WO2015190797A1 - 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물 - Google Patents

신경인성 방광증 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2015190797A1
WO2015190797A1 PCT/KR2015/005764 KR2015005764W WO2015190797A1 WO 2015190797 A1 WO2015190797 A1 WO 2015190797A1 KR 2015005764 W KR2015005764 W KR 2015005764W WO 2015190797 A1 WO2015190797 A1 WO 2015190797A1
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neurogenic bladder
group
bladder
sci
pharmaceutical composition
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PCT/KR2015/005764
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Inventor
김계환
Original Assignee
가천대학교 산학협력단
(의료)길의료재단
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder, and more particularly, to a pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder comprising oral mucosal stem cells as an active ingredient, neurogenic bladder using the pharmaceutical composition It relates to a method of treating and use of oral mucosa stem cells used in the manufacture of a pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder.
  • the bladder is a hollow pocket-like muscle organ that is responsible for the storage and excretion of urine, which is located in the pelvis, behind the dilator, and below the urethra, above the ureter, and in the lower bladder. Connected.
  • the bladder stores the urine up to about 400 ⁇ 500cc, and discharge the urine stored in accordance with the nerve signal through the urethra.
  • various bladder diseases are caused, and the causes of the bladder function damage can be largely classified into two types. One is impaired by external infection and the other is impaired by physical abnormality. Among these, functional damage due to physical abnormalities may be classified into those caused by abnormal bladder itself and nerve damage.
  • irritable bladder syndrome which is due to the psychological or pathological factors of the patient, bladder function is too sensitive to bladder muscle abnormally during urine storage in the bladder It often refers to a disease that causes frequent contractions, urgent feelings, and frequent urination.
  • Common symptoms of irritable bladder syndrome include frequent urination to urinate more than eight times a day, urinary urgency is difficult to put up with, urinary night urination more than two times to urinate at night, suddenly unbearable feelings Urinary leaks include urinary incontinence.
  • a combination of pharmacotherapy and behavioral therapy is generally effective to treat irritable bladder syndrome.
  • muscarinic receptor antagonists As a therapeutic agent used in the pharmacotherapy, compounds such as muscarinic receptor antagonists (WO 2003/080599) have been developed, and natural herbal compositions comprising pumpkin seed oil or pumpkin seed extract, soybean extract and magnesium as main ingredients to improve safety. (Korean Patent Registration No. 1352539) and the like have been developed and used.
  • a typical example of behavioral therapy is bladder training, which is a method of increasing urination intervals by holding up urination.
  • Neurogenic bladder disease known as a type of irritable bladder syndrome, refers to a disease exhibiting bladder and urethral abnormalities that accompany neurological diseases caused by various causes such as spinal cord injury (SCI).
  • SCI spinal cord injury
  • the neurological disease causes abnormalities of the central nervous system related to the urination part, the neuronal signals connected to the urination part are abnormally transmitted, so that the neurogenic bladder is known to be induced. Because it is a derivative disease, it has been known to relapse within a short time even if irritable bladder syndrome is treated by a known method so far, and development of a treatment method for this has been required.
  • stem cell therapy which is in the spotlight in recent years, is a method of fundamentally treating a disease caused by the damaged tissue by adding stem cells or cells differentiated from stem cells to damaged tissues in vivo and replacing the damaged tissues. Accordingly, various studies for differentiating stem cells into cells of a desired tissue have been performed. In the case of using the stem cell therapy, there is an active research to develop a method for treating neurogenic bladder as a result by treating a neurological disease causing neurogenic bladder, but there are no reports on the results. I'm not doing it.
  • the present inventors have made intensive studies to develop a method for treating neurogenic bladder using stem cells.
  • the oral mucosal stem cells are implanted in the damaged spinal cord causing neurogenic bladder, the damaged spinal cord is recovered.
  • the present invention was completed.
  • One object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder comprising oral mucosal stem cells as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating neurogenic bladder comprising administering the pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder to a subject having neurogenic bladder in a pharmaceutically effective amount.
  • Another object of the present invention to provide a use of the oral mucosa stem cells for the preparation of the pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder.
  • the pharmaceutical composition comprising the oral mucosa stem cells of the present invention may exhibit an effect of treating or ameliorating neurogenic bladder, which is a type of neurological disease caused by spinal cord injury, and thus secondary nerves derived from spinal cord injury. It may be widely used for more effective treatment of the disease.
  • neurogenic bladder which is a type of neurological disease caused by spinal cord injury, and thus secondary nerves derived from spinal cord injury. It may be widely used for more effective treatment of the disease.
  • 1 is a graph comparing the export pressure and contraction time in the bladder in rats of the control group, spinal cord injury (SCI) induced group and SCI induced / oral mucosal stem cell transplant group, where A represents the control group and B represents the SCI group. Induction group, C represents SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • SCI spinal cord injury
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of performing hematoxylin / eosin (H & E) staining on spinal cords selected from rats of the control group, the SCI induction group, and the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group, and A represents the control group.
  • B represents an SCI induction group
  • C represents an SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • Figure 3 is a photograph and graph showing the results of performing TUNEL staining on the spinal cord tissue selected from rats of the control group, SCI induction group and SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group, A is the control group, B is SCI Induction group, C represents SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of immunofluorescence staining on spinal cord tissue selected from rats of the control group, the SCI induction group and the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group, A is the control group, B is SCI induction Group represents, and C represents the SCI induced / oral mucosal stem cell transplant group.
  • Figure 5 is a photograph and graph showing the results of comparing the expression level of c-Fos in the rats of the control group, SCI induction group and SCI induction / buccal mucosa stem cell transplant group, A is a control group, B represents the SCI induction group, and C represents the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • Figure 6 is a photograph and graph showing the results of comparing the expression level of NGF in the rats of the control group, SCI induction group and SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group, A is a control group, B is SCI induction group, C represents SCI induction / oral mucosa stem cell transplant group.
  • the present inventors came to pay attention to oral mucosal stem cells, while performing various studies to develop a method for treating neurogenic bladder using stem cells.
  • Oral mucosal stem cells which are a type of adult stem cells, exist in the adult gum region, and have the highest differentiation ability among the various adult stem cells known to date, and unlike the bone marrow or umbilical cord blood, the burden of the donor is small, and like pluripotent cells. There is no risk of gene incorporation, making it an ideal stem cell resource.
  • the present inventors attempted to verify the therapeutic effect of the oral mucosal stem cells in neurogenic bladder caused by spinal cord injury.
  • an animal model of a spinal cord injury animal model and an oral mucosal stem cell transplanted into an injured spinal cord region of the animal model was prepared, respectively, and the effects of the oral mucosal stem cells on the symptoms of neurogenic bladder caused by spinal cord injury.
  • SMA was reduced in spinal cord injury lesions and thereby increased bladder pressure and contraction time, suppressed apoptosis in spinal cord tissue due to spinal cord injury, and decreased expression due to spinal cord injury.
  • Expression levels of - ⁇ and Ki67 were restored, and it was confirmed that c-Fos and NGF expression induced by spinal cord injury in neuronal urination were suppressed.
  • oral mucosal stem cells were found to have the effect of treating neurogenic bladder caused by spinal cord injury.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder, comprising oral mucosal stem cells as an active ingredient as one embodiment.
