CN109106987B - 一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体及其制备方法,该骨植入体的制备方法包括以下步骤:1)制备硅烷化的多孔钛合金支架;2)合成甲基丙烯酸酐改性明胶;3)甲基丙烯酸酐改性明胶水凝胶和多孔钛合金骨架的复合。本发明的骨植入体中含有3D打印的低模量、高强度多孔钛支架支撑结构,且多孔钛支架孔隙内复合有水凝胶,为细胞构建了类似体内的三维微环境,可以调控骨髓间充质干细胞的协同成骨分化和血管生成。
Description
技术领域
本发明涉及一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体及其制备方法,属于生物医学材料技术领域。
背景技术
骨是人体承重和运动的主要器官,而由创伤、畸形、肿瘤、退行性病变等因素导致的骨缺损十分常见。据不完全统计,我国每年新增的骨缺损病例高达300万,严重影响人们的生活质量与寿命。目前,小范围的骨缺损可通过多种手段进行治疗,但对于承重部位大段骨缺损的修复与重建仍是世界难题。
目前,治疗骨缺损的方法有自体骨移植、异体骨移植、可降解生物材料移植、医用金属材料移植等。自体骨移植的效果虽好,但来源有限,而且会给患者带来不必要的二次创伤;异体骨移植存在免疫原性、致病性等缺点;可降解生物材料移植在临床上已有比较广泛的应用,具有生物相容性良好的优点,但存在机械强度不够的缺陷,只能应用于小范围、非承重部位骨缺损的治疗;医用金属材料移植是目前临床上唯一可行的大范围、承重部位骨、关节缺损的治疗方法,具有生物相容性良好、机械强度高等优点,但长期临床应用亦暴露出不少问题,其中的关键问题之一就是植入物与宿主骨组织之间的界面整合效果不理想以及功能性供血不足,从而易引发炎症、骨吸收等并发症,最终导致植入物失效,使得植入物的服役寿命不能很好地满足临床应用的要求。医用金属材料移植易引发炎症、骨吸收等并发症的原因在于:植入体与骨组织的力学性能不匹配,成骨活性差以及功能性供血不足,导致骨的整合不理想。
因此,研发一种新型骨修复材料,使其既具有理想的机械强度和与人体骨组织相匹配的弹性模量,又具备成骨活性、促血管生成等功能,对于大范围、承重部位的骨缺损治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体的制备方法,包括以下步骤:
1)根据设计的模型3D打印多孔钛支架,再对多孔钛支架进行氧等离子体表面处理、硅烷偶联剂溶液浸泡处理,得到硅烷化的多孔钛合金支架;
2)将明胶溶解在PBS缓冲液中,再加入甲基丙稀酸酐,充分反应,再对反应液进行透析,再离心取上层清液进行冷冻干燥,得到甲基丙烯酸酐改性明胶;
3)将甲基丙烯酸酐改性明胶和光引发剂溶解在PBS缓冲液中,再将硅烷化的多孔钛合金支架浸入其中,再置于紫外光源下进行聚合反应,得到兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体。
步骤1)所述多孔钛支架上的孔洞直径为300~500μm,孔隙率为60%~85%。
步骤1)中3D打印多孔钛支架所采用的钛合金粉末为Ti6A14V,粉末粒径为15~45μm。
步骤1)所述硅烷偶联剂溶液由3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、pH=3.5的醋酸、水按照体积比1:(0.004~0.006):(40~60)组成。
步骤2)所述明胶、甲基丙稀酸酐的添加量比为1g:(0.9~1.1)mL。
步骤2)所述反应的温度为45~55℃,反应时间为2~4h。
步骤2)所述甲基丙稀酸酐通过滴加的方式添加。
步骤3)所述甲基丙烯酸酐改性明胶、光引发剂、PBS缓冲液的添加量比为1g:(0.03~0.04)g:(6~7)mL。
步骤3)所述聚合反应在紫外光波长360~480nm、光强度6~8mW/cm2的条件下进行,反应时间为60~80s。
本发明的有益效果是:本发明的骨植入体中含有3D打印的低模量、高强度多孔钛支架支撑结构,且多孔钛支架孔隙内复合有水凝胶,为细胞构建了类似体内的三维微环境,可以调控骨髓间充质干细胞的协同成骨分化和血管生成。
附图说明
图1为实施例1的骨植入体和兔子桡骨的应力-应变曲线。
图2为实施例1的骨植入体和兔子桡骨的杨氏模量对比图。
具体实施方式
一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体的制备方法,包括以下步骤:
1)根据设计的模型3D打印多孔钛支架,再对多孔钛支架进行氧等离子体表面处理、硅烷偶联剂溶液浸泡处理,得到硅烷化的多孔钛合金支架;
