JP2019512352A - 改善されたシルクフィブロイングリセロール膜 - Google Patents

Abstract

本発明は、鼓膜に対する穿孔及び損傷を含む中耳の修繕における使用のための膜の調製物に関する。本発明は、膜が、改善された機械的及び振動音響的特性を有する、複合シルクフィブロイン及びグリセロール膜をギ酸を用いて調製するための組成物及び方法をも提供する。【選択図】なし

Description

本発明の分野
本発明は、鼓膜に対する穿孔及び損傷を含む中耳の修繕における使用のための膜の調製に関する。本発明は、改善された機械的及び振動音響的特性を有する複合シルクフィブロイン及びグリセロール膜を、ギ酸を用いて調製するための組成物及び方法をも提供する。

背景
以下の議論は、本発明の理解を促進することのみを意図する。議論は、言及された材料のいずれかが、本出願の優先日における共通の一般的な知識であるか、又はその部分であったという認定又は承認ではない。

鼓膜（ｅａｒｄｒｕｍ）又は鼓膜（ｔｙｍｐａｎｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の慢性穿孔は、鼓膜形成術又は鼓室形成術タイプ１として知られる技術である、穿孔を覆う移植片材料を用いる外科的介入を必要とする比較的一般的な状態である。

筋膜、脂肪、軟骨膜及び軟骨などの自家移植片は、この手術において使用される最も一般的な組織である。しかしながら、このアプローチは、鼓膜と移植片の機械的特性のミスマッチ、移植片の非透過性、ドナー部位の病的状態及び手術時間の増加を含む、さまざまな制限を有する。

近年の材料科学における発展に伴い、脱細胞化した組織（例、ＡｌｌｏＤｅｒｍ（登録商標））、ポリマー（例、ヒアルロン酸、キトサン及びアルギン酸カルシウム）及び合成の材料［例、ポリ（グリセロールセバケート）（ＰＧＳ）］などのさまざまな代替足場材料が、移植材料として調査されてきた。しかしながら、最適な足場の選択は、解決されないままである。

シルクフィブロインは、組織エンジニアリングにおいて、バイオ足場としてのその可能性のため、広く研究されてきた。それは、抗原性タンパク質セリシンの除去後のカイコ繭に由来する。シルクフィブロイン溶液は、フィルム、繊維、マット、ヒドロゲル及びスポンジなどの、広い生物医学的適用にさまざまな形態に加工することができる。

シルクフィブロインは、生分解性であり、生体適合性で、かつ、コラーゲン及びポリ乳酸（ＰＬＡ）などのほとんどの他の自然の及び合成のバイオ材料と比較して優れた機械的強度、強靱性及び弾性を有する。重要なことに、シルクフィブロインは、軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、骨芽細胞及びケラチノサイトなどの、多くの異なる細胞タイプの付着及び増殖を支持することができる。

シルクの主要な有益な点の１つは、加工状態の単純な変化を介して、組織エンジニアリング適用に適合するようその特性を変えることができる能力である。加工方法の操作（例、水対有機溶媒、水対アルコールアニールすること）及び加工変数（例、乾燥率、シルク濃度、孔サイズ）は、シルクの物理的な及び構造的特性を変えることができ、足場材料としてのその性能に影響を与えることができる。

しかしながら、多くの場合、鼓膜に対する穿孔及び損傷を含む中耳の修繕における使用のために膜の機械的及び振動音響的特性を強化するよう複合ブレンドを改善することは、依然として重要な課題である。過剰なポリマーの添加を避け、延長された時間枠の間、安定性が存在する膜を生み出すことは、依然として重要な目標のままである。

シルクフィブロインフィルムの物理的な及び機械的特性を変更して、機械的及び振動音響的特性を改善する、ニーズが依然として存在する。

本発明者らは、シルクフィブロイン膜の製造において酸性溶媒を用いることにより、それらの酵素分解率及びβシート含有量を含む膜のさまざまな特徴を改善することが可能であることを同定し、その点において一般的な適用の主になるものを同定した。好ましくは、酸性溶媒は、水の代わりにギ酸である。理想的には、製造環境は、グリセロールなどの可塑剤を含む。

凍結乾燥されたシルクは、ギ酸に溶解性であり、長期間、保管することができる。これにより、必要に応じフィルムをキャストすることができる。また、ギ酸ベースのシルクから作られた生成物は、水に溶解性ではない。それらは、フィルムを縮ませること及び曲げることを引き起こすかもしれない工程である、エタノール又はメタノールを用いてアニールすることを必要としない。対照的に、水性シルクフィブロイン溶液は、すぐにキャストしなければならず、数日から数週以内に使用しなければならず、さもなければ、溶液又はゲルは、使用できなくなる。

第一の態様において、本発明は、ギ酸の存在下で調製された、複合シルクフィブロイン及びグリセロール膜マトリックスであって、当該膜が：
（ａ）膜の合計湿重量の約０．１％から約２０％（ｗｔ％）の範囲の量でシルクフィブロインを含み、
（ｂ）約５％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含み、
（ｃ）５ＭＰａから１０００ＭＰａの間の引張強度を有する、
膜であり、
ここで、グリセロール及びシルクタンパク質複合体溶液は、乾燥させて膜マトリックスを調製する前に、ギ酸の存在下で溶解される、
ものを提供する。

本発明のシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスは、組織エンジニアリングのための構築物を提供する。それは、ケラチノサイト、線維芽細胞、粘膜上皮、内皮細胞、軟骨細胞等がその上を増殖し得るマトリックスを提供する。膜マトリックスは、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞及び胚性幹細胞並びにそれらの組み合わせを用いる細胞療法に使用され、患者において、これらの細胞をその上で増殖させることができる足場を提供し得る。

本発明のシルクフィブロイン及びグリセロール膜マトリックスは、グリセロールを欠くシルクフィブロインフィルムと比較して明白な特性を有する。溶解性及び生体適合性は、可塑剤としてのグリセロールの使用及び使用又は含有に伴い、強化される。材料加工におけるシルクフィブロインと組み合わせたグリセロールの使用は、シルクフィブロインを用いて達成できる機能的な特性を拡張し、バイオ材料及びデバイスにおいて潜在的な有用性を有する、より柔軟性のあるフィルムの形成を拡張する。

第二の態様において、本発明は、
ａ．セリシンの繭又は繊維からの除去後、シルクタンパク質又はシルクタンパク質複合体溶液を調製する工程；
ｂ．ギ酸を用いて、グリセロール及びシルクフィブロインを溶解する工程；及び
ｃ．工程（ｂ）の調製物を乾燥させて、シルクタンパク質膜を作製する工程、
を含む、シルクフィブロイングリセロール膜マトリックスを作製する方法を提供する。

第三の態様において、本発明は、本発明の第二の態様の方法により製造されるシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスを提供する。

第四の態様において、本発明は、本明細書中に記載される膜マトリックスを含む、鼓膜穿孔、特に慢性穿孔の修繕のためのデバイスを提供する。これに関して、膜マトリックスは、好ましくは、およそ１５ＭＰａから９５ＭＰａの間の引張強度を有し、より好ましくは、およそ２５からおよそ７５ＭＰａの間の引張強度を有する。

第五の態様において、本発明は、本明細書中に記載される膜マトリックスを含む、外耳道、弛緩部及び／又は鼓室蓋骨の修繕における使用のためのデバイスを提供する。

第六の態様において、本発明は、対象の鼓膜に、より好ましくは、穿孔された、対象の鼓膜、及び／又は弛緩部及び／又は対象の弛緩部の近位にある鼓室蓋骨などの鼓膜に移植され又は適用される場合に、少なくとも鼓膜の細胞の増殖、移動及び／又は接着を支持する、本明細書に記載の膜マトリックスの使用にある本発明は、ヒドロキシアパタイト遊離移植片を覆うことを含む、乳様突起切除術後の対象の外耳道の再構築のための乳様突起閉塞技術における、本明細書に記載される膜マトリックスの使用を提供する。

さらなる態様において、本発明は、鼓膜、より好ましくは慢性鼓膜穿孔、及び／又は欠陥のある弛緩部及び／又は弛緩部の近位にある鼓室蓋骨などの、鼓膜穿孔を、かかる治療を必要とする対象において、修繕するための方法を提供し、前記方法は、修繕される損傷した組織又は組織に対する、本明細書に記載される膜マトリックスを含む。

本発明は、対象の外耳道、鼓膜穿孔及び／又は弛緩部の修繕における使用のためのキットをも提供し、前記キットは、本明細書に記載される膜マトリックスを含む。キットは、本明細書に記載される、生物学的活性分子のいずれかの一以上の溶液を含んでもよい。一以上の生物学的活性分子の溶液は、対象への膜マトリックスのインプランテーションより前の膜への適用のためであってもよく、膜マトリックスの対象への一回又はその後に複数回起こり得る移植又はインプランテーション後の膜マトリックスへの適用のためであってもよい。

従って、本発明の膜マトリックスは、損傷した組織の修繕及び再生における使用のためのカスタマイズされた移植片インプラントを提供する。一形態において、損傷した組織は穿孔された鼓膜である、及び／又はかかる治療を必要とする対象における、弛緩部及び鼓室蓋骨を含む外耳道の再構築及び再生である。

膜マトリックスをカスタマイズすることは、修繕に使用される組織の天然の形態に実質的に類似するように再生を促進することを支援することができ、それによって対象のために改善された治癒アウトカムのためのより良い機会を可能にする。

添付の図と併せた以下の例示的な実施形態の説明から、本発明の、これらの及び／又は他の、態様及び有益な点は明らかになるであろうし、より迅速に理解されるであろう。

図において、以下の略称を適用する：
ＡＱ５０ 水性溶液からキャストされたフィルム、厚さ５０μｍ
ＡＱ５０Ｇ４０ 水性溶液からキャストされたフィルム、厚さ５０μｍ、４０％グリセロールを含有する
ＦＡ５０ ギ酸溶液からキャストされたフィルム、厚さ５０μｍ
ＦＡ５０Ｇ４０ ギ酸溶液からキャストされたフィルム、厚さ５０μｍ、４０％グリセロールを含有する

図１は、水性シルク／グリセロールフィルム（ｂ）と比較した、ギ酸ベースのシルク／グリセロールフィルム（ａ）の透過性を示す図である。グラフは、３つのフィルムの、各フィルムから行った２回の測定値を用いた（合計６の測定値）平均透過率を表す。 図２は、ギ酸対水性膜の周波数応答を示す図である。 図３は、最大７ｋＰａの空気圧負荷に暴露した際の、水ベースのグリセロール含有フィルム（ＡＱ５０Ｇ４０）と比較した、ギ酸ベースのグリセロール含有フィルム（ＦＡ５０Ｇ４０）の変位を示す図である。 図４は、グリセロールを用いた又は用いていない、水性ｖｓギ酸ベースのフィルムの、デコンボリューションしたＦＴＩＲスキャンを示す図である。 図５は、水性ｖｓギ酸ベースのフィルムの、酵素分解によりもたらされる重量減少を示す図である。 図６は、光学形状測定を用いて作成された、水性ｖｓギ酸（グリセロールを用いた又は用いていない）フィルムの表面トポグラフィを示す図である。ＮＢ：表面の特性を強調するために、各画像の高さを２倍に増加させた。 図７は、ナノインデンターによる、水性ｖｓギ酸フィルムの硬度及び弾性を示す図である。（Ａ）グリセロールの添加は、いずれのタイプのシルクについても、係数を実質的に低下させた（約５倍）。（Ｂ）硬度は、ＦＡシルクにおいて、ａｑシルクより低かった。グリセロールの添加は、いずれのタイプのシルクについても、硬度を実質的に低下させた。（約１０倍）。 図８は、水性ｖｓギ酸フィルム上の、ヒト鼓膜ケラチノサイトの移動を示す図である。ＦＡシルクについて、移動及び生着は、４８時間以内に試料（３ｍｍ^２）全体にわたる、ケラチノサイトのコンフレントな覆いを生じるのに十分であった。水性シルクフィルムも、表面への細胞の移動及び生着を支持したが、より少ない程度で、多くの試料において満たされた領域の半分より少なかった。グリセロールの添加は、ＡＱ又はＦＡセッティングにおけるアウトカムに影響を与えなかった。半定量的分析において、ランク付けされたスコアは、ＦＡ５０＝ＦＡ５０Ｇ４０＞ＡＱ５０＝ＡＱ５０Ｇ４０であった。

本発明者らは、シルクフィブロイングリセロール膜の製造において、酸性溶媒を用いることにより、水性溶液中又はグリセロールを用いない同じ材料の調製物に対して、結果として生じる材料のバイオ機械特性を改善することが可能であることを発見した。その結果、本発明は、（ｉ）水性（水）環境中で調製された膜と比較して、相対的に長い期間保管することができ、（ｉｉ）水中で相対的に不溶性であり、（ｉｉｉ）生分解性であり、生体適合性であり、並びに他の多くの自然の及びシルクフィブロイン合成バイオ材料と比較して、改善された機械的強度、弾性及び剛性の一以上を有する、酸性溶媒（ギ酸など）の存在下で調製される複合シルクフィブロイングリセロール膜に向けられる。

本発明により製造されるシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスは、広い生物医学的適用に対応する、フィルム、繊維、マット、ヒドロゲル及びスポンジとして、組織エンジニアリングにおける足場などの、複数の利用方法がある。

