WO2008001868A1 - Kit for detection/quantification of analyte, and method for detection/quantification of analyte - Google Patents

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WO2008001868A1
WO2008001868A1 PCT/JP2007/063044 JP2007063044W WO2008001868A1 WO 2008001868 A1 WO2008001868 A1 WO 2008001868A1 JP 2007063044 W JP2007063044 W JP 2007063044W WO 2008001868 A1 WO2008001868 A1 WO 2008001868A1
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WO
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substance
detection target
bound
affinity
stimulus
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Application number
PCT/JP2007/063044
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Inventor
Hirokazu Nagaoka
Noriyuki Ohnishi
Kageaki Matsui
Satoru Sugita
Original Assignee
Chisso Corporation
Ortho-Clinical Diagnostics Kabushiki Kaisha
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction

Definitions

  • the present invention relates to a detection target, quantification kit, and a detection and quantification method.
  • a latex agglutination method has been performed as a method for detecting a detection target in a specimen.
  • the latex agglutination method is used to detect antigens in a fluid such as a biological sample.
  • the degree of latex aggregation is determined by mixing the fluid with a latex carrying an antibody or fragment thereof that specifically binds to the antigen. This is a method for detecting or quantifying an antigen by measuring (see, for example, Patent Document 1).
  • an antigen added as a specimen crosslinks a plurality of latex-bound antibodies to promote latex agglutination. Since the procedure is simple as described above, the antigen can be detected easily and quickly. However, if the amount of antigen is very small, the crosslinking is difficult to occur, and the latex does not aggregate sufficiently. For this reason, it was difficult to detect trace amounts of antigen.
  • ELISA and CLEIA enzyme substrate reactions
  • a primary antibody that specifically binds to an antigen is bound to the antigen
  • a secondary antibody having an enzyme is bound to the primary antibody.
  • the antigen is detected or quantified by adding the enzyme substrate and measuring the degree of reaction catalyzed by the enzyme.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 58-11575
  • this method includes a step of incubating the sample and each reagent (ST110, ST130), a step of washing the system (ST120), a step of measuring luminescence (ST140), and the like. It consists of multiple stages and is complicated to operate. Moreover, it is not suitable for large-scale processing where the time required for each stage is extremely long.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and it is an object of the present invention to provide a detection, quantification kit, and a detection and quantification method capable of quickly and inexpensively and simply detecting and quantifying a detection target.
  • One of the problems is to provide a detection and quantification kit that can be detected and quantified with high sensitivity, and a detection and quantification method.
  • the present invention provides the following.
  • a second bound substance in which a second substance having a charge and a second affinity substance for the detection target are bound
  • a kit wherein the first affinity substance and the second affinity substance can simultaneously bind to the detection target at different sites of the detection target.
  • a first substance containing a stimulus-responsive polymer and a first affinity for the detection target; a first binding substance bound to the substance; a second substance having a charge; and a second affinity for the detection target Mixing a second binding substance bound to a substance and the specimen, placing the specimen under conditions where the stimulus-responsive polymer aggregates, and determining whether or not the stimulus-responsive polymer is dispersed,
  • a method wherein the first affinity substance and the second affinity substance can be simultaneously bound to the detection target at different sites of the detection target.
  • the first substance contains a particulate magnetic substance
  • a second binding substance bound to a substance is mixed with the specimen, and the mixture is placed under a predetermined condition in which the stimulus-responsive polymer aggregates.
  • the first substance contains a particulate magnetic substance
  • the first affinity substance and the second affinity substance are bound to the binding target. Therefore, the stimulus-responsive polymer bound to the first affinity substance, A second substance bound to a second affinity substance approaches.
  • the charge portion is arranged in the vicinity of the stimulus-responsive polymer, and thus aggregation of the stimulus-responsive polymer in response to the stimulus is inhibited. Therefore, by observing the presence or absence of this aggregation inhibition, the presence of the detection target You can detect no.
  • the detection target can be quantified by measuring the degree of aggregation inhibition.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a kit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing a usage state of a kit according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a manner of applying magnetic force in the method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a flowchart of a method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the correlation between reaction time and turbidity in the method according to one example of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the correlation between the amount to be detected and turbidity in the method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the correlation between the amount to be detected and turbidity in the method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the correlation between the amount to be detected and turbidity in the method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the correlation between reaction time and turbidity in a method according to another example of the present invention.
  • FIG. 10 is a flowchart of a method according to a conventional example.
  • the kit of the present invention is a kit for detecting and Z or quantifying a detection target, and contains a first binding substance and a second binding substance. Each configuration will be described in detail below.
  • the first bound substance is a combination of the first substance containing the stimulus-responsive polymer and the first affinity substance for the detection target.
  • the first substance used in the present invention contains a stimulus-responsive polymer.
  • This stimulus-responsive polymer undergoes a structural change in response to an external stimulus, and is a polymer capable of adjusting aggregation and dispersion.
  • the stimulus can be any physical or chemical signal, such as temperature, light, acid, base, pH, electricity, etc.
  • the stimulus-responsive polymer is preferably a temperature-responsive polymer that can be aggregated and dispersed by temperature change. Further, it is preferable that the stimulus-responsive polymer does not change its structure even when it is bonded to a molecule having a charge.
  • the temperature-responsive polymer include a polymer having a lower critical solution temperature (hereinafter also referred to as LCST) and a polymer having an upper critical solution temperature.
  • Examples of the polymer having a lower critical solution temperature used in the present invention include N-n-propylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-ethylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-attalyloylpyrrolidine, N-Atarylloylbiperidine, N-Atarylloylmorpholine, N-n-propylmethacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-ethylmethacrylamide, N, N-dimethylmethacrylamide, N-methacryloylpyrrolidine, N- Polymers composed of N-substituted (meth) acrylamide derivatives such as methacryloyl biperidine and N-methacryloylmorpholine; hydroxypropylcellulose, polybule Partially acetylated alcohol, polybutyl methyl ether, (polyoxyethylene polyoxypropylene) block copolymer, polyoxyethylene
  • copolymers of these polymers and their at least two monomer forces can also be used.