2)将明胶溶解在PBS缓冲液中,再加入甲基丙稀酸酐,充分反应,再对反应液进行透析,再离心取上层清液进行冷冻干燥,得到甲基丙烯酸酐改性明胶;
3)将甲基丙烯酸酐改性明胶和光引发剂溶解在PBS缓冲液中,再将硅烷化的多孔钛合金支架浸入其中,再置于紫外光源下进行聚合反应,得到兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体。
优选的,步骤1)所述多孔钛支架上的孔洞直径为300~500μm,孔隙率为60%~85%。
优选的,步骤1)中3D打印多孔钛支架所采用的钛合金粉末为Ti6A14V,粉末粒径为15~45μm。
优选的,步骤1)所述硅烷偶联剂溶液由3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、pH=3.5的醋酸、水按照体积比1:(0.004~0.006):(40~60)组成,其制备方法如下:先将pH=3.5的醋酸加入水中,再加入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷。
优选的,步骤2)所述明胶、甲基丙稀酸酐的添加量比为1g:(0.9~1.1)mL。
优选的,步骤2)所述反应的温度为45~55℃,反应时间为2~4h。
优选的,步骤2)所述甲基丙稀酸酐通过滴加的方式添加。
优选的,步骤3)所述甲基丙烯酸酐改性明胶、光引发剂、PBS缓冲液的添加量比为1g:(0.03~0.04)g:(6~7)mL。
优选的,步骤3)所述光引发剂为巴斯夫的IRGACURE 2959。
优选的,步骤3)所述聚合反应在紫外光波长360~480nm、光强度6~8mW/cm2的条件下进行,反应时间为60~80s。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例1:
一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体的制备方法,包括以下步骤:
1)根据兔子桡骨缺损模型,通过Unigraphics NX 9.0(UG)软件设计多孔钛支架模型,再将设计的模型导入3D打印设备(聚焦光速直径为50μm)中,以粒径15~45μm的钛合金粉末Ti6A14V为原料,3D打印多孔钛支架(3D打印的功率为90W,打印速度为560mm/s,扫描间距为70μm,扫描层厚为30μm),再进行粗洗和精洗,再将多孔钛支架放入等离子体处理仪中,进行氧气处理使钛合金表面富集羟基(腔室氧浓度:100%,压强:0.3mbar,处理时间:10min),再将多孔钛支架浸入硅烷偶联剂溶液中,浸泡2h,再取出多孔钛支架,依次用去离子水、无水乙醇、去离子水各超声清洗20min,再在氮气保护下烘干,得到硅烷化的多孔钛合金支架;
2)将10g明胶溶解在100mL的PBS缓冲液中,再以0.5mL/min的滴加速度滴加10mL甲基丙稀酸酐,滴加完后50℃恒温反应3h,再将反应液加入透析袋中,在纯水中透析6天,再对得到的透析液进行离心(离心机转速为2500rpm,离心15min),再取上层清液进行冷冻干燥,得到甲基丙烯酸酐改性明胶;
3)将15g甲基丙烯酸酐改性明胶和0.5g光引发剂IRGACURE 2959溶解在100mL的PBS缓冲液中,再将硅烷化的多孔钛合金支架浸入其中,置于紫外光源(紫外光波长360~480nm、光强度6~8mW/cm2)下进行80s聚合反应,再将多孔钛合金支架浸入PBS溶液中,37℃浸泡12h除去未交联的单体,得到兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体。
注:步骤2)中的硅烷偶联剂溶液由3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、pH=3.5的醋酸、去离子水按照体积比1:0.005:50混合而成。
经测试,步骤1)中3D打印得到的多孔钛支架的孔隙率为76.4%,最大抗压强度为53MPa,弹性模量E为1.81±0.62GPa。
实施例2:
一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体的制备方法,包括以下步骤:
1)根据兔子桡骨缺损模型,通过Unigraphics NX 9.0(UG)软件设计多孔钛支架模型,再将设计的模型导入3D打印设备(聚焦光速直径为50μm)中,以粒径15~45μm的钛合金粉末Ti6A14V为原料,3D打印多孔钛支架(3D打印的功率为90W,打印速度为560mm/s,扫描间距为70μm,扫描层厚为30μm),再进行粗洗和精洗,再将多孔钛支架放入等离子体处理仪中,进行氧气处理使钛合金表面富集羟基(腔室氧浓度:100%,压强:0.3mbar,处理时间:10min),再将多孔钛支架浸入硅烷偶联剂溶液中,浸泡2h,再取出多孔钛支架,依次用去离子水、无水乙醇、去离子水各超声清洗20min,再在氮气保护下烘干,得到硅烷化的多孔钛合金支架;
