JP2009162533A - 検出対象の検出方法及び定量方法 - Google Patents

Abstract

【課題】検出対象を迅速、安価且つ簡便に高感度で検出、定量できる検出用キット等を提供すること。
【解決手段】検体中の検出対象５０を検出するキットは、ｐＨ応答性ポリマー１１を含有する第１の物質と検出対象５０に対する第１の抗体１３とが結合した第１の結合物１０と、有電荷又は親水性の第２の物質２１と検出対象５０に対する第２の抗体２３とが結合した第２の結合物２０と、を含む。第１の抗体１３及び第２の抗体２３は、検出対象５０の異なる部位において、同時に検出対象５０に結合できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、検出対象の検出／定量用キット、及び検出／定量方法に関する。

従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が行われてきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、流体と、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテックスとを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量する方法である（例えば、特許文献１参照）。

このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいため、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であった。

そこで、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法といった酵素基質反応を利用する方法も広く採用されている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する。

これらの方法によれば、例えば基質として発光試薬を用いると、基質添加後の発光の検出感度が高いため、微量の抗原も検出できる。
特公昭５８−ｌｌ５７５号公報

しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体、発光試薬、発光検出装置等の特殊な試薬、機器が必須であり、作業コストが高い。

また、図３に示すように、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションする工程（ＳＴ１１０、ＳＴ１３０）、系を洗浄する工程（ＳＴ１２０）、発光を測定する工程（ＳＴ１４０）等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極めて長く、大規模処理には適さない。

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、検出対象を迅速、安価且つ簡便に高感度で検出、定量できる検出／定量用キット、及び検出／定量方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、有電荷又は親水性物質に接近されるとｐＨ応答性ポリマーの凝集が阻害されることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の構成を有する。

［１］検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
ｐＨ応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、
有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、を含み、
第１の親和性物質及び第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できるキット。
［２］第１の物質は、微粒子状の磁性物質を含む［１］に記載のキット。
［３］第２の物質は、親水性の高分子化合物である［１］又は［２］に記載のキット。
［４］第２の物質は、ポリアニオン又はポリカチオンである［１］から［３］のいずれかに記載のキット。
［５］ポリアニオンは、核酸又はポリアクリル酸である［４］に記載のキット。
［６］ポリカチオンは、ポリアルキルアミン又はポリエチレンイミンである［４］に記載のキット。
［７］検体中の検出対象を検出する方法であって、
ｐＨ応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物をｐＨ応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記ｐＨ応答性ポリマーの拡散の有無を判定する工程を含み、
第１の親和性物質及び第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる方法。
［８］第１の物質は、微粒子状の磁性物質を更に含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む［７］に記載の方法。
［９］検体中の検出対象を定量する方法であって、
ｐＨ応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物をｐＨ応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
［１０］第１の物質は、微粒子状の磁性物質を更に含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む［９］に記載の方法。

本発明によれば、検出対象が存在すると、この結合対象に第１の親和性物質及び第２の親和性物質が結合するため、第１の親和性物質に結合したｐＨ応答性ポリマーと、第２の親和性物質に結合した第２の物質が接近する。これにより、電荷部分又は親水性部分がｐＨ応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答したｐＨ応答性ポリマーの凝集が阻害される。従って、この凝集阻害の有無を観察することで、検出対象の存否を検出できる。また、凝集阻害の程度を測定することで、検出対象を定量できる。

以上の手順は、いずれも特殊な試薬、機器を特に使用することなく行うことができ、安価且つ簡便である。また、凝集阻害の程度を測定するだけであり、酵素によって触媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。また、第２の物質が有する電荷部分又は親水性部分がｐＨ応答性ポリマーの凝集を高度に阻害するので、高感度で検出対象を検出、定量できる。

＜キット＞
本発明のキットは、検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、第１の結合物と、第２の結合物とを含有する。各構成について、以下詳細に説明する。

