CN109069698B

CN109069698B - 改善的丝纤蛋白甘油膜

Info

Publication number: CN109069698B
Application number: CN201780021491.XA
Authority: CN
Inventors: M·阿特拉斯; R·迪莉; B·阿勒代斯; R·拉杰霍瓦
Original assignee: EAR SCIENCE INSTITUTE AUSTRALIA; Deakin University
Current assignee: EAR SCIENCE INSTITUTE AUSTRALIA; Deakin University
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: AU2017243878B2; KR20180129831A; EP3436093A4; JP2019512352A; CA3018447A1; WO2017165922A1; KR102417283B1; CN109069698A; EP3436093B1; US20190112432A1; US11365292B2; AU2017243878A1; EP3436093A1

Abstract

本发明涉及用于修复中耳，包括鼓膜穿孔和损伤的膜的制备。本发明还提供了使用甲酸制备复合丝纤蛋白和甘油膜的组合物和方法，其中所述膜具有改善的机械和声振特性。

Description

改善的丝纤蛋白甘油膜

技术领域

背景技术

以下讨论仅意图促进对本发明的理解。所述讨论并不是认可或承认所提到的任何材料现在或在过去截至本申请的优先权日为公知常识的一部分。

耳鼓或鼓膜的慢性穿孔为相对常见的情况，需要用移植材料进行手术干预，以覆盖穿孔，这种技术称为1型鼓膜成形术或鼓室成形术。

诸如肌肉筋膜、脂肪、软骨膜和软骨等自体移植物为这种手术中最常用的组织。然而，这种方法具有各种限制，包括移植物的机械特性与鼓膜不匹配、移植物的不透明性、供体部位发病率和操作时间增加。

随着近年来材料科学的发展，已对各种替代支架材料，诸如脱细胞化组织(例如

)、聚合物(例如透明质酸、壳聚糖和海藻酸钙)以及合成材料[例如聚(癸二酸甘油酯)(PGS)]作为移植材料进行了研究。然而，最佳支架的选择仍然没有得到解决。

已广泛研究了丝纤蛋白在组织工程化中作为生物支架的潜能。它是在去除抗原蛋白丝胶之后从蚕茧衍生的。丝纤蛋白溶液可被加工成各种形式，诸如薄膜、纤维、垫子、水凝胶和海绵，从而为广泛生物医学应用提供所需。

丝纤蛋白是可生物降解的、生物相容的，并且与大多数其他天然和合成生物材料(诸如胶原蛋白和聚乳酸(PLA))相比具有优异的机械强度、韧性和弹性。重要的是，丝纤蛋白可支持诸如软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、成骨细胞和角质细胞等许多不同细胞类型的附着和生长。

丝的主要优点之一是能够通过简单改变加工条件来改变其特性，以适合组织工程化应用。对加工方法(例如水与有机溶剂、水与乙醇退火)和加工变量(例如干燥速率、丝浓度、孔隙大小)的操纵可改变丝的物理和结构特性，并且影响其作为支架材料的性能。

然而，在许多情况下，改善复合掺混物以增强用于修复中耳，包括鼓膜穿孔和损伤的膜的机械和声振特性仍然是一个重大挑战。避免添加过量的聚合物同时产生在延长的时间范围内呈现稳定性的膜仍然是一个重要目标。

仍然需要改变丝纤蛋白薄膜的物理和机械特性，以改善机械和声振特性。

发明内容

本发明人已确定了普遍应用的原则，因为他们已确定，通过在丝纤蛋白膜的制造中使用酸性溶剂，可以改善膜的各种特征，包括它们的酶降解速率和β-折叠含量。优选地，酸性溶剂是甲酸而不是水。理想地，制造环境还包含增塑剂，诸如甘油。

冻干的丝可溶于甲酸，并且可长时间贮存。这使得薄膜可根据需要进行浇铸。另外，由甲酸基丝制备的产物不溶于水。它们不需要用乙醇或甲醇进行退火，这一步骤可能会引起薄膜收缩和扭曲。相比之下，水性丝纤蛋白溶液必须立即浇铸，并且在几天至几周内使用，否则溶液或凝胶变得不可用。

在第一方面，本发明提供了一种在甲酸存在下制备的复合丝纤蛋白和甘油膜基质，其中所述膜：

(a)包括包含量在膜总湿重的约0.1％至约20％(wt％)范围内的丝纤蛋白，

(b)包括包含约5％(w/w)至60％(w/w)的甘油，

(c)具有5MPa至1000MPa之间的拉伸强度，

其中甘油和丝蛋白复合溶液是在甲酸存在下溶解，然后干燥以制备膜基质。

本发明的丝纤蛋白甘油膜基质提供了一种用于组织工程化的构建体。它提供了一种可供角质细胞、成纤维细胞、粘膜上皮细胞、内皮细胞、软骨细胞等生长的基质。还可将所述膜基质用于使用诱导多能干细胞、成体干细胞和胚胎干细胞以及它们的组合的细胞疗法中，以在患者中提供可供这些细胞生长的支架。

本发明的丝纤蛋白和甘油膜基质与缺乏甘油的丝纤蛋白薄膜相比具有不同的特性。在使用或包含并使用甘油作为增塑剂的情况下溶解度和生物相容性增强。在材料加工中将甘油与丝纤蛋白组合使用还扩展了使用丝纤蛋白可获得的功能特征，以及在生物材料和装置中具有潜在效用的更具柔性的薄膜的形成。

在第二方面，本发明提供了一种制作丝纤蛋白甘油膜基质的方法，所述方法包括以下步骤：

a.在从茧或纤维去除丝胶之后制备丝蛋白或丝蛋白复合溶液；

b.使用甲酸溶解甘油和丝纤蛋白；以及

c.干燥步骤(b)的制剂以制作丝蛋白膜。

在第三方面，本发明提供了一种根据本发明第二方面的方法制备的丝纤蛋白甘油膜基质。

在第四方面，本发明提供了一种用于修复鼓膜穿孔，并且特别是慢性穿孔的包含如本文所描述的膜基质的装置。在这方面，膜基质优选具有在约15Mpa至95Mpa之间的拉伸强度，并且更优选地，拉伸强度在约25与约75Mpa之间。

在第五方面，本发明提供了一种用于修复耳道、松弛部和/或盾板骨的包含如本文所描述的膜基质的装置。

在第六方面，本发明在于在将如本文中所描述的膜基质移植或施加至受试者的耳鼓，或更优选地，移植或施加至受试者的鼓膜，诸如穿孔鼓膜，和/或受试者的松弛部和/或邻近松弛部的盾板骨时，所述膜基质用于支持至少耳鼓细胞的增殖、迁移和/或粘附的用途。本发明还提供了一种如本文所描述的膜基质在乳突消除技术中用于在鼓室乳突切除术之后重建受试者的耳道，包括用于覆盖羟磷灰石游离移植物的用途。

在另一方面，本发明提供了一种用于在需要这种治疗的受试者中修复耳鼓，并且更优选地修复鼓膜穿孔(诸如慢性鼓膜穿孔)和/或有缺陷的松弛部和/或邻近松弛部的盾板骨的方法，所述方法包括将如本文所描述的膜基质施加到受损组织或要修复的组织。

本发明还提供了一种用于修复受试者的耳道、鼓膜穿孔和/或松弛部的套件，所述套件包含如本文所描述的膜基质。所述套件还可包含如本文所描述的任何生物活性分子的一种或多种溶液。生物活性分子的一种或多种溶液可用于在将膜基质植入受试者中之前施加至膜，或用于在将膜基质植入或移植给受试者之后施加至膜基质，这可一次或此后多次进行。

因此，本发明的膜基质提供了一种用于修复和再生受损组织的定制化移植植入物。在一种形式中，所述受损组织是穿孔鼓膜和/或在需要这种治疗的受试者中耳道的重建和再生包括松弛部和盾板骨。

膜基质的定制化可有助于促进再生以基本上类似于被用于修复的天然组织形式，由此实现更好的改善受试者的愈合结果的机会。

附图说明

由以下结合附图对示例性实施方案的描述本发明的这些和/或其他方面和优点将变得清楚和更容易理解。

在所述图中，以下缩写适用：

AQ50 由水溶液浇铸的薄膜，50μm厚

AQ50G40 由水溶液浇铸的薄膜，50μm厚，含有40％甘油

FA50 由甲酸溶液浇铸的薄膜，50μm厚

FA50G40 由甲酸溶液浇铸的薄膜，50μm厚，含有40％甘油

图1：与水性丝/甘油薄膜(b)相比甲酸基丝/甘油薄膜(a)的透明度。图中呈现了3个薄膜的平均透射率，每个薄膜进行2次测量(共6次测量)。

图2：甲酸与水性膜的频率响应。

图3：当暴露于高达7kPa的空气压力负荷时，与水基含甘油薄膜(AQ50G40)相比甲酸基含甘油薄膜(FA50G40)的位移。

图4：含甘油和不含甘油的水性与甲酸基薄膜的去卷积FTIR扫描。

图5：水性与甲酸基薄膜由酶降解产生的重量损失。

图6：使用光学轮廓测定法形成的水性与甲酸薄膜(含甘油和不含甘油)的表面形貌。NB：使每个图像的高度增加了2倍，以突出表面特征。

图7：由纳米压痕仪获得的水性与甲酸薄膜的硬度和弹性(A)添加甘油使两种类型的丝的模量基本上降低(约5倍)。(B)在FA丝中硬度比水性丝低。添加甘油使两种类型的丝的硬度基本上降低(约10倍)。

图8：在水性与甲酸薄膜上人鼓膜角质细胞的迁移在FA丝上，迁移和移植足以在48小时内在整个样品(3mm²)中产生角质细胞的汇合覆盖。水性丝薄膜也支持细胞迁移和移植至表面上，但达到的程度较低，在大多数样品中填充不到一半的区域。添加甘油不影响AQ或FA设定中的结果。在半定量分析中，经排序的得分为FA50＝FA50G40>AQ50＝AQ50G40。

具体实施方式

本发明人发现，相对于在水溶液中或在不含甘油的情况下制备相同材料，通过在丝纤蛋白甘油膜的制造中使用酸性溶剂，可改善所得材料的生物机械特性。因此，本发明是针对复合丝纤蛋白甘油膜，所述复合丝纤蛋白甘油膜是在酸性溶剂(诸如甲酸)存在下制备，(i)与在水性(水)环境中制备的膜相比，可贮存相对长的时间，(ii)相对不溶于水，(iii)是可生物降解的、生物相容的，并且与许多其他天然和丝纤蛋白合成生物材料相比，具有改善的机械强度、弹性和刚度中的一种或多种。

根据本发明制备的丝纤蛋白甘油膜基质具有多种用途，诸如在组织工程化中以薄膜、纤维、垫子、水凝胶和海绵的形式用于支架中，从而为广泛生物医学应用提供所需。

当将丝纤蛋白甘油膜基质用于修复鼓膜时，本发明人发现，通过在制造丝纤维膜时使用酸性溶剂，可以改善丝纤蛋白膜的机械和声振特性、酶降解速率和β-折叠含量。优选地，酸性溶剂是甲酸而不是水。

