CN102271724B

CN102271724B - 含有甘油的改性丝膜

Info

Publication number: CN102271724B
Application number: CN200980147082.XA
Authority: CN
Inventors: 卢神州; 王晓沁; 菲奥伦佐·奥米内托; 戴维·L·卡普兰
Original assignee: Tufts University
Current assignee: Tufts University
Priority date: 2008-10-09
Filing date: 2009-10-09
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2029-10-09
Also published as: HK1161142A1; MX2011003618A; EP2349367A4; AU2009302192A1; AU2009302192B2; JP5896743B2; CN105268020A; US10493179B2; WO2010042798A3; HK1220645A1; IL212143A0; EP2349367A2; US20110223153A1; JP2012505297A; CA2739487A1; BRPI0920453A2; WO2010042798A2; US20160038637A1; KR20110094277A; CN102271724A

Abstract

本发明提供用于制备不溶于水、展延性、柔性的丝纤蛋白膜的组合物和方法。这种丝膜含有丝纤蛋白和约10％～50％(w/w)的甘油，并通过完全的含水过程制备。这种展延性丝膜可以通过从丝膜提取甘油并将丝膜再次干燥而进一步处理。可以将活性剂嵌入甘油改性的丝膜或者沉积于其上，从而适于多种医疗应用。这种膜可以成型为三维结构，或者放在支撑表面上作为标签或涂层。本发明的甘油改性的丝膜可用于多种应用，如组织工程、医疗装置或植入体、药物递送以及可食用药物或食品标签。

Description

含有甘油的改性丝膜

政府支持

本发明是在由美国国家卫生研究院授予的资助金号EB002520和美国空军科学研究处授予的资助金号FA9550-07-1-0079的政府支持下完成的。美国联邦政府对本发明拥有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请根据35USC.§119(e)要求于2008年10月9日提交的美国临时申请号61/104,135的优先权，在此将其内容整体引入作为参考。

技术领域

本发明提供用于制备含有甘油并具有改进的机械性能的丝纤蛋白(silk fibroin)膜的组合物和方法。

背景技术

丝纤蛋白具有优异的成膜能力，并且也适合用在人体中。由于占主导的无规卷曲的蛋白结构，因而未经进一步操作或处理的丝纤蛋白膜可溶于水。通过若干处理，可以将蛋白的结构特征从无规卷曲转变成β-折叠结构，所述处理包括机械拉伸、在极性有机溶剂中浸渍或在水蒸汽中固化。这种结构转变导致水不溶性，因此提供将材料用于一定范围的生物医学和其他应用的选择。一些纯的丝纤蛋白膜趋于随着时间在干状态下变硬和变脆，然而却表现出令人印象深刻的抗拉强度，但是展延性低。仍然需要改变丝纤蛋白膜的物理和机械性能，以改善机械性能并提供用于生物医学和其他应用的更为柔性的基于丝纤蛋白的体系。

发明内容

本发明提供含有丝纤蛋白和甘油的膜，与缺乏甘油的丝纤蛋白膜相比，它具有不同的性能。更具体地说，通过使用或者包含并使用甘油作为增塑剂，水溶性和生物适应性得到提高。在水中处理丝纤蛋白也提高了生物适应性和负载生物活性化合物而无损功能的潜力，并为这些生物材料增加了“绿色化学”价值。例如，流延成膜的甘油浓度超过30％(w/w)的丝纤蛋白和甘油的共混物引起丝二级结构从无规卷曲转变成α-螺旋，防止丝经水合而溶解，提供了不同的膜纳米结构形态，改进了膜在干(流延后未经处理(as-cast)的膜)或湿(浸出甘油后)环境中的柔性，并保持细胞生物适应性。在机械上，甘油可以在丝纤蛋白链水合中替换水，与无规卷曲或β-折叠结构相反，引起螺旋结构的初始稳定化。甘油对稳定化的膜结构、水不溶性和功能的影响在甘油浓度超过约20wt％甘油时明显发生。在材料处理中甘油与丝纤蛋白的组合使用扩大了可由纤维状蛋白得到的功能特征，并且形成在生物材料和装置应用中具有潜在用途的更为柔性的膜。

本发明提供一种丝膜，其含有丝纤蛋白和约10％～50％(w/w)的甘油，其中所述膜通过完全含水过程制备，并且所述丝膜具有延展性且基本不溶于水。本发明的丝/甘油共混物膜的许多实施方案任选地经过甲醇处理或水退火表现出比缺乏甘油的丝膜更高的展延性。尽管不限于理论的束缚，但是丝纤蛋白膜中的甘油似乎使丝纤蛋白的α-螺旋结构稳定。因此，在一个实施方案中，通过从丝膜提取甘油并将膜再次干燥，可以将展延性丝纤蛋白膜从α-螺旋结构转化成β-折叠结构。

在一个实施方案中，含有甘油改性的丝膜的组合物可以用作用于组织工程的二维或三维构建体，并且还可含有至少一种活性剂。这种组织工程的构建体可用于器官修复、器官替换或其他再生组织材料(如心肌或角膜组织)。三维组织工程的实施方案可以通过在装置或植入体(如牙科植入体)周围用展延性丝/甘油膜缠绕或成型，并使膜干燥而完成。丝/甘油共混物可以形成或者膜可以折叠或成型成海绵或阻塞物或其他三维结构。任选地，然后可以将甘油从丝中浸出。因此，通过用丝/甘油展延性膜涂布生物医学材料(如医疗装置、组织工程的材料或植入体)的表面，丝膜也可用作这些结构上的涂层。从这种改性丝膜形成的涂层提供了改善的相容性并良好地符合基材轮廓。

在另一个实施方案中，含有甘油的丝纤蛋白膜是一种包括基于丝的结构(如丝纤蛋白纳米球(nanosphere)或微米球(microsphere))并任选含有活性剂的复合材料。另外，丝复合材料可以包括基于丝的复合物的支撑表面，如医疗植入体或装置的三维结构，展延性甘油/丝膜在其上成型。

本发明的实施方案也提供制备基本不溶于水的丝膜的方法，所述方法包括：将丝纤蛋白溶液与甘油共混，其中甘油在丝纤蛋白/甘油共混物溶液中的浓度为约10％～50％(w/w)；在膜支撑表面上流延所述丝纤蛋白/甘油共混物溶液；和将膜干燥。通过该过程制备的丝膜与缺乏甘油的丝膜相比表现出增大的展延性。

通过在流延和干燥膜之前，将丝纤蛋白溶液与至少一种活性剂及甘油共混，可以将至少一种活性剂嵌在展延性丝膜中。类似地，可以将细胞或组织嵌在丝/甘油共混物膜中。

附图说明

图1显示来自共混物膜的丝和甘油的溶解数据。^*组间的显著差异(p＜0.01)。数据表示平均值(ave)±标准偏差(SD)(n＝4)。

图2A-2C显示具有不同甘油含量的共混物膜中的丝二级结构的FTIR测量。图2A：膜流延后即刻的共混物膜。图2B：90％(v/v)甲醇处理1小时后的共混物膜。图2C：经水处理1小时和未经水处理的20％(w/w)甘油膜。^*组间的显著差异(p＜0.01)。数据表示ave±SD(n＝4)。

图3A-3D表示具有不同甘油含量的共混物膜的机械性能。图3A，抗拉强度。图3B，断裂伸长率。图3C，干共混物膜的拉伸模量。图3D，水处理1小时后的湿共混物膜的拉伸模量。^*组间的显著差异(p＜0.01)。数据表示ave±SD(n＝5)。