  • a copolymer of N-isopropyl acrylamide and N-t butyl acrylamide can also be used.
  • another copolymerizable monomer may be copolymerized with this polymer within a range having a lower critical solution temperature.
  • a polymer comprising at least one monomer selected for its force or a copolymer of N-isopropylacrylamide and N-t-butylacrylamide can be preferably used.
  • polymers having the upper critical solution temperature used in the present invention include polymers having at least one monomer power such as acryloylglycinamide, acryloyl-pecotamide, taliloylasparagine amide, and allyloylglutamine amide. Available. Moreover, the copolymer which also has these at least 2 types of monomer power may be sufficient. These polymers include acrylamide, acetyl acrylamide, biotinol atollate, N-Piotul N, monomethacryl trimethylene amide, acryloyl sarcosine amide, methatalyl sarcosine amide, acryloylmethyl. Other copolymerizable mono, such as uracil The copolymer may be copolymerized in a range having an upper critical solution temperature.
  • monomer power such as acryloylglycinamide, acryloyl-pecotamide, taliloylasparagine
  • the particulate magnetic material used here may be composed of polyhydric alcohol and magnetite.
  • This polyhydric alcohol is not particularly limited as long as it is an alcohol structure that has at least two hydroxyl groups as a structural unit and can bind to iron ions.
  • dextran, polybutyl alcohol, mannitol, sorbitol Examples include cyclodextrins.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-82538 discloses a method for producing a particulate magnetic substance using dextran.
  • a compound having an epoxy group and forming a polyhydric alcohol structure after ring opening such as a glycidyl metatalylate polymer, can also be used.
  • the fine particle magnetic material (magnetic fine particles) prepared using such a polyhydric alcohol preferably has an average particle size of 0.9 nm or more and less than lOOOnm so as to have good dispersibility.
  • the average particle size is preferably 2.9 nm or more and less than 200 nm, especially in order to increase the detection sensitivity of the target detection target!
  • the second binding substance is a combination of a second substance having a charge and a second affinity substance for the detection target.
  • the second substance having a charge is, for example, a hydrophilic polymer compound, and is preferably a polyion or a polycation.
  • the polyarion means a substance having a plurality of cation groups
  • the polycation means a substance having a plurality of cation groups.
  • Examples of polyions include nucleic acids such as DNA and RNA. These nucleic acids have the properties of polyions due to the presence of a plurality of phosphodiester groups along the nucleic acid skeleton.
  • polyions are polymerized with polypeptides containing many carboxylic acid functional groups (polypeptides with amino acid power such as dartamic acid and aspartic acid), polyacrylic acid, polymetatalic acid, and acrylic acid and methacrylic acid.
  • polymers contained as components, polysaccharides such as carboxymethylcellulose, hyaluronic acid, and heparin are also included.
  • examples of poly force thiones include polylysine, polyarginine, polyornithine, polyalkylamine, polyethyleneimine and polypropylethyleneimine.
  • Poly-on The number of functional groups of (carboxyl group) and polycation (amino group) is preferably 25 or more.
  • the first affinity substance of the first binding substance and the second affinity substance of the second binding substance are capable of simultaneously binding to the detection target at different sites of the detection target.
  • the first affinity substance and the second affinity substance may be, for example, monoclonal antibodies that recognize different antigenic determinants to be detected.
  • the antibody used here may be any type of immunoglobulin molecule, and may be an immunoglobulin molecule fragment having an antigen binding site such as Fab.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, but it is preferably two types of monoclonal antibodies having different antigen recognition sites.
  • the first binding substance is prepared by binding the first substance and the first affinity substance.
  • the binding method is not particularly limited.For example, both the first substance side (for example, the stimulus-responsive polymer moiety) and the first affinity substance (for example, the first antibody) side are close to each other. Substances (for example, avidin and piotin, dartathione and dartathione S-transphrase) are bound, and the first substance and the first affinity substance are bound through these substances.
  • the binding of piotin to the stimulus-responsive polymer is performed by bonding piotin or the like to a polymerizable functional group such as a methacryl group or an acrylic group as described in WO 01Z0914 Pamphlet. This can be carried out by adding an addition polymerizable monomer and copolymerizing with another monomer.
  • the binding of avidin or the like to the first affinity substance can be performed according to a conventional method.
  • the piotin-binding stimulus-responsive polymer and the avidin-binding first affinity substance are mixed, the first affinity substance and the stimulus-responsive polymer are bonded through the bond between avidin and piotin.
  • a monomer having a functional group such as a carboxylic acid, an amino group or an epoxy group is copolymerized with another monomer at the time of polymerization of the polymer, and this is known through the functional group.
  • a method of binding an antibody affinity substance for example, melon gel, protein A, protein G
  • an antibody affinity substance for example, melon gel, protein A, protein G
  • a monomer having a functional group such as a carboxylic acid, an amino group, or an epoxy group is copolymerized with another monomer during polymerization of the polymer, and the first antibody against the antigen to be detected is usually used as the functional group.
  • Direct bonding may be performed according to the law.
  • the first affinity substance and the stimulus-responsive polymer may be bound to the particulate magnetic substance.
  • the first bound substance may be purified by subjecting the first substance to conditions in which the stimulus-responsive polymer aggregates and then separating by centrifugation.
  • the first bound product is purified by a method in which a particulate magnetic substance is bound to a stimulus-responsive polymer, a first affinity substance is further bound, and then a magnetic force is applied to recover the magnetic substance. Also good.
  • Bonding between the fine-particle magnetic substance and the stimulus-responsive polymer may be achieved by a method of bonding via a reactive functional group, or by polymerization with active hydrogen on the polyhydric alcohol or polyhydric alcohol in the magnetic substance. It may be carried out by methods well known in the art such as graft polymerization by introducing saturated bonds (for example, ADV. Polym. Sci., Vol. 4, pill, 1965, J. Polymer Sci., Part- A, 3, pl031, 1965).