  • oral mucosa stem cell refers to a kind of adult stem cells present in the mucosal area of the gum of the animal, also referred to as "tooth stem cells".
  • the oral mucosal stem cells are known to be the most differentiated adult stem cells so far, and unlike the bone marrow or umbilical cord blood, the burden of the provider is less, and there is no risk of gene incorporation like pluripotent cells are known to be an ideal stem cell resource. .
  • neurogenic bladder of the present invention, also referred to as “neurogenic bladder”, refers to a disease showing the bladder and urethral abnormalities accompanying the development of various neurological diseases.
  • the neurological disease causes abnormalities of the central nervous system related to the urination part, the neural signals connected to the urination part are abnormally transmitted, so that the neurogenic bladder is a symptom, which is reflexively strong and sudden urinary irrespective of his urination doctor.
  • Urinating and unbearable urinary urinary feelings urgent urinary incontinence that is unbearable if urinating, urinating urine more than 8 times a day, night urination often during urination at night, difficulty urination, Urination disorders, pyelonephritis, and so on.
  • the causative neurological disease causing the neurogenic bladder is not particularly limited thereto, but may be most neurological diseases, preferably stroke, Parkinson's disease, dementia, multiple sclerosis, myelitis, spinal cord, which are neurologically abnormal.
  • Traum, spinal dysplasia, spinal disc or stenosis, cervical cancer surgery, rectal cancer surgery, etc. can be due to peripheral nerve disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder comprising oral mucosal stem cells as an active ingredient, and a method for treating neurogenic bladder using the pharmaceutical composition. It is not known and was first developed by the inventor.
  • the pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder of the present invention is a kind of cell therapy comprising live oral mucosal stem cells as an active ingredient, it further comprises a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of cell therapy.
  • a suitable carrier excipient or diluent commonly used in the manufacture of cell therapy.
  • examples include sterile water, physiological saline, conventional buffers (phosphate, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (ascorbic acid, etc.), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives. can do.
  • saline phosphate buffered saline
  • PBS phosphate buffered saline
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably prepared in a formulation suitable for injection, and for this purpose, the oral mucosa stem cells are preferably dissolved in a pharmaceutically acceptable aqueous solution or kept in a frozen form in solution.
  • the composition may further comprise a carrier for pharmaceutically acceptable purposes, which can be used to suspend or dilute oral mucosal stem cells.
  • a carrier for pharmaceutically acceptable purposes, which can be used to suspend or dilute oral mucosal stem cells.
  • distilled water, physiological saline, PBS, etc. are mentioned, for example.
  • Formulation carriers and excipients necessary for taking the form of pharmaceutical preparations may further contain stabilizers and anti-adsorption agents, and formulations may also be used as injections (subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, etc.), Pain-free agents can be used that can reduce pain upon injection, and suitable devices can be used as needed.
  • it may be filled in the form of a final injection in a syringe or device, in the form of a cryoial that can be frozen, or in the form of a pyrogen-free glass bottle and rubber field, which can contain liquid medicine, and an aluminum cap.
  • a syringe, a multi-syringe, or the like may be preferably used, and more preferably, a needle may be used to minimize pain without damaging the cells while the cells are being administered.
  • a needle may be used to minimize pain without damaging the cells while the cells are being administered.
  • a material that the syringe or device does not affect cell viability.
  • the content of the oral mucosa stem cells included in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be included in an amount of 10 to 50% by weight, more preferably 20 to 40% by weight based on the total weight of the final composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention to treat or prevent a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention
  • Sufficient amount means an effective dose level means the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration of the composition of the invention used, the route of administration and the rate of excretion treatment Period of time, factors including drugs used in combination or coincidental with the compositions of the invention used, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to one or a plurality of places (for example, 2 to 50 places) to the surviving muscle (skeletal muscle or myocardium) around the damaged spinal cord region, for example, and the dosage may be Preferably it may be 1.0 * 10 ⁇ 5> -1.0 * 108 cell number / kg (body weight), More preferably, it may be 1.0 * 10 ⁇ 6> -1.0 * 107 cell number / kg (body weight).
  • the present invention provides a method for treating neurogenic bladder comprising administering the pharmaceutical composition to a subject having a neurogenic bladder in a pharmaceutically effective amount.
  • the oral mucosal stem cells provided by the present invention when implanted in the damaged spinal cord region, it may have an effect of treating or improving neurogenic bladder which is a kind of neurological disease caused by spinal cord injury.
  • the pharmaceutical composition can be used to treat neurogenic bladder.
  • the term "individual” includes without limitation mammals including rats, livestock, humans, and the like, which have developed neurogenic bladder.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition may be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously or intradermally, as desired.
  • the composition may be administered by any device in which the active substance may migrate to the target cell.
  • the treatment method of the present invention can be carried out alone or in combination with other standard or advanced therapies.
  • it is also suitable to combine the treatment method of the neurogenic bladder of the present invention with a surgical method.
  • By using the treatment of the present invention in combination it is possible to actively improve the bladder function and to shorten the pathology.
  • the present invention provides the use of oral mucosal stem cells for use in the preparation of the pharmaceutical composition for treating neurogenic bladder.
  • Samples were obtained from the oral mucosa of rats (weight: 260 ⁇ 10 g; age: 13 weeks old) within 1 hour after surgical excision.
  • the isolated tissue was cut into three pieces of 1-2 mm size, washed with DPBS (Ca21-Mg21-free Dulbecco's PBS), and then treated with 3 mg / ml type 1 collagenase 1 at 37 ° C.
  • the reaction was carried out for hours to enzymatically degrade.
  • the sample was applied to a 40 ⁇ m cell strainer and filtered, centrifuged at 1,300 rpm for 3 minutes, and the precipitated cells were collected.
  • the cells were cultured in low glucose DMEM medium containing 10% heat-inactivated FBS, 1% penicillin / streptomycin and 1% gentamycin. To use together in all experiments, cells of the same group were collected to form one cell population.
  • Rats were reared under a feeding temperature of 23 ⁇ 2 ° C. and photoperiod conditions from 08:00 to 20:00, with feed and water optionally provided.
  • the rats were divided into three groups of 10 rats in each group as follows: sham-operation group, SCI-induced group and SCI-induced / oral mucosal stem cell transplant group (SCI-induced and oral). mucosa stem cell transplantation group).
  • control group was a rat that did not perform spinal cord injury and oral mucosa transplantation.
  • the SCI induction group was anesthetized during surgery by inhaling the rats with isoflurane (2% isoflurane, 30% O2 and 70% N2, JW Pharmaceutical Corporation, Kyung-Gi, Korea).
  • the skin in the T10-T12 region was incised through a 2.5 cm median incision, and the thoracic vertebral column and the spinous process in the T11 region were exposed by incision.
  • the spinous process of the T11 region is lifted with a drill to approach the verebral arch area, and a hole of 2 mm depth is formed at the surface of the pubis using an incision drill (diameter: 1 mm).
  • a 22 gauge needle was used to damage the spinal cord, and the skin was stitched layer by layer.
  • Body temperature was maintained at 36 ⁇ 0.5 ° C. during surgery using a homeothermic blanket control unit (Harvard Apparatus, Massachusetts, Mass.). After surgery, the experimental animals were monitored for an additional 2 hours to use rats that prevented hypothermia.
