача решается способом получения минерализованного композитного микроскаффолда, включающего следующие стадии:
а) подготовку водного раствора фиброина шелка, путем растворения фиброина в смеси CaCl2:C2H5OH:Н2О при молярном соотношении компонентов смеси, обеспечивающем растворение в ней фиброина, в течение 5-7 часов при нагревании до 70°С±5°С и последующего диализа против воды, доведение полученного раствора водой до концентрации 20-30 мг/мл, при этом фиброина берут в количестве 100-150 мг/мл смеси;
б) подготовку водного раствора желатина, путем растворения сухого желатина в воде из расчета 20-30 мг/мл;
в) формирование композитного скаффолда путем заморозки в течение 6-8 суток при температуре - 18-25°С смеси растворов, полученных на стадиях а) и б), смешанных в объемном соотношении 7:3 с добавлением 0,8-1,2 об% ДМСО и последующей разморозки и обработки 96% этанолом для формирования β - складчатой структуры;
г) получение композитных микроскаффолдов путем криоизмелчения скаффолда, полученного на стадии в, в 96% этаноле с использованием диспергатора и сортировки полученных фрагментов скаффолда с получением микроскаффолдов размером 100-250 мкм;
д) получение минерализованных композитных микроскаффолдов путем погружения полученных на этапе г) микроскаффолдов сначала в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 3,5 мМ MgCl2, 21 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0, на 6-14 часов и затем погружение в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 0,7 мМ MgCl2, 10,5 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0, на 1-3 суток с последующим высушиванием полученного продукта.
Предпочтительно смесь CaCl2:C2H5OH:H2O берут в молярном соотношении компонентов 1:2:8.
Предпочтительно для формирования β - складчатой структуры обработку размороженного скаффолда 96% этанолом осуществляют не менее 10 часов.
Предпочтительно когда сортировку полученных фрагментов скаффолда осуществляют посредством последовательного пропускания суспензии микроскаффолдов через сита с диаметром отверстий 500, 250 и 100 мкм.
Поставленная задача также решается применением минерализованного композитного микроскаффолда, полученного вышеуказанным способом для восстановления костной ткани.
Техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений является усиление стимуляции остеогенеза в отсутствие каких-либо индукторов при упрощении технологии. Кроме того, невысокая стоимость сырья, используемого для реализации способа, в сочетании с уникальными свойствами позволит создать доступный конкурентоспособный продукт и занять лидирующие позиции в данной области, т.к. изделия на основе фиброина превосходят по биосовместимости существующие на рынке имплантаты для регенерации костной ткани, которые представлены в основном ксеноматериалами и изделиями из полилактогликолидов. Кроме того, важным техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений, является усиление стимуляции остеогенеза в отсутствие каких-либо индукторов, а также индукция реорганизации актинового цитоскелета, необходимой для успешной адгезии и дифференцировки остеобластов.
Основным преимуществом шелка по сравнению с другими природными биополимерами являются его отличные механические свойства. Другие важные преимущества шелка как материала для регенерации тканей: хорошая биосовместимость, возможность получения водных растворов, способность к биологическому разложению, термостабильность, присутствие легкодоступных химических групп для функциональных модификаций, возможность газовой стерилизации и устойчивость к радиации [Yahong Zhao, et al. // J. Biomedical Science and Engineering, 2011, V. 4, Р. 397-402].
В предлагаемом изобретении может использоваться фиброин шелка каркасной нити пауков, фиброин шелка тутового шелкопряда и других видов шелкопрядов, фиброин рекомбинантного шелка, а также искусственные аналоги шелка.
Группа изобретений также относится к минерализованным композитным микроскаффолдам для лечения и/или регенерации костной ткани, полученным вышеуказанным способом.
Минерализованные композитные микроскаффолды по настоящему изобретению могут применяться для регенерации костной ткани, в частности ретикулофиброзной и пластинчатой.
Кость является специализированной соединительной тканью и состоит из кальцинированного внеклеточного матрикса, содержащего коллаген типа I и гидроксиапатит в качестве основных компонентов. Т.о., средство для лечения и/или регенерации костных тканей должно не только обеспечивать прочность, но и являться источником гидроксиапатита. В этом контексте минерализация композитных микроскаффолдов на основе фиброина шелка может обеспечить преимущества ввиду его высокой прочности, а также хорошей биосовместимости.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами.
На фиг. 1 показана структура поверхности неминерализованных (А, В) и минерализованных (Б, Г) композитных микроскаффолдов на основе фиброина и желатина. Изображения получены методом сканирующей электронной микроскопии.