  • the second binding substance is produced by binding the second substance and the second affinity substance directly or indirectly.
  • substances that are compatible with each other for example, avidin and piotin, dartathione and dartathione S transferase
  • the second substance side and the second affinity substance side for example, the second antibody side.
  • the second substance and the second affinity substance are directly bonded, they may be bonded via a functional group.
  • a functional group the method of Gosh et al. (Ghosh et al : Bioc onjugate Chem., 1, 71-76, 1990). Specifically, there are the following two methods.
  • a mercapto group also known as a sulfhydryl group
  • EMCS 6-maleimidohexanoic acid succinimide ester
  • a mercapto group is introduced into the 5 'end of the nucleic acid in the same manner as in the first method, and N, N-1, 1, which is a homobifunctional reagent, is further added to this mercapto group.
  • a maleimide group is introduced at the 5 'end of the nucleic acid by reacting with 2-phenol-maleimide, while a mercapto group is introduced into the antibody.
  • these two substances are bonded through a mercapto group and a maleimide group.
  • an oligonucleotide is reacted with cystamine, carpositimide and 1-methylimidazole to form a mercapto group at the hydroxyl group at the 5 'end of the oligonucleotide. Is introduced. After purification of the oligonucleotide into which the mercapto group has been introduced, reduction with dithiothreitol, followed by the addition of 2,2, -dipyridyldisulfide via the disulfide bond at the 5, terminal end of the oligonucleotide. Introduce pyridyl group.
  • a mercapto group is introduced by reacting with iminothalylene.
  • the oligonucleotide introduced with the pyridyl disulfide group and the protein introduced with the mercapto group are mixed and the pyridyl group and the mercapto group are specifically reacted to bind the protein and the oligonucleotide.
  • first reactive group that can react with a functional group (for example, an amino group) in a protein
  • a second reactive group for example, a maleimide group
  • a second reactive group is introduced into the protein to obtain a previously activated protein reagent.
  • the tank reagent thus obtained is covalently bound to the mercapto group of the thiol polynucleotide.
  • the second conjugate can be prepared by introducing a mercapto group at these ends and the like in the same manner as described above.
  • the kit produced in this way can be used for detecting and Z or quantifying the detection target by the following method, for example.
  • the detection method of the present invention comprises a step of first mixing a first bound substance, a second bound substance and a specimen, and determining whether or not the stimulus-responsive polymer is dispersed under conditions where the stimulus-responsive polymer aggregates. Including. Details of the procedure will be described below.
  • the first bound substance and the second bound substance are mixed in a container, and a sample is added to obtain a mixture. Subsequently, the mixture is subjected to conditions in which the stimulus-responsive polymer aggregates. Then, when the detection target is present, the stimulus-responsive polymer is dispersed and inhibited by the charge in the second binding substance, whereas when the detection target is not present, the stimulus-responsive polymer is inhibited from aggregation. Instead, they will aggregate.
  • the first conjugate 10 contains a stimulus-responsive polymer 11, and the stimulus-responsive polymer 11 is connected to the first target 50 to be detected via avidin 15 and piotin 17. It is bound to antibody 13. Further, the first bonded material 10 includes a particulate magnetic material 19, and the stimulus-responsive polymer 11 is bonded to the surface of the magnetic material 19. On the other hand, the second bound substance 20 includes a second substance 21 having a negative charge, and this second substance 21 is detected by the detection pair. Conjugated to a second antibody 23 against elephant 50. The first antibody 13 and the second antibody 23 can simultaneously bind to the detection target 50 at different sites of the detection target 50.
  • the container containing the mixed solution may be transferred to a thermostatic bath at a temperature at which the temperature-responsive polymer aggregates.
  • a pH-responsive polymer an acid solution or an alkali solution may be added to a container containing a mixed solution.
  • the container containing the mixed solution may be irradiated with light having a wavelength capable of aggregating the polymer.
  • the aggregation of the temperature-responsive polymer may be performed before the first bound substance and the second bound substance are bound to the detection target, or may be performed in parallel. The latter is preferable in that the time can be shortened. However, the former is preferred when the conditions under which the temperature-responsive polymer aggregates are significantly different from the conditions under which the first bound substance and the second bound substance bind to the detection target.
  • the lower critical solution temperature and the upper critical solution temperature are determined as follows, for example. First, put the sample in the cell of the absorptiometer and heat the sample at a rate of 1 ° CZ. During this time, the change in transmittance at 550 nm is recorded.
  • the transmittance when the polymer is transparently dissolved is 100% and when the transmittance when the polymer is completely aggregated is 0%, the temperature at which the transmittance is 50% is obtained as LCST.
  • Determination of the presence or absence of dispersion can be performed, for example, by visual observation or turbidity measurement. Turbidity can be calculated from the light transmittance of the light scattering device. If the turbidity is low, aggregation of the stimulus-responsive polymer is inhibited, suggesting the presence of the detection substance.
  • the wavelength of the light to be used may be appropriately set so as to obtain a desired detection sensitivity in accordance with the particle size of the magnetic substance.
  • the wavelength of light should be within the visible light range (for example, 550 nm) in that a conventional general-purpose device can be used. Are preferred.
  • Visual observation or turbidity measurement may be performed intermittently at a certain point in time or continuously over time. You can also make a judgment based on the difference between the measured turbidity at one time and the measured turbidity at another time.
  • the quantification method of the present invention first, the first binding substance, the second binding substance, and the specimen are mixed, and the mixture is subjected to a predetermined condition in which the stimulus-responsive polymer aggregates.
  • the amount of the detection target in the sample is calculated based on the correlation equation under the predetermined condition between the amount of the detection target and the turbidity. Since the procedure in the first half is similar to the detection method described above, the explanation is omitted.
  • a correlation equation between the amount of detection target and turbidity under the same condition as the predetermined condition is created.