  • the SCI-induced / oral mucosal stem cell transplant group used a 22-gauge insert vein (IV) catheter, ETFE0120, Sewon Med Co. Ltd, Seoul, Korea). 100 ⁇ l of oral mucosa stem cells were injected for at least 1 minute. After infusion, the catheter was left for an additional 3 minutes, then removed, and rats were further subjected to a procedure in which the hole was closed.
  • IV insert vein
  • Bladder function was evaluated by bladder pressure measurement at 21 days after SCI induction, according to known methods [8,20].
  • the rat Zoletil 50 ® were anesthetized with (10 mg / kg, ip Vibac Laboratories, Carros, France).
  • Sterile polyethylene catheter (PE50) was inserted into the urethra through the bladder dome.
  • the catheter is connected to a pressure transducer (pressure transducer, Harvard Apparatus, Holliston, MA) and a syringe (syringe pump, Harvard Apparatus) through a three-way stopcock to record bladder internal pressure, and into the bladder.
  • Physiological saline was injected. After emptying the bladder, 0.5 ml physiological saline was injected and bladder pressure measurement was performed.
  • Bladder contraction pressure and contraction time were monitored using LabScribe (iWork System Inc., Dover, NH) (FIG. 1).
  • FIG. 1 is a graph comparing the export pressure and contraction time in the bladder in rats of the control group, the SCI induction group and the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group, where A represents the control group and B represents the SCI induction group. , C represents the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • the contraction pressure in the control group is 2.55 ⁇ 0.22 cmH 2 O;
  • the contraction pressure in the SCI induction group was 6.49 ⁇ 0.77 cmH 2 O;
  • the contraction pressure in the SCI-induced / oral mucosal stem cell transplant group was 3.05 ⁇ 0.14 cmH 2 O.
  • Contraction time in the control group was 8.09 ⁇ 0.43 sec; Contraction time in the SCI induction group was 15.29 ⁇ 1.65 sec; The contraction time in the SCI-induced / oral mucosal stem cell transplant group was 13.36 ⁇ 0.40 sec.
  • the contraction pressure and contraction time in the bladder increased by SCI induction, but the implantation of oral mucosal stem cells into the insult area could alleviate the contraction pressure and contraction time induced by SCI. there was.
  • Rats of each experimental group were anesthetized using Zoletil 50® ( 10 mg / kg, ip; Vibac Laboratories), perfused using 50 mM PBS, and 100 mM phosphate buffer containing 4% paraformaldehyde (phosphate). buffer, PB, pH 7.4).
  • the brain and spinal cord were dissected, postfixed overnight with the same fixative, and then transferred to 30% sucrose solution for cryoprotection.
  • a freezing microtome Leica, Nussloch, Germany
  • a coronal section of a 40 ⁇ m thick brain and a transverse section of a 20 ⁇ m thick spinal cord were prepared. On average, 10 cut fragments were collected for each region in each rat.
  • the spinal cord was selected from the region between T10 and T12 of the spinal cord.
  • the PMC was selected from the region between Bregma -9.68 and -9.80 mm
  • the ventrolateral PAG (vlPAG) was selected from the region between Bregma -7.64 and -8.00 mm
  • the MPA was between Bregma -0.26 and 0.80 mm
  • the spinal cord was selected from the L4-L5 region.
  • hematoxylin / eosin (H & E) staining was performed.
  • the slide glass was immersed in hematoxylin solution (Mayer's hematoxylin) for 30 seconds, washed with running water until clear, then immersed in eosin solution for 30 seconds, and washed again with water.
  • the slide glass was air dried at room temperature, then immersed twice in 95% ethanol, twice in 100% ethanol, twice in a solution consisting of 50% ethanol and 50% xylene and twice in 100% xylene.
  • the cover slide glass was installed using Permount® ( Fisher Scientific, New Jersey, NJ) (FIG. 2).
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of performing hematoxylin / eosin (H & E) staining on spinal cords selected from rats of the control group, the SCI induction group, and the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group, and A represents the control group.
  • B represents an SCI induction group
  • C represents an SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • H & E hematoxylin / eosin
  • TUNEL staining was performed using an in situ cell death detection kit ( Roche, Mannheim, Germany). The fragment was post-fixed with ethanol-acetic acid solution (2: 1) and washed. Then, the fragment was treated with proteinase K (100 ⁇ g / ml), washed, treated with 3% H 2 O 2, permeated with 0.5% Triton X-100, washed again, and treated with a TUNEL reaction mixture. The fragments were washed and visualized using Converter-POD with 0.03% DAB (3,3'-diaminobenzidine).
  • Figure 3 is a photograph and graph showing the results of performing TUNEL staining on the spinal cord tissue selected from rats of the control group, SCI induction group and SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group
  • A is the control group
  • B is SCI Induction group
  • C represents SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • the number of TUNEL-positive cells in the control group was 4.84 ⁇ 0.62 per fragment
  • the number of TUNEL-positive cells in the SCI induction group was 44.92 ⁇ 5.21 per fragment
  • SCI induced / oral mucosal stem cell transplantation The number of TUNEL-positive cells in the group was found to be 30.92 ⁇ 4.60 per fragment.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of immunofluorescence staining on spinal cord tissue selected from rats of the control group, the SCI induction group and the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group, A is the control group, B is SCI induction Group represents, and C represents the SCI induced / oral mucosal stem cell transplant group.
  • the oral mucosa stem cells were shown to increase the expression level of SMA- ⁇ and Ki67 compared to the SCI induction group.
  • Example 7 Effect of Oral Mucosal Stem Cells on the Number of c-Fos-positive Cells in Neurodeterminants
  • c-Fos The expression level of c-Fos was determined by immunohistochemical analysis. After reacting overnight by adding rabbit anti-c-Fos antibody (Santa Cruz Biotechnology) diluted 1: 1000 to the free-floating tissue fragment, the biotin-coupled anti-mouse secondary antibody (Vector Laboratories) The reaction was added for 1 hour. Subsequently, avidin-biotin-peroxidase complex (Vector Laboratories) was added to the fragment and reacted at room temperature for 1 hour. The immunoreactivity was visualized by adding 50 mM Tris buffer (pH 7.6) containing 0.05% DAB and 0.01% H 2 O 2 to the fragment for about 3 minutes to react.
  • Tris buffer pH 7.6
  • the fragments were then washed three times with PBS and placed in gelatin coated slide glass.
  • the slide glass was air dried at room temperature and a cover slide glass was installed using Permount® ( Fisher Scientific, New Jersey, NJ) (FIG. 5).
  • Permount® Fisher Scientific, New Jersey, NJ
  • the number of c-Fos-positive cells in the neuronal urinary tract (MPA, PAG, PMC, and spinal cord L4-L5) was counted half-area through an optical microscope.
  • the spinal cord and neuronal urinary area in each fragment were measured by an image analyzer coupled to an optical microscope.
  • PAG it was measured in the abdominal side region (vlPAG) of the tail-shaped PGA (caudal PGA) of PAG.
  • Figure 5 is a photograph and graph showing the results of comparing the expression level of c-Fos in the rats of the control group, SCI induction group and SCI induction / buccal mucosa stem cell transplant group
  • A is a control group
  • B represents the SCI induction group
  • C represents the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • the number of c-Fos-positive cells in the medial preoptic nucleus (MPA) region is 33.69 ⁇ 4.15 per fragment in the control group, 74.07 ⁇ 5.43 per fragment in the SCI induction group, SCI induction / oral mucosa
  • the stem cell transplant group had 52.46 ⁇ 3.16 per fragment.