На фиг. 2 представлена структура актинового цитоскелета и оценка уровня экспрессии щелочной фосфатазы. (А-В) - актиновый цитоскелет остеобластоподобных клеток MG-63 в 2D-условиях при культивировании на стекле (А) и 3D-условиях (Б-В) при культивировании на композитных микроскаффолдов (Б) и минерализованных композитных микроскаффолдов (В). Актин выявлен с помощью фаллоидина, меченного флуоресцеинизотиоционатом. Представлена горизонтальная проекция серии оптических срезов на глубину 75 мкм с интервалом 0.13 мкм. Объектив CFI S Fluor × 100/1.30 Oil.
На фиг. 3 показана гистограмма оценки уровня экспрессии щелочной фосфатазы. А - Уровень ALP (М±m, n=6), нормированный на количество клеток по сигналу после окрашивания желтой солью тетразолия (МТТ) при культивировании на минерализованных композитных микроскаффолдов "ФЖ+" и неминерализованных "ФЖ-" композитных микроскаффолдов. Б - Уровень щелочной фосфатазы на 4 сутки культивирования в 2D условиях (пластик) и 3D - на композитных микроскаффолдах. В качестве положительного контроля использован индуктор остеогенеза - дексаметазон.
Осуществление изобретения.
Получение водного раствора фиброина шелка осуществляли с использованием Нитей хирургических нестерильных 100% натуральный шелк, произведенных по ГОСТ 396-84 (Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 396-84, наличие сертификата соответствия №0302120, гарантии производителя, срок годности, условия хранения по ГОСТ 396-84, сертификат соответствия), растворяя навеску в смеси dH2O, кальция хлористого (х.ч., о.с.ч., ГОСТ 450-77; Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 3885-73, наличие гарантии производителя, срок годности, внешний вид) и спирта этилового ректификованного 96% (ГОСТ 5962-67). Для получения композита готовили смесь водных растворов полимеров, используя раствор фиброина и водный раствор желатина (ГОСТу 23058-89). Формирование макроносителей для дальнейшего криоизмельчения с целью получения микроносителей проводили путем заморозки смеси водного раствора фиброина и водного раствора желатина с добавлением 1% ДМСО (х.ч., ТУ 2635-114-44493179-08). Криоизмельчение сформированных макроносителей выполняли с помощью диспергатора).
Все перечисленные выше процедуры осуществлялись с использованием следующего оборудования: Система очистки воды Elix 70, «Millipore» (Франция, система включает: картридж предварительной очистки Progard TL, картридж обратного осмоса, модуль Elix; производительность 70 л/час при температуре 7-30°С, рабочее давление 0,7-1,0 МПа, 220 В, 50 Гц, габариты (ШГВ): 662×441×733 мм, 56 кг); Резервуар для сбора очищенной воды SDS 200, «Millipore» (Франция, объем 200 л), Весы электронные RV 1502, «OHAUS» (США, (1500,00±0,01) г, 220 В, 50 Гц); Шкаф вытяжной 1200 ШВМкв (Россия, ООО «ЛаМО» макс. мощность подключаемых приборов 3,5 кВт, 220 В, габариты (ШГВ): 1280×750×2400 мм); Холодильник бытовой Атлант МХМ 1707-02 (Минск, Белоруссия, емкость камеры холодильника 175 л, температура от 0°С до 10°С, емкость мороз, камеры 115 л, температура минус 18 до минус 24°С, 220 В, 50 Гц); Диспергатор Bosch MSM 66150 ERGOMIXX (Словения, мощность 600 Вт, 220 В, погружной, турборежим, габариты (ВГШ): 210×620×550, вес: 1.15 кг); Центрифуга MiniSpin, «Eppindorf», (Германия, скорость вращения 13 400 об/мин, ротор F-45-12-11, 12×1,5/2 мл, 220 В, 70 Вт, габариты (ВГШ): 122×240×226 мм, 4,3 кг); Баня водяная BWT-U/20, Biosan (Латвия, ванна из н/ж стали объем 20 л. Диапазон регулирования температуры от 30°С до 100°С, точность поддержания температуры ±0,1°С, внутренняя циркуляция, внутр. размеры ванны: 300×320×140 мм, габариты: 345×550×290 мм, 11 кг, 220 В, 50 Гц, 1 кВт).