  • the more reliable the data the more reliable the correlation formula is obtained. Therefore, it is preferable that the data is related to the amount of the detection target of 2 or more, and is preferably related to the amount of the detection target of 3 or more.
  • the correlation equation between the amount of detection target and turbidity is not only an equation showing a direct correlation between the amount of detection target and turbidity, but also a parameter reflecting the amount of detection target and turbidity. It is a correlation equation.
  • the amount of detection target in the sample can be calculated.
  • the detection method or quantification method of the present invention further includes separating the aggregated magnetic substance by applying a magnetic force.
  • the agglomerated magnetic material is separated from the foreign material containing the non-aggregated magnetic material.
  • the measurement values such as the amount of the separated magnetic substance and the light transmittance when dispersed in the solvent exclude the influence of contaminants, and more accurately reflect the presence of the detection substance.
  • Magnetic force can be applied by bringing a magnet close to a magnetic substance. The magnetic force of this magnet varies depending on the magnitude of the magnetic force of the magnetic material used.
  • An example of the magnet is a neodymium magnet manufactured by Madana.
  • the magnetic force may be applied before the determination or in parallel with the determination, but the simultaneous parallel is preferable in that the time spent in the process can be reduced.
  • the aggregated magnetic substance is separated by inclusion of impurities, so the turbidity of the mixture after separation is rather small when there are impurities! It is guessed.
  • turbidity measurement in the detection method or quantitative method includes not only measuring turbidity directly but also measuring a parameter reflecting turbidity.
  • Such parameters include differences in turbidity measurements at multiple time points, the amount of separated aggregates, the turbidity of non-aggregates after separation, and the like.
  • one of the plurality of time points is in the vicinity of the time point at which the turbidity reaches a maximum value when a magnetic force is applied to a negative control having no detection target.
  • the difference from the turbidity measurement value at another point in time becomes large, and the amount of the detection target can be quantified more accurately.
  • Examples of the detection target in the sample include substances used for clinical diagnosis, specifically, human immunoglobulin G, human immunoglobulin M, human immunoglobulin A, contained in body fluid, urine, sputum, feces, etc.
  • Human immunoglobulin E human albumin, human fibrinogen (fibrin and their degradation products), a-fetoprotein (AFP), C-reactive protein (C RP), myoglobin, carcinoembryonic antigen, hepatitis virus antigen, Human chorionic gonadotropin (hCG), human placental ratatogen (HPL), HIV virus antigen, allergen, bacterial toxin, bacterial antigen, enzyme, hormone (eg, human thyroid stimulating hormone (TSH), insulin, etc.), drug, etc. Is mentioned.
  • the reagent kit includes, for example, the following reagents.
  • Antigen detection reagent kit Reagent A: Temperature-responsive polymer with a finely divided magnetic substance and a first antibody that specifically binds to the antigen to be detected
  • Reagent B A charged compound that recognizes a different site from the first antibody and can simultaneously bind to the antigen to be detected.
  • Reagent C Standard product of the substance to be measured (Specific examples include purified antigen)
  • Reagent D Dilution buffer (a buffer that can be used for dilution of the above reagents and for dilution of the sample to be measured) O Tris-HCl buffer, phosphate buffer, etc.)
  • the container can be kept at a temperature at which the polymer aggregates.
  • a conventionally well-known apparatus capable of irradiating transmitted light of up to 900 nm can be used.
  • the kit having the above-described reagent ability can be used, for example, by the following method.
  • reagent A5 ⁇ : LOOO / zL and reagent B5 ⁇ : LOOO / zL are mixed.
  • a solution containing Reagent A and Reagent B (1) a positive control to which a standard sample of the substance to be measured is added, (2) a negative control to which nothing is added, (3) 5 to 5 of the test solution: LOOO / A sample to which z L has been added is prepared and reacted at a temperature at which the polymer is dispersed (for example, about 0 to 30 ° C.) for a certain period of time.
  • reaction solution is put into a container kept at the aggregation temperature of the polymer (for example, 42 ° C), turbidity is measured by irradiating 550 nm transmitted light, and Determine presence or absence or quantitate antigen.
  • reagent A is reacted with the above (1), (2), and (3) for a certain period of time at a temperature at which the polymer is dispersed, and then reagent B is added to After the time reaction, put the reaction solution in a container kept at the aggregation temperature, measure the turbidity by irradiating with 550 nm transmitted light, determine the presence or absence of antigen, or quantify the antigen.
  • TSH human thyroid stimulating hormone
  • streptavidin is particulate magnetic substance bound Madanabito Co., Ltd.-made Therma- Max LSA Streptavidin (the 0.4 mass 0/0) 250 L to 1. 5 mL microtube, the microtube 42 Therma-Max LSA Streptavidin was aggregated by heating to ° C., collected with a magnet, and then the supernatant was removed. To this was added TBS buffer (20 mM Tris—HC1, 150 mM NaCl, pH 7.5) 250 ⁇ , and the aggregate was dispersed by cooling.
  • a piotin-labeled anti-TSH jS antibody 50 / dissolved in PBS buffer (0.01 M phosphate buffer, 0.0071 ⁇ potassium, 0.137 M salt sodium, pH 7.4) was added.
  • z UO. 75mgZmL was added and mixed by inversion for 15 minutes at room temperature.
  • the microtube was heated to 42 ° C to aggregate Therma—Max LSA Strepta vidin and collected with a magnet, and then the supernatant was removed to separate excess piotin-labeled anti-TSH beta antibody (BZF separation).
  • TBS buffer 250 L was added here and cooled to disperse the aggregates.
  • antibody (clone: 176 mouse, mouse IgG, manufactured by Leinco Technology, Inc., lmg / mL) as a second affinity substance for human thyroid stimulating hormone (TSH) as a detection target 2 mg of mercaptoethanol 6 mg
  • TSH human thyroid stimulating hormone
  • the reaction was carried out at 37 ° C for 120 minutes.