  • the number of c-Fos-positive cells in the vlPAG region was 33.38 ⁇ 2.37 per fragment in the control group, 92.61 ⁇ 4.10 per fragment in the SCI induction group, and 64.84 ⁇ 4.30 per fragment in the SCI induced / oral mucosal stem cell transplant group. It was.
  • the number of c-Fos-positive cells in the pontine micturition center (PMC) region was 21.46 ⁇ 1.45 per fragment in the control group, 60.00 ⁇ 1.87 per fragment in the SCI-induced group, and fragments in the SCI-induced / oral mucosal stem cell transplant group. 40.38 ⁇ 1.97 pcs.
  • the number of c-Fos-positive cells in the spinal cord L4-L5 region was 16.69 ⁇ 0.97 per fragment in the control group, 46.15 ⁇ 3.21 per fragment in the SCI induction group and 34.69 per fragment in the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group. It was confirmed that ⁇ 1.73 pieces.
  • NGF NGF-derived neurotrophic factor
  • Anti-NGF antibody Santa Cruz Biotechnology
  • mice diluted 1: 1000 was added to the free-floating tissue fragments and reacted overnight. Then, the fragments were added with anti-mouse secondary antibody (Vector Laboratories). The reaction was carried out for hours. Subsequently, avidin-biotin-peroxidase complex was added to the fragment and reacted at room temperature for 1 hour. The immunoreactivity was visualized by adding 50 mM Tris buffer (pH 7.6) containing 0.05% DAB and 0.01% H 2 O 2 to the fragment for about 3 minutes to react. The fragments were then washed three times with PBS and placed in gelatin coated slide glass.
  • the slide glass was the cover slide glass and air-dried at room temperature, using Permount ® (FIG. 6). At this time, the number of NGF-positive cells in the hard urination area was counted by the optical microscope to the half lateral area. The spinal cord and neuronal urinary area in each fragment were measured by an image analyzer coupled to an optical microscope.
  • Figure 6 is a photograph and graph showing the results of comparing the expression level of NGF in the rats of the control group, SCI induction group and SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group, A is a control group, B is SCI induction group, C represents SCI induction / oral mucosa stem cell transplant group.
  • the number of NGF-positive cells in the MPA region was 40.61 ⁇ 1.65 per fragment in the control group, 84.53 ⁇ 4.97 per fragment in the SCI induction group, and per fragment in the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group. 56.76 ⁇ 3.77 pieces.
  • the number of NGF-positive cells in the vlPAG region was 50.15 ⁇ 3.05 per fragment in the control group, 103.38 ⁇ 6.49 per fragment in the SCI induction group and 88.15 ⁇ 5.40 per fragment in the SCI induced / oral mucosal stem cell transplant group.
  • the number of NGF-positive cells in the PMC region was 32.15 ⁇ 2.06 per fragment in the control group, 61.84 ⁇ 3.88 per fragment in the SCI induction group and 43.69 ⁇ 2.88 per fragment in the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group.
  • the number of NGF-positive cells in the spinal cord L4-L5 region was 17.53 ⁇ 1.17 per fragment in the control group, 42.76 ⁇ 1.23 per fragment in the SCI induction group, and 30.46 ⁇ 2.09 per fragment in the SCI induction / oral mucosal stem cell transplant group. It was confirmed that the game.

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Abstract

본 발명은 구강점막 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 이용하여 신경인성 방광증을 치료하는 방법 및 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물의 제조에 사용되는 구강점막 줄기세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 구강점막 줄기세포를 포함하는 약학 조성물을 이용하면, 척수손상에 의해 유래된 신경질환의 일종인 신경인성 방광증을 치료 또는 개선시키는 효과를 나타낼 수 있으므로, 척수손상에 의해 파생된 이차성 신경질환의 보다 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신경인성 방광증 치료용 약학 조성물
본 발명은 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 구강점막 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물, 상기 약학 조성물을 이용하여 신경인성 방광증을 치료하는 방법 및 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물의 제조에 사용되는 구강점막 줄기세포의 용도에 관한 것이다.
방광은 소변의 저장과 배출을 담당하는 속이 빈 주머니 같은 근육기관으로서, 골반 내, 두덩결합(치골결합) 뒤쪽에 위치하고, 아래로는 요도, 위로는 요관과 연결되며, 남성은 방광하부에 전립선이 연결된다. 상기 방광은 400~500cc 정도까지의 소변을 저장하고, 신경신호에 따라 저장된 소변을 요도를 통하여 배출하게 된다. 이러한 방광의 기능이 손상될 경우, 다양한 방광질환이 유발되는데, 이러한 방광 기능손상의 원인은 크게 두가지로 구분될 수 있다. 하나는 외부 감염에 의한 기능손상이고, 다른 하나는 신체적 이상에 의한 기능손상이다. 이 중에서 신체적 이상에 의한 기능손상은 방광자체의 이상에 의한 것과 신경손상에 의한 것으로 구분될 수 있다.
신경손상에 의한 방광의 기능손상으로 인한 대표적인 질환으로는 과민성 방광증후군을 들 수 있는데, 이는 환자의 심리적 또는 병리적 요인으로 인하여 방광기능이 너무 예민해서 방광에서 소변을 저장하는 동안 방광근육이 비정상적으로 자주 수축하여 급하게 요의를 느끼고, 소변을 자주 보게되는 질환을 의미한다. 상기 과민성방광증후군의 일반적인 증상으로는 소변을 하루 8회 이상 자주 보는 빈뇨, 한번 소변이 마려우면 참기 힘든 절박뇨, 밤에 소변을 보기 위해 2회 이상 일어나는 야간빈뇨, 갑자기 참을 수 없는 요의를 느끼면서 소변이 새는 절박성 요실금 증세 등을 들 수 있다. 이러한 과민성 방광증후군을 치료하기 위하여는 대체로 약물요법과 행동치료를 일반적으로 병행하는 것이 효과적임이 알려져 있다. 상기 약물요법에 사용되는 치료제로는 무스카린 수용체 안타고니스트(WO 2003/080599)와 같은 화합물이 개발되었고, 보다 안전성을 향상시키기 위하여 호박씨오일 또는 호박씨추출물, 대두추출물 및 마그네슘을 주성분으로 포함하는 천연 생약 조성물(한국특허등록 제1362539호) 등이 개발되어 사용되고 있다. 또한, 행동치료의 대표적인 예로는 방광훈련을 들 수 있는데, 이는 소변이 마려운 것을 참아 배뇨 간격을 조금씩 늘려가는 방법이다.
상기 과민성 방광증후군의 일종으로 알려진 신경인성 방광증은 척수손상(spinal cord injury, SCI)과 같은 다양한 원인에 의한 신경질환이 발병됨에 따라 수반되는 방광과 요도이상을 나타내는 질환을 의미한다. 상기 신경질환이 배뇨부와 관련된 중추신경계의 이상을 초래할 경우, 배뇨부로 연결된 신경신호가 비정상적으로 전달되므로, 상기 신경인성 방광증은 유발되는 것으로 알려져 있는데, 이러한 신경인성 방광증은 본질적으로 신경질환에 의한 파생질환이기 때문에, 지금까지 알려진 방법으로 과민성 방광증후군을 치료한다 하여도, 짧은 시간내에 재발하는 것으로 알려져 있어, 이에 대한 치료방법의 개발이 요구되어 왔다.