为方便起见，以下部分大体概述了本文所用术语的各种含义。在此讨论之后，讨论了关于丝纤蛋白甘油膜基质的总体方面，随后为展示所述膜的各种实施方案的特性以及可如何使用它们的具体实例。

定义

本领域技术人员将了解，本文所描述的发明除具体描述的那些外易于作出改变和修改。本发明包括所有这些改变和修改。本发明还个别地或集体地包括本说明书中所提到或指出的所有步骤、特征、制剂和化合物以及所述步骤和特征的任何或所有组合或任何两种或更多种。

本文中所引用的每一份文档、参考文献、专利申请或专利均以全文引用的方式明确并入本文中，这意味着读者应将其作为本文的一部分来阅读和考虑。本文中未对本文中所引用的文档、参考文献、专利申请或专利进行重复仅仅是出于简洁的原因。然而，任何所引用的材料或该材料中所含的信息都不应被理解为一般常识。

本文中或以引用的方式并入本文中的任何文档中所提到的任何产品的制造商说明书、描述、产品规格和产品清单在此以引用的方式并入本文中，并且可用于本发明的实践中。

本发明的范围不受本文所描述的任何具体实施方案的限制。这些实施方案仅意图用于例示。功能上等效的产品、制剂和方法显然在如本文所描述的发明范围之内。

本文所描述的发明可包括值(诸如大小、浓度等)的一个或多个范围。值的范围将被理解为包括所述范围内的所有值，包括限定所述范围的值，以及邻近所述范围并且引起与紧邻限定范围边界的那个值的值相同或基本上相同的结果的值。

在本说明书通篇中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或变化型式(诸如“包含(comprises/comprising)”)将被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组，但不包括任何其他整数或整数组。

本文中所用的所选术语的其他定义可在本发明的详细描述中找到并且通篇适用。除非另有定义，否则本文中所用的所有其他科学和技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。

提到本文中所引用的材料或所含的信息不应被理解为承认所述材料或信息是一般常识的一部分，或在澳大利亚或任何其他国家为已知的。

出于描述本发明的装置和它可如何使用的目的，术语“穿孔的”、“穿孔”或“穿孔”的任何其他变化型式将被理解为包括受试者的使用本发明的装置可修复的任何鼓膜损伤。在一些非详尽实例中，这种损伤可包括因物理力或疾病造成的鼓膜中的洞或撕裂或膜或膜层的任何部分的畸形或损失(参见例如图1)。鼓膜或耳鼓包括紧张部和耳道内侧缘的松弛部。松弛部经受回缩和胆脂瘤，并且在手术治疗这些疾患后相邻鼓腔隐窝、盾板骨与耳道软组织常常需要重建。

出于描述本发明的装置和它可如何使用的目的，术语“有缺陷的”或所述术语的任何其他此类变化型式将被理解为包括受试者的松弛部软组织或周围区域骨骼的使用本发明装置可修复或重建的任何损伤或疾病。这可包括，来自胆脂瘤的损伤或疾病，或在乳突切除术之后对受试者耳道的必要修复，等等。

现将参考以下非限制性描述和实例讨论本发明的实施方案。

实施方案

根据本发明制备的丝纤蛋白甘油膜基质是可生物降解的、生物相容的，并且与大多数其他天然和合成生物材料(诸如胶原蛋白和聚乳酸(PLA))相比，在其机械强度、伸长率和刚度中的一个或多个方面得到改善。

A.丝纤蛋白甘油膜基质

本发明提供了一种在甲酸存在下制备的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述膜：

(a)包含量在膜总湿重的约0.1％至约20％(wt％)范围内的丝纤蛋白，

(b)包含约5％(w/w)至60％(w/w)的甘油，并且

丝纤蛋白以在膜总湿重的约0.1％至约10％(wt％)范围内的量存在于膜中。优选地，丝纤蛋白以选自聚合物总湿重的约1.0％至约2.0％、约2.0％至约3.0％、约3.0％至约4.0％、约4.0％至约5.0％、约5.0％至约6.0％、约6.0％至约7.0％、约7.0％至约8.0％、约8.0％至约9.0％、约9.0％至约10.0％、约10.0％至约11.0％、约11.0％至约12.0％、约12.0％至约13.0％、约13.0％至约14.0％和约14.0％至约15.0％的量存在。

丝纤蛋白甘油膜的甘油含量将介于约5％至60％(w/w)之间。优选地，甘油含量选自10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和60％(w/w)。

可通过改变丝纤蛋白和甘油的含量来改变膜基质的拉伸强度。理想情况下，针对膜进行生物工程化的目的对拉伸强度进行选择。举例来说，在使膜成形为用于组织工程化的支架的情况下，如果需要，拉伸强度可大到500MPa或甚至更大。理想地，膜基质的拉伸强度在5MPa至1000MPa范围内，并且根据使用材料的目的，拉伸强度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900MPa或这些数字间的任何值均为可接受的。举例来说，在使用膜基质作为骨骼修复支架或用于伤口修复中的情况下，装置的拉伸强度可在50MPa与500MPa之间。或者，在使用膜基质作为用于鼓膜修复的装置的情况下，材料的拉伸强度将在9至100MPa范围内。举例来说，此类膜基质的拉伸强度可为9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100MPa或这些数字间的任何值。

通过在甲酸存在下从丝纤蛋白和甘油制备本发明的膜，本发明人开发出改善的膜基质，所述改善的膜基质与大多数其他天然和合成丝纤蛋白生物材料相比可承受应变而不撕裂或断裂；为结实和有弹性的。材料的强度和弹性可定义为材料伸长而不断裂或破碎的能力。

可通过改变丝纤蛋白和甘油的含量来改变膜基质承受应变而不撕裂或断裂的弹性。理想情况下，膜将具有5与300％之间的伸长率百分比。低伸长率与脆性材料相关。脆性材料往往具有较高的拉伸强度和高模量，但伸长率低。

在使膜成形为用于组织工程化的生物支架的情况下，如果需要，伸长率百分比可低至5％MPa，以及高达300％或更高，这取决于膜将被应用的用途。理想地，膜基质的伸长率百分比在50至250％范围内，其中伸长率百分比为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300％或这些数字间的任何值均为可接受的。

在使用膜基质作为骨骼修复支架或用于伤口修复中的情况下，膜的伸长率百分比可在5至200％之间。或者，在使用膜基质作为用于鼓膜修复的装置的情况下，材料的伸长率百分比将在80至170％范围内。

在材料加工中将甘油与丝纤蛋白组合使用还扩展了使用丝纤蛋白可获得的功能特征，以及在生物材料和装置中具有潜在效用的更具柔性的薄膜的形成。

本发明的装置的膜可具有约10至1000MPa的杨氏模量(Young’sModulus)。举例来说，杨氏模量可为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000MPa或其间的任何值。理想情况下，杨氏模量将与膜所要用于的用途相匹配。举例来说，在使用膜基质作为骨骼修复支架或用于伤口修复中的情况下，杨氏模量可在400MPa与1000MPa之间。或者，在使用膜基质作为用于鼓膜修复的装置的情况下，材料的杨氏模量将在100至500MPa范围内。举例来说，此类膜基质的杨氏模量可为100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500MPa或这些值间的任何值。

将此杨氏模量值选择为基本上匹配穿孔尺寸和声学特性。约200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300MPa的杨氏模量为优选的。在这方面，声音传输到中耳听小骨依赖于包括所述装置的移植物的“刚度”，并且在大的穿孔中为听觉效果即时改善的重要问题。

在本发明第一方面的第一实施方案中，提供了一种在甲酸存在下制备的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述膜：

(b)包含约5％(w/w)至60％(w/w)的甘油，

(c)具有在10MPa与1000MPa之间的拉伸强度，

(d)具有在50与300％之间的伸长率，

(e)具有在10MPa与1000MPa之间的杨氏模量，

当将本发明的膜用于诸如生物支架等生物环境中，或用于修复受损组织，包括但不限于在伤口修复中作为骨骼的替代物或用于修复鼓膜时，所述膜适合于促进细胞粘附以使细胞在膜上有效生长和增殖。因此，本发明的丝纤蛋白甘油膜基质提供了一种用于组织工程化的构建体。它们提供了一种可供角质细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞、成骨细胞、成骨细胞、上皮细胞、内皮细胞、软骨细胞等生长的基质。还可将所述膜基质用于使用诱导多能干细胞、成体干细胞和胚胎干细胞以及它们的组合的细胞疗法中，以在患者中提供可供这些细胞生长的支架。

优选地，可将任何细胞类型添加到膜中进行培养和可能的植入，包括角质细胞、肌肉和骨骼系统的细胞(诸如软骨细胞、成纤维细胞、肌肉细胞和骨细胞)和干细胞(包括例如胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞)以及它们的组合，无论是从提供者获得，从已建立的细胞培养系获得，抑或甚至是在细胞修饰之前或之后通过分子或遗传手段获得。还可使用组织碎片来移植不同细胞类型的构建体。

在本发明第一方面的第二实施方案中，提供了一种包含丝的在甲酸存在下制备的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述膜：

(b)包含约5％(w/w)至60％(w/w)的甘油，并且

(c)具有在10MPa与500MPa之间的拉伸强度，

(d)具有在50与300％之间的伸长率，

(e)具有在10MPa与1000MPa之间的杨氏模量，

其中所述膜：(i)是通过在甲酸存在下溶解甘油和丝蛋白复合溶液，然后干燥以制备膜基质制作而成，(ii)支持选自至少包含以下中的任何一种或多种的组的细胞的增殖、迁移和/或粘附：软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、成骨细胞和角质细胞以及干细胞。

本发明的膜无需光滑，它们可在其表面上具有尺寸在约0.001微米与约200微米之间的范围内的孔或表面变形。在膜包含孔的情况下，孔可穿过膜，或者它们可在一端为封闭的。在孔穿过膜的情况下，它们可能支持或可能不支持细胞在膜上生长。在膜可用作鼓膜的情况下，它们不支持细胞在膜上的横向生长。然而，在将这些膜用作生物支架的情况下，它们可支持细胞在膜上的横向生长。

在一个实施方案中，膜在其表面上包含直径在约0.001微米至约200微米之间的一个或多个孔或表面变形，这促进细胞浸润和组织形成。在一种优选形式中，孔或表面变形的直径为0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200微米或这些数字间的任何值。

当孔存在于膜中时，它们将为新组织形成和重塑提供空隙体积，以有助于在植入需要此类治疗的受试者中之后的宿主组织整合。在这方面，装置提供了一种结构，所述结构允许有效营养物和代谢物运送同时又保留机械稳定性。