シルクフィブロイングリセロール膜マトリックスを鼓膜の修繕において使用する場合、本発明者らは、シルクフィブロイド膜の製造において酸性溶媒を用いることにより、機械的及び振動音響的特徴、酵素分解率及びシルクフィブロイン膜のβシート含有量を改善することが可能であることを発見した。好ましくは、酸性溶媒は、水の代わりにギ酸である。

便宜上、以下のセクションでは、一般に、本明細書で使用される用語のさまざまな意味を概説する。この議論の後、シルクフィブロイングリセロール膜マトリックスに関する一般的な態様について議論され、続いて、膜の様々な実施形態の特性及びそれらをどのように採用するかを実証する特定の実施例について議論する。

定義
当業者は、本明細書に記載される本発明が、具体的に記載されたもの以外の変形及び変更が可能であることを理解するであろう。本発明は、かかる全ての変形及び変更を含む。本発明はまた、本明細書中に個別に又は集合的に言及され又は示される全ての工程、特性、製剤及び化合物、並びに任意の若しくは全ての組み合わせ又は任意の２つ以上の工程又は特性を含む。

本明細書に引用された各文献、参考文献、特許出願又は特許は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれており、読者が本明細書の一部として読んで考慮する必要があることを意味する。本明細書で引用された文献、参考文献、特許出願又は特許が本明細書において繰り返されないことは、単に簡潔さの理由によるものである。しかしながら、引用された材料又はその材料に含まれる情報は、共通の一般的な知識であると理解されるべきではない。

本明細書中で言及された、又は参照により本明細書に組み込まれた任意の文献において、任意の製品の製造者の指示書、説明、製品仕様、及び製品シートは、参照により本明細書中に組み込まれ、本発明の実施において採用することができる。

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態のいずれかによって範囲が限定されるものではない。これらの実施形態は、例示のみを意図している。機能的に同等の製品、製剤及び方法は、本明細書に記載の本発明の範囲内であることは明らかである。

本明細書に記載される本発明は、一以上の値（例、サイズ、濃度など）の範囲を含み得る。値の範囲は、範囲の境界を定めるその値に直接隣接する値と同じ又は実質的に同じ結果につながる、範囲を定義する値及び範囲の近傍にある値を含めた、当該範囲内の全ての値を含むと理解されるであろう。

本明細書を通じて、文脈上そうでないことを要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記載された整数又は整数の群の包含することを意味すると理解されるであろうが、他の整数又は整数の群を包含しないことを意味するとは理解されないであろう。

本明細書で使用される選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な説明の中に見出され得るし、全体を通して適用され得る。他に定義されない限り、本明細書で使用される他の全ての科学及び技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書中に、引用された材料又は含まれる情報への言及は、当該材料又は情報が共通の一般的な知識の一部であるか、又はオーストラリア若しくは他の国で知られていたという譲歩として理解されるべきではない。

本発明のデバイス及びそれがどのように使用され得るかを記載する目的のために、用語「穿孔された」、「穿孔」、又は「穿孔する」のそれらの任意の他の変形は、本発明のデバイスを用いて修繕することができる、対象の鼓膜に対する任意の損傷を含むと理解されるであろう。包括的でない例において、かかる損傷は、物理的な力又は疾患による、鼓膜における穴若しくは裂け目、又は膜又は膜の層の任意の部分の変形若しくは損失を含んでもよい。（例えば図１を参照のこと）。鼓膜又は鼓膜（ｅａｒｄｒｕｍ）は、外耳道の内側境界における緊張部及び弛緩部を含む。弛緩部は、退縮及びコレステリン腫の対象であり、近傍にある鼓膜の鼓室上鼓室、鼓室蓋骨及び外耳道の軟組織は、しばしば、これらの状態の外科治療の後に再構築を必要とする。

本発明のデバイス及びそれがどのように使用され得るかを記載する目的のために、用語「欠陥のある」又はそれらの用語のその他のかかる変形は、本発明のデバイスを用いて修繕又は再構築することができる、対象の周囲の領域の骨又は弛緩部の軟組織に対する損傷又は疾患を含むと理解されるであろう。これは、とりわけ、コレステリン腫による損傷又は疾患、又は乳様突起切除術後の対象の外耳道の必要な修繕による損傷又は疾患を含み得る。

本発明の実施形態は、これから以下の非限定的な記載及び例示を参考にして議論されるであろう。

実施形態
本発明により製造されるシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスは、生分解性、生体適合性であり、コラーゲン及びポリ乳酸（ＰＬＡ）などのほとんどの他の自然の及び合成のバイオ材料と比較して、それらの機械的強度、伸長及び剛性の一以上が改善されている。

Ａ．シルクフィブロイングリセロール膜マトリックス
本発明は、ギ酸の存在下で調製されたシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスであって、
当該膜は、：
（ａ）膜の合計湿重量の約０．１％から約２０％（ｗｔ％）の範囲の量でシルクフィブロインを含み、
（ｂ）約５％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）グリセロールを含む、膜であり、
グリセロール及びシルクタンパク質複合体溶液は、乾燥させて膜マトリックスを調製する前にギ酸の存在下で溶解されるものを提供する。

シルクフィブロインは、膜の合計湿重量の約０．１％から約１０％（ｗｔ％）の範囲の量で、膜中に存在する。好ましくは、シルクフィブロインは、ポリマーの合計湿重量の約１．０％から約２．０％、約２．０％から約３．０％、約３．０％から約４．０％、約４．０％から約５．０％、約５．０％から約６．０％、約６．０％から約７．０％、約７．０％から約８．０％、約８．０％から約９．０％、約９．０％から約１０．０％、約１０．０％から約１１．０％、約１１．０％から約１２．０％、約１２．０％から約１３．０％、約１３．０％から約１４．０％及び約１４．０％から約１５．０％から選択される量で存在する。

シルクフィブロイングリセロール膜のグリセロール含有量は、約５％から６０％（ｗ／ｗ）の間であるだろう。好ましくは、グリセロール含有量は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９及び６０％（ｗ／ｗ）から選択される。

膜マトリックスの引張強度は、シルクフィブロイン及びグリセロールの含有量を変えることにより変えることができる。理想的には、引張強度は、膜がバイオエンジニアリングされる目的のために選択される。例えば、膜が組織エンジニアリングのためのバイオ足場として形成される場合、引張強度は、５００ＭＰａと同じくらい大きいものであり得、或いは必要とされる場合それより大きくでさえあり得る。望ましくは、膜マトリックスの引張強度は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、６００、７００、８００、９００ＭＰａ又はこれらの数値の間の任意の値の引張強度である、５ＭＰａ及び１０００ＭＰａの範囲であり、それは、材料が利用される目的に応じて許容可能である。例えば、骨の足場修繕として又は傷修繕において膜マトリックスが使用される場合、デバイスの引張強度は、５０ＭＰａ及び５００ＭＰａの間であり得る。或いは、膜マトリックスが、鼓膜の修繕のためのデバイスとして使用される場合、材料の引張強度は、９から１００ＭＰａの範囲となるだろう。例えば、かかる膜マトリックスは、９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ＭＰａ又はこれらの数値の間の任意の値の引張強度を有し得る。

ギ酸の存在下でシルクフィブロイン及びグリセロールから本発明の膜を調製することにより、本発明者らは、ほとんどの他の自然の及び合成のシルクフィブロインバイオ材料と比較して強くかつ弾性があり、裂け目又は破損を伴わずにひずみに耐え得る、改善された膜マトリックスを開発した。材料の強度及び弾性は、材料が破損すること又は粉々になることを伴わずに伸長する能力として定義することができる。

裂けること又は破損することを伴わずひずみに耐えるための膜マトリックスの弾性は、シルクフィブロイン及びグリセロールの含有量を変えることにより変えることができる。理想的には、膜は、５から３００％の間の伸長のパーセンテージを有するであろう。低い伸長は、もろい材料と関係する。もろい材料は、しばしば、より高い引張強度及び高い係数を有するが低い伸長を有する。

組織エンジニアリングのためのバイオ足場として膜が形成される場合、伸長のパーセンテージは、必要とされる場合５％ＭＰａ程度に低いものであり得るし、膜が適用される使用によって、３００％と同じくらい高いか又はそれより大きいものであり得る。望ましくは、膜マトリックスの伸長のパーセンテージは、許容可能である、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０又は３００％又はこれらの数値の間の任意の値の伸長のパーセンテージである、５０から２５０パーセンテージの範囲である。

膜マトリックスが骨の修繕の足場として、又は傷修繕において使用される場合、膜の伸長のパーセンテージは、５から２００％の間であり得る。或いは、膜マトリックスが、鼓膜の修繕のためのデバイスとして使用される場合、材料の伸長のパーセンテージは、８０から１７０％の範囲であるだろう。

材料加工におけるシルクフィブロインと組み合わせたグリセロールの使用は、シルクフィブロインを用いて達成できる機能的特性、及びバイオ材料及びデバイス適用において可能性のある有用性を有する、より柔軟性のあるフィルムの形成を拡張する。

本発明のデバイスの膜は、１０から１０００ＭＰａほどのヤング係数を有する。例えば、ヤング係数は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ＭＰａ又は中間の任意の値であり得る。理想的には、ヤング係数は、膜が使用される用途とマッチするであろう。例えば、膜マトリックスが骨の修繕又は傷修繕において足場として使用される場合、ヤング係数は、４００ＭＰａから１０００ＭＰａの間であってよい。或いは、膜マトリックスが鼓膜の修繕のためのデバイスとして使用される場合、材料のヤング係数は、１００から５００ＭＰａの範囲であるだろう。例えば、かかる膜マトリックスは、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０若しくは５００ＭＰａ又はこれらの数値の間の任意の値のヤング係数を有し得る。

このヤング係数値は、穿孔のサイズ及び音響特性と、実質的にマッチするよう選択される。およそ２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０又は３００ＭＰａのヤング係数が好ましい。これに関して、中耳小骨への音伝送は、デバイスを含む移植片の「剛性」に依存し、聴力アウトカムの即時の改善のための大きな穿孔における重要な問題である。

本発明の第一の態様の第一の実施形態において、ギ酸の存在下で調製されたシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスであって、当該膜が、：
（ａ）膜の合計湿重量の約０．１％から約２０％（ｗｔ％）の範囲の量でシルクフィブロインを含み、
（ｂ）約５％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）グリセロールを含み、
（ｃ）１０ＭＰａから１０００ＭＰａの間の引張強度を有し、
（ｄ）５０から３００％の間の伸長を有し、
（ｅ）１０ＭＰａから１０００ＭＰａの間のヤング係数を有する、膜であり、
乾燥させて膜マトリックスを調製する前に、グリセロール及びシルクタンパク質複合体溶液を、ギ酸の存在下で溶解する、
シルクフィブロイングリセロール膜マトリックスが提供される。

本発明の膜が、バイオ足場などの生物学的セッティングにおいて、又は、傷修繕品において、骨の代用物として、若しくは鼓膜の修繕においてを含むがこれらに限定されない、損傷した組織の修繕において使用される場合、膜は、効率的な増殖及び膜にわたる細胞の増殖のために細胞接着を促進するよう適合される。本発明のシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスは、従って、組織エンジニアリングのための構築物を提供する。それらは、その上で、ケラチノサイト、線維芽細胞、グリア細胞、骨芽細胞、破骨細胞、上皮細胞、内皮細胞、軟骨細胞等が増殖し得るマトリックスを提供する。膜マトリックスは、また、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞及び胚性幹細胞並びにそれらの組み合わせを用いる細胞療法においても使用され、患者においてこれらの上を細胞が増殖することができる足場を提供することができる。

好ましくは、ドナーから得られるか、確立した細胞培養株から得られるか、又は分子又は遺伝学的手段による細胞変更の前若しくは後の、ケラチノサイト、軟骨細胞、線維芽細胞、筋肉細胞及び骨細胞などの筋肉及び骨格系の細胞、及び幹細胞（例えば、胚性幹細胞、成体幹細胞、及び誘導多能性幹細胞を含む）、並びにそれらの組み合わせを含む、任意の細胞タイプが、培養及び可能性のあるインプランテーションのために膜に添加され得る。組織片は、異なる細胞タイプと構築物を移植するために使用され得る。

本発明の第一の態様の第二の実施形態において、シルクを含む、ギ酸の存在下で調製されたシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスが提供され、膜は、：
（ａ）膜の合計湿重量の約０．１％から約２０％（ｗｔ％）の範囲の量でシルクフィブロインを含み、
（ｂ）約５％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）グリセロールを含み、
（ｃ）１０ＭＰａから５００ＭＰａの間の引張強度を有し、
（ｄ）５０から３００％の間の伸長を有し、
（ｅ）１０ＭＰａから１０００ＭＰａの間のヤング係数を有する、膜であり、
膜は、：（ｉ）乾燥させて膜マトリックスを調製する前に、ギ酸の存在下で、グリセロール及びシルクタンパク質複合体溶液を溶解することにより作製され、（ｉｉ）軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、骨芽細胞及びケラチノサイト、及び幹細胞の少なくともいずれか一以上を含む群から選択される細胞の増殖、移動及び／又は接着を支持する。

本発明の膜は、滑らかである必要はなく、それらは、それらの表面上に、およそ０．００１ミクロンからおよそ２００ミクロンの間の範囲のサイズである孔又は表面変形を有し得る。膜が孔を含む場合、孔は、膜を横切ってもよく、又はそれらは、一端で閉じられていてもよい。孔が膜を横切る場合、それらは、膜を通る細胞の増殖を支持してもよく又は支持しなくてもよい。膜が鼓膜としての使用を見出す場合、それらは、膜を通る細胞の横方向の増殖を支持しない。しかしながら、これらの膜がバイオ足場として使用される場合、それらは、膜を通る細胞の横方向の増殖を支持し得る。

