CN1339971A - 聚丙烯酰胺凝胶在哺乳动物的器官组织中形成胶囊的应用、培养细胞的方法和治疗肿瘤和糖尿病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医疗领域,更具体而言涉及肿瘤细胞疫苗和肿瘤的疫苗疗法的难题,也涉及治疗糖尿病的方法。本发明提出了培养细胞的新方法,该方法包括在动物包括人机体组织内形成聚丙烯酰胺凝胶,向所述胶囊中注入所需的细胞。本发明提供长期间保持细胞活力。

Description

聚丙烯酰胺凝胶在哺乳动物的器官组织中形成胶囊的应用、 培养细胞的方法和治疗肿瘤和糖尿病的方法
本发明涉及医学尤其是免疫学和肿瘤免疫学，也涉及糖尿病主要是胰岛素依赖型糖尿病的治疗。更具体而言，本发明涉及肿瘤细胞疫苗和肿瘤疫苗疗法的难题，和涉及治疗糖尿病的新方法。另外，本发明提供治疗方法所用的特殊胶囊，正是由于所述胶囊的使用才使得治疗更为有效。
已知哺乳动物器官、组织、细胞培养物的移植问题涉及与异体体外组织-和-细胞物质在受体器官中“生根”的可能性有关的难题。现存的自体、异源和异体移植方法，需要对受体进行强有力的免疫抑制治疗或者需要原始操作(original procedure)。后者包括移植人和动物胎儿的各种器官细胞的方法，即使用未发育种属特异性的作用。例如，以这种方式，将24-26周龄人胎儿胰腺的胰岛细胞培养物移植入试验大鼠的肝实质或者门静脉中。
引入细胞的部位可以是脾髓或者腹前壁肌肉。用类似方法治疗糖尿病患者的病例是已知的((Skaletskii N.N.，“胰腺的培养胰岛细胞对其在异体体外移植受体器官中存活性的影响”，公开在全俄罗斯器官移植大会(All-Russian Conference on Transplantation of Organs)1995，第219-220页(俄文)))。
将莱迪希氏细胞移植入男性的睾丸组织用于治疗有关的不育症，由于血睾屏障的存在，未出现排斥反应(Zybin D.V，“使用移植技术治疗男性球机能障碍患者的方法”，1995年1月20日的RF专利2026643)。
作为前述两种方法的结果，在保存移植细胞活力方面均获得了良好效果。然而，第一种方法只能单独使用胚胎细胞成为，这方面显而易见的原因是涉及重重困难；第二种细胞治疗方法仅能用于男性个体。
已知有借助于肝细胞的肿瘤疫苗和肿瘤疫苗疗法的方法。所用细胞是杂交瘤细胞或者同种异体或自体移植细胞。这些细胞的缺点是在器官中存在时间短，和相应地，具有低的致免疫作用(B.E.Souberbielle，M.Westby，S.Ganz.，和J.Kayaga，在B-16 F10黑素瘤模型中肿瘤疫苗四种方案的比较，基因治疗(Gene Therapy)1998，1447-1454)。
使用微囊将胰腺的胰岛(PIs)进行移植的方法为本领域技术人员所已知。
该方法包括：引入PIs(自体或者异体)包封到藻酸盐凝胶球中。将此类球植入腹膜内。在175天的期限内，球的植入完全取代了胰岛素治疗，但是该病例同时使用了免疫抑制治疗。将小牛PIs施用于大鼠，糖尿病减轻而不使用免疫抑制。血糖量在数周至1个月保持正常。
该方法一个确定的不便之处是必需使用免疫抑制治疗。具体困难涉及在体外制备胶囊(Lanza R.P.，Esker D.M.，和Marsh J.P.，在糖尿病性啮齿动物和犬中使用微囊移植胰岛的研究，现代医学杂志(J.Mol，Med.)，1999年1月77(1)：206-10)。
借助于肝细胞的肿瘤疫苗和肿瘤疫苗疗法的方法也是已知的。该方法包括生产肿瘤细胞和自体树状细胞(或巨噬细胞)的杂交瘤。得到的杂交瘤用作疫苗制剂。