〔第１の結合物〕
第１の結合物は、ｐＨ応答性ポリマーを含有する第１の物質と、検出対象に対する第１の親和性物質とが結合したものである。

（第１の物質）
本発明で用いられる第１の物質はｐＨ応答性ポリマーを含有するところ、このｐＨ応答性ポリマーは、外的なｐＨ変化に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できるポリマーである。

ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨは、特に限定されないが、刺激付与時における第１の結合物、第２の結合物、及び検体の変性等による検出・定量精度の低下を抑制できる点で、ｐＨ４〜１０が好ましく、ｐＨ５〜９であることが更に好ましい。

かかるｐＨ応答性ポリマーは、（メタ）アクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ホスホリルエチル（メタ）アクリレート、アミノエチルメタクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド等の解離基を有するモノマーが重合されたものであってもよく、これら解離基を有するモノマーと、ｐＨ応答能が損なわれない程度において、他のビニルモノマー、例えばメチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類、スチレン、塩化ビニル、Ｎ−ビニルピロリドン等のビニル化合物、（メタ）アクリルアミド類等とが共重合されたものであってもよい。

第１の物質は、後述の磁力付加により検出精度を向上できる点で、微粒子状の磁性物質を更に含有することが好ましい。かかる磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されてよい。

多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し且つ鉄イオンと結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げられる。例えば特開２００５−８２５３８公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性物質の製造方法が開示されている。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。

このような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質（磁性微粒子）は、良好な分散性を有するように、その平均粒径が０．９ｎｍ以上１０００ｎｍ未満であることが好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、２．９ｎｍ以上２００ｎｍ未満であることが好ましい。即ち、平均粒径が大きすぎる場合には、後述のように磁力を付加した際、非凝集状態の粒子でも凝集物と同様の行動をとることが懸念される。

〔第２の結合物〕
第２の結合物は、有電荷又は親水性の第２の物質と、検出対象に対する第２の親和性物質とが結合したものである。

（第２の物質）
電荷を有する第２の物質は、例えば電荷を有する高分子化合物であり、ポリアニオン又はポリカチオンであることが好ましい。ポリアニオンとは複数のアニオン基を有する物質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリアニオンの例として、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨恪に沿って複数個のホスホジエステルが存在することにより、ポリアニオンの性質を有する。また、ポリアニオンには、多数のカルボキシルを含むポリペプチド（グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸からなるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、及びアクリル酸やメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸、及びヘパリン等の多糖類等も含まれる。一方、ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリアルキルアミン、ポリエチレンイミンやポリプロピルエチレンイミン等が挙げられる。なお、ポリアニオン（カルボキシル）やポリカチオン（アミノ）の官能基数は、２５個以上が好ましい。

親水性の第２の物質は、例えば水溶性の高分子化合物であり、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド等のエーテル結合を含有する高分子、ポリビニルアルコール等のアルコール性水酸基を含有する高分子、デキストラン、シクロデキストリン、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性多糖類等が挙げられる。

これら有電荷又は親水性の物質は、高分子鎖の中又は末端に、第２の親和性物質を結合させるための官能基等を有していてもよい。

（第１の親和性物質、第２の親和性物質）
第１の結合物の第１の親和性物質、及び第２の結合物の第２の親和性物質は、検出対象の異なる部位において、同時に検出対象に結合できるものである。第１の親和性物質及び第２の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体であってよい。

ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Ｆａｂ等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、異なる抗原認識部位を有する２種類のモノクローナル抗体であることが好ましい。

〔作製方法〕
以上のキットの作成方法を説明する。

［第１の結合物の作製］
第１の結合物は、第１の物質と第１の親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第１の物質側（例えばｐＨ応答性ポリマー部分）及び第１の親和性物質（例えば、第１の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第１の物質及び第１の親和性物質を結合させる。

具体的には、ｐＨ応答性ポリマーへのビオチンの結合は、国際公開第０１／０９１４１号パンフレットに記載されているように、ビオチン等をメタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行い、第１の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従って行う。次に、ビオチン結合ｐＨ応答性ポリマー及びアビジン結合第１の親和性物質を混合すると、アビジンとビオチンとの結合を介して、第１の親和性物質及びｐＨ応答性ポリマーが結合する。