一実施形態において、膜は、それらの表面上に、およそ０．００１ミクロンからおよそ２００ミクロンの間の直径を有する一以上の孔又は表面変形を含み、それは細胞の浸入及び組織形成を促進する。好ましい形態において、孔又は表面変形は、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００ミクロン又はこれらの数値の間の任意の値の直径を有する。

孔が膜に存在する場合、それらは、かかる治療を必要とする対象へのインプランテーションの際に、新しい組織形成及びホスト組織統合を促進するリモデリングのための、空隙容量を提供するであろう。これに関して、デバイスは、機械的安定性を維持するが効率的な栄養物及び代謝産物輸送を可能にする構造を提供する。

膜マトリックスの厚さは、およそ１ミクロンからおよそ２ｍｍの間で変わるであろう。例えば、膜は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、２０００ミクロンの厚さを有し得る。

膜が、鼓膜代替品として使用される場合、それらは、およそ１０からおよそ６００ミクロンの間の厚さを有するであろう。最も好ましくは、膜は、およそ８０からおよそ１００ミクロンの間の厚さを有する。

膜が足場として使用されている場合、膜は、最大２ｍｍなどはるかに厚くてもよい。これに関して、かかる使用における膜の相対的な厚さは、生分解能力の速度並びに膜が意図された使用のために供給しなければならない引張強度、強靱性、及び弾性の程度に基づいて、決定されるであろう。

好ましい形態において、膜マトリックスは、生分解性である。膜の生分解能力は、膜におけるシルクフィブロイン及びグリセロールの量により決定されるであろう。これに関して、膜は、完全な分解に最大２年以上かかる生分解能力を有し得る。好ましくは、膜は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４カ月にわたり生分解性である。対象において使用される際に分解されるべきであるバイオ足場として使用される場合、膜は、理想的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１カ月といった、１から１２カ月の間の生物学的寿命を有してもよい。

本発明のシルクフィブロイン及びグリセロール膜マトリックスは、グリセロールを欠くシルクフィブロインフィルムと比較して、明白な特性を有する。例えば、グリセロールの使用又は含有及び可塑剤としてのグリセロールの使用に伴い、柔軟性及び生体適合性が強化される。

本発明の膜マトリックスは、かかる治療を必要とする対象に対して非自己性である、一以上の追加の材料を含み得る。例えば、シルク膜は、追加の可塑剤、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルロニック１２７、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、及び１，２，６−ヘキサントリオール（ｈｅｘａｎｅｔｒｉｏｌａｎｄ）及び１，３−プロパンジオールから選択される少なくとも一の添加剤を含み得る。添加剤のさらなる例は、Ｊｏｓｅ， Ｒ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ２０１５． Ｐｏｌｙｏｌ−Ｓｉｌｋ Ｂｉｏｉｎｋ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ａｓ Ｔｗｏ−Ｐａｒｔ Ｒｏｏｍ−Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｕｒａｂｌｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ３Ｄ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ． ＡＣＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １， ｐｐ．７８０−７８８に説明され、それは相互参照により本明細書中に組み込まれる。

膜において使用され得る材料は、ヒアルロン酸ベースのヒドロゲル（Ｃａｒｂｙｌａｎ）及びフィルム（Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ）；アルギン酸カルシウム；ポリ（グリセロールセバケート）；水溶解性の及び不溶性のキトサン；及びコラーゲンを含む群から選択される材料のいずれかを含む。

コラーゲンは、主要な細胞外マトリックス構成要素であり、高い引張強度、柔軟性、非反応性、非毒性及び非発癌性を含む物理的な特徴を有する。鼓膜の固有層の主成分として、コラーゲンは、鼓膜の弾性及び完全性を維持することを補助し、これ故に聴覚において鍵となる役割を果たす。

膜マトリックスは、追加の可塑剤を含み得る。例えば、膜マトリックスは、デバイスが使用より前の乾燥状態において操作可能であるように、とりわけ、ゼラチン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、プルロニック１２７、脂肪族ポリエステル、ポリ（アルキレン）オキシド、ポリ（Ｌ−乳酸）、７０／３０Ｌ−ラクチド／ｅ−カプロラクトン コポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコール酸）、ポリ（ビニルピロリジン）、ポリ（ジメチルポリシロキサン）、ポリ（リシン）、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチン、プロテオグリカン、ポリペプチド、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニル）アルコール、１，２，６−ヘキサンジオール、１，３−プロパンジオール、ポリ（ビニル）アルコール、ポリ（エチレン）グリコール、ポリ（プロピレン）グリコール、ポリーＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド−ｃｏ−ε−カプロラクトン、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリグラクチン９１０、又は脂肪族ポリエステル、及びそれらの組み合わせを含む群から選択される一以上の添加剤をさらに含み得る。

脂肪族ポリエステルは、Ｄ−ラクチド、Ｌ−ラクチド、ポリ（乳酸）、ポリ（ラクチド）グリコール酸、ポリ（グリコール酸）、ポリ（グリコリド）、グリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、イプシロン−カプロラクトン、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）及びそれらの組み合わせから選択され得る。ポリ（アルキレン）オキシドは、ポリ（エチレン）オキシド及びポリ（プロピレン）オキシドから選択され得る。

本発明により製造されるシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスは、膜又はそれらの上の孔（存在する場合）に浸透する、細胞の増殖を支援する又は促進する少なくとも一の活性剤を含み得る。活性剤は、好ましくはビタミン、ミネラル、タンパク質（かかるサイトカイン、酵素並びに成長因子又は組換え成長因子及びそれらの断片及びバリアントを含む細胞増殖調節剤）、タンパク質阻害剤、ペプチド、核酸アナログ、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、アプタマー、抗体又はそれらの断片又は部分、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、炭水化物、補因子、抗生物質又は抗菌性化合物、抗炎症剤、抗増殖剤、抗ヒスタミン、ウイルス、抗ウイルス剤、毒素、プロドラッグ、化学療法剤、薬剤、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。

好ましくは、生物学的活性分子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン、エピジェン、エピレグリン、ベータセルリンを含む上皮成長因子；酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１／ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２／ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子；ケラチノサイト成長因子１（ＫＧＦ−１／ＦＧＦ−７）、ケラチノサイト成長因子２（ＫＧＦ−２／ＦＧＦ−１０）を含むケラチノサイト成長因子；インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）を含むインスリン様成長因子；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１９、ＩＬ−２４を含むサイトカインを含む血小板由来成長因子；ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンを含む細胞外マトリックスタンパク質；及びｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ビタミンＡ）、Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）、（＋）−α−トコフェロール（ビタミンＥ）を含むビタミンを含む群から選択されるいずれか一以上の生物学的活性分子を含む。より好ましくは、生物学的活性分子は、ヒアルロン酸；ビトロネクチン；アンフィレグリン；インターロイキン１９（ＩＬ−１９）；インターロイキン２４（ＩＬ−２４）；トランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−α）；ＶＥＧＦ；及びフィブロネクチンを含む群から選択されるいずれか一以上の生物学的活性分子を含む。

本発明の膜マトリックスは、デバイスの形態で、複数の膜の複合物として調製することができる。かかる環境において、デバイスは、２以上の膜層を有することができる。各層は、同じ又は異なる特徴を伴って調製してもよい。代替する本発明の形態において、一以上の膜が別の表面に積層される複合デバイスが調製され得る。その表面は、デバイスが利用される方法における使用に適した任意の材料で調製され得る。膜が組織エンジニアリングのために使用される場合、膜がその上に積層される表面は、好ましくは生体適合性であるタイプのものである。表面は、膜より固い又はより大きい引張強度を有する別の材料から調製してもよい。

本発明の第一の態様の第三の実施形態において、一以上のシルクフィブロイングリセロール膜から調製されるデバイスが提供され、膜の少なくとも一は、：
（ａ）膜の合計湿重量の約０．１％から約２０％（ｗｔ％）の範囲の量でのシルクフィブロイン、
（ｂ）約５％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）グリセロール、及び
（ｃ）５ＭＰａから５００ＭＰａの間の引張強度を有し、
（ｄ）５から３００％の間の伸長を有し、
（ｅ）１０ＭＰａから１０００ＭＰａの間のヤング係数を有する
を含み、
ここで、膜は：（ｉ）乾燥させて、膜マトリックスを調製する前に、グリセロール及びシルクタンパク質複合体溶液をギ酸の存在下で溶解することにより作製され、（ｉｉ）：軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、骨芽細胞及びケラチノサイト、及び幹細胞の少なくともいずれか一以上を含む群から選択される細胞の増殖、移動及び／又は接着を支持する、デバイスである。

膜がデバイスとして調製される場合、デバイスにおいて、一以上の膜層があってもよい。デバイスにおける各層の厚さは、およそ１０ミクロンからおよそ２ｍｍの間で変わるであろう。好ましくは、膜が鼓膜代替品として使用される場合、膜は、およそ１０からおよそ１００μＭの間の厚さを有するであろう。最も好ましくは、一以上の膜層は、およそ８０からおよそ１００μＭの間の組み合わせられた厚さを有する。

本発明のデバイスが本発明の方法により製造されるものとは異なる材料から調製される層を含む場合、それらの材料は、治療される対象に対し非自己性であるソースなどの任意のソースであり得る。かかる材料は、非哺乳動物ソースのものであり得る。或いは、それらは、とりわけ、鼓膜、心膜、骨膜、真皮、筋膜を含む、非自己性哺乳動物膜からの脱細胞化した組織を含む群から選択され得る。かかる追加の材料は、特に、デバイスが再構築手術において配置される場合に、適切かもしれない。

シルクフィブロイングリセロール膜マトリックスの作製
第二の態様において、本発明は、シルクフィブロイングリセロール膜マトリックスを作製する方法を提供する。

本発明の方法において、ギ酸は、グリセロール及びシルクフィブロインの組成物を溶解するために使用される。結果として生じる生成物は、その後、フィルムにキャストされる。これらのフィルムは、他の自然の及びシルクフィブロイン合成のバイオ材料と比較して、強化された機械的特性及び構造的特性を示し、それは、おそらくフィルムにおける、安定化水素結合架橋としてのβシートの形成において、シルクフィブロイン結晶化挙動に影響を与えることにより成立した。

本発明の方法は、：
ｄ．繭又は繊維からのセリシンの除去後、シルクタンパク質又はシルクタンパク質複合体溶液を調製する工程；
ｅ．ギ酸を用いてグリセロール及びシルク泡状物質を溶解する工程；及び
ｆ．調製されたシルクタンパク質又はシルクタンパク質複合体溶液を乾燥させて、調製されたシルクタンパク質又はシルクタンパク質複合体を作製する工程
を含む。

繭又は生のシルクからセリシンを除去する過程は、デガミングと呼ばれる。かかるデガミング過程は、当業者によく知られている。デガミング方法の例としては、（１）せっけん、炭酸ナトリウム又は他の類似の塩基等の中の繭又は生のシルクをアルカリ水性溶液中で煮沸すること、（２）繭又は生のシルクをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ等から抽出したプロテアーゼに暴露すること、及び（３）繭又は生のシルクを液体（例、水）環境中で高い温度及び高い圧力に暴露すること、が挙げられる。

方法によれば、グリセロール及びシルクフィブロインをギ酸を用いて溶解する。好ましくは、グリセロール及びシルクフィブロインを９８％ギ酸中で、サーモミキサーを用いるなどして混合しながら、１時間、３０℃で、溶解する。

９８％ギ酸溶液は、本発明の方法における使用のために理想的であるが、他の濃度のギ酸を使用してもよい。例えば、およそ７５から９９％の間の濃度のギ酸が、当該方法において使用され得る。９９％より低いギ酸の濃度が、グリセロール及びシルクフィブロインを溶解するために使用される場合、反応のための時間は、変えるべきである。かかる環境において、ギ酸濃度は、７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９９％ギ酸であり得る。

当該方法においてグリセロール及びシルクフィブロイン混合物を１時間溶解するために、理想的には９８％ギ酸溶液が使用されるが、当該方法において、他の反応時間を設定することもできる。ギ酸の濃度を減少させる場合、その後、より長い反応が用いられ得る。例えば、反応時間は、４５分から２時間であり得、及びギ酸の濃度に応じ、場合によっては、より長くできる。ギ酸濃度に応じ、反応時間は、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１００、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９及び１２０分であり得、ギ酸濃度に応じ、場合によってはより長くできる。

反応温度は、好ましくはセ氏３０度で設定されるが、９８％ギ酸溶液が使用され、グリセロール及びシルクフィブロイン混合物を溶解するための反応時間が１時間である場合、当該方法において、他の反応温度を設定することができる。ギ酸の濃度又は反応時間を減少させる又は増加させる場合、その後、反応温度を変えることができる。例えば、反応温度は、セ氏２０度からセ氏４０度であり得、場合によっては、ギ酸の濃度及び反応時間に応じてより高くできる。その結果、反応温度は、セ氏２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９度であり得る。

当該方法の好ましい形態において、工程（ｃ）の後に、水に対する溶解性を減少させる、熱又は溶媒、溶媒／グリセロール又は溶媒蒸気処理によりシルク膜を再結晶化させる。例えば、調製される膜は、エタノール又はメタノール若しくはプロパノールなどの別のＣ_１〜Ｃ_３アルコール、又はそれらの組み合わせ、又はそれらの蒸気に暴露して、タンパク質立体配座転移をβシート構造に誘導し、ＰＢＳ又は水中の不溶性を確保してもよい。