한편, 근래에 들어 각광받고 있는 줄기세포 치료법은 생체내의 손상된 조직에 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화된 세포를 가하여, 손상된 조직을 대체함으로써 상기 손상된 조직으로 인하여 유발되는 질환을 근본적으로 치료하는 방법이며, 이에 따라 줄기세포를 목적하는 조직의 세포로 분화시키기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 상기 줄기세포 치료법을 사용할 경우, 신경인성 방광증을 유발하는 원인이 되는 신경질환을 치료함으로써 결과적으로 신경인성 방광증을 치료하는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
본 발명자들은 줄기세포를 이용하여 신경인성 방광증을 치료하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 구강점막 줄기세포를 신경인성 방광증의 원인이 되는 손상된 척수에 이식할 경우, 손상된 척수가 회복되어, 결과적으로 신경인성 방광증을 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 구강점막 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 신경인성 방광증이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경인성 방광증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 상기 구강점막 줄기세포의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 구강점막 줄기세포를 포함하는 약학 조성물을 이용하면, 척수손상에 의해 유래된 신경질환의 일종인 신경인성 방광증을 치료 또는 개선시키는 효과를 나타낼 수 있으므로, 척수손상에 의해 파생된 이차성 신경질환의 보다 효과적인 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 대조군, 척수손상(SCI) 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트를 대상으로 방광에서의 수출압력과 수축시간을 비교한 그래프로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다.
도 2는 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에서 선별된 척수를 대상으로 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다.
도 3은 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에서 선별된 척수조직을 대상으로 TUNEL 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다.
도 4는 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에서 선별된 척수조직을 대상으로 면역형광염색을 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다.
도 5는 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에 유래된 신경성 배뇨부에서 c-Fos의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다.
도 6은 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에 유래된 신경성 배뇨부에서 NGF의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다.
본 발명자들은 줄기세포를 이용하여 신경인성 방광증을 치료하는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 구강점막 줄기세포에 주목하게 되었다. 성체줄기세포의 일종인 구강점막 줄기세포는 성체의 잇몸부위에 존재하는데, 지금까지 알려진 다양한 성체 줄기세포 중에서 가장 분화능이 우수하고, 골수 또는 제대혈과는 달리 제공자의 부담이 적으며, 만능세포와 같이 유전자 혼입 리스크도 없어 이상적인 줄기세포 자원이라고 알려져 있다. 본 발명자들은 척수손상으로 인하여 유발된 신경인성 방광증을 대상으로 상기 구강점막 줄기세포의 치료효과를 검증하고자 하였다. 구체적으로, 척수손상 동물모델과 상기 동물모델의 손상된 척수부위에 구강점막 줄기세포를 이식한 동물모델을 각각 제작하고, 상기 구강점막 줄기세포가 척수손상으로 인한 신경인성 방광증의 증상에 미치는 영향을 분석한 결과, 척수손상 병변 및 그에 의해 증가된 방광에서의 수축압력과 수축시간이 완화되고, 척수손상으로 인한 척수조직에서의 세포자멸(apoptosis)이 억제되며, 척수손상으로 인하여 발현이 감소된 SMA-α 및 Ki67의 발현수준이 회복되고, 신경성 배뇨부에서 척수손상에 의해 유도된 c-Fos 및 NGF 발현이 억제됨을 확인하였다.
따라서, 구강점막 줄기세포는 척수손상으로 인한 신경인성 방광증을 치료하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 구강점막 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "구강점막 줄기세포(oral mucosa stem cell)"란, 동물의 잇몸의 점막부위에 존재하는 성체줄기세포의 일종을 의미하고, "치아줄기세포"라고도 지칭된다. 상기 구강점막 줄기세포는 지금까지 알려진 성체줄기세포 중에서 가장 분화능이 우수하다고 알려져 있고, 골수 또는 제대혈과는 달리 제공자의 부담이 적으며, 만능세포와 같이 유전자 혼입 리스크도 없어 이상적인 줄기세포 자원이라고 알려져 있다.
본 발명의 용어 "신경인성 방광증(neurogenic bladder)"이란, "신경인성 방광"이라고도 하며, 다양한 신경질환이 발병됨에 따라 수반되는 방광과 요도이상을 나타내는 질환을 의미한다. 상기 신경질환이 배뇨부와 관련된 중추신경계의 이상을 초래할 경우, 배뇨부로 연결된 신경신호가 비정상적으로 전달되므로, 상기 신경인성 방광증은 증상으로서, 자신의 배뇨의사와는 관계없이 반사적으로 강하고 갑작스런 요의(오줌이 마려운 느낌)를 느끼면서 소변이 마렵고 참을 수 없는 요절박, 소변이 마려우면 참지 못하고 싸는 절박성 요실금, 하루 8회 이상 소변을 보는 빈뇨, 야간 수면 시간에 배뇨를 자주 하는 야간뇨, 배뇨곤란, 배뇨장애, 신우신염 등이 될 수 있다.
상기 신경인성 방광증을 유발하는 원인적 신경질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 대부분의 신경질환이 될 수 있고, 바람직하게는 신경학적으로 이상이 있는 뇌졸중, 파킨슨병, 치매, 다발성경화증, 척수염, 척수손상, 척수이형성증, 척추디스크나 협착증, 자궁암수술, 직장암수술 등에 따른 말초신경질환 등이 될 수 있다.
본 발명에서는 구강점막 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 이용하여 신경인성 방광증을 치료하는 방법을 제공하는데, 이러한 약학 조성물 및 치료방법은 지금까지 전혀 알려져 있지 않으며, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 배양된 구강점막 줄기세포를 척수손상이 유도된 랫트의 이식한 결과, 척수손상에 의해 증가된 방광에서의 수축압력과 수축시간이 완화되고(도 1), 척수손상으로 인한 병변이 구강점막 줄기세포 이식을 통하여 완화되며(도 2), 척수손상으로 인한 척수조직에서의 세포자멸(apoptosis)이 구강점막 줄기세포의 이식을 통해 억제되고(도 3), 척수손상으로 인하여 척수 조직에서 발현이 감소된 SMA-α 및 Ki67의 발현수준이 구강점막 줄기세포의 이식을 통해 증가되며(도 4), 신경성 배뇨부에서 c-Fos(도 5) 및 NGF(도 6)의 발현이 척수손상에 의해 증가되었으나, 구강점막 줄기세포의 이식은 신경성 배뇨부에서 척수손상에 의해 유도된 c-Fos 및 NGF 발현을 억제함을 알 수 있었다.
한편, 본 발명의 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물은 살아있는 구강점막 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 일종이므로, 세포치료제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위하여는, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시켜서 제형화 할 수도 있다. 상기 구강점막 줄기세포를 유지하기 위한 기제로는 생리식염수, PBS(phosphate buffered saline) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 주사에 적당한 제형으로 조제됨이 바람직하고, 이를 위해서는, 상기 구강점막 줄기세포를 약학적으로 허용되는 수용액 중에 용해되어 있거나 또는 용액상태에서 동결된 형태로 유지함이 바람직하다. 상기 조성물에는 구강점막 줄기세포를 현탁 또는 희석하기 위해 사용할 수 있는, 약학적으로 허용할 수 있는 목적으로 하는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체로서는, 예를 들면 증류수, 생리식염수, PBS 등을 들 수 있다.