图4A-4D显示共混物膜的SEM图像。图4A，甘油含量10％(w/w)。图4B，甘油含量20％(w/w)。图4C，甘油含量30％(w/w)，经水处理1小时。图4D，甘油含量0％，经甲醇处理1小时。标尺(scale bar)＝200nm。

图5A-5D是显示经水处理的含有30％(w/w)甘油丝膜中的纳米丝结构的显微照片。图5A和图5D显示膜中的不同区域。图5B，图5A的高倍放大。图5C，图5A的侧视图。图5E，图5D的高倍放大。在图5A、图5C、图5D中，标尺＝200nm；在图5B、图5E中，标尺＝100nm。

图6A和图6B说明成纤维细胞在不同表面上的附着和增殖。图6A显示在30％(w/w)甘油/丝膜、纯丝膜和组织培养塑料(TCP)上培养的成纤维细胞的显微图像。图6B显示成纤维细胞在不同膜上的附着。图6C显示成纤维细胞在不同膜上的增殖。数据表示ave±SD(n＝6)。标尺＝50μm。

图7是甘油共混的丝膜中的丝结构转变的示意图。

具体实施方式

应当理解，本发明并不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，这些都可以变化。本文所使用的术语其目的仅仅在于描述特定的实施方案，并不意味着对本发明范围的限定，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。

在本文及权利要求书中所用的单数形式也包含复数的含义，反之亦然，除非文中另行明确指出。除了在操作实施例中或另外指出的情况以外，本文用以表示组分的量或反应条件的所有数值在所有情况下都应理解为由术语“约”修饰。

出于记载和公开的目的，在此以引用的方式清楚地将本发明指明的所有专利文献和出版物并入，例如，在这些出版物中描述的可用于本发明的方法学。提供这些出版物仅仅是因为它们的公开早于本申请的申请日。在这一点上，任何事物不应被解释为对本发明者无权因在先发明或因任何其他原因使本发明的内容早于这些公开内容的承认。所有关于日期的陈述或关于这些文件内容的表达均基于申请人可以获得的信息，不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实施或测试中可使用任何已知的方法、装置和原料，但是在这方面本文仍对方法、装置和原料进行了描述。

丝纤蛋白具有优异的成膜能力，并且也适合用在人体中。Altman等人，24 Biomats.，401-16(2003)；Vepari&Kaplan，32 Prog.Polym.Sci.991-1007(2007)。丝纤蛋白膜在湿的状态下具有良好的溶解氧渗透性，与人皮肤类似，表明这些膜在创伤敷料和人造皮肤系统中的潜在应用。Minoura等人，11 Biomats.，430-34(1990)；Minoura等人，31 Polymer，265-69(1990a)。然而，由于占主导的无规卷曲的蛋白结构，因而未经进一步操作的由丝纤蛋白形成的膜可溶于水。通过热处理(Hu等人，41Macromolecules 3939-48(2008))、机械拉伸(Jin&Kaplan，424 Nature1057-61(2003))、在极性有机溶剂中浸渍(Canetti等人，28Biopolymers-Peptide Sci.§1613-24(1989))和在水蒸汽中固化(Jin等人，15Adv.Funct.Mat.1241-47(2005))，可以将蛋白的结构特征从无规卷曲转变成β-折叠形式。这种结构转变导致水不溶性，因此提供将材料用于一定范围的生物医学和其他应用如传感器平台的选择。Zhang，16Biotechnol.Adv.961-71(1998)。一些纯的丝纤蛋白膜趋于随着时间在干状态下变硬和变脆，然而却表现出令人印象深刻的抗拉强度，但是伸长率低。Jin等人，2005。因此，仍然需要改变丝膜的物理和机械性能，以主要是向着更为柔性的体系来控制性能。

将聚合物与增塑剂共混是实现上述展延性和抗拉强度的传统方法。例如，一些研究表明，可以通过将丝与其他合成或天然聚合物共混而改变丝膜性能，所述的聚合物例如是藻酸盐、聚烯丙胺、壳聚糖、纤维素、聚(己内酯-共-D，L-丙交酯)、S-羧甲基角蛋白、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇和聚环氧乙烷。参见Liang&Hirabayashi，45 J.Appl.Polymer Sci.1937-43(1992)；Arai等人，84 J.Appl.Polymer Sci.1963-70(2002)；Kitagawa&Yabuki，80 J.Appl.Polymer Sci.928-34(2001)；Noishiki等人，86 J.Appl.Polymer Sci.3425-29(2002)；Kesenci等人，12 J.Biomats.Sci.Polymer Ed.337-51(2001)；Lee等人，9 J.Biomats.Sci.Polymer Ed.905-14(1998)；Tsukada等人，32 J.Polymer Sci.B，243-48(1994)；Gotoh等人，38 Polymer487-90(1997)；Jin等人，5 Biomacromols.711-17(2004)。例如，丝纤蛋白和PEO的共混物显示出材料稳定化(Jin等人，2004；Jin等人，3Biomacromol.1233-39(2002))，并且将水用作增塑剂可以改善膜性能(Jin等人，2005)。

然而，在很多情况下，改进共混物以影响机械性能仍有挑战。特别是，在产生长时间范围内保持稳定性的体系的同时避免加入其他聚合物仍是一个目标。因此，本发明提供了可选的增塑剂选择：特别是，甘油。以前，将丝纤蛋白膜浸在10％甘油中(10分钟，95℃)，并在富湿度的干燥器中调节，以进行I型丝到II型丝的晶体变换。Kawahara等人，291Macromol.Mater.Eng.458-62(2006)。此外，加入3％～8％甘油减小了丝纤蛋白/PVA共混物的相分离。Dai等人，86 J.Appl.Polymer Sci.2342-47(2002)。在这两种方法中，通过将脱胶丝在CaCl₂/CH₃CH₂OH/H₂O的三元溶剂体系中溶解而产生丝纤蛋白溶液。

在本发明的方法中，甘油和水性溶解的丝纤蛋白溶液共混，然后流延成膜。对这些膜的机械性能和结构特征进行评价，以更好地了解丝纤蛋白和甘油之间的相互作用。丝纤蛋白和甘油之间的特定相互作用对膜性能提供了益处，或许通过影响丝纤蛋白在形成作为膜中的稳定化物理交联的β-折叠时的结晶行为而实现，不必加入其他聚合物。

本发明也提供具有不同水溶解性的丝膜，以及通过将丝纤蛋白溶液和适量甘油共混而调节丝膜的溶解性的方法。特别地，通过紫外线吸光度来测量丝纤蛋白从丝/甘油共混物膜的水中溶出，这是因为丝纤蛋白具有显著的酪氨酸含量(＞5摩尔％)，与甘油不同，酪氨酸在280nm波长下存在吸收。在第1个小时的快速初始重量损失后，没有发现残余质量和溶解的丝含量随着时间的进一步显著差异(图1)。当丝/甘油共混物膜中的甘油含量为2％和5％(w/w)时，膜完全溶于水，类似于不含甘油的对照丝膜(图1)。因此，浓度低于约5％(w/w)的甘油看来并未显著改变丝膜性能。

当膜中的甘油含量从约10％增大到约20％(w/w)时，保持不溶的残余膜质量分别从约10％增大到约75％(p＜0.01，图1)。进一步增大甘油至约30％(w/w)，进一步减小了溶解度，但结果与20％甘油数据相比在统计学上不显著。这些结果表明，20％(w/w)甘油是诱发丝膜性能显著变化而导致材料在水中基本不溶(即，在水溶液中浸泡后保持约75％的残余质量)的浓度。当甘油含量显著低于20％(w/w)时，溶于水中的丝量随着甘油含量增大而减小。在20％(w/w)甘油时，总丝质量的小于5％溶于水中，比10％(w/w)甘油膜低得多(p＜0.01，图1)。根据残余质量测定，20％(w/w)甘油膜在水中失去大约25％的总质量。因此，在比较溶解的材料的质量、初始甘油含量和紫外线吸光度时，含有大于约30％(w/w)甘油的共混物膜在水中失去几乎所有的甘油，同时丝纤蛋白在膜中保持稳定，这可能是由于丝结构中甘油诱发的变化。在降低的甘油含量下未观察到该结果。