グリセロールフィルムをエタノールのような溶媒で処理することは、グリセロールを浸出させる効果を有し得る。好ましくは、膜を再結晶化させるために選択される方法は、グリセロールの再導入を可能にするか又は膜の外にグリセロールが浸出しない。これは、水などの蒸気の溶媒グリセロール組み合わせを用いてベータシートを作ることにより達成され得る。例えば、膜は、エタノール又はメタノール蒸気アニールされ、グリセロールの浸出を最小限にするため、溶解性を減少され得る。

本発明の第二の態様の例示的な一形態において、作製方法は、：
ａ）シルク繊維をデガミングする工程；
ｂ）工程（ａ）のデガミングされた繊維を乾燥させ、生成物をカオトロピック塩に溶解する工程。
ｃ）工程（ｂ）のシルク溶液を、ｄＨ_２Ｏに対して透析し、シルク溶液を得る工程；
ｄ）工程（ｃ）のシルク溶液を乾燥させ、乾燥生成物をグリセロールに添加する工程
ｅ）７５〜９９％ギ酸に４５分間から２時間、セ氏２０度からセ氏４０度で、組成物が均質になるまで、工程（ｄ）の組成物を溶解する工程；及び
ｆ）溶液を膜にする工程
を含む。

工程（ｂ）のシルクタンパク質又はシルクタンパク質溶液を、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ_２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ_２）及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、チオシアン酸リチウム（ＬｉＳＣＮ）から選択されるものを含む、少なくとも一の化合物又はエタノール水性溶液より構成されるカオトロピック塩を用いて溶解してもよい。好ましくは、臭化リチウムが使用される。

第三の態様において、本発明は、本発明の第二の態様の方法により製造されるシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスを提供する。

耳鼻科用修繕のためのデバイス
第四の態様において、本発明は、本明細書中に記載される膜マトリックスを含む、具体的には慢性穿孔といった穿孔などの耳鼻科用状態の修繕のためのデバイスを提供する。

好ましくは、本明細書中に記載されるシルクフィブロイングリセロール膜は鼓膜穿孔の修繕のために作製される。かかる修繕に適している膜マトリックスは、好ましくは、１０ＭＰａから１００ＭＰａの間の、より好ましくはおよそ１５ＭＰａから９５ＭＰａの間の引張強度、望ましくはおよそ２５からおよそ７５ＭＰの間の引張強度を有するであろう。

かかる膜が鼓膜の穿孔の修繕のために使用される場合、膜は、音波を伝導しなければならない。これに関して、本発明の膜は、鼓膜再構築に使用される天然の鼓膜又は軟骨と実質的に一致するか又はそれより大きい振動音響的特徴を有するべきである。振動音響的特徴は、上記に議論されるように、デバイスの引張強度、弾性及び厚さに関連する。さらに、中耳小骨への音伝送は、またデバイスの「剛性」に依存する。剛性は、聴力アウトカムの即時改善のために、大きな穿孔において重要な問題である。一以上の膜の特定の引張強度は、膜を用いて治療される対象において、設置のすぐ後に、改善された聴力アウトカムをもたらす最適な音響伝送を促進する。

好ましくは、本明細書中に記載される膜は、２０Ｈｚから２０ＫＨｚの間の音波をｉｎ ｖｉｖｏで中耳に伝導する強度、弾性、厚さ及び「剛性」を有するであろう。

本発明の第四の態様の実施形態において、鼓膜の穿孔の修繕の修繕に適しているシルクフィブロイングリセロール膜が提供され、当該膜は、：
（ａ）ギ酸の存在下で調製されたグリセロール及びシルクタンパク質複合体溶液から作製され；
（ｂ）膜の合計湿重量の約０．１％から約２０％（ｗｔ％）の範囲の量でシルクフィブロインを含み；
（ｃ）約５％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）グリセロールを含み、
（ｄ）１０ＭＰａから５００ＭＰａの間の引張強度を有し、
（ｅ）５０から３００％の間の伸長を有し、
（ｆ）１０ＭＰａから１０００ＭＰａの間のヤング係数を有し、
膜が：（ｉ）グリセロール及びシルクタンパク質複合体溶液を、乾燥させて膜マトリックスを調製する前に、ギ酸の存在下で溶解することにより作製され、（ｉｉ）軟骨細胞、内皮細胞、上皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、骨芽細胞及びケラチノサイト及び幹細胞の少なくともいずれか一以上を含む群から選択される細胞の増殖、移動及び／又は接着を支持し、及び特性（ｄ）から（ｆ）が、２０Ｈｚ及び２０ＫＨｚの間の音波の、ｉｎ ｖｉｖｏでの中耳への伝導を最適化するよう選択される。

第五の態様において、本発明は、本明細書中に記載される膜マトリックスを含む、外耳道、弛緩部及び／又は鼓室蓋骨の修繕における使用のためのデバイスを提供する。

第六の態様において、本発明は、対象の鼓膜、より好ましくは、対象の穿孔された鼓膜などの鼓膜、及び／又は弛緩部及び／又は対象の弛緩部の近位にある鼓室蓋骨に移植され又は適用される場合、少なくとも鼓膜の細胞の増殖、移動及び／又は接着を支持する、本明細書に記載される膜マトリックスの使用にある。本発明は、ヒドロキシアパタイト遊離移植片を覆うことを含む、乳様突起切除術の後の対象の外耳道の再構築のための乳様突起閉塞技術における、本明細書に記載される膜マトリックスの使用を提供する。

いかなる改変された本明細書中に記載される本発明の膜構築物も、再構築手術に適合される膜の周りに周縁スカートを有してもよい。これは、鼓室輪に加えて又は鼓室輪の一部であるかもしれない。これに関して、デバイスは、その周縁で実質的に厚くされ、乳様突起炎、慢性化膿性中耳炎又はコレステリン腫のための治療の一部として行われる乳様突起切除術手術（根治的乳様突起切除術、Ｃａｎａｌ Ｗａｌｌ Ｄｏｗｎ乳様突起切除術、Ｃａｎａｌ Ｗａｌｌ Ｕｐ乳様突起切除術、Ｃｏｒｔｉｃａｌ乳様突起切除術、改変根治的乳様突起切除術を含む）に膜が使用されるのを可能にし得る。

シルク膜の文脈において本明細書中に使用される用語「周縁」は、膜の平面を取り囲んでいる境界線を言う。膜の周縁は、必ずしも円形でなく、同じ膜の厚さである必要はない。例えば、膜の周縁は、最大で５ｍｍ厚、最小で１０ミクロンであるかもしれず、その間の厚さを含むであろう。

たとえ本明細書中に記載される膜が音を伝導するかもしれず或いは伝導しないかもしれない周縁スカートを組み込むことができても、膜の中央は、２０Ｈｚから２０ＫＨｚの間の音波をｉｎ ｖｉｖｏで中耳に伝導しなければならない。

好ましい実施形態において、膜は、１０ＭＰａから３７ＭＰａの引張強度を有する。より好ましくは、本発明の膜は、１２ＭＰａから２５ＭＰａの引張強度を有する。かかる引張強度は、特に、穿孔の最も一般的領域である、緊張部における穿孔を治療するのに有用である。

本発明が、特に慢性穿孔といった鼓膜穿孔の修繕のための膜を提供する場合、膜マトリック層は、膜の反対側に２つの卵形又は実質的に円形の面を有する、実質的に円盤形である。好ましくは、片方又は両方の面は、およそ３ｍｍからおよそ２５ｍｍの間の直径を有し、より好ましくはおよそ１０ｍｍからおよそ２０ｍｍの間の直径を有する。好ましくは、デバイスの片方又は両方の卵面は、およそ９ｍｍからおよそ８ｍｍの直径を有する。より好ましくは、デバイスの片方又は両方の卵面は、およそ６ｍｍからおよそ５ｍｍの直径を有する。最も好ましくはデバイスの片方又は両方の面は、実質的に円形であり、およそ９．５〜１０ｍｍの最適な直径及び５〜１５ｍｍの範囲を有する。

本発明の膜マトリックスは、修繕される領域のサイズ及び形にマッチさせるため、製造後にトリミングすることができる。このトリミングは、外科用ハサミなどの、適切な切断デバイスを用いて、実施することができる。デバイスはまた、デバイスの一以上の表面における溝を切り込んで又は切断して、デバイスの柔軟性又は屈曲性を改善すること又は折り畳むことを可能にし、その折りたたまれた構造を実質的に維持することにより、製造後にも操作され得る。

さらに、鼓膜の穿孔の修繕に適している、本明細書中に記載されるかかる膜は、以下の一つ以上の特性を￥示すであろう。

Ａ．透過性
本発明のデバイスは、少なくとも部分的に半透明である。好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９及び１００％透明であり、それはデバイスを用いて治療された対象の鼓膜及び中耳の、治療後検診を支援することができる。

本発明のデバイスは透明であってもよく又は半透明であってもよく、損傷していない鼓膜と同様であってもよい。これは、デバイスを用いた鼓膜の修繕後のファローアップの間の感染又は欠陥についての、対象の中耳の検診を可能とする。

ギ酸を用いてキャストされたシルク膜は、水性ベースのシルク／グリセロール膜と比較して、より低い光散乱に起因する、より高い透過性を有する。

水性シルク／グリセロール膜は、ギ酸シルク／グリセロールフィルムから明らかではない、わずかに不鮮明な外観を有する。水性膜の拡散透過率は、より短い波長でほぼ２０％に増加し、これは、光散乱又は陰影の増加を示した。その一方、ギ酸シルクからキャストされたグリセロール含有膜は、純粋（グリセロールのない）ギ酸シルクフィブロイン膜と比較して、より小さい合計透過率の減少を示す。それは、９２から９７％、から８８から９１％に減少する（図１ｄ）。グリセロールのギ酸シルクフィブロイン膜への添加は、拡散透過率の減少を導き、それは、非常に低い光散乱を示唆した。

Ｂ．生分解能力
好ましい形態において、デバイスは、少なくとも１月の生物学的寿命を有する生分解性である。好ましくは、デバイスは、１から１２カ月の間の寿命予測値を有するであろう。

デバイスは、完全な又は実質的に完全な傷閉合が起こる時まで、場所にとどまらなければならないため、１から１２カ月の間のｉｎ ｖｉｖｏ生物学的寿命が好ましい。典型的には、嚢胞形成などの起こり得る長期間合併症を避けるため、最小限の時間の間、ｉｎ ｖｉｖｏにデバイスを有することが、組織エンジニアリングにおいて、有益である。例えば、小さな穿孔は、相対的に短い時間の期間で（閉合のためおよそ２週、加えて、完全なリモデリングのために４〜６週）治癒し得るが、より大きな穿孔は、有意により長くかかり、新生鼓膜の完全な細胞リモデリングのために１２カ月までを必要とする。デバイスのバイオ機械的特性は、デバイスを用いて治療される対象における萎縮及び退縮及び／又はコレステリン腫などの後期の合併症を実質的に避けるように選択されてきた。

Ｃ．細胞接着
表面孔又は変形が存在する場合、表面孔又は変形は、かかる治療を必要とする対象の穿孔された鼓膜又は外耳道に移植される場合、少なくともケラチノサイトの増殖、移動及び／又は接着を支持するであろう。これは、慢性穿孔などの損傷からの、鼓膜の修繕及び再生を促進する。従って、本発明のデバイスは、自然の創傷治癒過程を介した、慢性鼓膜穿孔又は外耳道軟組織及び骨の欠陥のある部分の閉合を加速することを可能とする足場を提供する。

好ましくは、膜構造は、コレステリン腫において、ケラチノサイトの中耳への移動を避けるなどといった、使用においてそれを介した中耳への細胞の浸入を制御する又は避ける。

Ｄ．厚さ
本発明のデバイスの厚さは、膜から必要とされる振動音響的特性及び機械的特性、膜層の数、又はデバイスを用いて治療される対象における鼓膜穿孔又は外耳道の欠陥のある部分のサイズなどの因子に依存して変わるであろう。本発明によれば、膜は、２０Ｈｚから２０ＫＨｚの間の音波を中耳小骨に伝達しなければならない。このパラメーターの限定の範囲内で、膜は、本発明の方法により調製される単層として調製することができる。或いは、デバイスは、本発明の方法の生成物と様々な材料範囲から製造される他の層とにより形成される複数の層を有し得る。複数の層がある場合、デバイスの膜部分は、２０Ｈｚから２０ＫＨｚの間の音波を中耳小骨に伝達しなければならない。

デバイスの膜部分が２０Ｈｚから２０ｋＨｚの間の音波を中耳小骨に伝達するならば、膜のスカートは、より厚くてもよい。これは、再構築手術が適切である場合、望ましい。これに関して、デバイスは、乳様突起炎、慢性化膿性中耳炎又はコレステリン腫のための治療の一部として行われる乳様突起切除術（根治的乳様突起切除術、Ｃａｎａｌ Ｗａｌｌ Ｄｏｗｎ乳様突起切除術、Ｃａｎａｌ Ｗａｌｌ Ｕｐ乳様突起切除術、Ｃｏｒｔｉｃａｌ乳様突起切除術、改変根治的乳様突起切除術を含む）の間の外科的要求に応じるために、その周縁で実質的に厚くなっていてもよい。

シルク膜の文脈において本明細書中に使用される用語「周縁」は、膜の平面を取り囲んでいる境界線を言う。膜の周縁は、必ずしも円形でなく、同じ膜の厚さである必要はない。例えば、膜の周縁は、最大で５ｍｍ厚、最小で１０ミクロンであるかもしれず、その間の厚さを含むであろう。