然而，该方法也具有致免疫效力低的特征，因为引入的细胞在受体的器官中存在时间短(Gajewsky T.F.和Fallarino F.，黑素瘤肿瘤抗原-特异性免疫的合理进展(Rational development of tumor antigen-specific immunization in melanoma.)治疗免疫学(TherapeuticImmunology)1997，2，211-225)。
因此，现今本领域的问题是增加移植细胞寿命从而增强致免疫效力以及免除免疫抑制治疗的需要。
本领域专家清楚地知道：治疗糖尿病的问题也与正面解决移植细胞的问题密切相关，这个问题的成功解决将在许多方面有利于糖尿病治疗方法产生所需的效果。
举例来说，有一个治疗糖尿病的方法是已知的，据此方法进成人良性胰岛瘤细胞的植入，含有胰腺β-细胞的材料植入到腹直肌中(RF专利2004247)。
可是，当使用β-细胞培养物用于移植时，需要对抗成纤维细胞优势增长，并需要精确控制胰岛素瘤细胞培养物特定部分所产生的胰岛素量的必要性，这是由于可能将功能活性差异相当大的肿瘤细胞用作移植物的缘故，所述问题的存在为该方法的广泛应用设置了障碍。
还已知一个治疗糖尿病的方法，是植入含有胰腺β-细胞的材料(RF专利2135193)。该治疗糖尿病特别是胰岛素依赖型糖尿病的方法是这样实现的：使用含有哺乳动物胰腺β-细胞的材料，该材料是利用β-细胞迁移现象而产生(胰岛素)。
把含有胰腺β-细胞的材料植入不同的器官和组织；植入肌肉中，植入腹直肌，植入肝脏(植入肝实质或经由门静脉)，植入脾髓，植入脾动脉，植入腹腔，植入大网膜，植入特别制作的肌肉袋中。
β-细胞在受体器官中产生胰岛素供给受体的时间短暂，因为对异源性细胞的排斥作用使得必需进行相当的免疫抑制治疗。
图1描述植入了幼猪(线1和线2)的和绿猴(线3和线4)的莱迪希氏细胞的Wistar-系大鼠血清中睾酮的代谢动力学。线1和3代表对照结果(皮下引入细胞)，线2和4显示实验结果(细胞装入制备的聚丙烯酰胺胶囊中)。
本发明涉及克服前面所指出的那些问题。本发明作者意外地发现：通过使用能够在需要所述细胞治疗的哺乳动物(包括人)的体内在体(invivo)形成的聚丙烯酰胺凝胶胶囊，能够提供长时间保持移植细胞(包括异源性细胞)在受体器官中的活力。
因此，本发明一个方面是聚丙烯酰胺凝胶在哺乳动物体内制备在体形成的聚丙烯酰胺胶囊中的应用，所述胶囊然后被用于培养移植进入胶囊的细胞。
本发明作者意外地证明，注射入所述胶囊中的细胞，能够长期间(达100天或更久)保存活力并且产生治疗所需的化合物。
因而，本发明的另一方面是在需要治疗的患者的机体中培养治疗所需细胞的方法。该细胞培养如此进行：预先将聚丙烯酰胺凝胶注入哺乳动物机体内；经过一定时间在哺乳动物体内形成凝胶胶囊；和将所需量的被移植细胞注入到所述胶囊内。
在患者体内培养长期存活的细胞，被证明特别适宜治疗多种需要移植产生生物活性化合物的自体固有细胞或异源细胞的疾病，机体缺乏所述生物活性化合物会恶化或引发所述疾病。
本发明的第三方面是治疗抗原引起免疫反应的疾病的方法，所述抗原在通常状况下需要强的免疫抑制治疗。
本发明的另一方面是治疗糖尿病主要是胰岛素依赖型糖尿病的方法，包括将有效量的胰腺β-细胞引入到在患者体内形成的聚丙烯酰胺凝胶胶囊中。
本发明再一方面是在哺乳动物体内培养和修饰异源性细胞(肿瘤细胞、莱迪希氏细胞等)的方法，目的在于接下来用于制备疫苗制剂。“修饰异源性细胞”的定义应当理解为降低增殖活性并对机体有免疫作用。
本发明将进一步以优选实施方案的实施例的方式详细公开，这些实施例仅以举例说明的方式给出，不得用作对本发明权利要求范围的限制。本领域技术人员可以发现有许多可能性用于补充或修改本发明而保持前述优点，这些补充或修改均囊括在本发明权利要求范围之内。
通常来说，本发明按照如下方法进行。