Для минерализации композитных микроскаффолдов использовали комерчески доступные реагенты степени чистоты х.ч. или о.с.ч. Минерализацию выполняли путем погружения полученных микроскаффолдов сначала в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 3,5 мМ MgCl2, 21 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0, на 6-14 часов и затем погружение в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 0,7 мМ MgCl2, 10,5 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0, на 1-3 суток с последующим высушиванием полученного продукта.
Ниже приведены примеры конкретного выполнения, которые не ограничивают сущность заявляемой группы изобретений.
Пример 1. Получение минерализованных композитных микроскаффолдов.
Фиброин растворяют в смеси CaCl2:С2Н5ОН:H2O (молярное соотношение 1:2:8) в течение 5 часов при температуре 70°С и диализуют против дистиллированной воды, проводя 4 смены диализа. Полученный раствор, содержащий фиброин и желатин, центрифугируют 10 минут при 13400 g, определяют концентрацию фиброина в супернатанте по ОД280, доводят концентрацию дистиллированной водой до 20 мг/мл и используют для формирования композитных скаффолдов. Желатин растворяют в дистиллированной воде из расчета 20 мг/мл и используют для формирования композитных скаффолдов. Смешивают полученные растворы фиброина и желатина в соотношении 7:3, добавляют 1% ДМСО, переносят в форму для формирования скаффолда и замораживают при -20°С 7 дней. Полученные композитные скаффолды в течение 120 минут обрабатывают 96%-ным этанолом.
Полученные композитные микроскаффолды замораживают в дистиллированной воде и криоизмельчают с использованием деспиргатора. Полученные фрагменты композитных микроскаффолдов сортируют путем последовательного пропускания через сита с диаметром отверстий 500 мкм, 250 мкм и 100 мкм. композитные микроскаффолды погружают на 6 часов или на ночь в раствор А, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 3,5 мМ MgCl2, 21 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0. Затем переносили в раствор Б следующего состава: 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 0,7 мМ MgCl2, 10,5 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0, на 1 или 3 суток.
Содержание минерального компонента в составе экспериментальных образцов разрабатываемых изделий для ускорения заживления и регенерации костной ткани определяли по формуле, приведенной ниже:
Содержание минерального компонента, %=(масса минерализованных образцов -масса исходная/масса минерализованных образцов) × 100%
Полученные результаты представлены в таблице 1.
Представленные в Таблице 1 данные указывают на высокое содержание минерального компонента в составе полученного матрикса.
Полученные экспериментальные образцы подвергают испытаниям на стабильность в водных растворах, полученные результаты сравнивают с неминерализованными микроскаффолдами на основе фиброина шелка и желатина. Как минерализованные композитные микроскаффолды, так и неминерализованные микроскаффолда на основе фиброина шелка и желатина оставались стабильными при физиологических условиях в течение 3-х месяцев. Это является очень важным свойством изделий, так как разрушение и изменение базовой структуры и физических свойств имплантата в водной среде может сделать невозможным его применение для работы in vivo. Изделия не обладают какими-либо значительными гигроскопичными свойствами и не набухают, что позволяет им сохранить заданные при изготовлении параметры.
Пример 2. Исследование биологических свойств минерализованных композитных микроскаффолдов.
Данное исследование проведено на линии MG-63 остеобластоподобных клеток человека, способных дифференцироваться в остеобласты в ответ на воздействия индукторов остеогенеза. В качестве контроля использовали неминерализованные композитные микроскаффолды на основе фиброина шелка и желатина.
В первый день культивирования в 20-условиях клетки MG-63 представляли собой распластанные клетки с выраженными актиновыми стресс-фибриллами, вытянутыми на всю длину (рис. 2А). В отличие от этого, при культивировании на композитных микроскаффолдах (контроль) цитоскелет клеток MG-63 был реорганизован: наблюдалось образование кортикального и глобулярного актина, при этом формирование стресс-фибрилл было существенно снижено (рис. 2Б).
На минерализованных композитных микроскаффолдах реорганизация цитоскелета была более выражена по сравнению с контролем: стресс-фибриллы практически отсутствовали, актин был представлен в основном глобулярной формой (рис. 2В).
Пример 3. Определение уровня щелочной фосфатазы.
Фермент щелочная фосфатаза является маркером остеогенеза, и повышение ее уровня указывает на усиление остеогенеза.