本発明を記載する目的のために、用語「膜層」及び「層」は、互いに交換可能に使用され得る。

好ましい形態において、デバイスは、互いに近傍に積層された１から３の間の膜を有する。従って、デバイスは、単一の膜、２つの膜又は３つの膜からなり得る。

デバイスの膜層は、デバイスの外面の一以上の膜の露出面の間の距離として測定される厚さを有する。本発明が鼓膜穿孔、特に慢性穿孔の修繕のためのデバイスを提供する場合、膜は、およそ１からおよそ６００μＭの間の、デバイスの外面の膜の露出面の間の距離として測定される厚さを有するであろう。より好ましくは、膜マトリックスは、およそ１０からおよそ１００μＭの間の厚さを有する。最も好ましくは、膜マトリックスは、およそ８０及びおよそ１００μＭの厚さを有する。

膜層は、およそ１からおよそ６００ミクロンの間の組み合わせられた厚さを有するであろう。前記厚さは、しかし、２０Ｈｚから２０ＫＨｚの間の音波を中耳小骨に伝達するよう選択されなければならない。このパラメーターの範囲内の膜の構築物における変動性は、認識されるべきである。好ましくは、このパラメーターを満たす膜層は、およそ１０からおよそ３００ミクロンの組み合わせられた厚さを有する。最も好ましくは、膜層は、およそ３０からおよそ１５０ミクロンの間の組み合わせられた厚さを有する。説明のために、膜層は、およそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０及びおよそ６００ミクロンの組み合わせられた厚さを有する。

膜が１より多い層を含む場合、層の少なくとも１つは、線維性材料を含む。

さまざまな態様において、少なくとも本発明の方法により調製されたシルクフィブロインを含む第一の層、及び第一の層と同じであってもよく又は異なっていてもよい材料の組成物を有する第二の層を含む、線維性膜が開示される。膜を形成する複数の層がある場合、各層の任意の繊維が一軸又は直径方向に整列するように層を配置することが好ましい。

Ｅ．シルクフィルムにおける活性剤
一実施形態において、シルク膜は、少なくとも一の活性剤を含む。活性剤は、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸アナログ、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、アプタマー、抗体又はそれらの断片若しくは部分、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、成長因子又は組換え成長因子及びそれらの断片及びバリアント、サイトカイン、酵素、抗生物質又は抗菌剤／抗菌性化合物、ウイルス、抗ウイルス剤、毒素、プロドラッグ、化学療法剤、低分子、薬剤、又はそれらの組み合わせであり得る。

例えば、本発明の膜は、ｉｎ ｖｉｖｏインプランテーション後及びｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後の、鼓膜ケラチノサイトの増殖、移動及び／又は接着を支持する様々な生体適合性の活性剤を含み得る。好ましくは、バイオ材料は、デバイスが相対的にやわらかいことを提供するよう選択される。

この実施形態によれば、シルクフィブロイン溶液を、ギ酸処理により不活性化されない少なくとも一の活性剤、及びグリセロールとブレンドすること；シルクブレンド溶液をフィルム支持表面にキャストすること；及びフィルムを乾燥させることを含む、少なくとも一の活性剤をシルクフィルムに埋め込む方法が提供される。

代替の実施形態において、本発明により製造されるシルクブレンド溶液を、フィルム支持表面にキャストすること；及び活性剤の存在下でフィルムを乾燥させることを含む、少なくとも一の活性剤をシルクフィルムに浸透させる方法が提供される。

本発明の膜に組込まれる又は浸される生物学的活性分子は、鼓膜の細胞の増殖を支援する又は促進する剤を含む。生物学的活性分子は、デバイスの表面に結合され得る、又はデバイスの孔中に位置し得る。

生物学的活性分子は、ビタミン、タンパク質、ペプチド、酵素、炭水化物、補因子、ヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ又はそれらの由来物）、有機低分子（例えば、薬剤）、抗生物質、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗増殖剤、サイトカイン、タンパク質阻害剤、抗ヒスタミン群から選択される分子を含む。好ましくは、生物学的活性分子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）ヘパリン結合性上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン、エピジェン、エピレグリン、ベータセルリンを含む上皮成長因子；酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１／ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２／ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子；ケラチノサイト成長因子１（ＫＧＦ−１／ＦＧＦ−７）、ケラチノサイト成長因子２（ＫＧＦ−２／ＦＧＦ−１０）を含むケラチノサイト成長因子；インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）を含むインスリン様成長因子；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１９、ＩＬ−２４を含むサイトカインを含む血小板由来成長因子；ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンを含む細胞外マトリックスタンパク質；及びｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ビタミンＡ）、Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）、（＋）−α−トコフェロール（ビタミンＥ）を含むビタミンを含む群から選択されるいずれか一以上の生物学的活性分子を含む。より好ましくは、生物学的活性分子は、ヒアルロン酸；ビトロネクチン；アンフィレグリン；インターロイキン１９（ＩＬ−１９）；インターロイキン２４（ＩＬ−２４）；トランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−α）；ＶＥＧＦ；及びフィブロネクチンを含む群から選択されるいずれか一以上の生物学的活性分子を含む。

生物学的活性分子の濃度は、好ましくは５ｎｇ／ｍｌから１５０μｇ／ｍｌの間である。

ヒアルロン酸がシルク膜中に存在する場合、それは、好ましくはおよそ１μｇ／ｍｌからおよそ１０μｇ／ｍｌの間、より好ましくはおよそ５μｇ／ｍｌの濃度であるだろう。

ビトロネクチンがシルク膜中に存在する場合、それは、好ましくはおよそ０．１μｇ／ｍｌからおよそ１．０μｇ／ｍｌの間、より好ましくはおよそ０．５μｇ／ｍｌの濃度であるだろう。

アンフィレグリンがシルク膜中に存在する場合、それは、好ましくはおよそ２０ｎｇ／ｍｌからおよそ１００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくはおよそ６０ｎｇ／ｍｌの濃度であるだろう。

ＩＬ−１９又はＩＬ−２４がシルク膜中に存在する場合、それは、好ましくはおよそ２０ｎｇ／ｍｌからおよそ１００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくはおよそ６０ｎｇ／ｍｌの濃度であるだろう。

ＴＧＦ−αがシルク膜中に存在する場合、それは、好ましくはおよそ２０ｎｇ／ｍｌからおよそ１４０ｎｇ／ｍｌの間、及びより好ましくはおよそ８０ｎｇ／ｍｌの濃度であるだろう。

ＶＥＧＦがシルク膜中に存在する場合、それは、好ましくはおよそ６０ｎｇ／ｍｌ及びおよそ２００ｎｇ／ｍｌの間、より好ましくはおよそ１００ｎｇ／ｍｌの濃度であるだろう。

生物学的活性分子は、デバイス形成の間に添加され得る、及び／又はデバイスが形成された後に及び／又はデバイスのインプランテーション又は移植の間に、別にデバイスに添加され得る。

デバイスは、本明細書中にリストされた化合物のいずれかを個別に又は任意の組み合わせで含み得るが、これらに限定されない。本明細書中にリストされた生物学的活性分子のいずれかを既知の方法により、即時放出又は長期放出用に製剤化してもよい。さらに、デバイスは、２以上の生物学的活性分子を異なる方法で含み得る。例えば、とりわけ、デバイスは、１の生物学的に活性な化合物が浸透しかつ別のものに覆われていてもよい。別の実施形態において、デバイスは、長期放出のために製剤化される一の生物学的活性分子及び即時放出のために製剤化される第二の生物学的に活性な化合物を含む。

鼓膜修繕を含む創傷治癒は、十分な栄養を必要とする。創傷治癒栄養物は、亜鉛、鉄、ビタミンＣ、アルギニン、及び他の生物学的活性分子のソースを含む。従って、デバイスは、創傷治癒に必要とされるこれらの栄養物の一以上の生理学的に利用可能な形態に浸透され得るか又はそれに覆われ得る。これらの栄養物は長期放出用に製剤化されることが好ましい。

好ましい実施形態において、免疫調節剤として利用されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチド（抗生物質を含む）は、好ましくは、鼓膜又は外耳道の欠陥のある部分への修繕を必要とする対象と同種に由来する。例えば、対象がヒトである場合、免疫調節剤として使用されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、好ましくはヒトであるか、又は当該タンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対する免疫応答の可能性を減少させるようヒト化される。

生物学的活性分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで、鼓膜ケラチノサイト及び粘膜細胞を含む細胞の、デバイス上又はデバイス内の増殖、移動及び／又は増殖を強化し、それは、かかる療法を必要とする対象のため、移植片として使用され、鼓膜における穿孔又は外耳道の欠陥のある部分の、閉合を促進すると考えられる。また、これらの生物学的活性分子は、実質的に発病前の状態のものに機能性を回復させるために治癒後の傷部位をリモデリングさせ、それによって長期間における前記対象についての治癒及び聴力アウトカムを強化することを可能とする、生物学的信号を提供するであろうことが予期される。本発明のデバイスは、生物学的活性分子を含まなくてもよい；しかしながら、かかる療法を必要とする対象における、鼓膜又は外耳道を修繕するための閉合時間は、生物学的活性分子を含むデバイスの使用と比較して、減じ得る。

本発明の別の実施形態において、本発明の方法により製造されるシルクフィブロイングリセロール膜は、頑丈な又は高強度の再構築適用に及ぶ、さまざまな適用に適合させることができる。例えば、膜の周縁スカートは、再構築材料又は組織エンジニアリング又は再構築足場を形成するよう適合され得る。いくつかの実施形態において、複合材料は、整形外科的適用のための手術道具を形成するよう適合される。いくつかの実施形態において、複合材料は、骨足場材料を形成するよう適合され得る。これらの実施形態において、骨足場材料は、骨伝導剤、骨誘導剤、骨形成剤、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

Ｆ．製造
本発明のシルクフィブロイングリセロール膜は、キャストされるが、本発明は、膜における複数の層の形成を予期する。この程度まで、本発明の方法により作られない層は、デバイスの製造の間、取り付けられる前に、別に作られてもよい。或いは、膜層は、デバイスを折りたたむことにより作られてもよい。

多層デバイスの開発における使用に適切な追加の層を調製する方法は、：エレクトロスピニングを含むスピニング；マイクロ製織を含む製織；又はキャスト又はディップコーティングの少なくともいずれか一以上を含む。

織物方法は、ミクロスケールではあるが標準的な繊維織機のような、マイクロ製織デバイスの使用を含んでもよい。結果物は、実質的に規則正しく織られた材料であり、非織物方法としては、とりわけ、キャスティングが挙げられる。キャスティングは、一定量の可溶化フィブロイン溶液をキャスティング容器に入れ、液体を蒸発させ、フィブロインタンパク質の固体キャストを残すことを含む。

エレクトロスピニングは、電荷を使用して、タンパク質の溶液から、非常に細かい（マイクロ又はナノスケールの）フィブロイン繊維を引く。それは、特に、大きく及び複雑な分子を用いた繊維の製造に適合する。

デバイスを調製するためのかかる方法は、デバイスの表面上又はデバイスの表面内に、孔を製造する。孔の形及びサイズは、使用される、デバイスを調製する方法によって変わるであろう。

Ｇ．サイズ及び形
鼓膜修繕においてデバイスが使用される場合、デバイスは、デバイスの反対側に２の卵形又は実質的に円形の面を有する、実質的に円盤状形として存在する。

かかるデバイスを、穿孔された鼓膜の修繕におけるその使用を促進するであろう、任意のサイズ、形又は構造で形成することができる。例えば、デバイスは、特に、タイプ１鼓室形成術又は鼓膜形成術の文脈において鼓膜穿孔の閉塞を促進するであろう、サイズ、形又は構造で形成され得る。

別の形態において、デバイスは、外耳道、弛緩部及び上鼓室領域の再構築を促進する、形又は構造で形成される。従って、デバイスは、外耳道軟組織及び骨の欠陥のある部分に合わせるよう適合される。これは、デバイスの調節された構造が維持されるようなデバイスの折り畳み又はデバイスの一以上の側部の切り込みを含むかもしれない。従って、デバイスのサイズ、形及び構造は、外耳道の欠陥のある部分を覆う又はそれに合うのに十分であるろう。

デバイスが、中耳の再構築手術に使用される場合、それは、膜の複数の層により形成されるスカートにより囲まれる、天然の鼓膜と類似する円盤状の形を含む。スカートは、手術の間に除去された組織の再構築形成のための基礎を提供する。

その結果、本明細書中で提供されるまた別の態様は、対象における罹患した又は損傷した骨組織を修繕する又は置換する方法に関し、それは、罹患した又は損傷した骨組織の標的部位に、シルクフィブロイングリセロール膜を含む少なくとも一の層を含む骨足場材料を置くことを含む。

いくつかの実施形態において、骨足場材料は、骨伝導剤、骨誘導剤、骨形成剤、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。

いくつかの実施形態において、骨足場材料は、さらに細胞（例、幹細胞）を含み得る。これらの実施形態において、本明細書中に記載される骨足場材料を、細胞（ｓ）を増殖させ（例、天然の細胞又は外から添加される細胞）及び細胞外マトリックスと置換するための、一時的な、生分解性の支持コンジットとして使用することができ、従って、さらに時間にわたりバイオ化学的特性が改善する。