由甘油含量造成的膜溶解度变化表明甘油诱发了丝纤蛋白中的结构变化。丝纤蛋白变成水不溶性纤维的自组装过程伴随有β-折叠结构含量(或II型丝、或晶体结构)的增大。Kaplan等人，Protein Based Mats.，103-31(McGrath编，Birkhauser，Boston，MA，1998)；Motta等人，203 Macromol.Chem.Phys.1658-65(2002)；Chen等人，89 Biophys.Chem.25-34(2001)。在体外，II型丝结构可以通过溶剂处理获得，如用甲醇和乙醇处理。流延丝膜在水退火后(将流延膜暴露于水蒸汽中24小时)表现出稳定的I型丝结构，具有增大的II型β-转角。Jin等人，2005。一旦形成，经水退火的膜中的I型丝结构即使用甲醇处理也不转变成II型丝结构。在本发明的丝纤蛋白/甘油膜中，α-螺旋结构含量明显增至达到约50％，而甘油含量高于10％(w/w)的共混物膜中的β-转角含量减小(p＜0.01，图2A)。这些结构变化不同于在没有甘油时制备的经甲醇处理的丝膜和经水退火的丝膜中观察到的变化。

当膜中的甘油含量从约10％增大到约20％(w/w)时，二级结构含量保持相对不变。因此，稳定的α-螺旋结构明显主导了甘油共混的材料。对于使用Langmuir-Blodgett技术的丝，之前已经报道了在空气-水界面上的三重螺旋晶体结构(III型丝)，这反映了丝的双亲特征(Valluzzi等人，24Int’l J.Biol.Macromol.237-42(1999))，但在甘油改性的丝材料中不是这样。如果压缩力大于35mNm^-1，则III型丝结构可以转变成更稳定的II型丝。沿着螺旋和链轴取向的氨基酸侧链分布已在这些研究中很好地表征。Valluzzi等人，1999。对于甘油/丝纤蛋白共混物膜，在甲醇处理后，β-折叠结构含量增大到约50％～60％，而α-螺旋结构含量减小到约20％，不管膜中的甘油含量如何(图2B)。就甲醇诱发的结构转变而言，这种响应不同于在经水退火的丝膜中所观察到的，在经水退火的丝膜中经甲醇处理未发生从α-螺旋到β-折叠的构象转变。Jin等人，2005。此外，在20％(w/w)甘油共混的丝膜用水漂洗并在空气中再次干燥后，α-螺旋结构含量减小，而β-折叠和β-转角结构含量分别增大到大约45％和20％(p＜0.01，图2C)。因此，对于甘油共混物丝膜，通过将甘油浸出并将膜再次干燥可以获得稳定的II型丝结构(晶体，β-折叠)。

在机械上，甘油似乎改变丝纤蛋白分子内和分子间的相互作用并导致从无规卷曲到α-螺旋的构象转变，α-螺旋通常被认为是朝向稳定的β-折叠结构形成的不稳定中间状态。甘油的存在似乎使α-螺旋结构稳定，但防止向β-折叠结构的进一步转变。似乎甘油的浓度可以达到临界水平以实现这种结构控制程度。对于20％和50％(w/w)甘油/丝纤蛋白共混物膜，甘油和丝纤蛋白之间的摩尔比分别为大约1000∶1和4000∶1。在将甘油浸出的水溶液中浸渍后，共混物膜仍可含有一些α-螺旋结构，这很可能是由于残余的结合甘油分子的稳定化效果。这可能是湿膜(在水中浸渍)与甲醇处理后的不含甘油的膜相比保持柔性的原因。由于丝浓度以及丝纤蛋白分子之间的分子间相互作用增大，因而从α-螺旋到β-折叠的丝结构转变可以在膜的再次干燥过程期间发生。结果，经过再次干燥的膜变得有些脆，类似于经过甲醇处理的丝纤蛋白膜。

如本文所定义的，“干共混物膜”指的是通过直接流延丝纤蛋白/甘油共混物溶液以形成膜，然后将膜干燥过夜而制备的丝膜。“湿共混物膜”指的是相同的经过流延和干燥的膜，其随后在37℃的超纯水中浸渍并提取1小时，将甘油溶出，并在空气中再次干燥。因此，干环境指的是得到“流延后未经处理(as-cast)”的丝纤蛋白/甘油共混物膜的环境，湿环境指的是包括进一步处理“流延后未经处理”的丝纤蛋白/甘油共混物膜以从该膜取出甘油的步骤。

也检验了本发明的丝纤蛋白/甘油膜的机械性能。干共混物膜的抗拉强度随着膜中的甘油含量的变化而变化。当甘油含量从0％增大到约20％(w/w)时，抗拉强度从约8MPa显著增大到约13MPa(p＜0.01，图3A)。当甘油含量增大超过20％时，抗拉强度显著减小。在40％的甘油时，抗拉强度为约4MPa，显著低于0％和20％(w/w)甘油膜的抗拉强度(p＜0.01，图3A)。甘油缺失的膜(甘油浸出后的膜)的抗拉强度未随着甘油含量的变化而显著变化，所有样品经测定小于2MPa(p＞0.05，图3A)。对于干共混物膜，当甘油含量低于20％(w/w)时，断裂伸长率保持很低(低于3％)。当甘油含量增大到30％和40％(w/w)时，这些值显著增大到大约150％。在50％(w/w)的甘油时，断裂伸长率值减小到小于20％。该趋势类似于抗拉强度，除了在30％～40％(w/w)的甘油时获得最高断裂伸长率，而不是在获得最高抗拉强度的20％(w/w)的甘油时。对于湿共混物膜，20％(w/w)甘油膜的断裂伸长率为约27％，显著高于0％和40％甘油膜的断裂伸长率(分别为14％和8％)(p＜0.01，图3B)。因此，与没有甘油的经甲醇处理的丝膜相比，甘油共混物膜在干湿两种状态下都具有更高的展延性，这对于许多应用是有用的性能。

甘油-丝膜的展延性也大于经水退火的丝膜的展延性，因为经水退火的膜表现出约6％的断裂伸长率(Jin等人，2005)，这是本文提出的30％甘油丝膜的断裂伸长率的1/25。游离水含量也可能影响丝膜的柔性。Kawahara等人，2006。含有甘油的共混物可以保持丝膜中的游离水含量，因此改善膜的柔性。甘油在丝纤蛋白的螺旋含量中的作用也可以在膜的机械性能中起作用。当甘油含量从0％增大到40％(w/w)时，干共混物膜的拉伸模量减小到约1/17，湿共混物膜的拉伸模量减小到约1/2.5(图3C和图3D)。显然，共混物中的甘油越多，膜在机械上越弱，并且这种影响对干共混物膜更显著。干丝纤蛋白/甘油共混物膜的拉伸模量比相应的甘油缺失(已从中浸出甘油)的湿共混物膜的拉伸模量高出超过100倍。