Экспрессию в 2D- и 3D-условиях сравнили с экспрессией, индуцированной 10-8 М дексаметазона, являющегося индуктором остеогенеза (рис. 2В). Культивирование в 3D-условиях на композитных микроскаффолдах способствовало повышению уровня щелочной фосфатазы, что указывает на способность фрагментов 3D скаффолдов к стимулированию остеогенеза даже в отсутствие индукторов. При индукции дексаметазоном различия в уровнях щелочной фосфатазы при культивировании в 2D- и 3D-условиях не были выявлены. Минерализация композитных микроскаффолдов усиливала их остеогенный эффект. Через 24 ч культивирования клеток MG-63 на минерализованных композитных микроскаффолдах уровень сигнала, отражающий активность щелочной фосфатазы, был почти в три раза выше, чем при их культивировании на неминерализованных композитных микроскаффолдах.
Таким образом, приведенный пример показывает преимущества предлагаемых минерализованных композитных микроскаффолдов над прототипом в отношении реорганизации актинового цитоскелета и усиления стимуляции остеогенеза в отсутствие каких-либо индукторов, что позволяет успешно применять их для регенерации костной ткани, в частности лечения травм, устранения дефектов, сращения переломов, ортопедической косметологии.
Claims (7)
1. Способ получения минерализованного композитного микроскаффолда для регенерации костной ткани, включающий следующие стадии:
а) подготовку водного раствора фиброина шелка путем растворения фиброина в смеси CaCl2:C2H5OH:H2O при молярном соотношении компонентов 1:2:8 в течение 5-7 часов при нагревании до 70°C±5°C и последующего диализа против воды, доведение полученного раствора водой до концентрации 20-30 мг/мл, при этом фиброина берут в количестве 100-150 мг/мл смеси;
б) подготовку водного раствора желатина путем растворения сухого желатина в воде из расчета 20-30 мг/мл;
в) формирование композитного скаффолда путем заморозки в течение 6-8 суток при температуре –(18-25)°C смеси растворов, полученных на стадиях а) и б), смешанных в объемном соотношении 7:3 с добавлением 0,8-1,2 об.% ДМСО, и последующей разморозки и обработки 96% этанолом не менее 10 часов для формирования β-складчатой структуры;
г) получение композитных микроскаффолдов путем криоизмелчения скаффолда, полученного на стадии в), в 96% этаноле с использованием диспергатора и сортировки полученных фрагментов скаффолда с получением микроскаффолдов размером 100-250 мкм;
д) получение минерализованных композитных микроскаффолдов путем погружения полученных на этапе г) микроскаффолдов сначала в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 3,5 мМ MgCl2, 21 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0, на 6-14 часов и затем погружения в водный раствор, содержащий 684 мМ NaCl, 9,5 мМ CaCl2, 0,7 мМ MgCl2, 10,5 мМ NaHCO3 и 4 мМ Na2HPO4, рН 4,0, на 1-3 суток с последующим высушиванием полученного продукта.
2. Применение минерализованного композитного микроскаффолда, полученного способом по п. 1, для восстановления костной ткани.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152064A RU2660558C2 (ru) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Способ получения минерализованных композитных микроскаффолдов для регенерации костной ткани |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016152064A RU2660558C2 (ru) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Способ получения минерализованных композитных микроскаффолдов для регенерации костной ткани |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016152064A3 RU2016152064A3 (ru) | 2018-07-02 |
| RU2016152064A RU2016152064A (ru) | 2018-07-02 |
| RU2660558C2 true RU2660558C2 (ru) | 2018-07-06 |
Family
ID=62813874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016152064A RU2660558C2 (ru) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Способ получения минерализованных композитных микроскаффолдов для регенерации костной ткани |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2660558C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2756551C2 (ru) * | 2019-12-30 | 2021-10-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева" (РХТУ им. Д.И. Менделеева) | Биосовместимый биоразлагаемый скаффолд на основе полимерного композита, содержащего наночастицы гидроксиапатита |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2208482A1 (en) * | 2007-10-12 | 2010-07-21 | Microport Medical (Shanghai) Co., Ltd. | An artificial stent and its preparation method |
-
2016
- 2016-12-28 RU RU2016152064A patent/RU2660558C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2208482A1 (en) * | 2007-10-12 | 2010-07-21 | Microport Medical (Shanghai) Co., Ltd. | An artificial stent and its preparation method |