膜基质的厚度将在约1微米与约2mm之间变化。举例来说，膜的厚度可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600、650、700、750、800、850、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、2000微米。

在使用膜作为替换鼓膜的情况下，它们将具有在约10与约600微米之间的厚度。最优选地，膜具有在约80与约100微米之间的厚度。

在将膜用作支架的情况下，膜可厚得多，诸如厚达2mm。在这方面，将基于膜针对预期用途必须实现的生物降解速度和拉伸强度、韧性和弹性来确定此类用途中膜的相对厚度。

在一种优选形式中，膜基质是可生物降解的。膜的生物降解性将由膜中丝纤蛋白和甘油的量决定。在这方面，膜可具有完全溶解需要长达2年或更多年的生物降解性。优选地，膜为历时1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月可生物降解的。当用作在受试者中使用时被降解的生物支架时，膜的生物寿命可在1与12个月之间，理想情况下为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月。

本发明的丝纤蛋白和甘油膜基质与缺乏甘油的丝纤蛋白薄膜相比具有不同的特性。举例来说，在使用或包含并使用甘油作为增塑剂的情况下柔性和生物相容性增强。

本发明的膜基质还可包含一种或多种额外材料，所述一种或多种额外材料对需要此类治疗的受试者来说为非自体的。举例来说，丝膜可包含至少一种选择以下的添加剂：另一增塑剂、明胶、胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸、透明质酸、普朗尼克(pluronic)127、聚(乙二醇)(PEG)以及1,2,6-己三醇和1,3-丙二醇。以下文献中说明了添加剂的其他实例：Jose,R.R.等,2015.Polyol-Silk Bioink Formulations as Two-Part Room-TemperatureCurable Materials for 3D Printing.ACS Biomaterials Science&Engineering,1,第780–788页，该文献以交叉引用的方式并入本文中。

膜中可使用的材料包括选自包含以下的组的任何材料：透明质酸基水凝胶(Carbylan)和薄膜(Seprafilm)；海藻酸钙；聚(癸二酸甘油酯)；水溶性和不溶性壳聚糖；以及胶原蛋白。

胶原蛋白是一种主要的细胞外基质组分，具有包括高拉伸强度、柔性、非活性、非毒性和非致癌性等物理特征。作为鼓膜固有层的主要成分，胶原蛋白有助于保持鼓膜的弹性和完整性，并且因此听觉中起着关键的作用。

膜基质还可包含另一增塑剂。举例来说，膜基质还可包含一种或多种选自尤其包含以下的组的添加剂：明胶、壳聚糖、海藻酸、透明质酸、普朗尼克127、脂族聚酯、聚(亚烷基)氧化物、聚(L-乳酸)、70/30L-丙交酯/e-己内酯共聚物、聚(己内酯)、聚(DL-丙交酯-共-己内酯)、聚(D-丙交酯-共-己内酯)、聚(L-丙交酯-共-己内酯)、聚(丙交酯-共-乙醇酸)、聚(乙烯基吡咯烷)、聚(二甲基硅氧烷)、聚(赖氨酸)、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、多肽、聚(亚乙基-共-乙烯基)醇、1,2,6-己二醇、1,3-丙二醇、聚(乙烯基)醇、聚(亚乙基)二醇、聚(亚丙基)二醇、聚-L-丙交酯-共-乙交酯-共-ε-己内酯、聚(四氟乙烯)、聚(二氧杂环己酮)、聚乳糖910或脂族聚酯以及它们的组合，以使装置在使用之前在干燥状态下为可管理的。

脂族聚酯可选自D-丙交酯、L-丙交酯、聚(乳酸)、聚(丙交酯)乙醇酸、聚(乙醇酸)、聚(乙交酯)、乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、ε-己内酯、聚(ε-己内酯)以及它们的组合。聚(亚烷基)氧化物可选自聚(亚乙基)氧化物和聚(亚丙基)氧化物。

根据本发明制备的丝纤蛋白甘油膜基质还可包含浸入膜中或它上面的孔(当存在时)中的至少一种活性剂，从而辅助或促进细胞生长。活性剂优选选自由以下组成的组：维生素、矿物质、蛋白质(诸如细胞因子、酶和细胞生长调节剂，包括生长因子或重组生长因子及其片段和变体)、蛋白质抑制剂、肽、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、适配体、抗体或其片段或部分、激素、激素拮抗剂、碳水化合物、共因子、抗生素或抗微生物化合物、消炎剂、抗增殖剂、抗组织胺、病毒、抗病毒剂、毒素、前药、化学治疗剂、药物以及它们的组合。

优选地，生物活性分子包含任何一种或多种选自包含以下的组的生物活性分子：表皮生长因子，包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、双调蛋白、上皮细胞有丝分裂蛋白(epigen)、上皮调节素、β细胞素；成纤维细胞生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1/aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2/bFGF)；角质细胞生长因子，包括角质细胞生长因子1(KGF-1/FGF-7)、角质细胞生长因子2(KGF-2/FGF-10)；胰岛素样生长因子，包括胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)；血小板源性生长因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、肝细胞生长因子(HGF)；细胞因子，包括IL-6、IL-19、IL-24；细胞外基质蛋白，包括透明质酸、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白；以及维生素，包括反式视黄酸(维生素A)、L-抗坏血酸(维生素C)、(+)-α生育酚(维生素E)。更优选地，生物活性分子包含任何一种或多种选自包含以下的组的生物活性分子：透明质酸；玻连蛋白；双调蛋白；白细胞介素19(IL-19)；白细胞介素24(IL-24)；转化生长因子-α(TGF-α)；VEGF；以及纤连蛋白。

在装置形式中，可将本发明的膜基质制备成多个膜的复合物。在此类情况下，装置可具有两个或更多个膜层。可将每个层制备成具有相同或不同的特征。在本发明的替代形式中，可制备复合装置，其中一个或多个膜层叠在另一表面上。所述表面可由适合以装置要被利用的方式使用的任何材料来制备。当将膜用于组织工程化的情况下，膜要被层叠的表面优选为生物相容的类型。所述表面可由比膜更具刚性或具有更高拉伸强度的另一材料制备。

在本发明的第一方面的第三实施方案中，提供了一种由一种或更多种丝纤蛋白甘油膜制备的装置，其中膜中的至少一者包含：

(a)在膜总湿重的约0.1％至约20％(wt％)范围内的量的丝纤蛋白，

(b)约5％(w/w)至60％(w/w)的甘油，并且

(c)具有在5MPa与500MPa之间的拉伸强度，

(d)具有在5与300％之间的伸长率，

(e)具有在10MPa与1000MPa之间的杨氏模量，

在将膜制备成装置的情况下，装置中可能存在一个或多个膜层。装置中每个层的厚度将在约10微米与约2mm之间变化。优选地，当将膜用作替换鼓膜时将具有在约10与约100μM之间的厚度。最优选地，一个或多个膜层具有在约80与约100μM之间的组合厚度。

在本发明的装置包括由与通过本发明方法制备的不同的材料制备的层的情况下，所述材料可具有任何来源，诸如对所治疗的受试者来说非自体的来源。此类材料可具有非哺乳动物来源。另外，它们可选自尤其包含来自非自体哺乳动物膜的脱细胞化组织，包括鼓膜、心包膜、骨膜、真皮、肌肉筋膜的组。此类额外材料可能是适当的，特别是在将装置部署在重建手术中的情况下。

丝纤蛋白甘油膜基质的制作

在第二方面，本发明提供了一种制作丝纤蛋白甘油膜基质的方法。

在本发明的方法中，使用甲酸来溶解甘油和丝纤蛋白的组合物。然后将所得产物浇铸成薄膜。这些薄膜与其他天然和丝纤蛋白合成生物材料相比展示增强的机械特性和结构特征，这可能是通过在薄膜中在β-折叠形成为稳定氢键合交联物时影响丝纤蛋白结晶行为而形成。

本发明的方法包括以下步骤：

d.在从茧或纤维去除丝胶之后制备丝蛋白或丝蛋白复合溶液；

e.使用甲酸溶解甘油和丝泡沫；以及

f.将所制备的丝蛋白或丝蛋白复合溶液干燥，以对所制备的丝蛋白或丝蛋白复合物进行制作。

从茧或生丝去除丝胶的过程称为脱胶。此类脱胶方法为本领域技术人员熟知的。脱胶方法的实例包括(1)将茧或生丝在肥皂、碳酸钠或其他类似碱等中在碱性水溶液中煮，(2)使茧或生丝暴露于从曲霉属(Aspergillus sp.)等提取的蛋白酶，以及(3)使茧或生丝在液体(例如水)环境中暴露于高温和高压。

根据所述方法，使用甲酸来溶解甘油和丝纤蛋白。优选地，在30℃下将甘油和丝纤蛋白在98％甲酸中溶解1h，同时诸如使用恒温混匀仪混合。

虽然98％的甲酸溶液对在本发明方法中使用是理想的，但也可使用其他甲酸浓度。举例来说，在所述方法中可使用约75至99％甲酸之间的浓度。在使用低于99％的甲酸浓度来溶解甘油和丝纤蛋白的情况下，应改变反应时间。在此类情况下，甲酸浓度可为75、76、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97或99％甲酸。

虽然在所述方法中理想情况下历时1小时使用98％的甲酸溶液来溶解甘油和丝纤蛋白混合物，但在所述方法中可部署其他反应时间。在甲酸浓度降低的情况下，那么可使用时间更长的反应。举例来说，反应时间可为45分钟至2小时，并且根据甲酸浓度可能更长。根据甲酸浓度，反应时间可为45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、100、111、112、113、114、115、116、117、118、119和120分钟并且根据甲酸浓度可能更长。

虽然在使用98％的甲酸溶液并且反应时间为1小时来溶解甘油和丝纤蛋白混合物的情况下，反应温度优选设定在30摄氏度，但在所述方法中可部署其他反应温度。在甲酸浓度或反应时间减少或增加的情况下，那么也可改变反应温度。举例来说，反应温度可为20摄氏度至40摄氏度并且根据甲酸浓度和反应时间可能会更高。因此，反应温度可为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39摄氏度。

在所述方法的优选形式中，在步骤(c)之后，通过热或溶剂、溶剂/甘油或溶剂蒸气处理使丝膜重结晶以降低在水中的溶解度。举例来说，可使所制备的膜暴露于乙醇或另一C₁至C₃醇，诸如甲醇或丙醇，或它们的组合或它们的蒸气，以诱导蛋白质构象转变为β-折叠结构，并且确保在PBS或水中的不溶性。

用如乙醇般的溶剂处理甘油薄膜可产生浸出甘油的作用。优选地，选择用于使膜重结晶的方法要么允许甘油的再引入，要么不将甘油从膜中浸出。这可使用诸如水等蒸气的溶剂甘油组合来实现，以形成β折叠。举例来说，膜可为乙醇或甲醇蒸气退火的，以降低溶解度，从而使甘油的浸出最小化。