의약제제로서의 형태를 취하기 위해서 필요한 제제담체나 부형제를, 나아가서는 안정화제나 흡착방지제를 함유할 수 있고, 제형도 주사제(피하, 피내, 근육 내, 정맥 내, 복강 내 등)등을 사용할 수 있으며, 주사 시 통증을 감소시킬 수 있는 무통화제를 사용할 수 있고, 필요에 따라 적당한 디바이스를 사용할 수 있다.
구체적인 제형으로서, 주사기나 디바이스에 담겨진 최종 주입 형태, 냉동이 가능한 크라이오바이알(cryovial)의 형태, 또는 액상의약품을 담을 수 있는 파이로젠이 없는 유리병과 고무전, 알루미늄 캡형태로 충진될 수 있다.
디바이스의 형태로는 바람직하게는 주사기, 멀티실린지 등이 사용될 수 있고, 보다 바람직하게는 세포가 투여되는 동안 세포에 손상을 입히지 않으면서 고통을 최소화 할 수 있는 주사바늘(needle)을 이용하며 가장 바람직하게는 20 내지 31 guage 범위에서 투여할 부위나 근육의 깊이를 고려하여 사용하며, 실린지나 디바이스가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 소재를 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 구강점막 줄기세포의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 10 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 20 내지 40 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 손상된 척수부위 주변의 생존근(골격근 또는 심근 등)에 1개소 또는 복수 개소(예를 들면 2~50개소)에 투여할 수 있으며, 투여량은 바람직하게는 1.0 × 105 내지 1.0 × 108 세포수/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0 × 106 내지 1.0 × 107 세포수/kg(체중)이 될 수 있다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 신경인성 방광증이 유발된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경인성 방광증의 치료방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 구강점막 줄기세포를 손상된 척수부위에 이식할 경우, 척수손상에 의하여 유발되는 신경질환의 일종인 신경인성 방광증을 치료 또는 개선시키는 효과를 나타낼 수 있으므로, 상기 약학 조성물은 신경인성 방광증을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어 "개체"란 신경인성 방광증이 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 신경인성 방광증을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 피내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은, 단독 내지 다른 스탠다드(standard) 내지 선진적인 치료법과의 조합으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 신경인성 방광증의 치료방법을 외과적인 수술방법과 조합하는 것도 적합하다. 본 발명의 치료법을 합하여 사용함으로써, 방광기능의 적극적인 개선, 병상기간의 단기화가 가능해진다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 구강점막 줄기세포의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 구강점막 세포의 배양
수술적 절체후 1시간 이내에 랫트(체중: 260 ± 10 g; 연령: 13 주령)의 구강점막으로부터 시료를 수득하였다. 분리된 조직을 1-2 mm 크기의 세개의 조각으로 절단하고, DPBS(Ca21-Mg21-free Dulbecco's PBS)로 세척한 다음, 3 mg/㎖의 제1형 콜라겐분해효소를 처리하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서 효소적으로 분해시켰다. 상기 시료를 40 ㎛ 세포 스트레이터에 적용하여 여과하고, 1,300 rpm으로 3분동안 원심분리한 다음, 침전된 세포를 수집하였다. 상기 세포를 10% 열처리된(heat-inactivated) FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin) 및 1% 겐타마이신(gentamycin)이 포함된 저농도 글루코스 DMEM 배지에서 배양하였다. 모든 실험에 함께 사용하도록, 동일 군의 세포를 모아서 하나의 세포집단을 형성하였다.
실시예 2: 실험동물의 준비
260 ± 10 g의 체중을 갖는 성체(13 주령) 웅성 Sprague-Dawley 랫트를 실험에 사용하였다. 실험방법은 국립보건원(National Institutes of Health, NIH)과 대한의학회(Korean Academy of Medical Sciences)에서 제공하는 동물관리지침(animal care guideline)에 따라 수행하였다. 상기 랫트를 23 ± 2℃의 사육온도 및 08:00 내지 20:00 시의 광주기 조건하에서, 사료 및 물을 임의로 제공하면서 사육하였다. 상기 랫트를 각 그룹당 10마리씩 3개 그룹으로 다음과 같이 분할하였다: 대조군(sham-operation group), SCI 유도군(SCI-induced group) 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군(SCI-induced and oral mucosa stem cell transplantation group).
먼저, 상기 대조군은 척수손상유도 및 구강점막세포의 이식을 수행하지 않은 랫트를 사용하였다.
다음으로, SCI 유도군은 상기 랫트를 이소플루란(2% isoflurane, 30% O2 및 70% N2, JW Pharmaceutical Corporation, Kyung-Gi, Korea)을 흡입시켜서 수술중에 마취시켰다. T10-T12 영역의 피부를 2.5 cm 정중절개술을 통하여 절개하고, 흉부척주(thoracic vertebral column)와 T11 영역의 극돌기(spinous process)를 절개에 의해 노출시켰다. 절개 후, 상기 T11 영역의 극돌기를 드릴을 이용하여 들어올려서 추골궁 영역(vertebral arch area)에 접근시키고, 절개용 드릴(직경: 1mm)을 이용하여 추골궁의 표면에서 2mm 깊이의 구멍을 형성한 다음, 22 gauge 바늘을 이용하여 척수를 손상시키고, 상기 피부를 층별로 봉합시켰다. 몸과 머리를 감싸는 장치(homeothermic blanket control unit, Harvard Apparatus, Massachusetts, MA)를 사용하여 수술중에 체온을 36 ± 0.5℃로 유지시켰다. 수술후, 상기 실험동물을 추가로 2시간동안 모니터링하여 저체온증을 방지한 랫트를 사용하였다.
끝으로, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군은 상기 SCI 유도군의 랫트에 22-gauge 삽입형 정맥(IV) 카테터(insert vein(IV) catheter, ETFE0120, Sewon Med Co. Ltd, Seoul, Korea)를 이용하여 100 ㎕의 구강점막 줄기세포를 1분 이상의 시간동안 주입하였다. 주입후, 상기 카테터를 추가로 3분 동안 잔류시키고, 제거한 다음, 상기 구멍을 폐쇄시킨 시술을 추가로 수행한 랫트를 사용하였다.
실시예 3: 방광에서 수축압력 및 수축시간에 미치는 구강점막 줄기세포의 효과
방광 기능은 공지된 방법[8,20]에 따라, SCI 유발후 21일이 경과된 시점에서 방광내압측정에 의해 평가하였다. 상기 랫트를 Zoletil 50®(10 mg/kg, i.p.; Vibac Laboratories, Carros, France)으로 마취시켰다. 멸균된 폴리에틸렌 카테터(PE50)를 방광원개(bladder dome)를 통해 요도로 삽입시켰다. 상기 카테터를 3방활전(three-way stopcock)을 통해 압력변환기( pressure transducer, Harvard Apparatus, Holliston, MA)와 자동주사기(syringe pump, Harvard Apparatus)에 연결하여, 방광내압을 기록하고, 방광내부로 생리식염수를 주입하였다. 방광을 비운 후, 0.5 ㎖ 생리식염수를 주입하여 방광내압측정을 수행하였다. 방광의 수축압력과 수축시간을 LabScribe(iWork System Inc., Dover, NH)를 사용하여 모니터링하였다(도 1).