  • dialyz against Slide-A-Lyzer (trade name) dialysis cassette, 10K MWCO (Pierce) against 500 mL of PBS buffer, remove excess 2 mercaptoethanol, and limit the molecular weight of 10000 ultrafiltration membrane (MILLIPORE [Amicon Ultra 4 Ultracel 100k]) was used to concentrate to 0.5 mL to obtain a mouse anti-TSH ⁇ antibody reduced antibody.
  • This labeled antibody (this antibody is also referred to as a polyacrylic acid anti-TSH a antibody conjugate) was added to 0.5% (wZv) BSA (manufactured by Sigma), 0.5% (wZv) Tween (registered trademark) 20ZPBS ( A second conjugate was prepared by diluting to a protein concentration of 4 g / mL with an aqueous solution of pH 7.4), 10 mM EDTA.
  • the maleimidated sodium polyacrylate was prepared as follows.
  • reaction solution was concentrated under reduced pressure to 10 mL and reprecipitated with jetyl ether until a viscous product became powdery.
  • the white precipitate was filtered off, further by 1 ⁇ dried in a vacuum dryer to obtain amino group-terminated polyacrylic acid (yield 1. 5 g) 0 then the amino group terminated polyacrylate was maleimidated.
  • a 50 mL eggplant flask equipped with a nitrogen gas inlet tube and a stirrer 0.5 g of amino group-terminated polyacrylic acid and 10 mL of N, N-dimethylformamide were dissolved.
  • a neodymium permanent magnet 73 (made by Seiko Sangyo Co., Ltd.) having a size of 5 mm ⁇ 9 m ⁇ 2 mm was attached outside the optical path of a conventionally used semi-micro cell 71 for a spectrophotometer.
  • This cell 71 was placed in a visible ultraviolet spectrophotometer UV-3101PC (manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a cell temperature controller, and kept at 37 ° C. for 10 minutes or more.
  • FIG. 4 is a flowchart showing the procedure of the quantification method according to the embodiment.
  • the quantification method includes a step (ST10) of mixing the first bound substance, the second bound substance and the sample, and a step of measuring the turbidity of the mixture (ST20).
  • the difference in measured values between two points of 0 seconds, 600 seconds, and 1000 seconds all depended on the amount of TSH.
  • the difference between the measured value at 600 seconds and the measured value at 1000 seconds was the largest and could be detected or quantified with the highest sensitivity. This ensures that the turbidity is highest when a magnetic force is applied to a negative control (ie, zero TSH). It was confirmed that it was preferable to select the vicinity of the time point (600 seconds) at which the value was large as one of the measurement time points.
  • the turbidity of a sample with zero TSH was the same as in Example 1, except that a neodymium permanent magnet 73 (made by Seiko Sangyo Co., Ltd.) was attached outside the optical path of the semi-micro cell 71 for spectrophotometers. Was measured. This result is shown in FIG. 9 together with the turbidity of the sample with zero TSH in Example 1.
  • Example 1 and Example 2 were substantially equal until about 600 seconds, and the turbidity in Example 2 was saturated after about 600 seconds.
  • This result shows that the time up to about 600 seconds can be detected or quantified with a constant high sensitivity without adding a magnetic force, and when detecting or quantifying with a higher sensitivity, the magnetic force is applied and the time is about 600 seconds. This suggests that the difference between the measured value and the measured value after that point should be used.
  • the detection limit value was 0.0025-0.005 mIUZL. As a result, it was confirmed that the example that could be detected with 0.0001 mIUZL has much higher detection sensitivity than the conventional system.
  • the present invention is a system for measuring turbidity without using an enzyme substrate reaction, and thus has a much higher detection sensitivity than conventional systems while being simple in procedure. Moreover, it was shown that it has an epoch-making effect that detection and quantification can be completed in a short time.
  • the resulting reaction solution was concentrated under reduced pressure, and the resulting solid was dissolved in acetone and reprecipitated with jetyl ether.
  • the white precipitate was filtered and further dried with a vacuum drier for 1 kg to obtain 11.84 g of piotin-containing poly (N-isopropylacrylamide).
  • the molecular weight of the resulting polytin-containing poly (N-isopropylacrylamide) is approximately 29000 (Shodex GPC LF-804, 8mm ID. X 300m m, mobile phase THF).
  • N- (3-aminopropyl) methacrylamide hydrochloride 24 g of piotin and 30 g of triethylamine were dissolved in 300 ml of N, N dimethylformamide (DMF) and cooled to 0 ° C.
  • a solution prepared by dissolving 28 g of diphenylphosphorozide in 50 ml of DMF was added dropwise to the mixture over 1 hour. After completion of dropping, the mixture was stirred at 0 ° C for 3 hours, and further stirred at room temperature (20 ° C) for 12 hours. Thereafter, the solvent was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by column chromatography using a mixed solvent of chloroform and methanol.
  • N-Piotinyl N′-methacryloyl trimethyleneamide was obtained.
  • Piotin-containing poly (N-isopropylacrylamide) lOOmg was dissolved in 10 mL of TBS buffer to a concentration of 0.1% (w / v). 0.1% (w / v) Piotin-containing poly (N-isopropylacrylamide) Strept dissolved in purified water (water purified with Direc t Q (trade name) manufactured by MILLIPORE) to 3mg and 10mg / mL
  • a TBS solution of streptavidin-bound poly ( ⁇ isopropylacrylamide) was obtained.
  • a polyacrylic acid anti-TSH ⁇ antibody conjugate was prepared in the same manner as in Example 2, except that mouse anti-TSH ⁇ antibody was used instead of mouse anti-TSH a antibody.
  • TBS solutions 25 ⁇ l were prepared in four 1.5 mL tubes (a, b, c, and d).
  • Vitros TS H Calibrator 1 Oso 'Tari-Cal' Diagnostics, product code 06 5002
  • 5 ⁇ L and TBS solution of each concentration of TBS 10 L (a is TSH concentration 0 , B is TSH concentration 0.001 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ c is TSH concentration 0.01 ⁇ g / ⁇ L, d is TSH concentration 0.1 g / L), and TBS buffer 165 L And left on ice for 5 minutes.