在本发明第二方面的一种说明性形式中，制作方法包括以下步骤：

a)使丝纤维脱胶；

b)干燥步骤(a)的脱胶纤维并且将产物溶解于离液盐中。

c)用dH₂O对步骤(b)的丝溶液进行透析，以获得丝溶液；

d)干燥步骤(c)的丝溶液并且将干燥的产物添加至甘油中

e)在20摄氏度至40摄氏度下历时45分钟至2小时将步骤(d)的组合物溶解于75至99％甲酸中，直至组合物为均匀的；以及

f)将溶液制作成膜。

可使用由至少一种选自溴化锂(LiBr)、氯化锂(LiCl₂)、氯化锌(ZnCl₂)和氯化钙(CaCl₂)、硫氰酸锂(LiSCN)的化合物组成的离液盐或包含所述物质的乙醇水溶液来溶解步骤(b)的丝蛋白或丝蛋白溶液。优选使用溴化锂。

用于耳科修复的装置

在第四方面，本发明提供了一种用于修复耳科病患，诸如穿孔，并且特别是慢性穿孔的包含如本文所描述的膜基质的装置。

优选地，制作本文所描述的丝纤蛋白甘油膜以修复鼓膜穿孔。适合于这种修复的膜基质优选将具有在10Mpa至100Mpa之间，更优选为约15Mpa至95Mpa的拉伸强度，并且理想地，拉伸强度在约25与与约75Mpa之间。

当使用这种膜来修复鼓膜穿孔时，膜必须可传导声波。在这方面，本发明的膜应具有与用于鼓膜重建的天然鼓膜或软骨基本上一致或更高的声振特征。声振特征与如上文所讨论的装置的拉伸强度、弹性和厚度有关。此外，声音传输到中耳听小骨还依赖于装置的“刚度”。刚度在大的穿孔中为听觉效果即时改善的重要问题。一个或多个膜的特定拉伸强度有助于最佳声传输，从而使得用膜治疗的受试者在放置后听觉效果立即有所改善。

优选地，本文所描述的膜将具有用以在体内将20Hz与20KHz之间的声波传导至中耳的强度、弹性、厚度和“刚度”。

在本发明第四方面的一个实施方案中，提供了一种适合于修复鼓膜穿孔的丝纤蛋白甘油膜，其中所述膜：

(a)是由在甲酸存在下制备的甘油和丝蛋白复合溶液制作而成的；

(b)包含量在膜总湿重的约0.1％至约20％(wt％)范围内的丝纤蛋白；

(c)包含约5％(w/w)至60％(w/w)的甘油，

(d)具有在10MPa与500MPa之间的拉伸强度，

(e)具有在50与300％之间的伸长率，

(f)具有在10MPa与1000MPa之间的杨氏模量，

其中所述膜：(i)是通过在甲酸存在下溶解甘油和丝蛋白复合溶液，然后干燥以制备膜基质制作而成，(ii)支持选自至少包含以下中的任何一种或多种的组的细胞的增殖、迁移和/或粘附：软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、成骨细胞和角质细胞以及干细胞，并且对特征(d)至(f)加以选择以对20Hz与20KHz之间的声波在体内传导至中耳进行优化。

本文所描述的发明的任何工程化膜构建体可在膜的周围具有适于重建手术的周边裙部。这可以是除鼓环之外的或作为鼓环的一部分。在这方面，所述装置可能在其周边为基本上加厚的，从而允许所述膜被用于作为乳突炎、慢性化脓性中耳炎或胆脂瘤治疗的一部分而进行的乳突切除术手术(包括根治性乳突切除术、管壁下乳突切除术、管壁上乳突切除术、皮质乳突切除术、改良的根治性乳突切除术)中。

如本文在丝膜的背景下所用，术语“周边”是指包围膜平面的边界线。膜的围边不一定是圆形的，并且不需要具有相同的膜厚度。举例来说，膜的围边可为高达5mm低至10微米厚，并且将包括其间的任何厚度。

尽管本文所描述的膜可能合并有可能会或可能不会传导声音的周边裙部，但膜的中间必须在体内将20Hz与20KHz之间的声波传导至中耳。

在一个优选实施方案中，膜具有10MPa至37MPa的拉伸强度。更优选地，本发明的膜具有12MPa至25MPa的拉伸强度。这样的拉伸强度特别适用于治疗紧张部的穿孔，紧张部为最常见的穿孔区域。

在本发明提供用于修复鼓膜穿孔，并且特别是慢性穿孔的膜的情况下，膜基质层基本上是圆盘样形状的，在膜的相对侧具有两个卵形或基本上圆形的面。优选地，一个或两个面的直径在约3mm与约25mm之间，并且更优选在约10mm与约20mm之间。优选地，装置的一个或两个卵形面的直径为约9mm和约8mm。甚至更优选地，装置的一个或两个卵形面的直径为约6mm和约5mm。最优选地，装置的一个或两个面为基本上圆形的，并且最佳直径为约9.5-10mm和范围5-15mm。

可在制备后对本发明的膜基质进行修剪，以匹配所要修复的区域的尺寸和形状。此修剪可使用适当的切割装置来进行，诸如手术剪刀。还可在制备后通过在装置的一个或多个表面刻痕或切槽对装置进行操纵，以改善装置的柔性或可弯曲性，或允许它折叠并基本上维持其折叠构形。

此外，如本文中所描述的此类适合于修复鼓膜穿孔的膜将呈现以下特性的一种或多种。

A.透明度

本发明的装置至少为部分半透明的。优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、9091、92、93、94、95、96、97、98、99和100％透明的，这可有助于用所述装置治疗的受试者的耳鼓和中耳的治疗后检查。

本发明的装置可类似于未受损鼓膜为透明或半透明的。这也使得能够在使用所述装置修复鼓膜之后在随访过程中对受试者中耳的感染或缺陷的检查。

由于光散射较低，使用甲酸浇铸的丝膜当与水溶液基丝/甘油膜相比时具有较高的透明性。

水性丝/甘油膜具有轻微雾状的外观，这在甲酸丝/甘油薄膜中不明显。水性膜的漫透射率在较短波长下也增加至近20％，表明光散射或混浊度增加。相比之下，从甲酸丝浇铸的含甘油膜与纯(无甘油)甲酸丝纤蛋白膜相比展示较小的总透射率降低，从92至97％降至88至91％(图1d)。将甘油添加至甲酸丝纤蛋白膜中还引起漫透射率降低，表明光散射非常低。

B.生物降解性

在一种优选形式中，所述装置为可生物降解的，具有至少1个月的生物寿命。优选地，所述装置将具有1与12个月之间的预期寿命。

在1与12个月之间的体内生物寿命为优选的，因为装置必须保持在适当位置，直到已经发生完全或基本上完全伤口闭合的时间。通常，在组织工程化中，有利的是使装置在体内达最少量的时间，以防止可能的长期并发症，例如囊肿形成。举例来说，小的穿孔可能会在相对短的时间内愈合(约2周闭合，加上4-6周完全重塑)，而较大的穿孔可能需要基本上更久，新鼓室的完全细胞重塑需要长达12个月。已对装置的生物机械特性加以选择，以在使用装置治疗的受试者中基本上预防随后的并发症，诸如萎缩和回缩和/或胆脂瘤。

C.细胞粘附

当存在表面孔或变形时，它们在移植到需要此类治疗的受试者的穿孔鼓膜或耳道时将支持至少角质细胞的增殖、迁移和/或粘附。这是为了有助于使鼓膜从损伤(诸如慢性穿孔)得到修复和再生。因此，本发明的装置提供了一种支架，以使得慢性鼓膜穿孔或耳道软组织和骨骼的有缺陷部分能够经由自然伤口愈合过程加速闭合。

优选地，在使用时膜结构控制或防止细胞通过它浸润至中耳中，诸如在胆脂瘤中防止角质细胞移动到中耳。

D.厚度

本发明的装置的厚度将根据诸如以下的因素而变化：膜所需的声振特性和机械特性、膜层的数目或使用所述装置治疗的受试者的鼓膜穿孔或耳道有缺陷部分的尺寸。根据本发明，膜必须将20Hz与20KHz之间的声波传输到中耳听小骨。在此参数的限制范围内，可将膜制备成根据本发明方法制备的单个层。另外，装置还可具有由本发明方法的产物与由一系列不同材料制备的其他层一起形成的多个层。在存在多个层的情况下，装置的膜部分必须将20Hz与20KHz之间的声波传输到中耳听小骨。

倘若装置的膜部分将20Hz与20kHz之间的声波传输到中耳听小骨，膜的裙部可具有更大的厚度。在重建手术合适的情况下，这是理想的。在这方面，装置可在其周边为基本上加厚的，以适应作为乳突炎、慢性化脓性中耳炎或胆脂瘤治疗的一部分而进行的乳突切除术(包括根治性乳突切除术、管壁下乳突切除术、管壁上乳突切除术、皮质乳突切除术、改良的根治性乳突切除术)期间的手术要求。

出于描述本发明的目的，术语“膜层”和“层”可互换使用。

在一种优选形式中，装置具有彼此相邻层叠的一至三个膜。因此，装置可由单个膜、两个膜或三个膜组成。

以装置外部的一个或多个膜的暴露面之间的距离的形式来测量装置膜层的厚度。在本发明提供用于修复鼓膜穿孔，并且特别是慢性穿孔的装置的情况下，膜的以装置外部膜的暴露面之间的距离来测量的厚度将在约1与约600μM之间。更优选地，膜基质具有在约10与约100μM之间的厚度。最优选地，膜基质具有约80和约100μM的厚度。

膜层将具有约1与约600微米之间的组合厚度。不过，必须将所述厚度选择为将20Hz与20KHz之间的声波传输到中耳听小骨。膜的构建体在此参数范围内的可变性将被认可。优选地，满足此参数的膜层具有约10和约300微米的组合厚度。最优选地，膜层具有在约30与约150微米之间的组合厚度。举例来说，膜层具有约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590和约600微米的组合厚度。

在膜包括多于一个层的情况下，所述层中的至少一者可包含纤维材料。

在各种方面中，公开了纤维膜，所述纤维膜至少包含第一层，所述第一层包含根据本发明方法制备的丝纤蛋白；以及第二层，所述第二层具有可能与第一层相同或不同的材料组成。在存在形成膜的多个层的情况下，所述层将优选被布置成使得每个层中的任何纤维为单轴或径向对齐的。

E.丝薄膜中的活性剂

在一个实施方案中，丝膜包含至少一种活性剂。活性剂可为细胞、蛋白质、肽、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、肽核酸、适配体、抗体或其片段或部分、激素、激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子及其片段和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗细菌剂/抗微生物化合物、病毒、抗病毒剂、毒素、前药、化学治疗剂、小分子、药物或它们的组合。

举例来说，本发明的膜可包含一系列生物相容性活性剂，所述生物相容性活性剂支持鼓膜角质细胞在体内植入以及体外培养之后的增殖、迁移和/或粘附。优选地，选择使得装置相对软的生物材料。