本発明のデバイスの前面は、鼓膜穿孔又は外耳道の欠陥のある部分の寸法により選択され得る、卵又は円形以外の形であり得る。

本発明のデバイスの前面は、さまざまなサイズを含み得る。好ましい形態において、前面は、およそ１０ｍｍから２０ｍｍの直径、より好ましくはおよそ１５ｍｍの直径を有する、卵形又は実質的に円形の形である。第一の望ましい形態において、前面は、およそ９ｍｍ×およそ８ｍｍの直径を有する卵形である。第二の望ましい形態において、前面は、およそ６ｍｍ×およそ５ｍｍの卵形である。第三の望ましい形態において、前面は、およそ９．５〜１０ｍｍの最適な直径及び５〜１５ｍｍの範囲を有する実質的に円形の形である。

デバイスは、前面の外縁の周りからトリミングしてもよく、それによってデバイスを、利用可能なデバイスより小さい鼓膜穿孔又は外耳道の欠陥のある部分の修繕のためにカスタマイズすることができる。

本発明のデバイスは、製造後に修繕を必要とする鼓膜の領域のサイズ及び形にマッチするようトリミングすることができる。このトリミングは、レーザー切断などの適切な切断デバイス又は外科用ハサミを用いて実施され得る。デバイスは、製造後、デバイスの一以上の面において切り込む又は溝を切断して、デバイスの柔軟性又は屈曲性を改善することにより、或いは、折り畳みを可能にし、及び実質的にその折り畳まれた構造を維持することにより、操作され得る。

好ましくは、両面は、およそ３ｍｍからおよそ２５ｍｍ、より好ましくはおよそ１０ｍｍからおよそ２０ｍｍの間の直径を有する。好ましくは、デバイスのいずれの卵面も、およそ９ｍｍからおよそ８ｍｍの直径を有する。さらにより好ましくは、デバイスのいずれの卵面も、およそ６ｍｍからおよそ５ｍｍの直径を有する。最も好ましくは、デバイスの両面は、実質的に円形であり、およそ３ｍｍの直径を有する。

デバイスの面の片方又は両方は、さまざまなハサミ又はナイフ又は刃物などの切断道具を含む異なる道具を用いて、切れ込みを入れてもよく、又は溝切断してもよい。

Ｈ．キット
本発明はまた、対象の外耳道、鼓膜穿孔及び／又は弛緩部の修繕における使用のためのキットを提供し、前記キットは、本明細書に記載されるデバイスを含む。キットはまた、一以上の、本明細書に記載される生物学的活性分子のいずれかの溶液を含んでもよい。生物学的活性分子の一以上の溶液は、デバイスの対象へのインプランテーションより前のデバイスへの適用のためであってもよく、一度起こるかもしれず又はその後に複数回の機会に起こるかもしれない、対象の鼓膜へのデバイスのインプランテーション又は移植の後のデバイスへの適用のためであってもよい。

本発明のデバイスは、鼓膜の修繕又は外耳道の再構築の促進のためのキットの形態で提供され得る。これに関して、キットにおけるデバイスは、包装され又は容器中に、無菌形態で提供され得る。キットは、同じ又は異なるサイズの一以上のデバイス、及び鼓膜又は外耳道の修繕を促進するであろう、任意の他の医療デバイス、消耗品又は薬剤を含み得る。好ましくは、キット中のデバイスは、キット内容物の残りとは別に、無菌容器又は包装で提供されるであろう。キットはまた、例えば、とりわけプラスティックフィルム又はシートといった、自然の又は合成材料のデバイスのための支持体を含み得る。前記消耗品は、包帯、鼓膜及び周囲の皮膚を滅菌するための滅菌手段、手袋、滅菌シート、綿棒、抗生物質クリーム又は軟膏の一以上を含み得る。一実施形態において、前記キットは、少なくとも一のデバイス及び一以上の生物学的活性分子を含む。キットは、対象へのインプランテーション又は移植より前にデバイスに適用するための生物学的活性分子を含み得る。生物学的活性分子は、一以上の溶液の形態であり得る。加えて又は或いは、デバイスをインプランテーションした後又は移植した後に、デバイスを用いて治療される対象の鼓膜に、生物学的活性分子を適用してもよい。これは、すぐであってもよく及び／又はインプランテーションの数時間又は数日後の期間にわたる一連の治療であってもよい。

Ｉ．使用の方法
さらなる態様において、本発明は、鼓膜、より好ましくはかかる治療を必要とする対象における、慢性鼓膜穿孔などの鼓膜穿孔、及び／又は欠陥のある弛緩部及び／又は鼓室蓋骨を修繕するための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載されるデバイスを用いることを含む。

本発明は、さらにかかる治療を必要とする対象において、鼓膜穿孔を修繕するための方法を提供する。前記方法は、本明細書中に記載される本発明のデバイスを用いることを含む。

本発明は、鼓膜穿孔を修繕するためのデバイスの使用が、唯一の鼓膜の治療であってもよく、又は鼓膜を治療する又は修繕する間に同時に又は併用して使用される他の療法又は治療を加えたものであってもよいことを提供する。例えば、本発明は、鼓膜をデバイスと接触させること、及び鼓膜をデバイスと接触させることを含まない追加の療法を用いて鼓膜を治療することを含む鼓膜の修繕を提供し、接触させること及び追加の療法は、個別に又は一緒に、鼓膜損傷の少なくとも一の態様の維持又は悪化の軽減において、測定可能な改善を引き起こす。

別の態様において、本発明は、対象の鼓膜、好ましくは対象の鼓膜の穿孔された緊張部及び／又は対象の弛緩部及び／又は鼓室蓋骨などの鼓膜に移植され又は適用される際の、少なくとも鼓膜の細胞の増殖、移動及び／又は接着を支持するための、本明細書に記載されるデバイスの使用を提供する。本発明はまた、ヒドロキシアパタイト遊離移植片を覆うことを含む、乳様突起切除術後の対象の外耳道の再構築のための乳様突起閉塞技術における、本明細書に記載されるデバイスの使用を提供する。

本発明のデバイスは、鼓膜の全ての部分と関連する鼓膜又は鼓膜穿孔において使用してもよく、対象からの自家移植片を用いる既存の技術を用いて、当技術分野で知られているアンレー、アンダーレイ又はインレイ技術として使用してもよい。

従って、本発明のデバイスは、かかる治療を必要とする対象において、穿孔された鼓膜の修繕及び再生における使用のための、及び／又は弛緩部及び鼓室蓋骨を含む外耳道の再構築及び再生のための、カスタマイズされた移植片インプラントを提供する。デバイスをカスタマイズすることは、鼓膜及び／又は外耳道を天然の形態に実質的に似せ、それによって対象についての治癒及び聴力アウトカムの改善のためのより良い機会を可能にすることを含む、鼓膜の再生を促進することを支援し得る。デバイスにおける線維性中間層の含有は、鼓膜を音響により効率的に作るが、一方、対象において、萎縮、穿孔及びコレステリン腫形成の可能性を減じるという点で特に有益である。

本発明はまた、かかる治療を必要とする対象において、欠陥のある弛緩部を含む外耳道の再構築における使用のための方法を提供し、前記方法は、本明細書中に記載される本発明のデバイスを用いることを含む。弛緩部は、技術的には、鼓膜の一部であり、これは、典型的には、近傍にある鼓室蓋と呼ばれる外耳道の骨をもむしばむコレステリン腫に関与する領域であり、鼓室の上鼓室を含み得る。従って、本発明のデバイスを用いたコレステリン腫における鼓膜（ｅａｒｄｒｕｍ）の再構築は、しばしば、近接しかつ相互に接続した上鼓室及び鼓室蓋骨の再構築を必要とする。

従って、この治療は、鼓膜の穿孔の修繕と併せて行ってもよい。或いは、治療は、鼓膜の穿孔持たない又は鼓膜の穿孔の修繕を必要としない、対象の外耳道を再構築するためであってもよい。

本発明はまた、鼓膜に、特に対象の鼓膜、及び／又は弛緩部又は鼓室蓋骨に移植された又はインプランテーションされた際に、少なくとも鼓膜の細胞の増殖、移動及び／又は接着を支持するための、本明細書中に記載されるデバイスの使用を提供する。

耳手術において、乳様突起切除術後の骨外耳道の再構築は、一般的に、必要とされる。デバイスは、かかる治療を必要とする対象の鼓室蓋の再構築において使用してもよい。この再構築過程において、本発明のデバイスを用いることの利益は、それが統合でき、その多孔構造を介して、領域への血液供給を支援できることであり、デバイス中のバイオ分子は再構築された領域への対象自身の細胞及び組織の増殖を促進することができることである。

また、本発明のデバイスは、例えば、慢性中耳炎のための乳様突起切除術といった乳様突起切除術などの間に罹患又は損傷していてもよい外耳道底の修繕又は再生に使用してもよい。これに関して、乳様突起閉塞は、慢性中耳炎のためのｃａｎａｌ ｗａｌｌ−ｄｏｗｎ乳様突起切除術後に乳様突起腔のサイズを減少させることが示されている。鼓室乳突乳様突起又は乳様突起閉塞の他の兆候は、一時的な骨切除（外傷又は腫瘍に続発する）及び脳脊髄液漏れの再構築を含む。閉塞を伴わずに、ｃａｎａｌ ｗａｌｌ−ｄｏｗｎ乳様突起腔は、腔の頻繁な掃除を必要とする持続性の耳漏、補聴器の使用の困難、感染の影響を受けやすいことに起因する侵水不寛容、及びめまいへの傾向をもたらし得る。閉塞技術の大部分は、局所皮弁（例、筋肉、骨膜又は筋膜）又は遊離の移植片（例、骨片又は骨パテ、軟骨、脂肪又はヒドロキシアパタイトなどのセラミック材料）のいずれかからなる。ヒドロキシアパタイトは、主要な同種移植片材料であるが、これは、治癒フェイズにおいて、生存可能な組織により覆われることを必要とする。プラスティックメッシュ、プロプラスト及び多孔性ポリプロピレンなどの同種移植片は、感染のため、長期間では成功していなかった。プロプラストは、永続的な巨細胞反応と関係があることが見出された。瘻孔、持続性のドレナージ及び肉芽組織は、漸進的なプラスチックの不使用を引き起こす。最後に、アロプラストは、海綿骨及びその幹細胞を欠いており、辺縁血管分布を有する。

従って、本発明のデバイスは、鼓室乳様突起切除術の後の再構築のための乳様突起閉塞技術に、ヒドロキシアパタイト遊離移植片を覆うために使用され得る。

デバイスの別の利益は、それが、コレステリン腫、無気肺及び再発性穿孔の場合に、手術の後に見出される適さない中耳環境において、それを非常に有用にする固さ及び安定性を提供することができることである。

実施例
材料及び方法
シルク−グリセロール膜の調製
多化性のＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉカイコからの、巻き取られ、デガミングされていない繊維を、北東インドの製造センターから購入した。２ｇ／Ｌ炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、米国）及び１ｇ／Ｌ無香オリーブオイルせっけん（Ｖａｓｓｅ Ｖｉｒｇｉｎ、ウィルヤブラップ、西オーストラリア、オーストラリア）を用いて、９８℃で、３０分、繊維からデガミングした。デガミングは、ロータリー染色機（Ａｈｉｂａ ＩＲ Ｐｒｏ、Ｄａｔａｃｏｌｏｒ、ローレンスビル、米国）を用いて実施した。デガミングされた繊維を一晩、４０℃で乾燥させ、その後、９．３Ｍ臭化リチウムを用いて、５時間、６０℃で溶解した。溶解したシルク溶液を、４℃で３日間、ｄＨ_２Ｏに対して透析し、重量分析により計算される４から５％ｗ／ｖの濃度の水性シルク溶液を得た。各バッチからのシルク溶液を４％に希釈した。

水性フィルムを作るために、グリセロールの必要とされる量を、空のチューブに量り分けた。４％シルク溶液の必要とされる体積を、その後、チューブに添加し、ロータリーミキサーで１時間混合した。溶液を、その後、水平面上のペトリディッシュにキャストする前に静置し、２４時間、乾燥させた。

ギ酸ベースのフィルムを作るために、４％シルク溶液を、５０ｍＬチューブに（膨張を可能とするようチューブあたり溶液の２０ｍＬを用いて）分けて、−８０℃で２４時間、凍結した。凍結したシルクを、その後、予め冷却されたＦｒｅｅＺｏｎｅ凍結乾燥機（Ｌａｂｃｏｎｃｏ、カンザスシティ、ＭＯ、米国）に移し、３日間、乾燥させた。凍結乾燥させたシルク泡状物質を、メスを用いて小塊にスライスし、予め量り分けたグリセロールを含有するチューブに添加した。泡状物質を、その後、１時間、３０℃で、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルク ドイツ）を用いて、混合しながら９９％ギ酸に溶解した。溶解した試料を、７０００ｘｇで、２分間、遠心分離し、泡を除去し、その後、水平なプラットフォーム上のペトリディッシュにキャストした。ドラフトチャンバーで、２４時間、乾燥させた。

ＵＶ−可視分光測光法
可視波長にわたるフィルム透過性を、拡散反射率アクセサリーを有するＣａｒｙ５０００ＵＶ−可視分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、ＣＡ、米国）を用いて、測定した。７００から３８０ｎｍのスキャニングにより試料の％透過率を決定した。試料を、取り付けられた参照標準を用いてスキャンして合計透過率を決定し、再び、取り付けられた光トラップを用いて拡散透過率を決定した。結果としてもたらされる合計及び拡散透過率スキャンを各フィルムタイプについて、一緒にプロットした。各試料の陰影を、３８０、５５０及び７００ｎｍで、定量化した。