Non-Patent Citations (11)
| Title |
|---|
| Bhumiratana S. et al. Biomaterials, 2011, 32 (11), 2812-2820. * |
| Midha S. et al. Materials Science and Engineering C, 01.11.2016, 68, 663-674. * |
| Moisenovich M.M. et al. Acta Naturae, 2014, 6 (1), 96-101. * |
| Orlova A.A. et al. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2014, 158 (1), 88-91. * |
| Orlova A.A. et al. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2014, 158 (1), 88-91. Мойсенович М.М. и др. Терапевтический архив, 2015, 12, 66-72. Yang L. et al. Biomedical Materials, 2010, 5, 1-10. * |
| Rockwood D.N. et al. Nature Protocols, 2012, 6 (10), 1-43. * |
| Safonova L.A. et al. Modern technologies in medicine, 2015, 7(3), 6-12. * |
| Safonova L.A. et al. Modern technologies in medicine, 2015, 7(3), 6-12. Wang Y. et al. International Journal of Nanomedicine, 12.05.2016, 11, 2053-2067. Bhumiratana S. et al. Biomaterials, 2011, 32 (11), 2812-2820. Rockwood D.N. et al. Nature Protocols, 2012, 6 (10), 1-43. Moisenovich M.M. et al. Acta Naturae, 2014, 6 (1), 96-101. Midha S. et al. Materials Science and Engineering C, 01.11.2016, 68, 663-674. Takeuchi A. et al. Wiley Periodicals, 2003, 283-289. * |
| Takeuchi A. et al. Wiley Periodicals, 2003, 283-289. * |
| Wang Y. et al. International Journal of Nanomedicine, 12.05.2016, 11, 2053-2067. * |
| Мойсенович М.М. и др. Терапевтический архив, 2015, 12, 66-72. Yang L. et al. Biomedical Materials, 2010, 5, 1-10. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2756551C2 (ru) * | 2019-12-30 | 2021-10-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева" (РХТУ им. Д.И. Менделеева) | Биосовместимый биоразлагаемый скаффолд на основе полимерного композита, содержащего наночастицы гидроксиапатита |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016152064A3 (ru) | 2018-07-02 |
| RU2016152064A (ru) | 2018-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tahmasebi et al. | Current biocompatible materials in oral regeneration: a comprehensive overview of composite materials | |
| Sowmya et al. | Role of nanostructured biopolymers and bioceramics in enamel, dentin and periodontal tissue regeneration | |
| Zhang et al. | Stem cell-friendly scaffold biomaterials: applications for bone tissue engineering and regenerative medicine | |
| Basha et al. | Design of biocomposite materials for bone tissue regeneration | |
| Bessa et al. | Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from laboratory to clinic, part II (BMP delivery) | |
| Ferreira et al. | Collagen for bone tissue regeneration | |
| US11173233B2 (en) | Keratin bioceramic compositions | |
| JP5406915B2 (ja) | 生体適合性インプラント | |
| He et al. | Biofunctionalized peptide nanofiber-based composite scaffolds for bone regeneration | |
| Wang et al. | Recent advances in biofunctional guided bone regeneration materials for repairing defective alveolar and maxillofacial bone: A review | |
| Lou et al. | Periosteal tissue engineering: current developments and perspectives | |
| US20100317587A1 (en) | Injectable bone regeneration gel containing bone formation enhancing peptide | |
| JPH01232967A (ja) | 生分解性および骨形成性を有する移植骨片代用組成体 | |
| Lagares | Nanobiomaterials in hard tissue engineering | |
| Tripathy et al. | Hybrid composite biomaterials | |
| Ribeiro et al. | Hierarchical HRP-crosslinked silk fibroin/ZnSr-TCP scaffolds for osteochondral tissue regeneration: Assessment of the mechanical and antibacterial properties | |
| Ghosh et al. | Bio mimicking of extracellular matrix | |
| US20090216336A1 (en) | Bioresorbable, mineralised material for filling osseous defects | |
| Pina et al. | Biocomposites and bioceramics in tissue engineering: beyond the next decade | |
| RU2660558C2 (ru) | Способ получения минерализованных композитных микроскаффолдов для регенерации костной ткани | |
| Nijsure et al. | Collagen-based scaffolds for bone tissue engineering applications | |
| Maaruf et al. | Angiogenic and Osteogenic Properties of Fibrin in Bone Tissue Engineering. | |
| Yun et al. | Local delivery of recombinant human bone morphogenic protein-2 (rhBMP-2) from rhBMP-2/heparin complex fixed to a chitosan scaffold enhances osteoblast behavior | |
| Yaremenko et al. | Prospectives for using artificial scaffolds in oral and craniofacial surgery: Literature review | |
| Sezer et al. | In vivo performance of poly (ε-caprolactone) constructs loaded with gentamicin releasing composite microspheres for use in bone regeneration |