CN112773943A - 一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架 - Google Patents

一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架 Download PDF

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Abstract

本发明申请属于腱骨组织修复材料技术领域，具体公开了一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架，其组分包括氧化石墨烯水溶液、富血小板血浆、凝血酶。本产品能应用在生物医学领域中对腱骨组织的修复过程中，解决了现有技术中常态下的富血小板血浆，结构不稳定、生物力学性能差、组织粘附能力较低、生长因子释放不稳定、半衰期较短，无法长时间作用于病灶，难以对组织进行持续修复的问题。

Description

一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶 支架
技术领域
本发明属于组织工程修复材料技术领域，具体公开了一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架。
背景技术
近年来，以支架材料和种子细胞为基础的组织工程研究发展迅速，为人工修复腱骨组织提供了一种新的途径，已成为腱骨愈合研究的热点和焦点。随着新型纳米材料的兴起，氧化石墨烯(GO)成为了生物医学领域应用较多的石墨烯衍生物之一，其表面积大、机械强度高且具有良好的生物相容性，表面含有丰富的亲水含氧活性基团，有利于对其表面进行化学功能化修饰，此外还具有良好水分散性并能显著提高复合材料的力学性能。先前的研究结果发现，将GO与高分子基质材料复合后，可大幅度提高和改善复合材料的物理性能。在骨组织工程中，二维的石墨烯结构和三维石墨烯泡沫可促进人间充质干细胞的成骨分化。
富血小板血浆(PRP)来源于自身血液，是根据血液中各类细胞沉降系数的差别，通过离心的方法从全血中提取出来的血小板浓缩液，含高浓度的血小板、白细胞和纤维蛋白。大量研究证实，PRP能促进组织修复主要因其含有高浓度的血小板，血小板细胞中含有大量促进组织修复的生长因子和细胞因子，如TGF、PDGF、VEGF、胰岛素样生长因子等。组织愈合的过程较为复杂，受到多种生物因子与信号通路调控，其机制尚未明确，多种生长因子对腱骨愈合过程有促进作用，但PRP常态为液态，结构不稳定、生物力学性能差、组织粘附能力较低、生长因子释放不稳定，而且多数生长因子半衰期较短，无法长时间作用于病灶，难以进行持续修复等缺点。PRP来源于自身血液，可以为组织修复提供多种细胞因子的局部微环境，避免单一生长因子的生理效应局限性。
研究表明，制备物理交联水凝胶中常用的非共价键相互作用包括氢键、离子键、疏水作用力等。与化学交联形成的水凝胶相比，物理交联形成水凝胶的条件比较温和，主要通过物理相互作用形成，通常不需引入有毒性的交联剂、引发剂等，因此在用于体内组织修复时具有更高的生物安全性。我们拟将氧化石墨烯与富血小板血浆以物理水凝胶的方式复合，提高支架力学强度，增加粘附能力，获得新的负载生长因子的方法并获得良好的释放动力学，从而改变损伤处的生长微环境，促进细胞增殖、分化，从而缩短腱骨愈合时限，为临床组织愈合提供理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架，以解决现有技术中常态下的富血小板血浆，结构不稳定、生物力学性能差、组织粘附能力较低、生长因子释放不稳定、半衰期较短，无法长时间作用于病灶，难以对组织进行持续修复的问题。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架，其组分包括富血小板血浆、氧化石墨烯水溶液、凝血酶。
本技术方案的有益效果在于：将氧化石墨烯与富血小板血浆以物理水凝胶的方式复合，提高了支架力学强度、增加了粘附能力，获得了新的负载生长因子的方法以及良好的释放动力学，从而改变损伤处的生长微环境，促进细胞增殖、分化，缩短腱骨愈合时限，为临床组织愈合提供理论基础。
附图说明
图1为使用SEM观察冻干后各组水凝胶支架的内部多孔结构图；
图2为通过Image J图像处理系统计算出的各组水凝胶支架的孔隙率；
图3为各组水凝胶支架累计缓释TGF-β1情况；
图4为各组水凝胶支架CCK8实验OD值(450nm)情况；
图5为兔植入GO/PRP水凝胶支架后心、肝、肺、肾HE染色情况；
图6为大鼠皮下包埋位置示意图；
图7为HE染色情况。
具体实施方式
一、PRP的制备