本发明结缔组织胶囊可以例如通过给动物皮下注射(体积1.0-5ml)聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)的方式而形成，所述动物如Wistar系大鼠(注射体积1.0-3ml)或者C57BLACK和BALB/C系小鼠(注射体积0.5-1ml)或者哺乳动物如人(注射体积1.0-3.0ml)。可以用不同性别的个体参加试验。将青春期幼猪、大鼠和绿猴的莱迪希氏细胞或者肿瘤细胞引入到凝胶胶囊中。皮下注射细胞的动物作为对照。
使用含有细胞营养物质特别是标准Eagle’s培养基、培养基199、hanks’溶液等组分的溶液来制备取自青春期幼猪、大鼠和绿猴睾丸的有活力的莱迪希氏细胞悬浮液。
所提出的治疗糖尿病患者的方法的本质是供体胰腺β-细胞在受体机体中产生胰岛素，并且胰岛素长期存在于受体基体中，这可以通过如下步骤而实现：预先给患者皮下注入聚丙烯酰胺凝胶，接下来将β-细胞移植入形成的胶囊中。
用于移植β-细胞的材料取自哺乳动物(刚出生的猪、兔，青春期绿猴)的胰腺。使用标准培养基和溶液进行培养。为了使β-细胞保持在存活状态，使用了胰腺的少量酶处理(sparing enzymatic treatment)的方法，该方法包括用酶和营养介质交替接触组织。将此处理步骤所得的胰腺组织碎片和β-细胞引入到培养管，不进行离心。用0.1-0.25％胰蛋白酶和chenopsin溶液以不同序列解聚组织，所述序列取决于供体材料。使用一个放在磁桌上的控制悬浮液搅拌的“Biocech-m”烧瓶，在组织与介质接触期间完成组织酶处理。
将产生的材料注入患者体内的通过预先皮下注射聚丙烯酰胺凝胶而形成的结缔组织囊中。细胞的用量取决于受体患者疾病的严重程度。
下面描述的实施例能够实现本发明
实施例1
把体积0.5ml、浓度为每ml5百万细胞的新生猪的莱迪希氏细胞培养物注入到雌性Wistar-系大鼠的聚丙烯酰胺凝胶胶囊中。
对于同系、同性别、相同人类学数据的对照组动物，皮下注射新生猪的莱迪希氏细胞培养物。在注射细胞培养物之前，测定动物血清中的睾酮含量。在接下来的7个月里，以不同间歇同时测定对照和实验动物的血清睾酮含量。
对照组和实验组动物的数量各为2只。见图1(分别为线1和2)。
实施例2
把体积0.5ml、浓度为每ml5百万细胞的青春期绿猴的莱迪希氏细胞培养物注入到雌性Wistar-系大鼠的聚丙烯酰胺凝胶胶囊中。
对于同系、同性别、相同人类学数据的对照组动物，皮下注射青春期绿猴的莱迪希氏细胞培养物。在注射细胞培养物之前，测定动物血清中的睾酮含量。在接下来的7个月里，以不同间歇同时测定对照和实验动物的血清睾酮含量。
对照组和实验组动物的数量各为2只。见图1(分别为线1和2)。
观察7个月后，处死动物，进行组织学研究。研究表明存在大量有活力的莱迪希氏细胞，因此得出结论：通过使用凝胶，异体、异源性细胞能够在受体机体中存活。
实施例3
给实验组BALB/C系小鼠(6只)皮下注射体积为0.5ml的PAAG。将体积为1ml、细胞浓度为每毫升1百万细胞的小鼠黑素瘤B-16肿瘤细胞注入凝胶中。给BALB/C系对照组小鼠(6只)皮下注射体积为1ml、细胞浓度为每毫升1百万细胞的小鼠黑素瘤B-16肿瘤细胞。
已知小鼠黑素瘤B-16肿瘤细胞在BALB/C系小鼠中不能生长。在对照组的6只动物中没有肿瘤生长。在实验组动物中，通过触诊检查，在所有6只动物的PAAG中均有显著的肿瘤生长。于第60天，将凝胶中荷有小鼠黑素瘤B-16的实验动物处死。无菌条件下提取凝胶中的肿瘤细胞并转移至营养介质为含10％胎血清的RPMI-1640的单层培养基上。在福尔马林中性溶液中固定带有肿瘤细胞的胶囊碎片，并进行组织学研究，通过研究可以判断黑素瘤细胞的高度分化和增生能力的丧失(表1[1-2])。