別法として、ポリマーの重合時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知の方法に従って抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ）をポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に第１の抗体を結合させることにより、ｐＨ応答性ポリマーと、検出対象の抗原に対する第１の抗体との第１の結合物が作製される。

第１の物質をｐＨ応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって分離することで、第１の結合物を精製してもよい。第１の結合物の精製は、ｐＨ応答性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第１の親和性物質を結合させた後、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。

微粒子状の磁性物質とｐＨ応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で行ってよい（例えば、ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５やＪ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．、Ｐａｒｔ−Ａ、３、ｐ１０３１、１９６５参照）。
次に、電荷を有する第２の物質と、検出対象の抗原に対する第２の抗体とを結合させ第２の結合物を作製する方法について記述する。

［第２の結合物の作製］
第２の結合物は、第２の物質と第２の親和性物質とを直接又は間接に結合することによって作製する。特に限定されないが、例えば、第２の物質側及び第２の親和性物質（例えば、第２の抗体）側の双方に、互いに親和性の物質（例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンＳトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物質を介して第２の物質及び第２の親和性物質を間接的に結合させる。

第２の物質と第２の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合させてもよく、例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、 １、 ７１−７６、１９９０）のマレイミド−チオールカップリングに従って結合できる。具体的には、以下の２つの方法が挙げられる。

第１の方法では、まず、核酸の５’末端にメルカプト（別名、スルフヒドリル）を導入する一方、抗体に６−マレイミドヘキサノイックアシッドスクシンイミドエステル（例えば、「ＥＭＣＳ（商品名）」（同仁化学社製））を反応させてマレイミドを導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト及びマレイミドを介して結合させる。

第２の方法では、まず、第１の方法と同様にして核酸の５’末端にメルカプトを導入し、このメルカプトに更にホモ二官能性試薬であるＮ，Ｎ−１，２−フェニレンジマレイミドと反応させることによって核酸の５’末端にマレイミドを導入する一方、抗体にメルカプトを導入する。次に、これら２種の物質をメルカプト及びマレイミドを介して結合させる。

この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１５巻５２７５頁（１９８７年）及びＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１６巻３６７１頁（１９８８年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結合に応用できる。

Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 第１６巻３６７１頁（１９８８年）によると、まず、オリゴヌクレオチドを、シスタミン、カルボジイミド及び１−メチルイミダゾールと反応させることによって、オリゴヌクレオチドの５’末端の水酸基にメルカプトを導入する。メルカプトを導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、この後に２、２’−ジピリジルジスルフィドを加えることによってオリゴヌクレオチドの５’末端にジスルフィド結合を介してピリジルを導入する。一方、タンパク質に対しては、イミノチアレンを反応させてメルカプトを導入しておく。これらピリジルジスルフィドを導入したオリゴヌクレオチドとメルカプトを導入したタンパク質を混合し、ピリジルとメルカプトを特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。

Ｎｕｌｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｃｈ 第１５巻５２７５頁（１９８７年）によると、まず、オリゴヌクレオチドの３’末端にアミノを導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオ−ビス−プロピオニックアシッド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ）を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することによりジチオ−ビス−プロピオニル−ＮＨＳ分子中のジスルフィド結合を還元して、オリゴヌクレオチドの３’末端にメルカプトを導入する。タンパク質の処理については、特開平５−４８１００号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、タンパク質中の官能基（例えば、アミノ）と反応しうる第１の反応性基（スクシンイミド）、及びメルカプトと反応しうる第２の反応性基（例えば、マレイミド等）を有するヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第２の反応性基を導入し、予め活性化されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタンパク試薬をチオール化ポリヌクレオチドのメルカプトへ共有結合させる。