根据此实施方案，提供了一种在丝膜中包埋至少一种活性剂的方法，所述方法包括将丝纤蛋白溶液与至少一种活性剂和甘油掺混，其中活性剂不因甲酸处理而失活；将丝掺混溶液浇铸到薄膜支撑表面上；以及将薄膜干燥。

在一个替代实施方案中，提供一种使至少一种活性剂浸入丝薄膜中的方法，所述方法包括将根据本发明制备的丝掺混溶液浇铸到薄膜支撑表面上；并且在活性剂存在下将薄膜干燥。

合并或浸泡到本发明的膜中的生物活性分子包括帮助或促进耳鼓细胞生长的剂。生物活性分子可结合至装置表面或定位于装置的孔中。

生物活性分子包括选自下组的分子：维生素、蛋白质、肽、酶、碳水化合物、辅因子、核苷酸(DNA或RNA或它们的衍生物)、有机小分子(例如药物)、抗生素、抗病毒剂、抗微生物剂、消炎剂、抗增殖剂、细胞因子、蛋白抑制剂、抗组织胺。优选地，生物活性分子包含任何一种或多种选自包含以下的组的生物活性分子：表皮生长因子，包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、双调蛋白、上皮细胞有丝分裂蛋白、上皮调节素、β细胞素；成纤维细胞生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1/aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2/bFGF)；角质细胞生长因子，包括角质细胞生长因子1(KGF-1/FGF-7)、角质细胞生长因子2(KGF-2/FGF-10)；胰岛素样生长因子，包括胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)；血小板源性生长因子，包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)；细胞因子，包括IL-6、IL-19、IL-24；细胞外基质蛋白，包括透明质酸、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白；以及维生素，包括反式视黄酸(维生素A)、L-抗坏血酸(维生素C)、(+)-α-生育酚(维生素E)。更优选地，生物活性分子包含任何一种或多种选自包含以下的组的生物活性分子：透明质酸；玻连蛋白；双调蛋白；白细胞介素19(IL-19)；白细胞介素24(IL-24)；转化生长因子-α(TGF-α)；VEGF；以及纤连蛋白。

生物活性分子的浓度优选在5ng/ml与150μg/ml之间。

当透明质酸存在于丝膜中时，它的浓度将优选在约1μg/ml与约10μg/ml之间，并且更优选为约5μg/ml。

当玻连蛋白存在于丝膜中时，它的浓度将优选在约0.1μg/ml与约1.0μg/ml之间，并且更优选为约0.5μg/ml。

当双调蛋白存在于丝膜中时，它的浓度将优选在约20ng/ml与约100ng/ml之间，并且更优选为约60ng/ml。

当IL-19或IL-24存在于丝膜中时，它的浓度将优选在约20ng/ml与约100ng/ml之间，并且更优选为约60ng/ml。

当TGF-α存在于丝膜中时，它的浓度将优选在约20ng/ml与约140ng/ml之间，并且更优选为约80ng/ml。

当VEGF存在于丝膜中时，它的浓度将优选在约60ng/ml与约200ng/ml之间，并且更优选为约100ng/ml。

可在形成装置的过程中添加和/或可在形成装置之后和/或在装置的植入或移植过程中与装置分开添加生物活性分子。

装置可个别地或以任何组合包含本文所列的任何化合物，但不限于此。可通过已知用于立即释放或缓释的方法来配制本文所列的任何生物活性分子。另外，装置可以不同的方式包含两种或更多种生物活性分子，例如，除其他外，可将装置用一种生物活性化合物浸渍并且用另一种生物活性化合物涂布。在另一实施方案中，装置包含一种为配制成用于缓释的生物活性分子，以及配制成用于立即释放的第二生物活性化合物。

包括鼓膜修复的伤口愈合需要足够的营养。伤口愈合营养物包括锌、铁、维生素C、精氨酸和其他生物活性分子的来源。因此，可将装置用这些为伤口愈合所需的营养物中的一种或多种的生理上可用的形式来进行浸渍或涂布。优选的是将这些营养物配制成用于缓释。

在一个优选实施方案中，用作免疫调节剂的蛋白质、多肽或肽(包括抗生素)优选是来源于与需要对鼓膜和耳道的有缺陷部分进行修复的受试者相同的物种。举例来说，如果受试者是人，那么用作免疫调节剂的蛋白质、多肽或肽优选为人的或人源化的，以降低对所述蛋白质、多肽或多肽的免疫应答的可能性。

生物活性分子被认为在它被用作移植物在需要此类治疗的受试者中促进鼓膜中的穿孔或耳道的有缺陷部分闭合时，在体内增强包括鼓膜角质细胞和粘膜细胞的细胞在装置上的生长、迁移和/或增殖，或增强所述细胞生长、迁移和/或增殖进入装置。此外，预期这些生物活性分子将提供生物信号以允许伤口部位在愈合后重塑，以便使功能性恢复到基本上发病前的状态，由此长期增强所述受试者的愈合和听觉效果。本发明的装置可不包含生物活性分子；然而，当与使用包含生物活性分子的装置相比时，用于修复需要此类治疗的受试者的鼓膜或耳道的闭合时间可能减少。

在本发明的另一实施方案中，根据本发明方法制备的丝纤蛋白甘油膜可适合于在重负荷或高强度重建应用范围内的多种应用。举例来说，膜的周边裙部可适合于形成重建材料或组织工程化或重建支架。在一些实施方案中，复合材料可适合于形成用于整形外科应用的手术工具。在一些实施方案中，复合材料可适合于形成骨骼支架材料。在这些实施方案中，骨骼支架材料可包含骨传导剂、成骨诱导剂、成骨剂或它们的任何组合。

F.制造

虽然本发明的丝纤蛋白甘油膜为浇铸的，但本发明涵盖在膜中形成多个层。从这个意义来说，可分开地形成不由本发明方法形成的层，然后在制备装置期间附着这些层。或者，可通过折叠所述装置来形成膜层。

制备适合用于产生多层装置的额外的层的方法至少包括以下中的任何一种或多种：纺制，包括静电纺制；织造，包括微织造；或浇铸或浸渍涂布。

织造方法可包括使用如标准纺织品织布机般的微织造装置，不过是以微小规模。结果为基本上有序的织造材料。非织造方法可包括浇铸等等。浇铸涉及将一定体积的溶解的纤蛋白溶液放入浇铸容器中以及允许液体蒸发，从而留下纤蛋白的固体浇铸物。

静电纺制使用电荷从蛋白质的液体溶液牵拉出非常精细(微或纳米尺度)的纤蛋白纤维。它特别适合于使用大分子和复杂分子制备纤维。

此类用于制备装置的方法在装置内和其表面上产生孔隙。孔隙的形状和尺寸将根据用于制备装置的方法而变化。

G.尺寸和形状

在将装置用于鼓膜修复中的情况下，装置以基本上圆盘样形状存在，在装置的相对侧具有两个卵形或基本上圆形面。

可将此类装置成形为将有助于用于修复穿孔鼓膜的任何尺寸、形状或构形。举例来说，可使装置成形为将特别是在1型鼓室成形术或鼓膜成形术的情形中有助于堵塞鼓膜穿孔的尺寸、形状或构形。

在另一形式中，使装置成形为有助于耳道、松弛部和隐窝区重建的形状或构形。因此，使装置适合于符合耳道软组织和骨骼的有缺陷部分。这可包括将装置折叠或在装置的一侧或多侧刻痕，使得修改的装置构形得以维持。因此，装置的尺寸、形状和构形将足以覆盖耳道的有缺陷部分或适合放于耳道的有缺陷部分内。

在将装置用于中耳重建手术的情况下，它包含由多个膜层形成的裙部包围的类似于天然鼓膜的圆盘样形状。所述裙部为对操作期间去除的组织进行重建性建造提供基础。

因此，本文所提供的另一方面涉及一种修复或替换受试者的患病或受损骨骼组织的方法，所述方法包括将包含至少一个包括丝纤蛋白甘油膜的层的骨骼支架材料放置于患病或受损骨骼组织的目标部位。

在一些实施方案中，骨骼支架材料可还包含骨传导剂、成骨诱导剂、成骨剂或它们的任何组合。

在一些实施方案中，骨骼支架材料可还包含细胞(例如干细胞)。在这些实施方案中，可使用本文所描述的骨骼支架材料作为供细胞(例如天然细胞或外部添加的细胞)生长并替换细胞外基质的临时的、可生物降解的支撑管道，从而进一步改善随时间推移的生化特性。

本发明装置的正面可为不是卵形或圆形的形状，所述形状可根据鼓膜穿孔或耳道有缺陷部分的尺寸加以选择。

本发明装置的正面可包含多种尺寸。在一种优选形式中，正面为卵形或基本上圆形的，直径为约10mm至20mm，并且更优选直径为约15mm。在第一种期望的形式中，正面为直径为约9mm乘约8mm的卵形。在第二种期望的形式中，正面为约6mm乘约5mm的卵形。在第三种期望的形式中，正面为基本上圆形的，最佳直径为约9.5-10mm和范围5-15mm。

可从正面的外边缘周围对装置进行修剪，由此将用于修复鼓膜穿孔或耳道有缺陷部分的所述装置定制成比可用装置小的。

可在制备后对本发明的装置进行修剪以与耳鼓需要修复的区域的尺寸和形状相匹配。可使用诸如激光切割等适当的切割装置或使用手术剪刀来进行此修剪。还可在制备后通过在装置的一个或多个表面刻痕或切槽对装置进行操纵，以改善装置的柔性或可弯曲性，或允许它折叠并基本上维持其折叠构形。

优选地，两个面具有在约3mm与约25mm之间，并且更优选在约10mm与约20mm之间的直径。优选地，装置的两个卵形面具有约9mm和约8mm的直径。甚至更优选地，装置的两个卵形面具有约6mm和约5mm的直径。最优选地，装置的两个面为基本上圆形的，并且具有约3mm的直径。

可使用各种不同的工具对装置的一个或两个面进行刻痕或切槽，包括切割工具，诸如剪刀或刀子或刀片。

H.套件

本发明还提供了一种用于修复受试者的耳道、鼓膜穿孔和/或松弛部的套件，所述套件包含如本文所描述的装置。所述套件还可包含如本文所描述的任何生物活性分子的一种或多种溶液。生物活性分子的一种或多种溶液可用于在将装置植入受试者中之前施加至装置，或用于在将装置植入或移植至受试者的耳鼓之后施加至装置，这可一次或此后多次进行。