表1.黑素瘤B-16(小鼠)和SKMEL 28(人)在小鼠BALB/C和C57BLACK
             系中的生长状况比较
小鼠系  肿瘤株 黑素瘤生长 寿命   转移瘤
BALB/C+凝胶  B-16     + 60天(观察期)*     -
BALB/C  B-16     - ＞观察期     -
C57BLACK+凝胶  SKMEL28     + ＞观察期     -
C57BLACK  SKMEL28     - ＞观察期**     -
*将凝胶中有肿瘤生长的动物处死。从中分离肿瘤细胞用于下一个实验(表2)。**小鼠进一步用于评价对黑素瘤B-16的免疫性的实验中(表3)。
实施例4
给C57BLACK系小鼠(6只)皮下注射1ml浓度为1百万细胞的按照实施例1制备的细胞培养物。
已知在C57BLACK系小鼠中，小鼠黑素瘤B-16肿瘤细胞100％生长，动物在第20-25天死亡的发生率为100％。
给对照组C57BLACK系小鼠皮下注射1ml浓度为1百万细胞的小鼠黑素瘤B-16的细胞培养物。
实验小鼠在60-65天出现显著肿瘤生长症状；对照小鼠出现时间则是在20-23天(表2)。表2.移植入C57BLACK系小鼠中的在凝胶胶囊中培养的小鼠BALB/C系黑
                    素瘤B-16的致瘤活性
编号 肿瘤株 肿瘤出现时间 小鼠寿命 转移瘤存在
1 从BALB/C系小鼠(B-16-X)凝胶中提取的黑素瘤     30天   60天     +
2 B-16(对照)     7天   22天     +
实施例5
给C57BLACK系小鼠(6只)皮下注射体积为0.5ml的PAAG。将体积为1ml、细胞浓度为每毫升1百万细胞的人黑素瘤SKMEL的细胞培养物注入凝胶中。
给同系对照组小鼠(6只)皮下注射体积为1ml、细胞浓度为每毫升1百万细胞的人黑素瘤SKMEL28的细胞培养物。
已知人黑素瘤的细胞培养物在小鼠中100％不能生长。注射后第15-20天，在实验组动物中，通过触诊检测到凝胶中肿瘤的生长。在对照组动物中没有发现肿瘤生长(表1[3-4])。
实施例6
给实施例3中的实验组动物(6只)皮下注射体积为1ml浓度为1百万细胞的小鼠黑素瘤B-16的细胞培养物。给对照组C57BLACK系小鼠(6只)皮下注射1ml浓度为1百万细胞的小鼠黑素瘤B-16的细胞培养物。
于第7-15天，对照动物皮下生长黑素瘤直径大约3-5cm。而同样时间段在实验组动物未检测到肿瘤症状(表3)。
    表3.人黑素瘤SKMEL28对于小鼠的致免疫活性
   编号     肿瘤株    出现肿瘤时间     动物死亡
    5     B-16        -     ＞60天
    6     B-16      7-15天     18-20天
因此，上述结果为下述观点确立了基础：确信在PAAG中在体培养异源性细胞的方法适用于疫苗和疫苗疗法，在所述PAAG中肿瘤细胞增生活性下降而且培养细胞在机体中产生致免疫作用。
实施例7
女性患者F.，37岁，11年前在分娩后1年诊断为胰岛素依赖型糖尿病，在孕期后半阶段因肾病中毒加重，体重增加26kg。这些年来疾病的特征一直不稳定，相当大的努力是选择适量的胰岛素治疗。每日外源性胰岛素用量由58单位至30单位不等。最近2年确诊有肾脏的病理学改变，确定为糖尿病性肾病。尿分析表明，蛋白尿高出上限10-12倍。动脉压高达170/110mmHg。
将新生兔的胰腺细胞培养物皮下注射到病人体内事先已经形成的胶囊中。7天后，就观察到患者全身状况改善，口渴感和口腔粘膜干燥感减轻，动脉压降至140/90mmHg。在15天，患者的状况改善得以至于可以将外源性胰岛素的需要量由30单位降至18单位(血液和尿液监控)。在30天时，外源性胰岛素的每日所需量降至12单位，接近第2个月月末时，每日所需量降为4单位。