2)将10g明胶溶解在100mL的PBS缓冲液中,再以0.5mL/min的滴加速度滴加11mL甲基丙稀酸酐,滴加完后45℃恒温反应4h,再将反应液加入透析袋中,在纯水中透析5天,再对得到的透析液进行离心(离心机转速为2500rpm,离心15min),再取上层清液进行冷冻干燥,得到甲基丙烯酸酐改性明胶;
3)将15g甲基丙烯酸酐改性明胶和0.45g光引发剂IRGACURE 2959溶解在90mL的PBS缓冲液中,再将硅烷化的多孔钛合金支架浸入其中,置于紫外光源(紫外光波长360~480nm、光强度6~8mW/cm2)下进行75s聚合反应,再将多孔钛合金支架浸入PBS溶液中,37℃浸泡12h除去未交联的单体,得到兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体。
注:步骤2)中的硅烷偶联剂溶液由3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、pH=3.5的醋酸、去离子水按照体积比1:0.005:50混合而成。
经测试,步骤1)中3D打印得到的多孔钛支架的孔隙率为65%,最大抗压强度为105MPa,弹性模量E为4.15±0.92GPa。
实施例3:
一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体的制备方法,包括以下步骤:
1)根据兔子桡骨缺损模型,通过Unigraphics NX 9.0(UG)软件设计多孔钛支架模型,再将设计的模型导入3D打印设备(聚焦光速直径为50μm)中,以粒径15~45μm的钛合金粉末Ti6A14V为原料,3D打印多孔钛支架(3D打印的功率为90W,打印速度为560mm/s,扫描间距为70μm,扫描层厚为30μm),再进行粗洗和精洗,再将多孔钛支架放入等离子体处理仪中,进行氧气处理使钛合金表面富集羟基(腔室氧浓度:100%,压强:0.3mbar,处理时间:10min),再将多孔钛支架浸入硅烷偶联剂溶液中,浸泡2h,再取出多孔钛支架,依次用去离子水、无水乙醇、去离子水各超声清洗20min,再在氮气保护下烘干,得到硅烷化的多孔钛合金支架;
2)将10g明胶溶解在100mL的PBS缓冲液中,再以0.5mL/min的滴加速度滴加9mL甲基丙稀酸酐,滴加完后55℃恒温反应2h,再将反应液加入透析袋中,在纯水中透析6天,再对得到的透析液进行离心(离心机转速为2500rpm,离心15min),再取上层清液进行冷冻干燥,得到甲基丙烯酸酐改性明胶;
3)将15g甲基丙烯酸酐改性明胶和0.6g光引发剂IRGACURE 2959溶解在100mL的PBS缓冲液中,再将硅烷化的多孔钛合金支架浸入其中,置于紫外光源(紫外光波长360~480nm、光强度6~8mW/cm2)下进行70s聚合反应,再将多孔钛合金支架浸入PBS溶液中,37℃浸泡12h除去未交联的单体,得到兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体。
注:步骤2)中的硅烷偶联剂溶液由3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、pH=3.5的醋酸、去离子水按照体积比1:0.005:50混合而成。
经测试,步骤1)中3D打印得到的多孔钛支架的孔隙率为85%,最大抗压强度为20MPa,弹性模量E为1.07±0.29GPa。
测试例:
1)对实施例1制备的骨植入体和兔子桡骨(新西兰大白兔)进行力学性能测试,测试结果如图1所示。
由图1可知:实施例1的骨植入体的应力-应变曲线和兔子桡骨的应力-应变曲线接近,且杨氏模量也接近,即实施例1的骨植入体的力学性能和天然骨接近。
2)对实施例1~3制备的骨植入体进行急性溶血实验,具体操作如下:
a)从新西兰大白兔的耳缘静脉取新鲜血液4mL置于抗凝采血管中,加入5mL的PBS缓冲液进行稀释,得到稀释血;
b)将实施例1~3的骨植入体(孔隙率依次为76.4%、65%、85%)分别用PBS缓冲液浸没(骨植入体表面积与PBS缓冲液体积的比为1.25cm2:1mL),且每组设三个平行样品;
c)设置3个阴性对照组,每组加同批号同体积的PBS缓冲液,再设置3个阳性对照组,每组加同体积的超纯水;