1.取新西兰大白兔，在兔耳中央动脉处消毒，10ml无菌注射器抽取1ml 10％枸橼酸钠抗凝剂，然后抽取动脉血10ml；
2.将含抗凝剂的血液移入离心管中；
3.先以200g离心10min，离心后血液随即分为上层的为淡黄色血浆层和下层的为深红色的红细胞层；
4.吸取上层血浆层和分界线下2mm以上的溶液至新的离心管中；
5.250g离心10分钟进行第二次离心；
6.经过两次离心后，血浆随即分为两层，下层为富血小板血浆(Platelet-richplasma，PRP)，上层为乏血小板血浆(Platelet poor plasma，PPP)。吸管吸弃上层的PPP(约占液体总体积的70％)，剩余液体即为富血小板血浆，体积约2ml，充分摇匀备用。
二、氧化石墨烯水溶液的制备
GO(氧化石墨烯)购买自中科时代纳米有限公司，型号为：TNGO-50。
1.称取已消毒(环氧乙烷)的氧化石墨烯粉末与PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)混合，分别获得0.25mg/ml、0.50mg/ml、1.00mg/ml的石墨烯水溶液；
2.超声破碎仪下超声超过1小时，使氧化石墨烯完全溶于水；
3.使用前进行紫外线消毒过夜。
三、GO/PRP水凝胶支架的制作
取制备好的PRP与处理好的GO水溶液以2:1比例混合并盛放于设定的支架模具中，添加凝血酶后，氧化石墨烯复合物在30s内迅速成胶，得到GO/PRP水凝胶。
四、GO/PRP水凝胶的表征
扫描电镜：将各组水凝胶支架进行干冻冷冻干燥，修剪成合适大小后，将样品抽真空，表面喷金处理正面喷金60s，侧面喷金15s。用SEM在10KV的条件下观察冻干样本的内部孔状结构，结果见图1，其中A为单纯PRP水凝胶支架，B为GO浓度是0.25mg/ml的GO/PRP水凝胶支架，C为GO浓度是0.5mg/ml的GO/PRP水凝胶支架，D为GO浓度是1.0mg/ml的GO/PRP水凝胶支架。
四组冻干水凝胶样本均显示具有多孔结构，扫描电镜观察可见复合支架材料表面凹凸不平，有大量陷窝、沟槽样结构，孔内壁稍粗糙，且孔与孔之间通过微孔相互连通。通过Image J图像处理系统计算各组孔隙率(见表一、图2)，各组间通过独立样本T检验结果显示，PRP组的孔隙率比0.5GO/PRP组与1.0GO/PRP组明显要大，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。其余各组间孔隙率均无明显差异性(P＞0.05)，但各氧化石墨烯水凝胶支架随着氧化石墨烯的浓度越高，孔隙率越小。各组孔径分布较均一，孔径范围为40-130μm，这证实了GO/PRP水凝胶支架具有高度多孔且孔隙相联的内部特征。这种水凝胶具有的多孔结构可容纳从周围组织迁移来的细胞，也可作为递送细胞和生物活性分子的可注射支架，具有广阔的应用前景。
表一 各组水凝胶支架的孔隙率
PRP 0.25GO/PRP 0.5GO/PRP 1.0GO/PRP
孔隙率 64.84±0.70 63.04±1.00 61.08±2.06 59.17±2.43
五、支架体外生长因子释放动力学
将制备的不同凝胶支架分成4组，0.25GO/PRP表示GO浓度为0.25mg/ml的GO/PRP水凝胶支架、0.5GO/PRP表示GO浓度为0.5mg/ml的GO/PRP水凝胶支架、1.0GO/PRP表示GO浓度为1.0mg/ml的GO/PRP水凝胶支架、PRP表示为单纯PRP水凝胶支架，每组取6个样品，分别做好标记，将制备好的四组放置于无菌离心管中并注入2ml的生理盐水，将复合物凝胶完整浸泡，将其密封，检查气密性，放置于恒温箱内37℃孵育1小时，再将浸泡液全部吸出，再更换2ml生理盐水继续孵育，孵育至12h、24h、48h、72h、96h再重复上述步骤，将不同时间吸出的浸泡液标记好，储存在-80℃待通过Elisa法检测生长因子。以上步骤保证在无菌下操作。
生长因子含量检测
通过酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测TGF-β1的含量。具体操作遵循操作手册。每个标本测量三次。采用双抗体夹心ABC--ELISA法，用鼠抗兔TGF-p1ELISA试剂盒检测。
1.建立标准曲线：设标准空白孔8孔，每孔中各加入标准品&标本通用稀释液l00ul，第1孔加标准品l00ul，混匀后用加样器吸出l00ul，移至第二孔；如此反复作对倍稀释至第7孔，从第7孔中吸出l00ul弃去，第8孔为空白对照；
2.加样：其余待测品孔每孔各加入之前制备好的浸泡液l00ul。用新封板胶纸封住反应孔，将反应板充分混匀后置于37℃孵箱孵育90分钟。