在12个月的期间内一直跟踪患者的状况。未检测到肾病的临床表现，动脉压在与年龄相适应的正常范围内。患者转为口服抗糖尿病制剂同时强制性糖尿病饮食和控制血糖、尿糖以及糖基化的血红蛋白。
实施例8
男性患者K.，52岁。自18岁由于严重紧张的环境背景而患上了胰岛素依赖型糖尿病。开始，疾病的特征是极端不稳定。外源性胰岛素每日用量高达70单位。最近几年来病情已经稳定，但是在遇紧张情形和饮食不注意之时病情出现恶化。
近3年观察到下肢末端脉管状况恶化，性欲减退，勃起减弱和房事质量下降。诊断为下肢末端和阴茎糖尿病性血管病。最近几年外源性胰岛素的需要量从每日20单位升至每日40单位。
将14天猪的胰腺细胞培养物皮下注射到病人体内事先已经形成的胶囊中。2周后，就观察到患者全身状况改善，1个月每日所需外源性胰岛素的量降至12单位。2个月，外源性胰岛素的每日所需量降至6单位。移植后4个月，患者转为口服抗糖尿病制剂。患者的性生活正常，下肢末端血管状况明显改善。
从对患者主观和客观症状的测查结果、另外进行的血液和尿液检测的数据可以得出这样的结论：该方法治疗糖尿病高度有效，方法极大减少患者外源性胰岛素的用量，有些病例甚至停用胰岛素治疗。该方法不需要免疫抑制治疗，降低了发生继发性糖尿病并发症如视网膜病、神经疾病、肾病的风险。方法使得相当程度地改善患者的生活质量变为可能。通常来说，取决于疾病的严重程度，治疗效果持续10-12个月。
移植细胞的用量也取决于糖尿病病程的严重程度，尤其取决于患者外源性胰岛素的用量。
本发明使得下述过程成为可能：使用“聚丙烯酰胺凝胶”，将聚丙烯酰胺凝胶引入哺乳动物机体内在体形成胶囊，然后，为移植目的而向胶囊中注入有活力的细胞，胶囊起到长期间培养细胞的室腔的作用，所述细胞能够制备成化合物，通过这些化合物可以进行治疗，培养细胞的时间就是化合物治疗所需要的时间。当所述化合物从此人造室腔释放后，则对患者的机体产生所需的影响。为了所提出的目的而使用聚丙烯酰胺凝胶，能够长时间保持培养细胞的活力，从而延长了治疗效果。所述应用使得取消免疫抑制治疗成为可能，并且可以在医疗实践中寻求非常广泛的应用。

Claims (11)

1.聚丙烯酰胺凝胶在哺乳动物机体组织中形成胶囊的应用，所述胶囊是为了长时间培养动物自体或异体移植细胞，所述移植细胞是为了产生生物活性成分，机体中所述生物活性成分的缺乏或不足将导致疾病，和/或增加机体中所述生物活性成分的含量将有助于改善患病机体的状况。
2.权利要求1所述的应用，其中所述机体是人机体。
3.权利要求2所述的应用，其中所述疾病是糖尿病。
4.权利要求1-3所述的应用，其中所述移植细胞是胰腺β-细胞。
5.权利要求4所述的应用，其中所述胰腺细胞是新生兔的细胞或者幼猪的细胞。
6.培养和修饰哺乳动物异源性细胞的方法，所述细胞是为了在下一步用于制备疫苗制剂，其中培养异源性细胞是通过将聚丙烯酰胺凝胶预先注入哺乳动物体内，接下来将哺乳动物的异源性或自体固有细胞注入所述凝胶内而长时间在有生命的机体中进行的。
7.权利要求6所述方法，其中所述异源性细胞是肿瘤细胞。
8.权利要求6所述方法，其中所述异源性细胞莱迪希氏细胞。
9.权利要求6-9中任一项所述方法，其中所述细胞修饰包括降低其增生活性及其对机体的致免疫效力。
10.通过移植胰腺β-细胞的方法来治疗糖尿病的方法，其中将聚丙烯酰胺凝胶预先注入受体体内，接着将治疗显著量的胰腺β-细胞注入到所述凝胶中。
11.权利要求10所述的方法，其中所述β-细胞是新生兔的细胞或幼猪的细胞。
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