このようにして製造されるキットは、例えば以下のような方法で、検出対象を検出及び／又は定量するために使用できる。

＜検出方法＞
本発明の検出方法は、まず第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、ｐＨ応答性ポリマーが凝集する条件下において、ｐＨ応答性ポリマーの拡散の有無を判定する工程を含む。手順の詳細を以下に説明する。

（混合・凝集）
まず、第１の結合物と第２の結合物とを容器内で混合し、更に検体を添加して混合物を得る。続いて、この混合物をｐＨ応答性ポリマーが凝集する条件下におく。すると、検出対象が存在する場合には、ｐＨ応答性ポリマーが第２の結合物中の電荷部分又は親水性部分によって凝集阻害されて拡散する一方、検出対象が存在しない場合にはｐＨ応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。

この現象を、図１〜図２を参照しながら説明する。

図１に示されるように、第１の結合物１０はｐＨ応答性ポリマー１１を含有し、この１１はアビジン１５及びビオチン１７を介して検出対象５０に対する第１の抗体１３に結合されている。また、１０は微粒子状の磁性物質１９を含み、この１９の表面に１１が結合されている。一方、第２の結合物２０は負電荷を有する第２の物質２１を含み、この２１は検出対象５０に対する第２の抗体２３に結合されている。そして、１３及び２３は、検出対象５０の異なる部位において、同時に検出対象５０に結合できる。

図２に示されるように、第１の結合物１０、第２の結合物２０及び検体の混合物を所定条件下におくと、検出対象５０が存在する場合には、ｐＨ応答性ポリマーが第２の結合物２０中の電荷によって凝集阻害されて拡散する（図２（Ａ））一方、検出対象５０が存在しない場合にはｐＨ応答性ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる（図２（Ｂ））。

ｐＨ応答性ポリマーが凝集する条件は、混合液の入った容器に、構造変化を起こすｐＨまで酸溶液又はアルカリ溶液を加えることで達成される。具体的には、ｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲の外にある分散混合液の入った容器に、酸溶液又はアルカリ溶液を加え、容器内をｐＨ応答性ポリマーが構造変化を起こすｐＨ範囲に変更すればよい。例えば、ｐＨ５以下で凝集、ｐＨ５超で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ５超で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが５以下になるように酸溶液を加えればよい。また、ｐＨ１０以上で凝集、ｐＨ１０未満で分散するｐＨ応答性ポリマーを用いた場合、ｐＨ１０未満で分散している混合液の入った容器に、ｐＨが１０以上になるようにアルカリ溶液を加えればよい。

ここで使用される酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ホウ酸等の無機酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、乳酸等の有機酸が挙げられる。また、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、エタノールアミン等のアミン等が挙げられる。

酸溶液又はアルカリ溶液は、添加時のｐＨ急変化による第１の結合物、第２の結合物、及び検体の変性を抑制するべく、０．０１〜１．０ｍｏｌ／Ｌで調製されることが好ましい。

なお、ｐＨ応答性ポリマーの凝集は、第１結合物及び第２結合物の検出対象への結合の前に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮できる点で後者が好ましい。ただし、ｐＨ応答性ポリマーが凝集する条件が、第１結合物及び第２結合物が検出対象に結合する条件と大幅に異なる場合、前者が好ましい。また、ｐＨの不均衡による第１の結合物、第２の結合物、及び検体の局所的な変性を抑制するべく、酸溶液又はアルカリ溶液の添加後、速やかに混合作業を行うことが好ましい。

（判定）
拡散の有無の判定は、例えば目視又は濁度測定で行うことができる。濁度は光散乱装置での光透過率から算出でき、濁度が低ければｐＨ応答性ポリマーの凝集が阻害されており、検出物質の存在が示唆される。ここで、使用する光の波長は、磁性物質の粒径等に応じ所望の検出感度が得られるよう適宜設定されてよい。光の波長は、従来汎用の装置を利用できる点で、可視光の範囲内（例えば、５５０ｎｍ）であることが好ましい。