可以用于促进鼓膜修复或耳道重建的套件的形式提供本发明的装置。在这方面，可于包装或容器中并且以无菌形式提供套件中的装置。所述套件可包括相同或不同尺寸的一个或多个装置以及任何其他一次性医学装置或将有助于修复鼓膜或耳道的药物。优选地，将套件中的装置提供于与其余套件内容物分开的无菌容器或包装中。套件还可包括天然或合成材料的装置支撑物，例如塑料薄膜或罩布等等。所述一次用品可包括以下中的一种或多种：绷带、用于对鼓膜和周围皮肤进行灭菌的灭菌构件、手套、无菌罩布、拭子、抗生素乳膏或膏剂。在一个实施方案中，所述套件包括至少一个装置和一种或多种生物活性分子。所述套件还可包含用于在植入或移植给受试者之前施加至装置的生物活性分子。生物活性分子可呈一种或多种溶液形式。另外或或者，可在已植入或移植装置之后将生物活性分子施加至使用装置治疗的受试者的耳鼓。这可在植入之后立即进行和/或以一系列处理历经数小时或数天的时间来进行。

I.使用方法

在另一方面中，本发明提供一种用于修复需要此类治疗的受试者的耳鼓，并且更优选地修复鼓膜穿孔，诸如慢性鼓膜穿孔，和/或有缺陷的松弛部和/或盾板骨的方法，所述方法包括使用如本文所描述的装置。

本发明还提供了一种修复需要此类治疗的受试者的鼓膜穿孔的方法，所述方法包括使用如本文所描述的本发明装置。

本发明规定使用所述装置来修复鼓膜穿孔可为仅有的鼓膜治疗，或可除此之外在治疗或修复鼓膜期间同时或伴随地使用其他疗法和治疗。举例来说，本发明所提供的鼓膜修复包括使鼓膜与所述装置接触，并且使用另一疗法治疗鼓膜不包括使鼓膜与所述装置接触，其中所述接触和所述另一疗法个别地或一起引起鼓膜损害的至少一个方面的可测量改善、维持或减少其恶化。

在另一方面中，本发明提供了如本文所描述的装置当移植或施加至受试者耳鼓，或更优选地，移植或施加至受试者的鼓膜，诸如鼓膜的穿孔紧张部，和/或受试者的松弛部和/或盾板骨时用于支持至少耳鼓细胞的增殖、迁移和/或粘附的用途。本发明还提供了如本文所描述的装置在乳突消除技术中在鼓室乳突切除术之后用于重建受试者的耳道，包括用于覆盖羟磷灰石游离移植物的用途。

本发明的装置可用于鼓膜或涉及耳鼓所有部分的耳鼓穿孔中并且可如本领域中已知的与使用来自受试者的自体移植物的现有技术一起用作裱贴、衬垫或甚至镶嵌技术。

因此，本发明的装置提供一种用于修复和再生需要此类治疗的受试者的穿孔鼓膜和/或重建和再生包括松弛部和盾板骨的耳道的定制化移植植入物。装置的定制化可帮助促进包括鼓膜和/或耳道的耳鼓再生为基本上类似于天然形式，由此实现更好的改善受试者的愈合和听觉效果的机会。装置中包括纤维中间层在制备声学上更高效的鼓膜时特别有益，同时降低受试者中发生萎缩、穿孔和胆脂瘤形成的可能性。

本发明还提供了一种用于对需要此类治疗的受试者中包括有缺陷的松弛部的耳道进行重建的方法，所述方法包括使用如本文所描述的本发明装置。松弛部在技术上是耳鼓的一部分，并且这是胆脂瘤通常所涉及的区域，胆脂瘤还侵蚀耳道中称为盾板的相邻骨骼，并且还可能涉及鼓腔隐窝。因此，在胆脂瘤中使用本发明的装置重建鼓膜通常需要重建隐窝以及靠近和相连的盾板骨。

因此，可将此治疗与鼓膜穿孔的修复结合。或者，治疗可能是对没有鼓膜穿孔或不需要修复鼓膜穿孔的受试者的耳道进行重建。

本发明还提供了如本文所描述的装置当移植或植入到耳鼓，且更特别地移植或植入到鼓膜和/或受试者的松弛部或盾板骨时用于支持至少耳鼓细胞的增殖、迁移和/或粘附的用途。

在耳部手术中，通常需要在乳突根治术之后进行骨质耳道的重建。可将所述装置用于需要此类治疗的受试者的盾板重建中。将本发明的装置用于此重建过程中的益处在于它可通过其多孔结构整合并且辅助血液供给至区域中，并且装置中的生物分子可促进受试者自己的细胞和组织生长至重建区域中。

此外，可使用本发明的装置来修复或再生耳道底部，耳道底部诸如在乳突切除术(例如针对慢性中耳炎的鼓室乳突切除术)期间可能会患病或受损。在此方面，在针对慢性中耳炎的管壁下鼓室乳突切除术之后乳突消除被指示使乳突腔的尺寸减小。鼓室乳突或乳突消除的其他适应症包括颞骨切除(继发于外伤或肿瘤)和脑脊髓液渗漏的重建。在不消除的情况下，管壁下乳突腔可引起持久性耳漏、需要频繁清洁耳腔、难以使用助听器、因易感染性而引起的水浸不耐性以及倾向于头晕。大多数消除技术由局部皮瓣(例如肌肉、骨膜或筋膜)或游离移植物(例如骨片或骨板、软骨、脂肪或陶瓷材料，诸如羟磷灰石)组成。当羟磷灰石为主要异源移植材料时，这种材料需要在愈合阶段用有活力的组织覆盖。诸如塑料网、Proplast以及多孔聚丙烯等异源移植归因于感染而未长期成功下去。Proplast被发现与持续巨细胞反应相关。瘘、持续引流和肉芽组织导致塑料被逐步废弃。最后，异质移植物缺乏松质骨和其干细胞并且具有最低限度的血管供应。

因此，可将本发明的装置用于乳突消除技术中以在鼓室乳突切除术之后进行重建从而覆盖羟磷灰石游离移植物。

所述装置的另一益处在于它可在手术后所发现的不友好的中耳环境中提供刚度和稳定性，使得它非常适合用于胆脂瘤、肺不张和复发性穿孔的情况。

实施例

材料和方法

丝甘油膜的制备

从印度东北部的生产中心购得卷于轴上的来自多化性家蚕(Bombyx mori)的未脱胶纤维。在98℃下使用2g/L碳酸钠(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)和1g/L无气味橄榄油皂(Vasse Virgin,Wilyabrup,Western Australia,Australia)使纤维脱胶30min。使用旋转染色机器(Ahiba IR Pro,Datacolor,Lawrenceville,USA)进行脱胶。将脱胶纤维在40℃下干燥过夜，然后在60℃下用9.3M溴化锂溶解5h。用dH₂O将溶解的丝溶液在4℃下透析3天以获得浓度如通过重力分析所计算在4与5％w/v之间的丝水溶液。将每一批的丝溶液稀释至4％。

为了制备水性薄膜，将所需量的甘油称重至空管子中。然后将所需体积的4％丝溶液添加至管子中并在旋转混合器上混合1h。然后允许溶液沉降，然后浇铸至皮式培养皿中的水平表面上并且允许干燥24h。

为了制备甲酸基薄膜，将4％丝溶液分装到50mL管子中(每个管子20mL的溶液以允许膨胀)并且在-80℃下冷冻24h。然后将冷冻的丝转移至预冷却的FreeZone冷冻干燥器中并且干燥3天(Labconco,Kansas City,MO,USA)。用解剖刀将冷冻干燥的丝泡沫切成小碎片并且添加至含有预称重的甘油的管子中。然后在30℃下将泡沫溶解于99％甲酸中1h，并且使用恒温混匀仪(Eppendorf,Hamburg Germany)混合。将溶解的样品在7000x g下离心2min以去除气泡，然后浇铸至皮式培养皿中的水平平台上并且允许在通风橱中干燥24h。

UV-可见光分光光度法

使用具有漫反射率附件的Cary 5000 UV-可见光分光光度计(Agilent,SantaClara,CA,USA)测量可见光波长范围内的薄膜透明度。通过从700nm扫描至380nm来测定样品的透射率％。在所附参考标准物存在下扫描样品以测定总透射率并且再次在所附陷光器存在下进行扫描以测定漫透射率。针对每种薄膜类型将所得总透射率和漫透射率扫描一起作图。还在380、550以及700nm下对每个样品的混浊度进行了定量。

拉伸机械特性

将用于拉伸测试的薄膜切成5mm宽的条带，然后在拉伸测试之前将其在20℃±2℃和65％±2％相对湿度下调节至少48h。使用具有100N测力盒的5967型测试仪(Instron,Norwood,MA,USA)进行拉伸测试。使用15mm的标距长度对样品进行测试直至断裂。伸长速率为15mm/min并且预加负荷为0.1N。在切成条带之前测量每个薄膜的厚度；使用三小数位数字测微计(Kinchrome,Melbourne,Australia)在6个拉置对薄膜进行测量。使用这些测量的平均厚度来计算截面积并且随后计算每个薄膜的应力和应变。在至少3个薄膜上测试最少20个条带；拉伸特性以这些测量的平均值±标准偏差表示。

薄膜声学特性

将圆形样品安装至由内径为7.5mm的中空尼龙管组成的定制模型耳道的末端。使用安装至管子相对末端的ER-2听力学耳机(Etymotic Research,Elk Grove Village,IL,USA)以用由PCI信号发生器(PCI-6711,National Instruments,Austin,USA)产生的周期性线性调频信号来激发样品。使用探头传声器(ER-7C；Etymotic Research)来测量管道内的动态压力响应。通过管壁中的洞来送入探头，使得它紧靠着管道内的样品放置。使用聚焦于所夹持样品的暴露侧的激光多普勒振动仪(CLV-2534,Polytec,Waldbronn,Germany)测定不同材料的声学响应。

使用连接至专用PC的数据采集卡(PCI-4462,National Instruments)检测来自振动仪与探头传声器的信号。使用软件包Vibsoft 84 5.0版(Polytec,Waldbronn,Germany)在12.5Hz至20KHz的频率范围内进行快速傅里叶变换并且将变换函数计算为dB rel 1mm/s/Pa。通过首先排除低于100Hz和超过8KHz的所有频率来计算第一共振峰的振幅。使用Origin 2015测定最大振幅和对应频率。展示每个样品的FFT曲线以证实此最大值与第一共振峰有关。将这些测量每个样品测定30次测量(10个丝膜，每个膜冲孔得到三个10mm圆片)。使用平均峰值频率和振幅来描述所测试的不同材料的声音传输特性。

薄膜在压力负荷下的横向位移

为了测试丝薄膜作为用于耳鼓修复的材料的适合性，在被设计成对薄膜施加至多7kPa压力的定制模型耳道中对薄膜进行测试。所述模型由内部尺寸与如文献(Grewe等,2013)中所描述的平均人耳道相匹配的尼龙塑料管组成。利用拧上带有橡胶O形环的盖子来使薄膜圆片保持抵靠管子的一个末端(以代表管子的中耳侧)，同时使管子的另一末端(代表耳朵的外部开口)连接至注射器泵。经由小端口将压力传感器紧靠着样品前面连接在管内，使得可实时监测压力。紧靠着薄膜前面放置小电子位移传感器。光学传感器由红外(IR)LED和检测器组成，以反射的IR光的强度变化的形式来测量样品与传感器之间的距离。传感器产生距离在2mm至5mm之间(如通过线性平移台所测量)的线性输出电压变化。将白色修正液小点置于每个样品的中心以改善其反射率。