도 1은 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트를 대상으로 방광에서의 수출압력과 수축시간을 비교한 그래프로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다. 도 1에서 보듯이, 대조군에서의 수축압력은 2.55 ± 0.22 cmH2O 이고; SCI 유도군에서의 수축압력은 6.49 ± 0.77 cmH2O 이며; SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서의 수축압력은 3.05 ± 0.14 cmH2O 이었다. 대조군에서의 수축시간은 8.09 ± 0.43초 이고; SCI 유도군에서의 수축시간은 15.29 ± 1.65초 이며; SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서의 수축시간은 13.36 ± 0.40초 임을 확인하였다.
따라서, 방광에서의 수축압력과 수축시간은 SCI 유도에 의해 증가하였으나, 손상부위(insult area)로의 구강점막 줄기세포의 이식은 SCI에 의해 유도된 수축압력과 수축시간을 완화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 척수조직에서 조직학적 변화에 미치는 구강점막 줄기세포의 효과
상기 각 실험군의 랫트를 Zoletil 50®(10 mg/kg, i.p.; Vibac Laboratories)을 사용하여 마취시키고, 50 mM PBS를 사용하여 경심관류시켰으며, 4% 파라포름알데히드를 포함하는 100mM 인산염 완충액(phosphate buffer, PB, pH 7.4)을 이용하여 고정시켰다. 뇌와 척수를 절개하고, 동일한 고정액으로 하룻밤동안 후고정시킨 다음, 동결보호를 위하여 30% 수크로스 용액으로 옮겼다. 동결 마이크로톰(freezing microtome, Leica, Nussloch, Germany)을 이용하여, 40 ㎛ 두께의 뇌의 관상단면(coronal section)과 20㎛ 두께의 척수의 가로단면(transverse section)을 제작하였다. 각 랫트에서 각 영역별로 평균 10개의 절단된 단편을 수집하였다. SCI의 회복을 위하여(회복여부를 확인하기 위하여?), 척수의 T10 내지 T12 사이의 영역으로부터 선별하였다. 추가로, 상기 PMC는 Bregma -9.68 내지 -9.80 mm 사이의 영역으로부터 선별하였고, 상기 vlPAG(ventrolateral PAG)는 Bregma -7.64 내지 -8.00 mm 사이의 영역으로부터 선별하였으며, 상기 MPA는 Bregma -0.26 내지 0.80 mm 사이의 영역으로부터 선별하였고, 상기 척수는 L4-L5 영역으로부터 선별하였다.
상기 선별된 척수 조직으로부터 조직학적 변화를 검출하기 위하여, 헤마톡실린/에오신(H & E) 염색을 수행하였다. 슬라이드 글라스를 30초 동안 헤마톡실린 용액(Mayer's hematoxylin)에 침지하고, 깨끗하게 될 때까지 흐르는 물로 세척한 다음, 30초 동안 에오신 용액에 침지하였으며, 다시 물로 세척하였다. 상기 슬라이드 글라스를 실온에서 공기건조시킨 다음, 95% 에탄올에 2회, 100% 에탄올에 2회, 50% 에탄올과 50% 자일렌으로 구성된 용액에 2회 및 100% 자일렌에 2회 침지하였다. 끝으로, Permount®(Fisher Scientific, New Jersey, NJ)를 사용하여 커버슬라이드 글라스를 설치하였다(도 2).
도 2는 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에서 선별된 척수를 대상으로 헤마톡실린/에오신(H&E) 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 대조군에서는 정상적인 척수가 관찰되었고, SCI 유도군에서는 H & E 염색을 통해 배면영역에서 완전하게 손상된 병변이 관찰되었으나, 구강점막 줄기세포의 이식은 SCI-유도성 손상병변을 감소시키고, 새로운 조직이 손상된 조직의 주변에 증가함을 확인하였다.
따라서, 척수손상의 병변을 구강점막 줄기세포를 사용하여 완화시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5: 척수조직에서 TUNEL-양성 세포의 수에 미치는 구강점막 줄기세포의 효과
자멸세포사의 마커인 DNA 분절화를 가시화시키기 위하여, in situ cell death detection kit®(Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여, TUNEL 염색을 수행하였다. 단편을 에탄올-아세트산 용액(2:1)으로 후고정시키고, 세척하였다. 그런 다음, 상기 단편에 proteinase K(100 ㎍/㎖)를 처리하고, 세척한 다음, 3% H2O2로 처리하였으며, 0.5% Triton X-100로 투과시키고, 다시 세척하였으며, TUNEL 반응 혼합액으로 처리하였다. 상기 단편을 세척하고 0.03% DAB(3,3'-diaminobenzidine)이 포함된 Converter-POD를 사용하여 가시화시켰다. 헤마톡실린 용액(Mayer's hematoxylin, DAKO, Glostrup, Denmark)을 사용하여 대조염색하고, 끝으로 상기 단편을 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스에 설치하였다. 상기 슬라이드 글라스를 실온에서 공기건조시키고, Permount®(Fisher Scientific, New Jersey, NJ)를 사용하여 커버슬라이드 글라스를 설치하였다(도 3). 이때, 척수에서 TUNEL-양성 세포의 수는 광학현미경을 통해 반측면적으로(hemilaterally) 계수하였다. 각 단편에서 척수와 신경성 배뇨부의 영역은 광학현미경에 결합된 이미지 분석기(Image-Pro® Plus computer-assisted image analysis system, Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD)를 통해 측정하였다.
도 3은 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에서 선별된 척수조직을 대상으로 TUNEL 염색을 수행한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다. 도 3에서 보듯이, 대조군에서 TUNEL-양성 세포의 수는 단편당 4.84 ± 0.62개 이고, SCI 유도군에서 TUNEL-양성 세포의 수는 단편당 44.92 ± 5.21개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서 TUNEL-양성 세포의 수는 단편당 30.92 ± 4.60개임을 확인하였다.
따라서, 상기 결과는 SCI 유도에 의해 세포자멸이 증가하는 반면, 구강점막 줄기세포의 이식은 SCI 유도성 세포자멸을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 6: 척수 조직에서 SMA-α 및 Ki67의 발현수준에 미치는 구강점막 줄기세포의 효과
SMA-α 및 Ki67을 검출하기 위하여, 면역형광염색을 수행하였다. 이중 형광을 표지하기 위하여, 고정된 조직에 다양한 항체(마우스 항-SMA-α 단클론 항체(1:100, M0851, Dako, Seoul, Korea) 및 토끼의 항-Ki67 다클론 항체(1:100, H-300, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA))를 가하고 36℃에서 2시간 동안 반응시켰다: PBS로 세척한 후, 두가지 유형의 세포에 각각 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG 항체(1:1000, A10677, Invitrogen, Eugene, OR)와 Texas Red goat anti-rabbit IgG 항체(1:1000, T2767, Invitrogen, Eugene, OR)를 가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이중 위치결정을 위하여 PBS는 1% 정상 말 혈청과 Triton X-100를 포함하였다. PBS로 3회 추가세척한 후에, Vectashield medium(H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 이용하여 슬라이드 글라스에 커버글라스를 설치하였다(도 4). 이때, 척수에서 SMA-α 및 Ki67의 영상은 공초점 현미경(Zeiss LSM 700 confocal microscope, Carl Zeiss MicroImaging Inc., Jena, Germany)으로 촬영하였다. 488-nm 및 568-nm 레이저로 자극된 공초점 형광영상을, 각각 녹색 방출필터 및 적색/청색 이중 방출필터를 사용하여 필터링시켰다.