目視又は濁度測定は、一定の時点で断続的に行ってもよいし、経時的に連続して行ってもよい。また、ある時点における濁度測定値と、他の時点における濁度測定値との差に基づいて判定を行ってもよい。

＜定量方法＞
本発明の定量方法によれば、まず、第１の結合物、第２の結合物及び検体を混合し、この混合物をｐＨ応答性ポリマーが凝集する所定条件下におく、次に、混合物の濁度を測定し、検出対象の量と濁度との所定条件下における相関式に基づいて、検体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似するので、説明を省略する。

（相関式）
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と濁度との相関式を作成する。この相関式を構成する検出対象の量と濁度との測定は、データが多い程に信頼性の高い相関式が得られる。そこでデータは、２以上の検出対象の量に関するものであればよく、３点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。

ここで、検出対象の量と濁度との相関式は、検出対象の量と濁度との直接的な相関を示す式のみならず、検出対象の量と濁度を反映するパラメータとの相関式であってもよい。

（算出）
混合物の濁度測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出対象の量を算出できる。

（分離）
第１の物質が微粒子状の磁性物質を含有する場合、本発明の検出方法又は定量方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことが好ましい。これによって、凝集した磁性物質が、非凝集状態の磁性物質を含む夾雑物から分離される。このため、分離した磁性物質の量、溶媒に分散した際の光透過率等の測定値は、夾雑物の影響が除外され、検出物質の存在をより忠実に反映したものとなる。

磁力の付加は磁性物質に磁石を接近させて行うことができるところ、この磁石の磁力は、用いる磁性物質が有する磁力の大きさによって異なる。磁石としては、例えばマグナ社製ネオジ磁石が挙げられる。

また、磁力の付加は、判定の前又は判定と同時並行して行ってよいが、工程に費やされる時間を短縮化できる点で同時並行が好ましい。なお、磁力を付加すると、凝集した磁性物質は夾雑物を巻き込んで分離されるため、分離後における混合物の濁度は、凝集磁性物質が存在していた場合の方がむしろ小さくなるものと推測される。

なお、検出方法又は定量方法における「濁度測定」には、濁度を直接的に測定することのみならず、濁度を反映するパラメータを測定することも包含される。かかるパラメータとしては、複数時点での濁度測定値の差異、分離された凝集物量、分離後の非凝集物の濁度等が挙げられる。ここで、複数時点のうちの１点は、例えば、検出対象が非存在である陰性対照に磁力を付加した際、濁度が最大値となる時点近傍であることが好ましい。これにより、別の時点での濁度測定値との差異が大きくなり、検出対象の量をより正確に定量できることになる。

（検出対象）
検体中の検出対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリンＧ、ヒトイムノグロブリンＭ、ヒトイムノグロブリンＡ、ヒトイムノグロブリンＥ、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン（フィブリン及びそれらの分解産物）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトーゲン（ＨＰＬ）、インスリン、ＨＩＶウイルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細菌抗原、酵素、ホルモン、薬剤等が挙げられる。

本実施例では、第１の結合物としてビオチン結合−ｐＨ応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を、第２の結合物としてビオチン結合ポリアクリル酸を用いて、ストレプトアビジンを検出、定量する例を示す。

（第１の結合物の調製）
［製造例１］磁性粒子（６０ｎｍ）の調製方法
１００ｍｌのフラスコ内に、塩化第二鉄・六水和物（１．０ｍｏｌ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．５ｍｏｌ）の混合水溶液を３ｍｌ、多価アルコールであるデキストラン（和光純薬工業社製、分子量３２０００〜４００００）の１０質量％水溶液６０ｍｌを入れ、メカニカルスターラで撹拌した。得られた混合溶液を５０℃に昇温した後、これに２５質量％アンモニア溶液５．０ｍｌを滴下し、１時間程度撹拌した。これにより、平均粒径が約６０ｎｍのデキストラン含有磁性粒子が得られた（特開２００５−８２５３８（Ｐ２００５−８２５３８Ａ）を参照）。