3.用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向吸水纸上轻拍印干。空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(l00ul/孔)，用新封板胶纸封住反应孔，置于37℃孵箱孵育60分钟。
4.用洗涤液将反应板充分洗涤5次，向吸水纸上轻拍印干。空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱，避光孵育30分钟。
5.打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
6.洗板5次。加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光37℃孵箱，避光孵育15分钟。
7.加入反应终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。
8.结果：所有OD值都减除零孔值后再行计算；以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0ng/ml之OD值在双对数纸上作图，画出标准曲线。通过标本OD值在标准曲线上查出相对应TGF-β1的浓度；
统计学方法(四号黑体)
所得数据使用均数±标准差表示，采用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析，任意两组之间运用LSD做组间差异的统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
根据各组上清液通过ELISA试剂盒所测得的吸光度值，应用标准曲线方程计算TGF-β1含量。各组水凝胶支架累计缓释TGF-β1的情况详见表二：
表二 各组水凝胶支架累计缓释TGF-β1情况
Figure BDA0002892843010000051
如图3所示，不同浓度组的氧化石墨烯水凝胶支架在96小时内对TGF-β1的累计释放量情况，整体呈上升趋势，这表明各组均有一定缓释能力。一定时间内所释放的生长因子量越高，其所生长因子储备越低。如图3所示，各不同浓度的氧化石墨烯水凝胶支架累计释放量均比PRP组要低，1.0GO/PRP组大于0.5GO/PRP组，0.5GO/PRP组大于0.25GO/PRP组，且各组间差异均具有统计学意义(P＜0.05)。随着氧化石墨烯的加入，水凝胶支架TGF-β1的释放发生改变，随着氧化石墨烯的浓度越高，生长因子释放的速率越缓慢。
由此可得出可知，0.25GO/PRP组与0.5GO/PRP组均与1.0GO/PRP组能延缓释放生长因子，且氧化石墨烯浓度越高，延缓效果越好。
六、生物相容性
兔MSCs提取培养及传代
取2只1月龄的健康新西兰乳兔，均以耳缘静脉注射空气处死。在无菌条件下解剖乳兔四肢长骨，去除两端骨垢，用生理盐水冲洗骨髓腔，收集细胞成分，用含体积分数10％胎牛血清，低糖DMEM，100U/mL青霉素，100mg/L链霉素的培养基重悬，以每瓶10mL接种75cm2培养瓶中。在37℃饱和湿度，体积分数5％CO2条件培养箱中培养。3d后，未附着的细胞在第一次换液过程中被弃去。剩余细胞接下来一周换2次液。附着细胞直到长满瓶底约80％，用0.25％含EDTA的胰酶消化液将BMSCs消化下来，然后以1.0×104个细胞/cm2的密度传代培养于新的培养皿中。培养第二代BMSCs长满约90％可被用于接下来的实验中。
分组
分为5组，0.25GO/PRP组、0.5GO/PRP组、1.0GO/PRP组、PRP组、正常组。每组6个标本，每个标本4个复孔。
CCK8实验
1.培养第二代细胞至90％融合；
2.用胰酶消化后按1×104/个种植于96孔板，分为空白组、PRP组、0.25g/LGO/PRP组、0.5g/LGO/PRP组、1g/LGO/PRP组5组，每组6个标本，每个标本4个复孔，画好分组标记；
3.培养24h待细胞完全贴壁后，弃去培养液，换用相应浸提液各孔200μL进行培养；
4.上述分组共同培养，分别在培养的1、3、5天，向每孔中10μLCCK-8液，并将培养板置于37℃、5％CO2细胞孵箱中孵育4h；
5.最后利用酶标仪测定450nm处的吸光度(Optical Density，OD)。
结果
各组水凝胶支架OD值(450nm)情况见表三：
表三
Figure BDA0002892843010000061
如图4所示，为各组水凝胶支架OD值(450nm)情况(#标志细胞毒性；*p＜0.05、**p＜0.01、*p＜0.05)