薄膜二级结构

使用Vertex 70傅里叶变换红外(FTIR)分光光度计(Bruker,Billerica,MA,USA)在每种薄膜类型中测量结晶(β-折叠和转角)和无定形(α-螺旋以及随机卷曲)基序的比例。在4000至600cm^-1的范围内以吸光度模式进行扫描。每种类型进行总共3个薄膜的扫描，每个薄膜进行6次扫描(薄膜的边缘、顶部表面、薄膜底部表面的边缘、薄膜顶部表面的中心、薄膜底部表面的中心)，每种薄膜类型总共18次测量。将顶部和底部表面扫描取平均值，并且如先前所描述使用7个已知构象位置对酰胺I区(1705至1595cm^-1)进行反卷积和曲线拟合(Rajkhowa等,2012)。使用这7个反卷积峰中的每一者的相对峰面积来确定侧链、β-折叠、随机卷曲、α-螺旋和β-转角的含量％。峰面积％值以6次测量(3个单独薄膜的中心和边缘区域)的平均值±标准偏差表示。在反卷积之后还对每种薄膜类型的所有样品的平均扫描进行作图。

降解抗性

基于先前的工作(Rajkhowa等,2011)使用改良的方法使用体外酶降解研究来测试薄膜。将薄膜在20℃±2℃和65％±2％相对湿度下调节至少48h，然后将每个薄膜切割成5个条带。使用4小数位天平记录每个样品的重量，然后使用UV光将膜带灭菌30min。然后将每个条带无菌转移至15mL塑料管中。将对照样品与0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4一起孵育，同时将实验样品与含有1mg/mL蛋白酶XIV(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)的0.1MPBS一起孵育。将样品孵育超过3天；每天更换蛋白酶溶液和缓冲液以维持最佳酶活性。在6h、1天和3天之后将样品去除。在各时间点，将对照和实验薄膜条带从孵育器移出并且用dH2O充分冲洗，然后浸泡于2％乙酸中30min以去除结合的蛋白酶。然后再次将条带充分冲洗以去除乙酸并在通风橱中干燥过夜。在干燥后，将薄膜条带针对20℃±2℃和65％±2％相对湿度再次调节至少48h并且再次称重。每个实验组和每个时间点对总共5个条带进行称重。将在每个时间点样品的重量减轻呈现为5个样品的平均值±标准偏差，以占原始(调节后的)重量的百分比表示。

表面计量学和粗糙度

使用光学轮廓测定法来计算每个样品的表面粗糙度。简单来说，在Veeco Dektak150 Contour GT(Bruker,Billerica,MA,USA)上使3个薄膜的顶部和底部成像。使用2×倍增器在50×的放大倍数下进行扫描。然后将每次扫描的输出文件输入开源软件Gwyddion(2.44版)中；通过平面调平来校正扫描，然后计算均方根(RMS)粗糙度(R_q)。将由Gwyddion鉴定出的任何缺失数据掩蔽并且排除在粗糙度计算以外。将粗糙度数据呈现为所测量的每种类型的3个薄膜的平均值±标准偏差。

扫描电子显微术

将组织培养板中的样品在室温下在PBS中冲洗30分钟，然后在室温下用等级逐渐增加的乙醇各脱水1小时(50％、70％、95％、100％超干燥乙醇更换2次)。在Emitech K850型临界点干燥器中对样品进行在CO₂中的临界点干燥。在25kV下在Polaron Equipment Inc,E5100型溅射涂布机中在氩气中在0.07托下进行溅射涂布达2min。将样品安装在铝台上并且在Philips,XL30型扫描电子显微镜中观察。在18x、200x和500x放大倍数下取得图像。将图像信息记录在每个图像上所印的数据条上。

纳米压痕

将材料强力胶粘至金属台上并且放置到Hysitron纳米压痕仪950的平台上。针对铝对照样品对样品进行校准。每个测试样品对硬度进行20次测量并且在每个测量点在软件中计算折合模量。

细胞迁移

将来自在DMEM/10％FBS中生长的储备培养物的人鼓膜角质细胞涂铺至transwell培养插件中24小时。事先用2mm活检冲孔器对Transwell膜进行穿孔以形成3个洞。将插件放置在测试材料上并且将细胞覆盖在培养基中。历经48小时，细胞从支撑膜迁移至测试材料。然后将细胞固定在福尔马林中，并且在将已迁移至测试材料上的细胞进行核染色(DAPI)并且于PBS/甘油中安装在载片上的盖玻片下方之后，在荧光显微镜上使其成像。基于所覆盖表面积的比例来估计迁移量。

细胞活力

使用人鼓膜角质细胞培养物对细胞活力进行定量比色分析，使用1％DMSO作为细胞毒性对照。使用CellTiter

单水溶液细胞增殖分析试剂盒在96孔培养板中进行分析并且通过MTS底物转化率来估计细胞数目。在Epoch,BioTek读板仪中读取板。

结果：

透明度：

使用甲酸浇铸的丝膜具有较高透明度，这是由于当与水溶液基丝/甘油膜相比时光散射较低。

在可见光波长范围内，甲酸基丝/甘油薄膜展示较高的总透光率和较低的漫透射率(图1)。鉴于甲酸基薄膜的清澈度较佳并且混浊度较低，较低的漫透射率对应于较低的光散射。在较低的波长下两种薄膜类型之间的差异最大。

水性丝/甘油膜具有轻微雾状的外观，这在甲酸丝/甘油薄膜中不明显。水性膜的漫透射率在较短波长下也增加至近20％，表明光散射或混浊度的增加。相比之下，从甲酸丝浇铸的含甘油膜与纯(无甘油)甲酸膜相比展示较小的总透射率降低，从92至97％降至88至91％。将甘油添加至甲酸膜中还引起漫透射率降低，表明光散射非常低。

声学特性(LDV)：

在听觉频率范围内含有甘油的FA丝薄膜展示与软骨样品相比显著较高的振幅(图2)。

机械特性(拉伸强度、杨氏模量、最大伸长率、空气压力负荷下的位移、纳米压痕)：

拉伸结果：

测试3种主要特性：

●极限拉伸强度：使样品断裂所需力的量

●杨氏模量：样品抵抗长度变化的能力-样品刚度的量度。即，杨氏模量较高＝较硬。

●伸长率：样品在其断裂之前伸长的量(以占样品原始长度的百分比的形式测量)。低伸长率与脆性材料相关。脆性材料往往具有较高的拉伸强度和高模量，但伸长率低。

添加甘油使水性与甲酸基薄膜的拉伸强度和杨氏模量显著降低。

此降低与伸长率显著增加相关。较高的伸长率使得含有甘油的薄膜较脆，因为它们在断裂之前延伸超过100％。

比较含有甘油的水性薄膜与甲酸薄膜(AQ50G40与FA50G40)的特性，两种薄膜具有相同的拉伸强度，但甲酸薄膜展示稍微较高的模量和较低的伸长率。

将甘油添加至水性膜与甲酸膜中使得极限拉伸强度与杨氏模量显著降低。

正如所料，在水性膜与甲酸膜中增塑膜的最大伸长率也显著增加，表明含有甘油的膜与不含甘油的膜相比显著更易延展。

然而，虽然增塑薄膜的强度和模量为类似的，但甲酸甘油膜的最大伸长率为119％，显著低于水性甘油膜的250％伸长率。甘油的增塑作用可能主要作用于无定形区。在水性膜中发现的无定形区(在此情况下为随机卷曲)含量较高可能允许更大的增塑作用，从而产生更大的最大伸长率。

空气压力负荷下的位移：

两种薄膜类型均能够在没有破裂的情况下承受超过7kPa的压力负荷(图3)。

在0至7kPa范围内两种膜展示几乎相同的位移，在较高压力下甲酸薄膜表现得稍微更好(在高于3kPa的压力下比水性薄膜位移更少)，但差异不为统计显著性的。结论是两种薄膜类型表现得同样好。

承受这些压力的能力指示所述膜也许能承受耳朵内常见的短期压力变化。此结果不一定表明所述薄膜能在较长时间的轻微压力下抵抗变形。仍在研发测试这种情况的方法。

化学特性(β-折叠含量、降解抗性)：

将甘油添加至两种薄膜类型中使β-折叠含量增加。甲酸甘油膜在所测试的所有膜中含有最高比例的β-折叠，显著高于水性甘油膜。比较含甘油薄膜，水性甘油薄膜(AQ50G40)具有44.5％的β-折叠含量，而甲酸甘油薄膜(FA50G40)具有显著(P＝0.000)较高的63.8％的β-折叠含量(表2)。

表2：薄膜的β-折叠含量的概括.每个组测量总共3个薄膜。每个薄膜测量两次-一次在薄膜中心，一次靠近边缘。值表示这6次测量的平均值±标准偏差。

薄膜类型	AQ50	AQ50G40	FA50	FA50G40
					侧链	3.0±0.5	0	5.9±0.7	1.3±1.9
β-折叠	23.8±4.8	44.3±3.6	45.5±1.5	63.8±9.3
					随机卷曲	36.4±13.8	44.5±3.8	29.7±3.6	20.6±5.6
α-螺旋	24.8±16.5	0	5.4±4.8	5.8±10.9
					转角	12.0±1.4	11.2±0.4	13.5±3.6	8.4±3.3

甲酸基薄膜(甚至那些不含甘油的甲酸基薄膜)与任一个水性薄膜(含甘油或不含甘油，表2)相比均具有较高的β-折叠含量。这可在反卷积曲线中看出(图4)，所述反卷积曲线表明两种甲酸薄膜在两个β-折叠区内均含有大峰，而水性薄膜曲线以在无定形区内的大峰为主(随机卷曲和α-螺旋区)。

与水性浇铸膜相比甲酸膜的二级结构显著不同。甲酸浇铸膜与水性膜相比具有较高的晶体含量(β-折叠和β-转角)和较低的无定形含量(随机卷曲和α-螺旋)。

与文献(Jose等,2015)相比较发现，不含甘油的情况下，β-折叠含量为31.5％，当将丝与30％甘油混合时β-折叠升高至39.9％。这与在此所呈现的40％甘油并且β-折叠含量为44.5％的水性薄膜相比毫不逊色。此研究还发现，制备不溶于PBS的薄膜需要超过31.4％的β-折叠含量。

降解抗性

两种对照组薄膜(在PBS缓冲液中孵育但没有蛋白酶)损失34％至35％的重量，并且这主要发生在头6小时内。这表明薄膜中绝大多数的甘油被快速浸出去掉，在干燥之后仅仅5％保留在薄膜中。