［製造例２］ビオチンモノマー〔Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミド〕の調製方法
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩１８ｇ、ビオチン２４ｇ及びトリエチルアミン３０ｇを３００ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、０℃に冷却した。ジフェニルホスフォニルアジド２８ｇを５０ｍｌのＤＭＦに溶解させた溶液を１時間かけて、冷却溶液中に滴下した。滴下終了後、０℃で３時間撹拌し、更に室温で１２時間撹拌した。この後、減圧下で溶媒を留去し、展開溶媒としてクロロホルム−メタノール混合溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーで精製したところ、白色粉末２２ｇが得られた。これは、目的物であるＮ−ビオチニル−Ｎ’−メタクリロイルトリメチレンアミドであった（収率５９％）。（特開２００５−８２５３８（Ｐ２００５−８２５３８Ａ）を参照）

［製造例３］ビオチン結合−ｐＨ応答性ポリマー表面修飾磁性粒子（第１の結合物）の調製方法
５０ｍｌの三口フラスコ内に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３００ｍｇ、上記方法で調製したビオチンモノマー３ｍｇ、アクリル酸９．５ｍｇ、上記方法で調製したデキストラン含有磁性粒子（６０ｎｍ）の２質量％水溶液２ｍｌを入れ、蒸留水で２０ｍｌに調節した。この溶液を窒素置換した後、更に０．２Ｍ硝酸二アンモニウムセリウム（ＩＶ）硝酸溶液２００μｌを添加し、２時間撹拌し、反応を進行させることで、ｐＨ応答性磁性粒子が得られた。

このｐＨ応答性磁性粒子の平均粒径は、レーザーゼータ電位計「ＥＬＳ−８０００」（大塚電子株式会社製）を用いて測定したところ、約１００ｎｍであることがわかった（特開２００５−８２５３８（Ｐ２００５−８２５３８Ａ）を参照）。また、この粒子は、３７℃において、ｐＨ７では水溶液中に完全に分散し、磁石での回収が困難であったが、溶液をｐＨ５以下にすると直ちに凝集し、磁石で容易に回収できた。即ちｐＨ７で分散し、ｐＨ５以下で凝集するｐＨ応答性が確認された。

こうして得たｐＨ応答性ポリマー表面修飾磁性粒子を３７℃、ｐＨ４で凝集させ、磁石で回収した後、上清部分を除去した（Ｂ／Ｆ分離）。分離後の粒子を、０．５ｗ／ｖ％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５ｗ／ｖ％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有させたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に分散することで、第１の結合物を調製した。

（第２の結合物の調製）
［製造例４］Ｎ−（６−アミノヘキシル）ビオチンの調製方法
窒素ガス導入管、温度計、及び撹拌装置を付した２００ｍｌの三口フラスコ内にヘキサメチレンジアミン（和光純薬工業社製）５ｇ及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｇを入れ、溶解した。ここに、ビオチン−ＮＨＳ（和光純薬工業社製）２ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｇに溶解した溶液を、５分かけて滴下した。２時間の反応後、生成した白い沈殿物をろ過して除き、ろ液を減圧濃縮した。更に真空乾燥機で、一晩乾燥し、Ｎ−（６−アミノヘキシル）ビオチンを得た。収量２．６７ｇ。

［製造例５］ビオチン結合ポリアクリル酸（第２の結合物）の調製方法
温度計、及び撹拌装置を付した２００ｍｌの三口フラスコ内に、２５％ポリアクリル酸（Ｍｗ．５００００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）４ｇ、及び８４ｍｌの精製水（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製 Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ（商品名）で精製した水）を入れ、撹拌しながら１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム水溶液１３ｍｌを加え、中和した。更に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１００ｍｇを加え、撹拌溶解した。ここに上記で調製した１％Ｎ−（６−アミノヘキシル）ビオチン水溶液３４１μｌを添加し、２４時間反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブに移し、５Ｌの精製水中で２４時間透析し、精製水で１００ｍｌにメスアップした。更に５ｍｌずつガラス試験管に小分けし、９５℃の恒温槽中で５分間加熱し、濃度１％のビオチン結合ポリアクリル酸を得た。こうして得た１％ビオチン結合ポリアクリル酸５ｍｌと、０．５ｗ／ｖ％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５ｗ／ｖ％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有させたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）７ｍｌとを混合することで、第２の結合物を調製した。