通过形态表征来分析丝共混物膜中的丝纤蛋白的纳米结构，以进一步评价甘油对膜性能的影响。在液氮中使丝膜断裂，并通过SEM检验膜的截面。当甘油含量为10％(w/w)时，丝纤蛋白形成直径为100nm～200nm的球状纳米结构。然而，当20％(w/w)甘油共混在膜中时，未观察到球体：当通过SEM观察时共混物膜具有相对平滑的形态(图4B)。这些结果表明，高甘油含量(＞20％w/w)影响丝纤蛋白的自组装和纳米结构特征。有趣的是，当20％(w/w)甘油丝膜用水处理以浸出甘油然后在空气中再次干燥时，丝纤蛋白自组装成纳米丝，类似于在经甲醇处理的纯丝膜中所观察到的那些(图4C和图4D)。该观察结果与经水处理和经甲醇处理的甘油丝膜中形成β-折叠结构的二级结构转变一致(图2B和图2C)。因此，甘油共混的膜中的纳米结构的形成与膜中的结构特征有关，并且可能受到丝二级结构变化的影响。

通过SEM进一步研究水处理后的30％(w/w)甘油膜中形成的丝纳米丝结构(图5A、图5D)。纳米丝结构在较高倍放大(图5B和图5E)下和侧视图(图5C)中更清晰可见。在膜的不同区域，观察到纳米丝的不同形态和组织(比较图5A、图5B和图5D、图5E)，这可能是由于丝膜流延期间不均匀干燥速率造成的。然而，纳米丝的尺寸在整个膜中一致，约为10nm～20nm。

丝膜中的甘油含量对于控制丝二级结构转变和影响膜的机械性能可能很重要。甘油分子可以通过分子间力与丝纤蛋白链相互作用，分子间力最可能是甘油的羟基和丝的酰胺基之间的氢键。Dai等人，86 J.Appl.Polymer Sci.2342-47(2002)。这种相互作用可以改变蛋白链的疏水性水合状态，因为由于甘氨酸-丙氨酸重复单元的高含量，这些蛋白是疏水蛋白(Bini等人，335 J.Mol.Biol.27-40(2004))，并因而诱发从占主导的无规卷曲(丝溶液状态或流延后未经处理的膜)到α-螺旋的丝二级结构变化(图7)。这种相互作用可以稳定丝的螺旋阶段，除非膜已经用溶剂(如水和甲醇)处理过。经溶剂处理，一些甘油分子从膜中溶解并扩散进入周围介质，但是紧密结合的甘油分子可能保持与丝纤蛋白链连接，从而稳定丝α-螺旋结构并保持膜柔性。替换浸出的甘油并与丝纤蛋白分子形成较弱氢键的水分子也可以有助于维持丝结构和机械性能。当将这些甘油缺失的膜再次干燥时，丝分子之间的强分子间相互作用可能居于主导，从而促进从α-螺旋到更加热力学稳定的β-折叠的结构转变(图7)。该过程类似于之前报道的基于蛋白链的疏水性水合状态变化的丝结构转变机理。Matsumoto等人，110 J.Phys.Chem.B 21630-38(2006)。

尽管已经探索了甘油在丝膜机械中的一些相互作用(Kawahara等人，291 Macromol.Mater.Eng.458-62(2006)；Dai等人，86 J.Appl.PolymerSci.2342-47(2002))，但是特定的配方并且更重要的是甘油在本发明中的作用与以前报道的那些不同。例如，丝/PVA共混物膜的拉伸性能通过在丝/PVA共混物中包含达到8％甘油而改变。丝/PVA膜的抗拉强度和断裂伸长率分别为约350kg/cm³和10％。当5％甘油与PVA/丝膜共混以减小相分离时，得到的膜的抗拉强度和断裂伸长率分别为426kg/cm²和53％。然而，将甘油的浓度增大到＞5％显著减小了丝/PVA共混物膜的抗拉强度。Dai等人，2002。相反，在本发明的一个实施方案中，将30％甘油加到丝纤蛋白膜中显著改善了抗拉强度(到约12MPa)和断裂伸长率(150％)，而未加入PVA。

在另一个研究中，甘油溶液用作纯丝膜的后处理，以将丝结构从I型丝转化成II型丝(β-折叠结构)。更具体地说，将丝膜在10％甘油溶液中浸渍，在95℃加热，并在50％相对湿度下干燥。尽管浸泡了甘油的膜在浸泡处理后发生自膨胀，但其展延性未作评价。Kawahara等人，2006。相反，在本发明的一些实施方案中，丝纤蛋白溶液与甘油共混并流延成高度展延性的膜，这由含有约10％～50％甘油的丝膜的改善的抗拉强度和断裂伸长率证实。

本文提出的甘油共混的丝膜显示了独特的特征：多样和可控的丝结构转变、所需的机械性能和易于制造(一步膜流延，无需进一步处理)。这些特征揭示了这些膜在生物医学应用中的用途。

本发明因此提供制备具有增大的抗拉强度和展延性的丝膜的方法。所述方法包括将丝纤蛋白溶液与甘油共混，其中甘油在丝纤蛋白/甘油共混物溶液中的浓度为约10％～50％(w/w)；在膜支撑表面上流延所述丝纤蛋白/甘油共混物溶液；和将膜干燥。这个简单过程使本发明的丝膜具有可取决于甘油浓度而设计的抗拉强度和展延性，提供在没有甘油时由丝纤蛋白溶液制备的丝膜的替代品。另外，使用上述相同过程，也可利用甘油改变含有其他生物聚合物(如PVA和PEO)的丝共混物膜，以提高丝/生物聚合物共混物膜的柔性或展延性。

另外，本发明的甘油丝共混物可以与其他基于丝的结构组合以形成三维丝骨架、丝海绵或其他具有三维结构的丝复合结构，用于诸如药物递送系统、组织工程材料或其他生物医学装置等应用。例如，本发明的展延性丝膜可以与承载活性剂的丝纤蛋白纳米球或微米球组合以提供所述活性剂的缓释。作为另一个实例，任选涂有丝纤蛋白溶液或丝凝胶的含有丝纤维的丝纤维基复合物可以与本发明的展延性丝膜组合以提供柔性纤维状材料，用作光纤或肌纤维。甘油可以容易地与任何丝复合物共混以改变基于丝的结构的机械性能。或者，基于丝的复合物可以在基于丝的结构的轮廓周围用展延性丝/甘油膜缠绕或成型。本文描述的所有丝复合物可以容易地用药物、抗生素、细胞响应分子、染料、酶以及其他小分子和大分子功能化，并保持功能。

由于甘油改性引起的丝膜或丝共混物膜的柔性改善，本发明的过程可用于在多种医疗应用和组织工程应用中改变多种丝共混物膜或涂层，医疗应用例如是创伤闭合系统(包括血管创伤修复装置)、止血敷料、海绵、贴片和胶、缝合、药物递送(WO 2005/123114)、生物聚合物传感器(WO2008/127402)，组织工程应用例如是组织工程的器官或其他进入人体的可生物降解植入(WO 2004/0000915；WO 2008/106485)。丝膜的改善柔性是有利的，因为可以向一些应用所需的生物医学材料(如功能性敷料或组织材料(如肌肉组织))提供柔韧的膨胀性或收缩性。例如，本发明的展延性丝膜可以在一种结构(如植入体)周围成型。丝膜可以含有被选择用以拓展装置用途的额外活性剂，如牙科装置中的组织或骨助长剂。另外，一旦展延性膜已经成型为这种结构，则甘油可通过本文所述的浸出而除去。