当与1mg/mL蛋白酶XIV(Sigma-Aldrich)一起孵育时，含有40％甘油的水性薄膜(AQ50G40)在6小时(第一时间点)内完全降解。换句话说，在管中可见一些非常精细的片段(长度小于1mm)，但这些不能被收集或称重。

相比之下，含有40％甘油的甲酸基薄膜(FA50G40)在6小时之后降解了61％，并且在24小时之后降解了71％。其中34％可归因于损失的甘油，因此发现丝在6小时之后的重量减轻为起始重量的27％。

甲酸膜随后在后面几天内持续降解直到3天时间点，在此时膜片段太小而不能称重(基本上完全降解)。甲酸膜与水性膜相比提供显著更佳的降解抗性。

所用的蛋白酶类型和所选的浓度是基于以前的方法并且针对它们在降解丝纤维中的效率加以选择(Horan等,2005)。所述研究可看做加速降解研究。在体内环境中降解被认为慢得多。

表面形态和粗糙度：

光学轮廓测定法数据：

FA50G40薄膜比AQ50G40薄膜更光滑(图6，表3)。

表1：水性与甲酸基薄膜的表面的平均粗糙度(Rq)(nm).NB值表示对每个样品中3个薄膜的测量的平均值±标准偏差。

扫描电子显微术数据：

纯丝具有含亚微米尺度波动的精细纹理的光滑均质表面。FA丝又更光滑，但具有陷窝表面，陷窝尺寸为约2μm直径。

Aq丝甘油呈现出比丝更精细的表面纹理。

FA丝甘油的陷窝比FA丝少。一个样品具有较大直径的陷窝，而另一个样品具有较小的陷窝。

两个表面的图像表明水性膜的顶部表面比底部粗糙。

相比之下，甲酸衍生的丝膜展示明显更光滑的表面，没有任何可见的微粗糙度。然而，FA-SF膜的顶部表面以存在直径长达几μm的陷窝或凹坑为主，从而导致93.8±6.1nm的高得多的平均粗糙度。这些凹坑存在于由甲酸浇铸的纯丝与丝/甘油膜两者中并且存在于两个表面上，然而在纯甲酸基丝膜的顶部表面上它们为最大和最显著的。较大的点状凹坑似乎不会不利地影响甲酸膜的透明度，因为甲酸膜展示类似于或优于水性膜的透明度。

纳米压痕：

与Aq丝相比FA丝的折合模量较高。

添加甘油使两种类型的丝的模量基本上降低(约五倍)。

与Aq丝相比FA丝的硬度较低。

添加甘油使两种类型的丝的硬度基本上降低(约10倍)。

细胞培养数据(细胞迁移、活力)：

细胞迁移

使用专用细胞迁移和移植分析，我们能够证实所有支架均支持人鼓膜角质细胞从支撑性PET膜迁移至支架表面。然后细胞附着于支架上并且保持有活力，将增殖的证据视为有丝分裂像和整个表面的快速移植。

在FA丝上，迁移和移植足以在48小时内产生角质细胞在整个样品(3mm²)上的汇合覆盖。

水性丝薄膜也支持细胞迁移和移植至表面上，但达到的程度较低，在大多数样品中填充不到一半的区域。

添加甘油不影响AQ或FA设定中的结果。

在半定量分析中，经排序的得分为FA50＝FA50G40>AQ50＝AQ50G40。

细胞活力

使用人鼓膜角质细胞培养物对细胞活力进行定量分析，使用5％DMSO作为细胞毒性对照。

这些实验中关于细胞毒性的对照处理(5％DMSO)使吸光度降低63％，指示细胞死亡。

所有薄膜均支持活细胞群体48小时并且评估丝膜支持细胞活力的相对效率是有可能的。

终点时的吸光度(细胞数目)为可变的，但AQ丝和FA丝为类似的。

甘油的存在不影响细胞数目。

平均值±SD，n＝3-6，平均三至六个实验，一式三份

这些数据证实与水性薄膜相比甲酸薄膜的优点为：

I.当与水溶液基丝/甘油膜相比较时，归因于光散射较低，透明度较高，

II.混浊度较低。

III.与水性薄膜相比晶体含量(β-折叠)较高，所述水性薄膜具有较高的无定形含量(随机卷曲和α-螺旋)。

IV.此较高结晶度转化为较高的酶降解抗性，较高的酶降解抗性可转化为较慢的体内降解，同时维持良好机械强度和与非增塑膜相比显著更佳的断裂伸长率。

V.较高的结晶度也转化为稍微较高的模量(FA50G40膜比AQ50G40稍微更硬)。没有直接益处，但可能允许与AQ薄膜相比具有相同压力位移抗性的FA膜稍微更薄。在FA50G40膜在超过3kPa的压力下的位移稍微更低方面这是明显的，不过此结果不为统计显著性的。因此，不能声称较高的压力抗性为显著益处。

VI.由甲酸制成的丝膜也展示良好的生物相容性并且支持人鼓室的迁移。

甘油和甲酸作为溶剂的组合允许制备与甘油增塑的水性膜相比具有较高透明度和优良酶降解抗性的增塑膜。增塑的甲酸衍生的膜展示类似于增塑的水性膜的拉伸强度和模量并且实现大于100％的最大伸长率。使用甲酸不负面地影响细胞毒性或生物相容性，所以认为这些膜对于需要透明度和较慢的降解的环境来说提供了强有力的替代方案。

参考文献

Grewe，J.，Thiele，C.，Mojallal，H._，Raab，P.，Sankowsky-Rothe，T.，Lenarz.T.，Blau，M.&Teschner，M.2013.New HRCT-based measurement of the human outer earcanal as a basis for acoustical methods.American Journal of Audiology，22，65-73.

Horan，R.L.，Antle，K.，Collette，A.L.，Wang，Y.，Huang，J..Moreau，J.E.，Volloch，V.，Kaplan，D.L.&Altman，G.H.2005.In vitro degradation of silkfibroin.Biomaterials，26，3385-3393.

Jose，R.R.，Brown，J.E.，Polido.K.E.，Omenetto，F.G.&Kaplan，D.L.2015.Polyol-Silk Bioink Formulations as Two-Part Room-Temperature CurableMaterials for 3D Printing.ACS Biomaterials Science&Engineering，1，780-788.

Rajkhowa，R.，Hu，X.，Tsuzuki，T.，Kaplan，D.L.&Wang，X.2012.Structure andbiodegradation mechanism of milled Bombyx mori silkparticles.Biomacromolecules，13，2503-12.

Rajkhowa，R.，Levin，B.，Redmond，S.L..Li，L.H.，Wang，L.J.，Kanwar，J.R.，Atlas，M.D.&Wang，X.G.2011.Structure and properties of biomedical filmsprepared from aqueous and acidic silk fibroin solutions.Journal of BiomedicalMaterials Research Part A，97A，37-45.

Claims

1.一种在甲酸存在下制备的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述膜基质：

(a) 包含量在所述膜基质的总湿重的0.1%至20% (wt%)范围内的丝纤蛋白；

(b) 包含10% (w/w)至60% (w/w)的甘油；

(c) 在体内将20 Hz与20 KHz之间的声波传输至中耳；

(d) 具有10 MPa至100 MPa之间的拉伸强度；

(e) 是由在甲酸存在下制备的甘油和丝纤蛋白复合溶液制作而成的；并且

(f) 其中所述膜基质在没有通过溶剂或溶剂/甘油或溶剂蒸气退火处理的情况下具有二级结构，通过酰胺I区1705至1595 cm^-1中的反卷积FTIR峰的分析所测定，具有63.8 ±9.3%的β-折叠基序含量。

2.一种制作甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质的方法，所述方法包括以下步骤：

(a) 在从茧或纤维去除丝胶之后制备丝纤蛋白或丝纤蛋白复合物；

(b) 使用甲酸溶解甘油和所述丝纤蛋白或丝纤蛋白复合物以形成丝纤蛋白或丝纤蛋白复合溶液，所述丝纤蛋白或丝纤蛋白复合溶液包含0.1%至20% (wt%)范围内的量的丝纤蛋白；以及

(c) 将所述丝纤蛋白或丝纤蛋白复合溶液干燥，以制作所述甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中：

（1）所述丝纤蛋白甘油膜基质包含10% (w/w)至60% (w/w)的甘油；

（2）所述甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质在没有通过溶剂或溶剂/甘油或溶剂蒸气退火处理的情况下具有二级结构，通过酰胺I区域1705至1595cm^-1中的反卷积FTIR峰的分析所测定，具有63.8±9.3%的β-折叠基序含量；并且

（3）所述甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质能在体内将20 Hz与20 KHz之间的声波传输至中耳；并且具有10 MPa至100 MPa之间的拉伸强度。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(c)之后，通过加热或溶剂或溶剂/甘油或溶剂蒸气处理使所述甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质再结晶以降低水溶性。

4.根据权利要求3所述的方法，其中使所述甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质暴露于乙醇或另一C₁至C₃醇或它们的组合以诱导蛋白质构象转化为β-折叠结构并且确保不可溶于PBS或水。

5.一种根据权利要求2至4中任一项所述的方法制备的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质。

6.根据权利要求5所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其包含至少一种活性剂。

7.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是选自由以下组成的组：细胞、蛋白质、核酸类似物、核苷酸或寡核苷酸、适配体、抗体或其片段、激素、激素拮抗剂、生长因子及其片段和变体、抗生素、病毒、毒素、前药以及它们的组合。

8.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是肽。

9.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是肽核酸。

10.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是重组生长因子及其片段和变体。

11.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是细胞因子。

12.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是酶。

13.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是抗微生物化合物。

14.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是抗病毒剂。

15.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是化学治疗剂。

16.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是小分子。

17.根据权利要求6所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述活性剂是药物。

18.根据权利要求5-17任一项所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中所述膜基质支持角质细胞、成纤维细胞、粘膜上皮细胞、内皮细胞、软骨细胞、诱导多能干细胞、成体干细胞和胚胎干细胞以及它们的组合的生长。

19.根据权利要求1或权利要求5-17任一项所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中在没有通过溶剂或溶剂/甘油或溶剂蒸气退火处理的情况下或在通过溶剂或溶剂/甘油或溶剂蒸气退火处理之前，通过酰胺I区1705至1595 cm^-1中的反卷积FTIR峰的分析所测定，所述甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质包含54.5-73.1%的β-折叠基序含量。

20.根据权利要求1或权利要求5-17任一项所述的甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质，其中在没有通过溶剂或溶剂/甘油或溶剂蒸气退火处理的情况下或在通过溶剂或溶剂/甘油或溶剂蒸气退火处理之前，通过酰胺I区1705至1595 cm^-1中的反卷积FTIR峰的分析所测定，所述甲酸处理的丝纤蛋白甘油膜基质所包括的%β-折叠基序含量大于侧链、随机卷曲、α-螺旋和β-转角基序的%含量的总和。