d)将各组样品均置于37℃水浴槽中保温30min,然后每组加稀释血0.2mL,轻轻混匀后置于37℃水浴槽中继续保温60min;
e)再对各组样品进行离心(3000rpm/min离心5min),吸取上清液200μL,用分光光度计于545nm波长处测定吸光度;
f)取3次实验的平均值计算溶血率(Hemolysis rate,HR):HR=(样品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)×100%。
经测试,实施例1~3的骨植入体的溶血率HR依次为0.50%、0.65%和0.60%,HR≤5%,满足ISO规定,符合医用植入材料的溶血实验要求。
注:按ISO规定,若材料溶血率≤5%,则符合医用植入材料的溶血实验要求,若溶血率>5%,则表示材料有溶血作用。
3)对实施例1~3制备的骨植入体进行CCK-8细胞毒性测试,具体操作如下:
a)复苏BMSCs并培养至对数生长期;
b)将消毒后的实施例1~3的骨植入体(孔隙率依次为76.4%、65%、85%)放入24孔板内,每组设置4个平行样,另设阴性对照组4个平行样,配置对数生长期的浓度为2×104个/mL的细胞悬液,每孔加500μL细胞悬浮液,24孔板置于37℃、5%的CO2培养箱中培养,隔天换液;
c)培养1d后取出培养板,完全吸弃旧的培养基,加入CCK8混合溶液(新鲜培养基加CCK8溶液配制,比例为9:1)500μL,然后放回细胞培养箱孵育2h,接着每孔吸取200μL入96孔板,酶标仪450nm波长测各组的吸光度;
d)继续培养3d、5d、7d,再测吸光值,操作同前。按GB1997-2008计算细胞相对增殖率(Relative growth rate,RGR),并按表1的要求,将RGR值转化成六级,评定材料毒性;
e)RGR(%)=(材料组吸光度-空白组吸光度)/(阴性对照组吸光度-空白组吸光度)×100%。
经测试,实施例1~3的骨植入体的细胞相对增殖率RGR依次为90%、91%和93%,毒性分级均为1级(细胞毒性的分类标准和评价结果如表1所示),均无细胞毒性。
表1细胞毒性的分类标准和评价结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)根据设计的模型3D打印多孔钛支架,再对多孔钛支架进行氧等离子体表面处理、硅烷偶联剂溶液浸泡处理,得到硅烷化的多孔钛合金支架;
2)将明胶溶解在PBS缓冲液中,再加入甲基丙烯酸酐,充分反应,再对反应液进行透析,再离心取上层清液进行冷冻干燥,得到甲基丙烯酸酐改性明胶;
3)将甲基丙烯酸酐改性明胶和光引发剂溶解在PBS缓冲液中,再将硅烷化的多孔钛合金支架浸入其中,再置于紫外光源下进行聚合反应,得到兼具力学适配性和成骨活性的骨植入体;
步骤1)所述多孔钛支架上的孔洞直径为300~500μm,孔隙率为60%~85%;
步骤1)中3D打印多孔钛支架所采用的钛合金粉末为Ti6A14V,粉末粒径为15~45μm。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤1)所述硅烷偶联剂溶液由3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、pH=3.5的醋酸、水按照体积比1:(0.004~0.006):(40~60)组成。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤2)所述明胶、甲基丙烯酸酐的添加量比为1g:(0.9~1.1)mL。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法,其特征在于:步骤2)所述反应的温度为45~55℃,反应时间为2~4h。
5.根据权利要求1或3所述的制备方法,其特征在于:步骤2)所述甲基丙烯酸酐通过滴加的方式添加。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤3)所述甲基丙烯酸酐改性明胶、光引发剂、PBS缓冲液的添加量比为1g:(0.03~0.04)g:(6~7)mL。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法,其特征在于:步骤3)所述聚合反应在紫外光波长360~480nm、光强度6~8mW/cm2的条件下进行,反应时间为60~80s。
8.一种骨植入体,其特征在于:按照权利要求1~7中任一项所述的方法制备得到。
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