本发明的丝纤蛋白/甘油共混物膜也为成纤维细胞的附着和增殖提供合适的平台。由于这些丝共混物膜的改变的且潜在有用的机械性能，评价生物材料在细胞和组织培养中的潜在用途很重要。因此，在初步研究中，将成纤维细胞在30％(w/w)甘油-丝膜上的附着和增殖与作为对照的经甲醇处理的纯丝膜和组织培养塑料(TCP)相比较。在所有三个表面上的初始细胞附着(3小时)相似(图6A中的第一行)并通过Alamar Blue染色而定量(图6B)。然而，在14天培养中的细胞增殖在不同表面上不同。培养4天后，TCP上的成纤维细胞比纯丝膜和共混物丝膜上的那些长得快，这个观察结果与对纯丝膜的在先研究一致。(Sofia等人，54 J.Biomed.Mater.Res.139-48(2001)；Wang等人，29 Biomats.894-903(2008)。培养14天后，根据Alamar Blue染色测定(图6C)，TCP上的细胞数约为丝膜上的1.8倍，并且在纯丝膜和共混物丝膜之间没有显著差异。30％(w/w)甘油丝膜仅在第6天到第11天的时间内与经甲醇处理的丝膜在成纤维细胞增殖方面不同，其中细胞在经甲醇处理的膜上比在甘油膜上长得快(p＜0.01，图6C)。RGD-改性的丝膜表现出优异的表面性能，从而促进成纤维细胞、成骨细胞样细胞和源于人骨髓的间质干细胞的快速附着和增殖。Chen等人，67 J.Biomed.Mater.Res.A，559-70(2003)。因此，类似的策略可用于丝-甘油共混物膜。

因此，本发明的实施方案提供可能适合于组织工程的构建体的丝/甘油膜，所述构建体可用于器官修复、器官替换或再生策略，所述策略可能受益于这些改性的丝材料。组织工程的构建体含有丝纤蛋白/甘油共混材料和任选的至少一种生物活性剂(如细胞)，并且可以用于器官修复、器官替换或再生策略，包括但不限于脊椎圆盘、颅组织、硬膜、神经组织、肝、胰、肾、膀胱、脾、心肌、骨骼肌、腱、韧带、角膜组织和胸部组织。任何类型的细胞均可加到组织工程的构建体中，用于培养和可能的植入，包括肌肉和骨骼系统的细胞，如软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞和骨细胞、实质细胞(如肝细胞)、胰细胞(包括胰岛细胞)、肠源细胞以及其他细胞(如神经细胞、骨髓细胞、皮细胞、多能细胞和干细胞(包括例如胚胎干细胞、成熟干细胞和诱发的多能干细胞))和它们的组合，或者从捐赠者获得、从建立的细胞培养系获得，或者甚至在分子基因工程之前或之后获得。组织碎片也可使用，这样可以在单个结构中提供许多不同的细胞类型。

或者，柔性丝/甘油膜也可用作生物医学材料(如医疗装置、组织工程材料或植入体)上的涂层。如上所述，甘油改性的丝膜的改善柔性可以提供柔韧的膨胀性或收缩性，以匹配一些应用所需的生物医学材料(如功能性敷料或组织(如肌肉组织))的收缩性。由于改性的丝膜在伸长、收缩、拉伸或变形时断裂的倾向性较小，因此来自这种膜的涂层会提供改进的相容性并会良好地符合基材轮廓。改性的丝膜所涂布的基材或物品可包括许多组织、再生组织、医疗装置、医疗植入体、兽医装置或兽医植入体。例如，展延性丝/甘油膜可以在装置或植入体(如脊柱笼、冠状支架、牙科植入体或者臀和膝假体)周围缠绕。

如上所述，丝/甘油共混物膜可以被改性以含有至少一种活性剂。活性剂可以在形成丝共混物膜之前与丝纤蛋白溶液混合，或者在丝共混物膜形成后载入其中。可以与本发明的丝共混物膜共同使用的活性剂的种类广阔。例如，活性剂可以是治疗剂或生物材料，如细胞(包括干细胞)、蛋白、肽、核酸(DNA、RNA、siRNA)、核酸类似物、核苷酸、寡核苷酸或序列、肽核酸、适配体(aptamer)、抗体、激素、激素拮抗物、生长因子或重组体生长因子及其碎片和变体、细胞因子、酶、抗生素、病毒、抗病毒剂、毒素、前体药物、化疗剂、小分子、药物和它们的组合。适于改变本发明的丝共混物膜的例示活性剂包括细胞(包括干细胞)、促红细胞生成素(EPO)、YIGSR肽、糖胺聚糖(GAG)、透明质酸(HA)、整联蛋白、选凝素和钙粘素；止痛剂和止痛剂组合；类固醇；抗生素；胰岛素；干扰素α和γ；白介素；腺苷；化疗剂(例如，抗癌剂)；肿瘤坏死因子α和β；抗体；细胞附着介体，如RGD或整联蛋白；或者其他天然来源的或基因工程的蛋白、多糖、糖蛋白、细胞毒素、前体药物、免疫原或脂蛋白。

一种或多种活性剂可用于改性丝/甘油共混物膜。例如，当使用本发明的丝共混物膜作为平台以支撑生物材料(如细胞)时，可能希望加入其他材料以促进活性剂的生长、促进活性剂从丝共混物膜释放后的功能性或提高活性剂在处理期间残存或保持其效力的能力。已知的促进细胞生长的例示材料包括但不限于细胞生长培养基，如Dulbecco’s Modified EagleMedium(DMEM)、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸和抗生素，以及生长和形态因子，如成纤维细胞生长因子(例如，FGF 1-9)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源生长因子(PDGF)、类胰岛素生长因子(IGF-I和IGF-II)、骨形态发生生长因子(例如，BMP 1-7)、骨形态发生样蛋白(例如，GFD-5、GFD-7和GFD-8)、转化生长因子(例如，TGF-α、TGF-βI-III)、神经生长因子和相关的蛋白。生长因子在本领域中是已知的，参见，例如，Rosen&Thies，Cellular&Mol.Basis Bone Formation&Repair(R.G.Landes Co.)。将要嵌在丝/甘油膜中的另外材料可以包括DNA、siRNA、反义物(antisense)、质粒、脂质体和有关遗传材料递送的系统；活化细胞信号级联的肽和蛋白；促进矿化或来自细胞的相关事件的肽和蛋白；改善膜-组织界面的粘附肽和蛋白；抗菌肽；和蛋白及有关化合物。

将生物活性剂嵌在丝/甘油共混物生产的膜中可以按受控释放方式递送活性剂。在将生物活性剂嵌入丝中的整个过程期间使活性剂维持在活性形式能够使它在从丝膜释放时是活性的。活性剂的受控释放允许活性剂随着时间持续释放，具有受控的释放动力学。在一些情况下，生物活性剂连续递送至需要治疗的位点，例如在数周内。随着时间(例如，在数天或数周内或者更久)受控释放允许生物活性剂连续递送，以获得优选的治疗。受控递送载体是有利的，因为它防止生物活性剂例如被蛋白酶在体液和组织中体内降解。

活性剂从丝膜的受控释放可被设计成随着时间进行，例如在12小时或24小时内。释放时间可被选择为例如在约12小时到24小时；约12小时到42小时；或例如约12到72小时的时间内。在另一个实施方案中，释放可以例如在大约1天到15天发生。受控释放时间可以基于治疗的情况而选择。例如，时间越长，对伤口愈合越有效，而递送时间越短，对一些心血管应用更有用。

活性剂在体内从丝膜的受控释放可以按例如约1ng～1mg/天的量发生。在其他实施方案中，受控释放可以按约50ng～500ng/天的量发生，或者，在另一个实施方案中，按约100ng/天的量发生。含有治疗剂和载体的递送系统可配制成含有例如10ng～1mg的治疗剂，或约1μg～500μg，或例如约10μg～100μg，这取决于治疗应用。