第1D时，与空白组相比，各组均没有表现出细胞毒性，且1.0GO/PRP组、PRP组表现出一定的促进细胞存活的能力，差异具有统计学意义(P＜0.05)；在第3D时，与空白组相比，各组均没有表现出细胞毒性，各组别均表现出一定的促进细胞存活的能力，差异具有统计学意义(P＜0.05)；第5D时，1.0GO/PRP组水凝胶浸提液组中细胞的数量较空白组明显减少，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，这表明在第5天时该组表现出一定的细胞毒性。结合支架生长因子释放动力学，我们选择氧化石墨烯浓度为0.5mg/ml的GO/PRP水凝胶支架进行下一步研究。
七、石墨烯急性毒性实验
实验方法：选取体重为200g的健康SD雄性大鼠8只，随机分为A、B、C、D四个组组，每组2只，A组注射GO浓度为0.25mg/ml的GO/PRP水凝胶支架浸提液，B组注射GO浓度为0.5mg/ml的GO/PRP水凝胶支架浸提液，C组注射GO浓度为1mg/ml的GO/PRP水凝胶支架浸提液，D组注射单纯PRP水凝胶支架浸提液，浸提液注射剂量为每只大鼠50ml/kg，注射后分笼饲养，按照1天、3天、7天三个时间点观察其有无死亡以及活动、步态、呼吸、神经反应等有无异常。
结论：急性毒性试验中，A、B、C、D四组大鼠中在三个时间段中均正常存活，活动、步态、呼吸、神经反应均无明显异常。
八、兔重要器官HE染色
如图5所示，兔植入0.5GO/PRP水凝胶支架后心、肝、肺、肾HE染色情况：在各重要器官均未发现石墨烯存在，说明石墨烯不会进入机体重要器官，并对其造成伤害。
九、皮下包埋试验
方法：选取体重200g左右的SD雄性大鼠8只，随机分为A、B、C、D四个组，每组2只，将全部大鼠背部皮肤备皮至无杂毛，3％戊巴比妥钠(1ml/kg)腹腔注射麻醉后，将麻醉好的大鼠放置于操作台上，用备皮刀备皮，使每组大鼠背部(脊柱中段)呈现3cm×3cm大小的无毛区，常规消毒铺巾，如图7所示，在脊柱一侧旁1cm做一纵行皮肤切口，逐层分离皮下组织至肌层，制备一个1cm×1cm的皮下囊。将制备好的0.25mg/ml的GO/PRP水凝胶支架、0.5mg/ml的GO/PRP水凝胶支架、1mg/ml的GO/PRP水凝胶支架、单纯PRP水凝胶支架取0.5ml分别植入其中，然后逐层缝合，关闭切口，无菌敷料覆盖伤口，牢固包扎。图6中，A:备皮消毒B:逐层分离组织，植入PRP和石墨烯复合物C:缝合D:包扎
术后抗感染及护理：术后每只大鼠大腿注射注射青霉素4万U/100g预防感染，术后连续三天给药，大鼠麻醉苏醒后，转回笼单独喂养。术后每天观察周围是否有红肿、破溃、异常分泌物等现象，并记录。术后2W处死，取出植入材料周围1cm×1cm组织，中性甲醛固定，石蜡包埋后切片，HE染色观察。
结论：术后2周，四组大鼠伤口周围无红肿、破溃、异常分泌物等现象，精神状态无异常。HE染色结果如图7所示，四组大鼠植入物组织均未见明显炎症反应，未发现巨噬细胞、肥大细胞及淋巴细胞等异常增生情况，表明该浓度下GO/PRP水凝胶支架无明显毒副作用。

Claims (5)

1.一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架，其特征在于，其组分包括氧化石墨烯水溶液、富血小板血浆、凝血酶。
2.根据权利要求1所述的一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架，其特征在于，富血小板血浆和氧化石墨烯水溶液的体积比例为：2:1。
3.根据权利要求1或2所述的一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架，其特征在于，氧化石墨烯水溶液为氧化石墨烯与PBS缓冲液的混合液，氧化石墨烯的浓度为：0.25-1.00mg/ml。
4.根据权利要求3所述的一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架，其特征在于，氧化石墨烯的浓度为：0.50mg/ml。
5.一种用于权利要求1所述的一种氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1).抽取动物的动脉血，并按比例向动脉血中注入设定量的抗凝剂；
(2).对动脉血进行离心处理，分离出血浆；
(3).对步骤(2)中得到的血浆进行离心处理，分离出富血小板血浆；
(4).将氧化石墨烯粉末与PBS缓冲液充分混合，制备所需浓度的氧化石墨烯水溶液；
(5).将富血小板血浆与氧化石墨烯水溶液按设定比列混合并盛放于预制的模型中；
(6).添加设定量凝血酶，形成氧化石墨烯复合富血小板血浆的缓释生长因子水凝胶支架。
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