  • 8 antibody conjugate was added to each tube, and the tube was allowed to stand on ice for 30 minutes to obtain a measurement sample.
  • the cell holder of the spectrophotometer UVmini (manufactured by Shimadzu Corporation) was kept at 31.5 ° C in a thermostatic bath.
  • a quartz cell with no sample (QS, Hella, optical path length 10 mm) was placed on a cell holder and allowed to stand for 5 minutes. Thereafter, 200 L of the measurement sample in the tube a was placed in the quartz cell, and the absorbance was measured 6 minutes later.
  • the absorbance was measured in the same procedure. As a result, the absorbance was 0.216, b force .199, c force SO.176, d force SO.168.
  • the absorbance changes according to the TSH concentration in other words, the TSH concentration can be quantified by measuring the absorbance. That is, the method according to the present invention is a novel method that can detect and quantify a detection target quickly, inexpensively, and easily without requiring special reagents and equipment such as secondary antibodies, luminescent reagents, and luminescence detection devices. It was confirmed.

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Description

明 細 書
検出対象の検出、定量用キット、及び検出、定量方法
技術分野
[0001] 本発明は、検出対象の検出、定量用キット、及び検出、定量方法に関する。
背景技術
[0002] 従来から、被検体中の検出対象を検出する方法として、ラテックス凝集法が行われ てきた。ラテックス凝集法とは、生体試料等の流体中における抗原を検出する場合、 流体と、抗原に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させたラテック スとを混合して、ラテックスの凝集の程度を測定することにより、抗原を検出又は定量 する方法である（例えば、特許文献 1参照)。
[0003] このラテックス凝集法によれば、検体として添加された抗原が複数のラテックス結合 抗体を架橋させ、ラテックスの凝集を促す。このように手順が単純であるから、簡便且 つ迅速に抗原を検出できる。しかし、抗原が微量の場合、その架橋が起こりにくいた め、ラテックスが十分に凝集しない。このため、微量の抗原を検出することが困難であ つた o
[0004] そこで、 ELISA法や CLEIA法といった酵素基質反応を利用する方法も広く採用さ れている。これらの方法では、例えば、抗原に特異的に結合する一次抗体を抗原に 結合させ、この一次抗体に酵素を有する二次抗体を結合させる。ここで、酵素の基質 を添加し、酵素が触媒する反応の程度を測定することで、抗原を検出又は定量する
[0005] これらの方法によれば、例えば基質として発光試薬を用いると、基質添加後の発光 の検出感度が高いため、微量の抗原も検出できる。
特許文献 1：特公昭 58—11575号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] しかし、酵素基質反応を利用する方法では、二次抗体、発光試薬、発光検出装置 等の特殊な試薬、機器が必須であり、作業コストが高い。 [0007] また、図 10に示すように、この方法は、試料及び各試薬をインキュベーションするェ 程（ST110、 ST130)、系を洗浄する工程（ST120)、発光を測定する工程（ST140 )等の多段階からなっており、操作が煩雑である。しかも、各段階に要する時間が極 めて長ぐ大規模処理には適さない。
[0008] 本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、検出対象を迅速、安価且つ 簡便に検出、定量できる検出、定量用キット、及び検出、定量方法を提供することを 課題の一つとし、更には高感度で検出、定量できる検出、定量用キット、及び検出、 定量方法を提供することを課題の一つとする。
課題を解決するための手段
[0009] 発明者らは、電荷を有する化合物を接近させると、刺激応答性ポリマーの凝集が阻 害されることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、本発明は以下の ようなものを提供する。
[0010] [1]検出対象を検出及び Z又は定量するためのキットであって、
刺激応答性ポリマーを含有する第 1の物質と前記検出対象に対する第 1の親和性 物質とが結合した第 1の結合物と、
電荷を有する第 2の物質と前記検出対象に対する第 2の親和性物質とが結合した 第 2の結合物と、を含み、
第 1の親和性物質と第 2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、 同時に前記検出対象に結合できることを特徴とするキット。
[2]第 1の物質が、微粒子状の磁性物質を含むことを特徴とする [1]に記載のキット
[3]第 2の物質が、親水性の高分子化合物であることを特徴とする [1]又は [2]に 記載のキット。
[4]第 2の物質が、ポリア-オン又はポリカチオンであることを特徴とする [1]〜 [3] の!、ずれか 1項に記載のキット。
[5]ポリア-オン力 核酸又はポリアクリル酸であることを特徴とする [4]に記載のキ ッ卜。
[6]ポリカチオン力 ポリアルキルアミン又はポリエチレンィミンであることを特徴とす る [4]に記載のキット。
[7]検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第 1の物質と前記検出対象に対する第 1の親和性 物質とが結合した第 1の結合物と、電荷を有する第 2の物質と前記検出対象に対する 第 2の親和性物質とが結合した第 2の結合物と、前記検体とを混合し、刺激応答性ポ リマーが凝集する条件下におき、前記刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する 工程を含み、
第 1の親和性物質と第 2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、 同時に前記検出対象に結合できることを特徴とする方法。
[8]第 1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む ことを特徴とする [7]に記載の方法。