本发明的丝/甘油共混物生产的膜也可经过表面图案化而用于生物光学装置应用。表面图案化技术在本领域中是已知的，例如，图案的喷墨印刷、沾笔纳米光刻技术图案、微接触印刷或软平版印刷技术。参见Wilran等人，98 P.N.A.S.13660-64(2001)；Bettinger等人，19 Adv.Mat.2847-50(2007)。也参见PCT/US/07/83620；PCT/US2008/082487。在丝膜表面上的形貌图案化结合丝膜的光学透明度可以提供高分辨率表面特征，不仅适合于生物光学装置，如光栅、透镜、微透镜阵列(WO08/127404)，而且也适合于组织工程的构建体，这是由于它们引导细胞功能和基质沉积的能力，如组织取向和增殖(WO 08/106485)。

因此，本文描述的特定实施方案提供了可用于视觉生物医学装置和视觉组织工程的甘油改性的丝膜。例如，在角膜组织工程应用中，丝膜的表面支撑角膜成纤维细胞附着和增殖。改性的丝膜的任选表面图案化为细胞取向提供进一步的引导。甘油改性的丝膜可用于体内角膜组织修复或用于后续植入的体外角膜组织再生。由于软和柔的性质，使用本发明的方法由甘油改性的丝膜为需要这种组织植入的病人提供了改进的舒适性和相容性。改性的丝膜在视觉生物医学装置中的额外例示应用包括但不限于软隐形眼镜、眼内透镜、青光眼过滤植入体、人工角膜、巩膜扣和粘弹性替换剂的制造。

本发明中的甘油改性的丝膜的另一个应用是制造柔性光学装置。如上所述，丝膜表面可以进一步图案化成高分辨率特征。使用本发明的甘油改性的丝膜，可以提供柔性、可膨胀的全息标签，所述标签易于伸长、拉伸或变形以匹配需要例如标签的产品的表面轮廓。例如，丝膜可以纳米图案化成高分辨率衍射微起伏以得到全息图像，从而提供可食用的全息产品识别标签，其易于符合胶囊、片剂或食品。参见PCT/US09/47751。

如本文所述，甘油改性的丝膜是可食用的。着色剂、释放剂、涂布剂、甜化剂、调味品和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于丝膜或含有丝膜的制剂中。例如，可以生产维生素、保健品或其他药物的调味的丝膜制剂或调味的丝膜涂布制剂，以供儿科使用。

总之，用甘油(＞10％w/w)共混的丝膜显然富含α-螺旋结构，在通过甲醇或水处理并将膜再次干燥而除去甘油后，α-螺旋结构进一步转变成晶体β-折叠结构。富含β-折叠结构的丝/甘油共混物膜由特性的纳米丝组成，而富含α-螺旋结构的那些未表现出这些形态。无论是流延后未经处理的还是甘油缺失状态下的共混物膜，都比经甲醇处理和经水退火的纯丝纤蛋白膜更有展延性，即使它们对拉伸变形的抵抗性更小。经甘油共混(30％w/w)和经甲醇处理的丝膜都支撑成纤维细胞附着和生长。在机械上，甘油的作用似乎模仿水在控制丝纤蛋白链的结构转变中的作用，从而在调节基于丝的生物材料的结构并因而调节材料性质方面提供新的有用控制点。

因此，本发明的实施方案提供一种含有丝纤蛋白和约10％～50％(w/w)甘油的丝膜。这种丝膜可以含有约20％～40％(w/w)或约30％(w/w)的甘油。

另外，丝膜可以含有至少一种活性剂。所述活性剂可以是细胞、蛋白、肽、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、适配体、抗体或其碎片或部分、激素、激素拮抗物、生长因子或重组体生长因子及其碎片和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗菌化合物、病毒、抗病毒剂、毒素、前体药物、化疗剂、小分子或药物、或它们的组合。在特定的实施方案中，活性剂是细胞。所述细胞可以选自肝细胞、胰岛细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、外分泌细胞、肠源细胞、胆管细胞、甲状旁腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺-下丘脑-垂体轴的细胞、心肌细胞、肾上皮细胞、肾管状细胞、肾基底膜细胞、神经细胞、血管细胞、形成骨和软骨的细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、口腔细胞、外皮细胞、骨髓细胞、角质细胞、多能细胞、诱发的多能干细胞、成熟干细胞或胚胎干细胞、或它们的组合。

丝膜也可以含有嵌在丝膜中的丝微米球或丝纳米球。丝膜可以是层叠或折叠成海绵或阻塞物(block)的膜。丝膜也提供用于组织工程的构建体。特别地，组织工程的构建体可以是角膜组织构建体，其中细胞是角膜成纤维细胞。在一些实施方案中，丝膜还可以含有细胞生长培养基。

本发明的丝膜也可以包括在丝膜上的图案，如光学图案，特别是全息图像。

本发明的实施方案也提供一种制备丝膜的方法，所述方法包括将丝纤蛋白溶液与甘油共混，其中甘油在丝纤蛋白/甘油共混物溶液中的浓度为约10％～50％(w/w)；在膜支撑表面上流延所述丝纤蛋白/甘油共混物溶液；和将丝膜干燥。所述方法还可包括以下额外步骤：将所述丝膜在溶解甘油的液体中浸渍一段时间以从所述丝膜排出甘油；和将甘油缺失的膜干燥。所述方法还可进一步包括将所述膜退火，例如用甲醇或水蒸汽处理所述膜。

本发明的实施方案也提供一种用丝组合物覆盖基材表面的方法，所述方法包括提供膜支撑基材；和用含有约10％～50％(w/w)甘油的丝纤蛋白/甘油共混物膜覆盖所述膜支撑基材。所述丝纤蛋白/甘油共混物膜还可含有至少一种生物聚合物，如PVA或PEO。所述丝纤蛋白/甘油共混物膜还可含有至少一种活性剂。

本发明的另一个实施方案是一种根据用丝组合物覆盖基材表面的方法制备的丝膜覆盖的基材，所述方法包括提供膜支撑基材；和用含有约10％～50％(w/w)甘油的丝纤蛋白/甘油共混物膜覆盖所述膜支撑基材。所述基材可以是组织、再生组织、医疗装置、医疗植入体、兽医装置或兽医植入体，如牙科植入体。所述基材也可以是基于丝的复合物。

本发明的另一个实施方案是一种将至少一种活性剂嵌在丝膜中的方法，所述方法包括将丝纤蛋白溶液与至少一种活性剂及甘油共混，其中甘油在丝共混物溶液中的浓度为约10％～50％(w/w)；在膜支撑表面上流延所述丝共混物溶液；和将膜干燥。在该方法中，所述活性剂可以是细胞、蛋白、肽、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、适配体、抗体或其碎片或部分、激素、激素拮抗物、生长因子或重组体生长因子及其碎片和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗菌化合物、病毒、抗病毒剂、毒素、前体药物、化疗剂、小分子或药物、或它们的组合。所述方法还可包括以下步骤：将丝膜在溶解甘油的液体中浸渍一段时间以从所述丝膜排出甘油；和将甘油缺失的膜干燥。所述方法还可包括将所述膜退火的进一步步骤。

本发明的一些实施方案可在下列已编号段落的任一个段落中进行定义：

1.一种丝膜，其含有丝纤蛋白和约10％～50％(w/w)的甘油。

2.如段落1所述的丝膜，其中所述丝膜的甘油含量为约20％～40％(w/w)。

3.如段落1或2所述的丝膜，其中所述丝膜的甘油含量为约30％(w/w)。

4.如段落1～3中任一项所述的丝膜，还含有至少一种活性剂。

5.如段落1～4中任一项所述的丝膜，还含有嵌在所述丝膜中的丝微米球或丝纳米球。

6.如段落1～5中任一项所述的丝膜，其中所述膜层叠或折叠成海绵或阻塞物。

7.如段落1～6中任一项所述的丝膜，其中所述至少一种活性剂选自细胞、蛋白、肽、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、适配体、抗体或其碎片或部分、激素、激素拮抗物、生长因子或重组体生长因子及其碎片和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗菌化合物、病毒、抗病毒剂、毒素、前体药物、化疗剂、小分子、药物和它们的组合。