張力機械的特性
張力試験のためのフィルムを、５ｍｍ幅の細長い一片にスライスし、その後、張力試験より少なくとも４８時間前に、２０℃±２℃及び６５％±２％相対湿度で調節した。１００Ｎロードセルを有するモデル５９６７テスター（Ｉｎｓｔｒｏｎ、ノーウッド、ＭＡ、米国）を用いて張力試験を実施した。１５ｍｍのゲージ長を用いて、試料を破損まで試験した。１５ｍｍ／分の伸長率、及び０．１Ｎのプレロード。細長い一片に切断する前に各フィルムの厚さを測定した；小数点第３位デジタルマイクロメータ（Ｋｉｎｃｈｒｏｍｅ、メルボルン、オーストラリア）を用いて、６か所で、フィルムを測定した。これらの測定値の平均の厚さを使用して、断面積を計算し、続いて、各フィルムのひずみと応力を計算した。２０の細長い一片の最小値を少なくとも３のフィルムにわたり試験した；張力特性を、これらの測定値の平均±標準偏差として表現した。

フィルム音響特性
円形の試料は、７．５ｍｍの内径を有する、中が空洞のナイロンチューブからなる、特注のモデル外耳道の端に備え付けた。チューブの反対端に備え付けられたＥＲ−２聴覚イヤホン（Ｅｔｙｍｏｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、エルクグローブビレッジ、ＩＬ、米国）を使用し、ＰＣＩ信号発生器（ＰＣＩ−６７１１、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、オースティン、米国）により生じた周期的なチャープ信号を用いて、試料を刺激した。プローブマイクロホン（ＥＲ−７Ｃ；Ｅｔｙｍｏｔｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して外耳道内の動的圧力応答を測定した。すぐに外耳道内の試料の近傍に留まるように、外耳道壁における穴を介して、プローブを与えた。異なる材料の音響応答を、レーザードップラー振動記録計（ＣＬＶ−２５３４、Ｐｏｌｙｔｅｃ、ヴァルトブロン、ドイツ）を用いて決定し、それは、固定された試料の曝露された側に焦点を当てた。

専用ＰＣに接続されたデータ収集カード（ＰＣＩ−４４６２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、振動記録計及びプローブマイクロホンの両方からの信号を検出した。ソフトウェアパッケージＶｉｂｓｏｆｔ８４バージョン５．０（Ｐｏｌｙｔｅｃ、ヴァルトブロン、ドイツ）を用いて、１２．５Ｈｚから２０ｋＨｚに及ぶ周波数にわたり、高速フーリエトランスファー（ｆａｓｔ Ｆｏｕｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を行い、トランスファー関数をｄＢ ｒｅｌ １ｍｍ／ｓ／Ｐａとして計算した。第一の共振ピークの振幅は、第一の１００Ｈｚより少ない、及び８ｋＨｚより多い全ての周波数を除くものにより計算した。最大振幅及び対応周波数をＯｒｉｇｉｎ２０１５を用いて決定した。各試料についてのＦＦＴプロットを表示して、この最大値が、第一の共振ピークに関係することを確認した。これらの測定値を試料あたり３０の測定値（各膜から穴を開けた３つの１０ｍｍディスクを有する１０のシルク膜）について、決定した。平均ピーク周波数及び振幅を使用して試験した異なる材料の音伝送特性を記載した。

圧負荷下のフィルムの側方変位
シルクフィルムの鼓膜（ｅａｒｄｒｕｍ）修繕のための材料としての適合性を試験するため、フィルムを、フィルムに対して最大７ｋＰａの圧力適用するため設計された特注のモデル外耳道中で試験した。モデルは、文献（Ｇｒｅｗｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）に記載された平均ヒト外耳道にマッチする内法を有するナイロンプラスティックチューブで構成された。フィルムディスクを、ラバーＯ−リングを有するキャップ上のスクリューを用いて（チューブの中耳側を表す）チューブの一端にあて、一方、（耳の外側開口を表す）チューブのもう一方を注射器ポンプに接続した。圧力をリアルタイムにモニターできるように、チューブ内の、試料のすぐ前の小さなポートを介して圧力センサーを接続した。小さな電子的な変位センサーを、フィルムのすぐ前に置いた。光学センサーは、赤外線（ＩＲ）ＬＥＤ及び検出器からなり、試料及びセンサー間の距離を、反射ＩＲ光の強度における変化として測定した。センサーは、（線形変換ステージにより測定されるように）２ｍｍから５ｍｍの間の距離を有する出力電圧の線形変化を生み出した。白い修正液の小さなドットを、各試料の中央に置いて、その反射率を改善した。

フィルム二次構造
結晶（βシート及びターン）及び非晶質（α−ヘリックス及びランダムコイル）モチーフの割合を、Ｖｅｒｔｅｘ７０フーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ，ビレリカ，ＭＡ，米国）を用いて、各フィルムタイプにおいて測定した。４０００から６００ｃｍ^−１の範囲にわたる吸光度モードでスキャンを行った。各タイプの合計３のフィルムのスキャンを行い、フィルムタイプあたり、合計１８の測定のため、フィルムあたり６回（フィルムの端、上面、フィルム底面の端、フィルム上面の中央、フィルム底面の中央）のスキャンを行った。上面及び底面スキャンを、平均し、アミドＩ領域（１７０５から１５９５ｃｍ^−１）をデコンボリューションさせ、以前（Ｒａｊｋｈｏｗａ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）に記載された７つの既知の立体配座位置を用いて、カーブフィッティングさせた。これら７つのデコンボリューションしたピークのそれぞれの相対ピーク面積を使用して、側鎖、βシート、ランダムコイル、α−ヘリックス及びβ−ターンの％含有量を決定した。％ピーク面積値を、６の測定値（３つの別のフィルムの中央及び端領域）の平均±標準偏差として表現した。フィルムタイプあたりの全ての試料の平均したスキャンをデコンボリューション後にプロットした。

分解に対する抵抗
フィルムを、以前の研究（Ｒａｊｋｈｏｗａ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）に基づいて改変した方法を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素分解研究を用いて試験した。フィルムを、２０℃±２℃及び６５％±２％の相対湿度で少なくとも４８時間、調節し、その後、フィルムあたり、５の細長い一片に切り分けた。フィルムの細長い一片をＵＶ光を用いて３０分間滅菌する前に、各試料の重量を、小数点以下４桁を用いて記録した。各細長い一片を、その後、無菌で、１５ｍＬプラスティックチューブに移した。対照試料を０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４でインキュベートし、一方、実験試料を、１ｍｇ／ｍＬプロテアーゼＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス、ＭＯ、米国）を含有する０．１Ｍ ＰＢＳでインキュベートした。試料を、３日にわたりインキュベートした；プロテアーゼ溶液及びバッファーを毎日交換して、最適な酵素活性を維持した。６時間後、１日後及び３日後に試料を除去した。各時点において、対照及び実験フィルムの細長い一片を、インキュベーターから除去し、ｄＨ２Ｏを用いて十分にすすぎ、その後、２％酢酸に３０分間浸し、結合したプロテアーゼを除去した。細長い一片を、その後、十分に再びすすいで酢酸を除去し、ドラフトチャンバー中で一晩乾燥させた。一度乾燥させると、フィルムの細長い一片を、２０℃±２℃及び６５％±２％の相対湿度で少なくとも４８時間再び調節し、再度量り分けた。合計５の細長い一片に各実験群について及び各時点で量り分けた。各時点での試料の重量減少は、オリジナルの（調節された）重量のパーセンテージとして表現した５の試料の平均±標準偏差として現れた。

表面計量学及び粗度
各試料の表面粗度を、光学形状測定を用いて計算した。簡潔に述べると、３つのフィルムの上及び底を、Ｖｅｅｃｏ Ｄｅｋｔａｋ １５０ Ｃｏｎｔｏｕｒ ＧＴ（Ｂｒｕｋｅｒ、ビレリカ、ＭＡ、米国）上で、撮像した。２Ｘ倍率器を用いて５０Ｘの倍率でスキャンを行った。各スキャンについてのアウトプットファイルを、その後、オープンソースソフトウェアＧｗｙｄｄｉｏｎ（バージョン２．４４）にインポートした；スキャンを平面レベリングにより補正し、その後、二乗平均平方根（ＲＭＳ）粗度（Ｒ_ｑ）を計算した。Ｇｗｙｄｄｉｏｎにより同定した欠測データをマスクし、粗度計算から除いた。粗度データは、測定した各タイプの３つのフィルムの平均±標準偏差として現れた。

走査電子顕微鏡法
組織培養プレートにおける試料をＰＢＳで３０分間、ＲＴですすぎ、その後、ＲＴで、１時間ごとにエチルアルコールの濃度を増加させながら（５０％、７０％、９５％、１００％超脱水２回の交換）、脱水した。ＣＯ_２における試料の臨界点乾燥をＥｍｉｔｅｃｈモデルＫ８５０臨界点乾燥機で行った。アルゴンガス中、０．０７トールでの２分間、２５ｋＶで、Ｐｏｌａｒｏｎ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｉｎｃ、モデルＥ５１００スパッタコーターにおいて、スパッタコーティングを、行った。試料を、アルミニウムスタブ上にマウントし、Ｐｈｉｌｉｐｓ、モデルＸＬ３０スキャニング電子顕微鏡で見た。画像を１８ｘ、２００ｘ及び５００ｘ倍率で取得した。画像情報を各画像上に刻み込まれたデータバーに記録した。

ナノインデンテーション
材料を、金属スタブ上に強力瞬間接着剤でくっつけ、Ｈｙｓｉｔｒｏｎナノインデンター９５０のステージ上に置いた。試料を、アルミニウム対照試料に対して、キャリブレートした。各試験試料について、各測定点でソフトウェアにおいて計算された硬度及び相当弾性係数について、２０の測定値を作った。

細胞移動
ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で増殖させたストック培養からのヒト鼓膜ケラチノサイトを、トランスウェル培養インサートに２４時間、プレートした。トランスウェル膜は、事前に２ｍｍ生検パンチを用いて穿孔し３つの穴を作っていた。インサートは、試験材料上に置き、細胞は、培地中で覆われた。４８時間にわたり、細胞は、支持膜から試験材料に移動した。細胞は、その後、ホルマリン中で固定し、試験材料へ移動した細胞を、核染色（ＤＡＰＩ）後に蛍光顕微鏡で撮像し、ＰＢＳ／グリセロール中、カバースリップの下、スライド上にマウントした。移動量を、覆われた表面積の割合に基づいて推定した。

細胞生存率
細胞生存率についての定量的比色分析アッセイを、細胞毒性対照として１％ＤＭＳＯを用い、ヒト鼓膜ケラチノサイト培養物を用いて行った。アッセイは、９６ウェル培養プレート中で、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙキットを用いて行い、ＭＴＳ基質コンバージョンにより、細胞数を推定した。Ｅｐｏｃｈ、ＢｉｏＴｅｋプレートリーダーにおいて、プレートを読んだ。

結果：
透過性：
水性ベースのシルク／グリセロール膜と比較した際、ギ酸を用いてキャストしたシルク膜は、より低い光散乱のため、より高い透過性を有した。

ギ酸ベースのシルク／グリセロールフィルムは、可視波長にわたり、より高い合計光透過率及びより低い拡散透過率を示した（図１）。より低い拡散透過率は、より低い光の散乱に対応し、それは、ギ酸ベースのフィルムにより良い透明性及びより低い陰影を与える。２つのフィルムタイプ間の差は、より低い波長で、最も大きかった。

水性シルク／グリセロール膜は、ギ酸シルク／グリセロールフィルムでは示されなかった、わずかに不鮮明な外観を有した。水性膜の拡散透過率は、より短い波長でほぼ２０％に増加し、それは、光散乱又は陰影の増加を示した。その一方、ギ酸シルクからキャストしたグリセロール含有膜は、合計透過率において、純粋（グリセロールのない）ギ酸膜と比較してより小さい減少を示し、それは、９２から９７％を８８から９１％に減少した。グリセロールのギ酸膜への添加は、拡散透過率を減少させ、それは非常に低い光散乱を示唆した。

音響特性（ＬＤＶ）：
グリセロールを含有するＦＡシルクフィルムは、聞き取れる周波数にわたり、軟骨試料より有意に高い振幅を示した（図２）。

機械的特性（引張強度、ヤング係数、最大限伸長、空気圧負荷下での変位、ナノインデンテーション）：
張力結果：
３つの鍵となる特性試験：
・最大引張強度：試料を破損するのに必要とされる力の量
・ヤング係数：試料の、長さの変化に抵抗する能力−試料の剛性の測定。すなわち、より高いヤング係数＝より硬い
・伸長：試料が破損する前に伸長する量（試料のオリジナルの長さの％として測定される）。低い伸長は、もろい材料と関連する。もろい材料は、しばしば、より高い引張強度及び高い当該係数を有するが低い伸長を有する。

グリセロールの添加は、水性及びギ酸ベースのフィルムのいずれにも、引張強度及びヤング係数の有意な降下をもたらす。

この降下は、伸長における有意な増加と関連する。それらは破損の前に１００％超まで伸びるため、より高い伸長は、グリセロール含有フィルムを、よりもろくなくさせる。

グリセロールを含有する水性対ギ酸フィルムの特性を比較すると（ＡＱ５０Ｇ４０対ＦＡ５０Ｇ４０）、いずれのフィルムも、同程度の引張強度を有したが、ギ酸フィルムはわずかにより高い係数及びより低い伸長を示した。