[9]検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第 1の物質と前記検出対象に対する第 1の親和性 物質とが結合した第 1の結合物と、電荷を有する第 2の物質と前記検出対象に対する 第 2の親和性物質とが結合した第 2の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を 刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下にお ける相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
[10]第 1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む ことを特徴とする [9]に記載の方法。
発明の効果
本発明によれば、検出対象が存在すると、この結合対象に第 1の親和性物質及び 第 2の親和性物質が結合するため、第 1の親和性物質に結合した刺激応答性ポリマ 一と、第 2の親和性物質に結合した第 2の物質が接近する。これにより、電荷部分が 刺激応答性ポリマーの近傍に配置されるため、刺激に応答した刺激応答性ポリマー の凝集が阻害される。従って、この凝集阻害の有無を観察することで、検出対象の存 否を検出できる。また、凝集阻害の程度を測定することで、検出対象を定量できる。
[0012] 以上の手順は、いずれも特殊な試薬、機器を特に使用することなく行うことができ、 安価且つ簡便である。また、凝集阻害の程度を測定するだけであり、酵素によって触 媒される反応を利用する系ではないから、迅速に行うことができる。また、第 2の物質 が有する電荷部分が刺激応答性ポリマーの凝集を高度に阻害するので、高感度で 検出対象を検出、定量できる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]本発明の一実施形態に係るキットの概略構成図である。
[図 2]本発明の一実施形態に係るキットの使用状態を示す模式図である。
[図 3]本発明の一実施例に係る方法における磁力の付加の態様を示す図である。
[図 4]本発明の一実施例に係る方法のフローチャートである。
[図 5]本発明の一実施例に係る方法における反応時間と濁度との相関性を示すダラ フである。
[図 6]本発明の一実施例に係る方法における検出対象量と濁度との相関性を示すグ ラフである。
[図 7]本発明の一実施例に係る方法における検出対象量と濁度との相関性を示すグ ラフである。
[図 8]本発明の一実施例に係る方法における検出対象量と濁度との相関性を示すグ ラフである。
[図 9]本発明の別の実施例に係る方法における反応時間と濁度との相関性を示すグ ラフである。
[図 10]従来例に係る方法のフローチャートである。
符号の説明
[0014] 10 第 1の結合物
11 刺激応答性ポリマー
13 第 1の抗体 (第 1の親和性物質）
19 磁性物質
20 第 2の結合物 21 第 2の物質
23 第 2の抗体 (第 2の親和性物質）
50 検出対象
発明を実施するための形態
[0015] 以下、本発明の一実施形態について、図面を参照しながら説明する。
[0016] <キット >
本発明のキットは、検出対象を検出及び Z又は定量するためのキットであって、第 1 の結合物と、第 2の結合物とを含有する。各構成について、以下詳細に説明する。
[0017] 〔第 1の結合物〕
第 1の結合物は、刺激応答性ポリマーを含有する第 1の物質と、検出対象に対する 第 1の親和性物質とが結合したものである。
[0018] (第 1の物質）
本発明で用いられる第 1の物質は刺激応答性ポリマーを含有するところ、この刺激 応答性ポリマーは、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整 できるポリマーである。刺激は、特に限定されないが、温度、光、酸、塩基、 pH、電気 等の様々な物理的、あるいは化学的信号であってよ!、。
[0019] 特に、本発明では、刺激応答性ポリマーは、温度変化によって凝集及び分散可能 な温度応答性ポリマーであることが好ましい。また、刺激応答性ポリマーは、電荷を有 する分子と結合しても構造変化しないことが好ましい。なお、温度応答性ポリマーとし ては、下限臨界溶液温度 (以下、 LCSTとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶 液温度を有するポリマーが挙げられる。
[0020] 本発明で用いられる下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、 N—n—プロピ ルアクリルアミド、 N—イソプロピルアクリルアミド、 N—ェチルアクリルアミド、 N、 N— ジメチルアクリルアミド、 N—アタリロイルピロリジン、 N—アタリロイルビペリジン、 N— アタリロイルモルホリン、 N—n—プロピルメタクリルアミド、 N—イソプロピルメタクリル アミド、 N—ェチルメタクリルアミド、 N、 N—ジメチルメタクリルアミド、 N—メタクリロイ ルピロリジン、 N—メタクリロイルビペリジン、 N—メタクリロイルモルホリン等の N置換（ メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビュル アルコール部分酢化物、ポリビュルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン ポリオキ シプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシェ チレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシ エチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノ-ルフエ-ルエーテル）ァ タリレート、（ポリオキシエチレンォクチルフエ-ルエーテル)メタタリレート等の（ポリオ キシエチレンアルキルフエ-ルエーテル）（メタ）アタリレート類；及び（ポリオキシェチ レンラウリルエーテル）アタリレート、（ポリオキシエチレンォレイルエーテル)メタクリレ ート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アタリレート類等のポリオキシ エチレン (メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及 びこれらの少なくとも 2種のモノマー力もなるコポリマーも利用できる。また、 N—イソプ 口ピルアクリルアミドと N— t ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）ァ クリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合 可能なモノマーを、下限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。本発明で は、なかでも、 N—n—プロピルアクリルアミド、 N—イソプロピルアクリルアミド、 N—ェ チルアクリルアミド、 N、 N ジメチルアクリルアミド、 N アタリロイルピロリジン、 N— アタリロイルビペリジン、 N—アタリロイルモルホリン、 N—n—プロピルメタクリルアミド、 N—イソプロピルメタクリルアミド、 N ェチルメタクリルアミド、 N、 N ジメチルメタタリ ルアミド、 N—メタクリロイルビ口リジン、 N—メタクリロイルビペリジン、 N—メタタリロイ ルモルホリンからなる群力も選ばれる少なくとも 1種のモノマーからなるポリマー又は N イソプロピルアクリルアミドと N— t ブチルアクリルアミドのコポリマーが好ましく利 用できる。