8.一种用于组织工程的构建体，其包括如段落1～7中任一项所述的丝膜，其中至少一种活性剂是细胞。

9.如段落8所述的用于组织工程的构建体，其中所述细胞选自肝细胞、胰岛细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、外分泌细胞、肠源细胞、胆管细胞、甲状旁腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺-下丘脑-垂体轴的细胞、心肌细胞、肾上皮细胞、肾管状细胞、肾基膜细胞、神经细胞、血管细胞、形成骨和软骨的细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、口腔细胞、外皮细胞、骨髓细胞、角质细胞、多能细胞、诱发的多能干细胞、成熟干细胞和胚胎干细胞、和它们的组合。

10.如段落9所述的用于组织工程的构建体，其中组织工程的构建体是角膜组织构建体并且所述细胞是角膜成纤维细胞。

11.如段落8～10中任一项所述的用于组织工程的构建体，还含有细胞生长培养基。

12.如段落1～7中任一项所述的丝膜，还包括在所述丝膜上的光学图案。

13.如段落12所述的丝膜，其中所述光学图案是全息图像。

14.一种制备丝膜的方法，所述方法包括：

将丝纤蛋白溶液与甘油共混，其中甘油在丝纤蛋白/甘油共混物溶液中的浓度为约10％～50％(w/w)；

在膜支撑表面上流延所述丝纤蛋白/甘油共混物溶液；和

将丝膜干燥。

15.如段落14所述的方法，还包括以下步骤：将所述丝膜在溶解甘油的液体中浸渍一段时间以从所述丝膜排出甘油；和将甘油缺失的膜干燥。

16.如段落14或15所述的方法，还包括将所述膜退火。

17.一种用丝组合物覆盖基材表面的方法，所述方法包括：

提供膜支撑基材；和

用含有约10％～50％(w/w)甘油的丝纤蛋白/甘油共混物膜覆盖所述膜支撑基材。

18.如段落17所述的方法，其中所述丝纤蛋白/甘油共混物膜还含有至少一种生物聚合物。

19.如段落18所述的方法，其中所述生物聚合物是PVA或PEO。

20.如段落19所述的方法，其中所述丝纤蛋白/甘油共混物膜还含有至少一种活性剂。

21.一种根据如段落17～20所述的方法制备的丝膜覆盖的基材。

22.如段落21所述的丝膜覆盖的基材，其中所述基材是组织、再生组织、医疗装置、医疗植入体、兽医装置或兽医植入体。

23.如段落20或22所述的丝膜覆盖的基材，其中所述基材是基于丝的复合物。

24.一种将至少一种活性剂嵌在丝膜中的方法，所述方法包括：

将丝纤蛋白溶液与至少一种活性剂及甘油共混，其中甘油在丝共混物溶液中的浓度为约10％～50％(w/w)；

在膜支撑表面上流延所述丝共混物溶液；和

将膜干燥。

25.如段落24所述的方法，其中所述至少一种活性剂选自细胞、蛋白、肽、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、适配体、抗体或其碎片或部分、激素、激素拮抗物、生长因子或重组体生长因子及其碎片和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗菌化合物、病毒、抗病毒剂、毒素、前体药物、化疗剂、小分子、药物和它们的组合。

26.如段落24或25所述的方法，还包括以下步骤：将丝膜在溶解甘油的液体中浸渍一段时间以从所述丝膜排出甘油；和将甘油缺失的膜干燥。

27.如段落24～26中任一项所述的方法，还包括将所述膜退火。

实施例

实施例1.丝纤蛋白提纯

按照之前的描述制备丝纤蛋白贮备水溶液。Sofia等人，54 J.Biomed.Mater.Res.139-48(2001)。简单的说，将家蚕(Bombyx mori)的茧在0.02M碳酸钠的水溶液中煮沸20min，然后用纯水彻底漂洗。干燥后，将提取的丝纤蛋白溶于60℃的9.3M LiBr溶液4小时，得到20％(w/v)溶液。使用SLIDE-A-LYZER渗析盒，3,500MWCO(Pierce，Rockford，IL)将该溶液用蒸馏水渗析3天以除盐。渗析后，溶液是光学透明的，离心除去在该过程中形成的少量丝聚集体，丝聚集体通常来自茧上存在的环境污染物。丝纤蛋白水溶液的最终浓度为大约6％(w/v)。通过在干燥后称量已知溶液体积的残余固体重量而测定该浓度。

在使用前将6％丝纤蛋白溶液储存于4℃下，并可以用超纯水稀释至较低浓度。为了获得具有较高浓度的丝纤蛋白溶液，可以将6％丝纤蛋白溶液用吸湿性聚合物(如聚乙二醇(PEG)、淀粉酶或丝胶)渗析。例如，可以使6％丝纤蛋白溶液在SLIDE-A-LYZER3,500MWCO渗析盒外部在渗透压下接触25％～50％wt％的PEG(MW 8,000～10,000)溶液2～12小时，丝水溶液的最终浓度被浓缩到8％～30％wt％或更大。

实施例2丝/甘油共混物膜的制备

以0％、5％、10％、20％、30％、40％、50％(w/w)的重量比将提纯的丝纤蛋白溶液与甘油混合。将混合溶液倒入Petri培养皿并在层流净化罩中室温下干燥过夜。除非另有说明，“干共混物膜”指的是通过这种直接流延并干燥过夜而制备的膜，“湿共混物膜”指的是相同的经过流延和干燥的膜，随后在37℃的超纯水中从其中提取甘油1小时，然后将膜在空气中再次干燥。对于处理组中的另外变量，使用甲醇处理，并且在这些情况下将膜(含有甘油和没有甘油)在90％(v/v)甲醇中浸渍1小时，然后空气干燥。

实施例3.丝/甘油膜的溶解

将共混物膜切成大约5mm×5mm的正方形，将一个正方形膜称重并在2ml管的超纯水中浸浸，至浓度为1％(膜的重量/水的体积)，并在37℃下保持1小时或1天。温孵后，将丝膜从溶液中取出，空气干燥过夜，称重，并与初始膜的质量相比以获得残余质量(％)。对残余溶液进行280nm下的紫外线吸光度测量。使用不同浓度下的经提纯的丝纤蛋白溶液作为标准，将吸光度值转化成在水中溶解的丝量。然后将溶解的丝量与膜中的总丝质量相比，以获得膜在水中溶解的丝的百分比。

实施例4.通过傅里叶变换红外(FTIR)光谱分析丝/甘油膜

使用红外吸收光谱的傅里叶自去卷积(FSD)评价膜中存在的二级结构，包括无规卷曲、α-螺旋、β-折叠片和转角。经处理的样品的FTIR分析使用Bruker Equinox 55/S FTIR光谱仪(Bruker Optics Inc.，Billerica，MA)进行，该光谱仪配备有氘化三甘氨酸硫酸酯检测器和含有锗(Ge)晶体的多重反射的水平MIRacleATR附件，来自Pike Tech.(Madison，WI)。将5mm×5mm正方形丝膜置于Ge晶体池中并用FTIR显微镜以反射模式检验。用空池进行背景测量并从样品读数中扣除。对于每次测量，以4cm^-1的分辨率记录64次扫描，波数范围是400cm^-1～4000cm^-1。