ビオチン結合−ｐＨ応答性ポリマー表面修飾磁性粒子及びビオチン結合ポリアクリル酸を用いたストレプトアビジンの定量

［試料の調製］
ストレプトアビジン（和光純薬工業社製）を、精製水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した。この溶液を０．５ｗ／ｖ％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ社製）、０．５ｗ／ｖ％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有させたＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で２６．７μｇ／ｍｌ、１３．３μｇ／ｍｌ、６．７μｇ／ｍｌ、及び０μｇ／ｍｌとなるよう希釈したものを、それぞれ試料とした。

［定量］
分光光度計用セミミクロセルを、セル温度制御機が設けられた可視紫外分光光度計Ｖ−６６０ＤＳ（日本分光製）内に設置し、３７℃で１０分間以上保持した。第１の結合物（４ｍｇ／ｍｌ）１５０μｌ、第２の結合物１２０μｌ及び各試料７５０μｌをマイクロチューブ内に注ぎ、ピペッティングで均一に混合した後、２０℃で５分間インキュベートした。この混合液をセル内に分注し、５分間静置した後、０．３３ｍｏｌ／ｌの塩酸６９μｌを加えて速やかに撹拌し（このとき混合液のｐＨは５．１であった。）、５分後の吸光度を波長４２０ｎｍの光を用いて測定した。この結果を表１に示す。

表１より、ストレプトアビジンの濃度に依存して吸光度が変化することが分かる。即ち、吸光度を測定することで、ストレプトアビジンの定量が可能であることが示された。

本発明の一実施形態に係る方法において使用される第１の結合物及び第２の結合物の概略構成図である。 前記実施形態に係る第１の結合物及び第２の結合物の使用状態を示す模式図である。 従来例に係る方法のフローチャートである。

符号の説明

１０ 第１の結合物
１１ ｐＨ応答性ポリマー
１３ 第１の抗体（第１の親和性物質）
１９ 磁性物質
２０ 第２の結合物
２１ 第２の物質
２３ 第２の抗体（第２の親和性物質）
５０ 検出対象

Claims (10)

1. 検出対象を検出及び／又は定量するためのキットであって、
   ｐＨ応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、
   有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、を含み、
   第１の親和性物質及び第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できるキット。
2. 第１の物質は、微粒子状の磁性物質を含む請求項１に記載のキット。
3. 第２の物質は、親水性の高分子化合物である請求項１又は２に記載のキット。
4. 第２の物質は、ポリアニオン又はポリカチオンである請求項１から３のいずれかに記載のキット。
5. ポリアニオンは、核酸又はポリアクリル酸である請求項４に記載のキット。
6. ポリカチオンは、ポリアルキルアミン又はポリエチレンイミンである請求項４に記載のキット。
7. 検体中の検出対象を検出する方法であって、
   ｐＨ応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物をｐＨ応答性ポリマーが凝集する条件下におき、前記ｐＨ応答性ポリマーの拡散の有無を判定する工程を含み、
   第１の親和性物質及び第２の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、同時に前記検出対象に結合できる方法。
8. 第１の物質は、微粒子状の磁性物質を更に含有し、
   前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む請求項７に記載の方法。
9. 検体中の検出対象を定量する方法であって、
   ｐＨ応答性ポリマーを含有する第１の物質と前記検出対象に対する第１の親和性物質とが結合した第１の結合物と、有電荷又は親水性の第２の物質と前記検出対象に対する第２の親和性物質とが結合した第２の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物をｐＨ応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
   前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下における相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
10. 第１の物質は、微粒子状の磁性物質を更に含有し、
    前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む請求項９に記載の方法。

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