水性膜及びギ酸膜のいずれに対するグリセロールの添加も、最大引張強度及びヤング係数のいずれにも対する有意な降下をもたらした。

予想されたとおり、可塑化された膜の最大伸長は、水性膜及びギ酸膜のいずれにおいても有意に増加し、それは、グリセロールを含有する膜は、グリセロールを含有しない膜よりも、有意に延性があることを示した。

しかしながら、可塑化されたフィルムの強度及び係数は同様であったが、ギ酸グリセロール膜の最大伸長は１１９％であり、水性グリセロール膜の２５０％伸長より有意に低かった。グリセロールの可塑化作用は、主として非晶質領域に作用することが可能である。水性膜において見出された非晶質領域のより高い含有量（この場合、ランダムコイル）は、より大きい最大伸長につながる、より大きい可塑化を可能にしやすい。

空気圧負荷下での変位：
いずれのフィルムタイプも、７ｋＰａを上回る圧負荷に、破裂することなく耐えることができた（図３）。

いずれの膜も、０から７ｋＰａにわたり、ほとんど同じ変位を示し、ギ酸フィルムは、より高い圧力で、わずかにうまく行った。（３ｋＰａより高い圧力で、水性フィルムより低く変位した）が、差は、統計的に有意ではなかった。結論は、いずれのフィルムタイプも、等しくうまくいったということである。

これらの圧力に耐える能力は、膜が、耳の中において一般的である短期間の圧力変化に耐えることができるかもしれないことを示す。この結果は、わずかな圧力でより長い期間にわたり変形させることに対してフィルムが抵抗し得ることを必ずしも示さない。この種の状況を試験する方法は、いまだ開発中である。

化学的特性（βシート含有量、分解に対する抵抗）：
いずれのフィルムタイプへのグリセロールの添加も、βシート含有量を増加させた。ギ酸グリセロール膜は、水性グリセロール膜より有意に高く、試験した全ての膜の中で最も高い割合のβシートを含有した。グリセロール含有フィルム間を比較すると、水性グリセロールフィルム（ＡＱ５０Ｇ４０）は４４．５％を有したが、一方、ギ酸グリセロールフィルム（ＦＡ５０Ｇ４０）は６３．８％の有意に（Ｐ＝０．０００）高いβシート含有量を有した（表２）。

ギ酸ベースのフィルム（グリセロールを持たないものでさえ）は、水性フィルムのいずれか（グリセロールを有する又は有さない、表２）よりも、高いβシート含有量を有した。これは、デコンボリューションプロット（図４）において理解することができ、それは、いずれのギ酸フィルムも、２つのβシート領域内に大きなピークを含有したことを示し、一方、水性フィルムプロットは、非晶質領域（ランダムコイル及びα−ヘリックス領域）内に大きなピークが優位を示すことを示す。

ギ酸膜の二次構造は、水性キャストする膜と比較して著しく異なっていた。ギ酸キャスト膜は、水性膜よりも高い結晶含有量（βシート及びβ−ターン）及び水性膜よりも低い非晶質含有量（ランダムコイル及びα−ヘリックス）を有した。

グリセロールを有さないβシート含有量は３１．５％であることが見出された文献（Ｊｏｓｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１５）と比較して、シルクを３０％グリセロールと混合した場合、βシートが３９．９％に上昇した。これは、本明細書中に提示された水性フィルム−それは、４０％グリセロールであり、４４．５％のβシート含有量を有する、と比較して遜色ない。この研究は、フィルムをＰＢＳ中で非溶解性にさせるために、３１．４％より多いβシート含有量が必要とされることを見出した。

分解に対する抵抗
いずれの対照群フィルム（プロテアーゼのないＰＢＳバッファー中でインキュベートした）も、それらの重量の３４％から３５％を失い、このほとんどは最初の６時間のうちに起こった。これは、フィルム中のグリセロールの大部分は、素早く浸出し、乾燥後にフィルム中にちょうど５％が残っていたことを示す。

１ｍｇ／ｍＬプロテアーゼＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートした場合、４０％グリセロールを含有する水性フィルム（ＡＱ５０Ｇ４０）は、６時間（第一の時点）以内に、完全に分解した。つまり、いくつかの非常に細かい断片がチューブ内に見えた（１ｍｍより小さい長さ）が、これらは、回収する又は量り分けることができなかった。

その一方、４０％グリセロールを含有するギ酸ベースのフィルム（ＦＡ５０Ｇ４０）は、６時間後に６１％、及び２４時間後に７１％まで分解した。これの３４％は、失われたグリセロールに帰することができるため、６時間後のシルクの重量減少は、出発重量の２７％であることが見出された。

ギ酸膜は、続いて、その後の日３日の時点までにわたり分解し続け、その時間により、膜断片は、量り分けるには小さすぎた（本質的に完全分解）。ギ酸膜は、分解に対し、水性膜より有意に良い抵抗を提示した。

使用されるプロテアーゼタイプ及び選択された濃度は、以前の方法に基づき、シルク繊維の分解におけるそれらの効率のために選択された（Ｈｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。当該研究は、加速された分解研究として理解することができる。分解は、ｉｎ ｖｉｖｏ環境において、はるかに緩やかであると考えられる。

表面形態及び粗度：
光学形状測定データ：
ＦＡ５０Ｇ４０フィルムは、ＡＱ５０Ｇ４０フィルムより滑らかであった（図６、表３）。

走査電子顕微鏡法データ：
純粋シルクは、サブミクロン−スケールの起伏を有するきめの細かい質感である、滑らかな均質の表面を有した。ＦＡシルクも、より滑らかであったが、くぼみのある表面を有し、くぼみの寸法は、〜２μｍ直径であった。

Ａｑシルクグリセロールは、シルクよりきめ細かい表面の質感のように見えた。

ＦＡシルクグリセロールは、ＦＡシルクより少ないくぼみを有した。１つの試料は、より大きな直径くぼみを有し、他は、より小さいくぼみを有した。

いずれの表面のイメージングからも、水性膜の上面は、底面よりも粗いことが明らかになった。

その一方、ギ酸由来シルク膜は、可視ミクロ粗度のない、大幅により滑らかな表面を示した。ＦＡ−ＳＦ膜の上面は、しかしながら、９３．８±６．１ｎｍのはるかに高い平均粗度につながる、最大数μｍの直径を有するへこみ又はくぼみの存在が優位を示していた。これらのへこみは、ギ酸からキャストされた純粋シルク及びシルク／グリセロール膜のいずれにも存在し、いずれの面にも存在したが、しかしながらそれらは、純粋ギ酸ベースのシルク膜の上面に最も大きく及び最も目立っていた。ギ酸膜は、水性膜と同様の又はより優れた透過性を示したため、点在するより大きなへこみは、ギ酸膜の透過性に不利な影響を与えるようには見えなかった。

ナノインデンテーション：
相当弾性係数は、ＦＡシルクについてＡｑシルクより高かった。

グリセロールの添加は、両方のタイプのシルクについて、係数を実質的に低下させた（約５倍）。

硬度は、ＦＡシルクにおいて、Ａｑシルクより低かった。

グリセロールの添加は、両方のタイプのシルクについて、硬度を実質的に低下させた（約１０倍）。

細胞培養データ（細胞移動、生存率）：
細胞移動
独自の細胞移動及び生着アッセイを用いて、我々は、全ての足場が、支持ＰＥＴ膜から足場表面への、ヒト鼓膜ケラチノサイトの移動を支持したことを示すことができた。細胞は、その後、分裂図としてみられる増殖、及び面全体の迅速な生着を示し、当該足場に接着し、生存可能なままであった。

ＦＡシルクについて、移動及び生着は、４８時間以内に試料（３ｍｍ^２）全体にわたる、ケラチノサイトのコンフレントな覆いを生じるのに十分であった。

水性シルクフィルムも、表面への細胞の移動及び生着を支持したが、より少ない程度で、多くの試料において満たされた領域の半分より少なかった。

グリセロールの添加は、ＡＱ又はＦＡセッティングにおいて、アウトカムに影響を与えなかった。

半定量的分析において、ランク付けされたスコアは、ＦＡ５０＝ＦＡ５０Ｇ４０＞ＡＱ５０＝ＡＱ５０Ｇ４０であった。

細胞生存率
細胞生存率についての定量的アッセイを、細胞毒性対照として５％ＤＭＳＯを用い、ヒト鼓膜ケラチノサイト培養を用いて行った。

これらの実験における細胞毒性（５％ＤＭＳＯ）についての対照処理は、吸光度を６３％に減少させ、それは細胞死を示した。

全てのフィルムは、４８時間、生存可能な細胞集団を支持し、細胞生存率を支持するシルク膜の相対効率を評価することが可能であった。

終点での吸光度（細胞の数）は、変化しやすかったが、ＡＱシルク及びＦＡシルクについては同様であった。

グリセロールの存在は、細胞の数に影響を与えなかった。

これらのデータは、水性フィルムと比較した、ギ酸フィルムの有益な点は：
Ｉ．水性ベースのシルク／グリセロール膜と比較した場合の、より低い光散乱に起因する、より高い透過性、
ＩＩ．より低い陰影、
ＩＩＩ．より高い非晶質含有量（ランダムコイル及びα−ヘリックス）を有する水性フィルムと比較した、より高い結晶含有量（βシート）、
ＩＶ．このより高い結晶化度は、良好な機械的強度、及び可塑化されていない膜より有意に良い破損伸長を維持しながら、酵素分解に対するより高い抵抗に変換され、それは、ｉｎ ｖｉｖｏでより緩やかな分解に変換されるかもしれない。
Ｖ．より高い結晶化度もわずかにより高い係数（ＦＡ５０Ｇ４０膜は、ＡＱ５０Ｇ４０よりわずかに硬い）に変換される。これに対する直接的な利益はないが、圧力変位に対する同じ抵抗を有する、ＦＡ膜を、ＡＱフィルムよりわずかに薄くさせるかもしれない。これは、３ｋＰａを超える圧力での、ＦＡ５０Ｇ４０膜のわずかにより低い変位から明らかであるが、しかし、この結果は、統計的に有意ではなかった。そのため、より高い圧力抵抗は、有意な利益として主張することができない。
ＶＩ．ギ酸から作られたシルク膜も、良い生体適合性を示し、ヒト鼓膜の移動を支持した。

溶媒としてのグリセロール及びギ酸の組み合わせは、グリセロール可塑化された水性膜と比較して、より高い透過性、及び酵素分解に対する優れた抵抗を有する、可塑化された膜の製造を可能にする。可塑化されたギ酸由来の膜は、可塑化された水性膜と同様の引張強度及び係数を示し、より大きい１００％最大限伸長を達成した。ギ酸の使用は、細胞毒性又は生体適合性に悪影響を与えず、そのため、これらの膜が、透過性及びより緩やかな分解が必要とされる環境のための、説得力のある代替物を提示することが提案される。

参考文献
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Claims (8)

1. ギ酸の存在下で調製されたシルクフィブロイングリセロール膜マトリックスであって、膜は、：
   （ａ）膜の合計湿重量の約０．１％から約２０％（ｗｔ％）の範囲の量でシルクフィブロインを含み、
   （ｂ）約５％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含み、
   （ｃ）ｉｎ ｖｉｖｏで２０Ｈｚ及び２０ＫＨｚの間の音波を中耳に伝達し、
   （ｄ）１０ＭＰａから１００ＭＰａの間の引張強度を有し；かつ、
   （ｅ）膜が、ギ酸の存在下で調製されたグリセロール及びシルクタンパク質複合体溶液から作製される、
   シルクフィブロイングリセロール膜マトリックス。
2. （ａ）繭又は繊維からのセリシンの除去後、シルクタンパク質又はシルクタンパク質複合体溶液を調製すること；
   （ｂ）ギ酸を用いて、グリセロール及びシルクフィブロインを溶解すること；及び
   （ｃ）調製されたシルクタンパク質又はシルクタンパク質複合体溶液を乾燥させて調製されたシルクタンパク質又はシルクタンパク質複合体を作製すること
   の工程を含む、シルクフィブロイングリセロール膜マトリックスを作製する方法。
3. 工程（ｃ）の後に、熱又は溶媒又は溶媒／グリセロール又は溶媒蒸気処理によりシルク膜を再結晶化させ、水に対する溶解性を減少させる、請求項２に記載の方法。
4. 調製された膜を、エタノール若しくは別のＣ_１からＣ_３アルコール又はそれらの組み合わせに暴露し、タンパク質立体配座転移をβシート構造に誘導し、ＰＢＳ又は水中での不溶性を確保する、請求項３に記載の方法。
5. 請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法により調製された、シルクフィブロイングリセロール膜マトリックス。
6. 少なくとも一の活性剤を含む、請求項５に記載のシルクフィブロイングリセロール膜マトリックス。
7. 活性剤が、細胞、タンパク質、ペプチド、核酸アナログ、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、アプタマー、抗体又はそれらの断片若しくは部分、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、成長因子又は組換え成長因子及びそれらの断片及びバリアント、サイトカイン、酵素、抗生物質又は抗菌性化合物、ウイルス、抗ウイルス剤、毒素、プロドラッグ、化学療法剤、低分子、薬剤、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載のシルクフィブロイングリセロール膜マトリックス。
8. 膜が、ケラチノサイト、線維芽細胞、粘膜上皮、内皮細胞、軟骨細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞及び胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせの増殖を支持する、請求項５に記載のシルクフィブロイングリセロール膜マトリックス。

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