按照之前的描述使用Opus 5.0软件(Opus Software，Inc.，SanFrancisco，CA)进行覆盖酰胺I区(1595cm^-1～1705cm^-1)的红外光谱的FSD。Hu等人，39 Macromolecules，6161-70(2006)。频率范围1616cm^-1～1637cm^-1和1695cm^-1～1705cm^-1内的吸收带表示富集的β-折叠结构；1638cm^-1～1655cm^-1范围内的吸收带归于无规卷曲结构；1656cm^-1～1663cm^-1范围内的吸收带归于α-螺旋；1663cm^-1～1695cm^-1范围内的吸收带归于转角。参见，同上。

实施例5.丝/甘油膜的机械性能

拉伸试验在Instron 3366试验架上进行，该试验架配备有10N容量的负载传感器和BIOPULS^TM试验系统(Instron，Norwood，MA)，包括能潜入的气动夹和温控液浴。基于ASTM标准D638-02a，将膜样品浇注到硅树脂模具中，并按比例增大2×，得到80mm的总长度，以适应夹持所需的大表面和视频伸长测定法所需的量规长度(28mm)。对于干环境，将膜在25℃和50％相对湿度的环境室中调节两天。对于湿环境，将丝/甘油膜样品在0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中水合1小时，然后在装满PBS的BIOPULS^TM浴(37±0.3℃)中浸渍至少5min，然后试验。将纯的丝纤蛋白膜(0％甘油)用90％v/v甲醇预处理1小时，然后按照与甘油样品相同的方式处理。所有膜均基于初始夹子到夹子长度(额定长度约47mm，额定伸长率约2.82mm/min)以0.1％s^-1的应变控制速率进行试验。在20Hz下捕捉负载和视频伸长计应变数据，后者基于以约1cm的额定距离置于每个膜的最薄部分表面上的两个基准油漆标记。对每个膜试验重复五次。初始截面积通过用SEM测量膜厚并乘以样品宽度(10mm)而测定。对于额定应力和应变绘图，测定初始“线性弹性模数”、致损应变和极限抗拉强度(UTS)。UTS作为试验中获得的最高应力值测定。初始“线性弹性模数”通过使用对应于0.1N负载的点与对应于50％UTS的点之间的最小二乘法拟合计算出来。这被认为足以客观地捕捉所有被试验样品的应力/应变曲线的线性部分。致损伸长率作为＞10％的负载减小之前的最后数据点测定。

实施例6.扫描电子显微镜法(SEM)

使丝膜在液氮中断裂并用铂溅射。使用Zeiss SUPRA^TM 55 VP SEM(Carl Zeiss，Inc.，Jena，Germany)对不同丝膜的横截面和表面形态进行成像。

实施例7.丝膜上的成纤维细胞培养和粘附

在含有90％DMEM、10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、1000U/ml链霉素的生长培养基中使成纤维细胞增殖。在具有95％空气和5％CO₂的恒温箱中在37℃下保持细胞培养物。培养物每隔一天补充37℃的新鲜培养基。为了粘附，在24孔板中预先流延的丝膜上接种细胞，每个孔在1ml含血清培养基中具有50,000个细胞。具有组织培养塑料(TCP)但没有丝的空孔充当对照。在细胞接种3小时后，通过将50μl的Alamar蓝加到培养基中，再培养6小时，并测定培养基荧光(Ex＝560nm，Em＝590nm)，从而评价细胞附着。在培养期间，使用Alamar蓝染色测定细胞增殖，并通过相差光显微镜法(Carl Zeiss，Inc.，Jena，Germany)监视细胞形态。

所有实验对于每个数据点均进行最少N＝3次。通过单因素方差分析(ANOVA)和Student-Newman-Keuls Multiple Comparisons Test进行统计分析。当p≤0.05时认为差异显著，并且当p≤0.01时认为差异非常显著。

Claims

1.一种含有丝纤蛋白的丝膜，其中所述丝膜从丝/甘油共混物制备，并且其中在形成丝膜之后从所述丝膜排出甘油，以及其中所述丝膜根据如下所述的方法制备：

a)将丝纤蛋白溶液与甘油共混，其中甘油在丝纤蛋白/甘油共混物溶液中的浓度为10％～50％(w/w)；

b)在膜支撑表面上流延所述丝纤蛋白/甘油共混物溶液；

c)将b)中得到的膜干燥；

d)将c)中得到的膜在溶解甘油的液体中浸渍一段时间以从膜排出甘油；和

e)将甘油缺失的膜干燥。

2.如权利要求1所述的丝膜，其中所述丝膜的甘油含量为30％(w/w)。

3.如权利要求1或2所述的丝膜，还含有至少一种活性剂。

4.如权利要求1所述的丝膜，还含有嵌在所述丝膜中的丝微米球或丝纳米球。

5.如权利要求1所述的丝膜，其中所述丝膜层叠或折叠成海绵或阻塞物。

6.如权利要求3所述的丝膜，其中所述至少一种活性剂选自细胞、蛋白、肽、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、适配体、激素、激素拮抗物、酶、抗生素或抗菌化合物、病毒、抗病毒剂、毒素、药物和它们的组合。

7.如权利要求6所述的丝膜，其中所述蛋白选自抗体或其碎片或部分、生长因子或重组体生长因子及其碎片和变体以及细胞因子；所述药物选自前体药物和化疗剂。

8.如权利要求1所述的丝膜，其中所述丝膜还包括光学图案。

9.一种用于组织工程的构建体，其包括如权利要求3所述的丝膜，其中至少一种活性剂是细胞。

10.如权利要求9所述的用于组织工程的构建体，其中所述细胞选自肝细胞、胰岛细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、外分泌细胞、肠源细胞、胆管细胞、甲状旁腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺-下丘脑-垂体轴的细胞、心肌细胞、肾上皮细胞、肾管状细胞、肾基膜细胞、神经细胞、血管细胞、形成骨和软骨的细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、口腔细胞、外皮细胞、骨髓细胞、角质细胞、多能细胞、诱发的多能干细胞、成熟干细胞和胚胎干细胞、和它们的组合。

11.如权利要求10所述的用于组织工程的构建体，其中组织工程的构建体是角膜组织构建体并且所述细胞是角膜成纤维细胞。

12.如权利要求9～11中任一项所述的用于组织工程的构建体，还含有细胞生长培养基。

13.一种制备丝膜的方法，所述方法包括：

b)在膜支撑表面上流延所述丝纤蛋白/甘油共混物溶液；

c)将b)中得到的膜干燥；

e)将甘油缺失的膜干燥。

14.如权利要求13所述的方法，还包括将所述丝膜退火。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述丝膜还含有至少一种生物聚合物。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述生物聚合物是PVA或PEO。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述丝膜还含有至少一种活性剂。

18.如权利要求13所述的方法，包括：

将所述丝纤蛋白溶液与至少一种活性剂及甘油共混。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述至少一种活性剂选自细胞、蛋白、肽、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、适配体、激素、激素拮抗物、酶、抗生素或抗菌化合物、病毒、抗病毒剂、毒素、药物和它们的组合。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白选自抗体或其碎片或部分、生长因子或重组体生长因子及其碎片和变体以及细胞因子；所述药物选自前体药物和化疗剂。

21.一种丝膜覆盖的基材，其中所述丝膜根据如权利要求13～17中任一项所述的方法制备。

22.如权利要求21所述的丝膜覆盖的基材，其中所述基材是组织、再生组织或医疗装置。

23.如权利要求22所述的丝膜覆盖的基材，其中所述医疗装置是医疗植入体或兽医装置。

24.如权利要求23所述的丝膜覆盖的基材，其中所述兽医装置是兽医植入体。

25.如权利要求21或22所述的丝膜覆盖的基材，其中所述基材是基于丝的复合物。