도 4는 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에서 선별된 척수조직을 대상으로 면역형광염색을 수행한 결과를 나타내는 사진으로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 구강점막 줄기세포의 이식이 SCI 유도군의 것에 비하여 SMA-α 및 Ki67의 발현수준을 증가시킴을 보여주었다.
실시예 7: 신경성 배뇨부에서 c-Fos-양성 세포의 수에 미치는 구강점막 줄기세포의 효과
면역조직화학 분석에 의하여 c-Fos의 발현수준을 결정하였다. 자유부유 조직 단편에 1:1000으로 희석된 토끼의 항-c-Fos 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 가하여 하룻밤 동안 반응시킨 다음, 상기 단편에 바이오틴이 결합된 항-마우스 2차항체(Vector Laboratories)를 가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 상기 단편에 아비딘-바이오틴-퍼록시다제 복합체(Vector Laboratories)를 가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 단편에 0.05% DAB 및 0.01% H2O2를 포함하는 50mM Tris 완충액(pH 7.6)을 약 3분 동안 가하여 반응시킴으로써, 면역반응도를 가시화하였다. 그런 다음, 상기 단편을 PBS로 3회 세척하고 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스에 설치하였다. 상기 슬라이드 글라스는 실온에서 공기건조시키고, Permount®(Fisher Scientific, New Jersey, NJ)를 사용하여 커버슬라이드 글라스를 설치하였다(도 5). 이때, 신경성 배뇨부(MPA, PAG, PMC, 및 척수 L4-L5)에서 c-Fos-양성 세포의 수는 광학현미경을 통해 반측면적으로 계수하였다. 각 단편에서 척수와 신경성 배뇨부의 영역은 광학현미경에 결합된 이미지 분석기를 통해 측정하였다. 또한, PAG의 경우에는, PAG의 꼬리형태의 PGA(caudal PGA)의 복부 측면부위(vlPAG)에서 측정하였다.
도 5는 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에 유래된 신경성 배뇨부에서 c-Fos의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, MPA(medial preoptic nucleus) 영역에서 c-Fos-양성 세포의 수는 대조군에서는 단편당 33.69 ± 4.15 개 이고, SCI 유도군에서는 단편당 74.07 ± 5.43 개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서는 단편당 52.46 ± 3.16 개 였다. vlPAG 영역에서 c-Fos-양성 세포의 수는 대조군에서는 단편당 33.38 ± 2.37 개 이고, SCI 유도군에서는 단편당 92.61 ± 4.10 개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서는 단편당 64.84 ± 4.30 개 였다. PMC(pontine micturition center) 영역에서 c-Fos-양성 세포의 수는 대조군에서는 단편당 21.46 ± 1.45 개 이고, SCI 유도군에서는 단편당 60.00 ± 1.87 개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서는 단편당 40.38 ± 1.97 개 였다. 척수 L4-L5 영역에서 c-Fos-양성 세포의 수는 대조군에서는 단편당 16.69 ± 0.97 개 이고, SCI 유도군에서는 단편당 46.15 ± 3.21 개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서는 단편당 34.69 ± 1.73 개임을 확인하였다.
따라서, 신경성 배뇨부에서 c-Fos의 발현이 SCI 유도에 의해 증가되었으나, 구강점막 줄기세포의 이식은 신경성 배뇨부에서 SCI-유도성 c-Fos 발현을 억제함을 알 수 있었다.
실시예 8: 신경성 배뇨부에서 NGF-양성 세포의 수에 미치는 구강점막 줄기세포의 효과
면역조직화학 분석에 의하여 NGF의 발현수준을 결정하였다. 자유부유 조직 단편에 1:1000으로 희석된 마우스의 항-NGF 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 가하여 하룻밤 동안 반응시킨 다음, 상기 단편에 바이오틴이 결합된 항-마우스 2차항체(Vector Laboratories)를 가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 상기 단편에 아비딘-바이오틴-퍼록시다제 복합체를 가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 단편에 0.05% DAB 및 0.01% H2O2를 포함하는 50mM Tris 완충액(pH 7.6)을 약 3분 동안 가하여 반응시킴으로써, 면역반응도를 가시화하였다. 그런 다음, 상기 단편을 PBS로 3회 세척하고 젤라틴이 코팅된 슬라이드 글라스에 설치하였다. 상기 슬라이드 글라스는 실온에서 공기건조시키고, Permount®를 사용하여 커버슬라이드 글라스를 설치하였다(도 6). 이때, 경성 배뇨부에서 NGF-양성 세포의 수는 광학현미경을 통해 반측면적으로 계수하였다. 각 단편에서 척수와 신경성 배뇨부의 영역은 광학현미경에 결합된 이미지 분석기를 통해 측정하였다.
도 6은 대조군, SCI 유도군 및 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군의 랫트에 유래된 신경성 배뇨부에서 NGF의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 대조군을 나타내고, B는 SCI 유도군을 나타내며, C는 SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군을 나타낸다. 도 6에서 보듯이, MPA 영역에서 NGF-양성 세포의 수는 대조군에서는 단편당 40.61 ± 1.65 개 이고, SCI 유도군에서는 단편당 84.53 ± 4.97 개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서는 단편당 56.76 ± 3.77 개 였다. vlPAG 영역에서 NGF-양성 세포의 수는 대조군에서는 단편당 50.15 ± 3.05 개 이고, SCI 유도군에서는 단편당 103.38 ± 6.49 개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서는 단편당 88.15 ± 5.40 개 였다. PMC 영역에서 NGF-양성 세포의 수는 대조군에서는 단편당 32.15 ± 2.06 개 이고, SCI 유도군에서는 단편당 61.84 ± 3.88 개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서는 단편당 43.69 ± 2.88 개 였다. 척수 L4-L5 영역에서 NGF-양성 세포의 수는 대조군에서는 단편당 17.53 ± 1.17 개 이고, SCI 유도군에서는 단편당 42.76 ± 1.23 개 이며, SCI 유도/구강점막 줄기세포 이식군에서는 단편당 30.46 ± 2.09 개임을 확인하였다.
따라서, 신경성 배뇨부에서 NGF의 발현이 SCI 유도에 의해 증가되었으나, 구강점막 줄기세포의 이식은 신경성 배뇨부에서 SCI-유도성 NGF 발현을 억제함을 알 수 있었다.

Claims (7)

  1. 구강점막 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 신경인성 방광증은 요절박, 절박성 요실금, 빈뇨, 야간뇨, 배뇨곤란, 배뇨장애, 신우신염 및 이들의 조합으로 선택되는 증상을 나타내는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신경인성 방광증은 신경질환이 발병됨에 따라 수반되는 방광과 요도이상을 나타내는 질환인 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 신경질환은 뇌졸중, 파킨슨병, 치매, 다발성경화증, 척수염, 척수손상, 척수이형성증, 척추디스크, 척수 협착증 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 신경인성 방광증이 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경인성 방광증을 치료하는 방법.
  7. 신경인성 방광증 치료용 약학 조성물의 제조를 위한, 구강점막 줄기세포의 용도.
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