本発明で用いられる上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、ァクロィルグリシ ンアミド、ァクロィル-ペコタミド、アタリロイルァスパラギンアミド及びアタリロイルグル タミンアミド等カもなる群力も選ばれる少なくとも 1種のモノマー力もなるポリマーが利 用できる。また、これらの少なくとも 2種のモノマー力もなるコポリマーであってもよい。 これらのポリマーには、アクリルアミド、ァセチルアクリルアミド、ビォチノールアタリレー ト、 N—ピオチュル N，一メタクロィルトリメチレンアミド、ァクロイルザルコシンアミド、 メタタリルザルコシンアミド、ァクロィルメチルゥラシル等、その他の共重合可能なモノ マーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよ 、。
[0022] (微粒子状の磁性物質）
ここで用いる微粒子状の磁性物質は、多価アルコールとマグネタイトとで構成されて よい。この多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも 2個有し且つ鉄イオンと 結合可能なアルコール構造体である限りにおいて特に限定されず、例えば、デキスト ラン、ポリビュルアルコール、マン-トール、ソルビトール、シクロデキストリンが挙げら れる。例えば特開 2005— 82538公報には、デキストランを用いた微粒子状の磁性 物質の製造方法が開示されている。また、グリジジルメタタリレート重合体のようにェ ポキシ基を有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。この ような多価アルコールを用いて調製された微粒子状の磁性物質 (磁性微粒子）は、良 好な分散性を有するように、その平均粒径が 0. 9nm以上 lOOOnm未満であることが 好ましい。平均粒径は、特に目的とする検出対象の検出感度を高めるためには、 2. 9nm以上 200nm未満であることが好まし!/、。
[0023] 〔第 2の結合物〕
第 2の結合物は、電荷を有する第 2の物質と、検出対象に対する第 2の親和性物質 とが結合したものである。
[0024] (第 2の物質）
電荷を有する第 2の物質は、例えば親水性の高分子化合物であり、ポリア-オン又 はポリカチオンであることが好まし 、。ポリア-オンとは複数のァ-オン基を有する物 質を意味し、ポリカチオンとは複数のカチオン基を有する物質を意味する。ポリア- オンの例として、 DN A及び RN A等の核酸が挙げられる。これらの核酸は、核酸骨格 に沿って複数個のホスホジエステル基が存在することにより、ポリア-オンの性質を有 する。また、ポリア-オンには、多数のカルボン酸官能基を含むポリペプチド (ダルタミ ン酸、ァスパラギン酸等のアミノ酸力 なるポリペプチド）、ポリアクリル酸、ポリメタタリ ル酸、及びアクリル酸ゃメタクリル酸を重合成分として含有するポリマー、カルボキシ メチルセルロース、ヒアルロン酸、及びへパリン等の多糖等も含まれる。一方、ポリ力 チオンの例としては、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオル二チン、ポリアルキルアミン 、ポリエチレンイミンゃポリプロピルエチレンィミン等が挙げられる。なお、ポリア-オン (カルボキシル基)やポリカチオン (ァミノ基)の官能基数は、 25個以上が好ま 、。
[0025] (第 1の親和性物質、第 2の親和性物質）
第 1の結合物の第 1の親和性物質、及び第 2の結合物の第 2の親和性物質は、検 出対象の異なる部位において、同時に検出対象に結合できるものである。第 1の親 和性物質及び第 2の親和性物質は、例えば、検出対象の異なる抗原決定基を認識 するモノクローナル抗体であってよ 、。
[0026] ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよぐ Fab等の 抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。また、抗体は、モノク ローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよ ヽが、異なる抗原認識部位を有する 2種 類のモノクローナル抗体であることが好まし 、。
[0027] 〔作製方法〕
以上のキットの作成方法を説明する。
[0028] [第 1の結合物の作製]
第 1の結合物は、第 1の物質と第 1の親和性物質とを結合することによって作製する 。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、第 1の物質側 (例えば刺激応答性 ポリマー部分)及び第 1の親和性物質 (例えば、第 1の抗体)側の双方に、互いに親 和性の物質 (例えば、アビジン及びピオチン、ダルタチオン及びダルタチオン Sトラン スフエラーゼ)を結合させ、これら物質を介して第 1の物質及び第 1の親和性物質を 結合させる。
[0029] 具体的には、刺激応答性ポリマーへのピオチンの結合は、国際公開第 01Z0914 1号パンフレットに記載されているように、ピオチン等をメタクリル基やアクリル基等の 重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合すること により行うことができる。また、第 1の親和性物質へのアビジン等の結合は常法に従つ て行うことができる。次に、ピオチン結合刺激応答性ポリマー及びアビジン結合第 1の 親和性物質を混合すると、アビジンとピオチンとの結合を介して、第 1の親和性物質 及び刺激応答性ポリマーが結合する。
[0030] 別法として、ポリマーの重合時にカルボン酸、アミノ基又はエポキシ基等の官能基 を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介し、当技術分野で周知 の方法に従って抗体親和性物質 (例えば、メロンゲル、プロテイン A、プロテイン G)を ポリマーに結合させる方法が利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質に 第 1の抗体を結合させることにより、刺激応答性ポリマーと、検出対象の抗原に対す る第 1の抗体との第 1の結合物が作製される。
[0031] あるいは、ポリマーの重合時にカルボン酸、アミノ基又はエポキシ基等の官能基を 有するモノマーを他のモノマーと共重合させ、これらの官能基に検出対象の抗原に 対する第 1の抗体を常法に従って直接結合させてもよい。
[0032] あるいは、微粒子状の磁性物質に第 1の親和性物質及び刺激応答性ポリマーを結 合させてもよい。
[0033] 第 1の物質を刺激応答性ポリマーが凝集する条件においた後、遠心分離によって 分離することで、第 1の結合物を精製してもよい。第 1の結合物の精製は、刺激応答 性ポリマーに微粒子状の磁性物質を結合させ、更に第 1の親和性物質を結合させた 後、磁力を付加して磁性物質を回収する方法によって行ってもよい。
[0034] 微粒子状の磁性物質と刺激応答性ポリマーとの結合は、反応性官能基を介して結 合する方法や、磁性物質中の多価アルコール上の活性水素又は多価アルコールに 重合性不飽和結合を導入してグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法 で行ってよい（例えば、 ADV. Polym. Sci.、 Vol. 4、 pi l l, 1965や J. Polymer Sci.、 Part -A, 3、 pl031、 1965参照）。
[0035] 次に、電荷を有する第 2の物質と、検出対象の抗原に対する第 2の抗体とを結合さ せ第 2の結合物を作製する方法につ 、て記述する。
[0036] [第 2の結合物の作製]
第 2の結合物は、第 2の物質と第 2の親和性物質とを直接又は間接に結合すること によって作製する。特に限定されないが、例えば、第 2の物質側及び第 2の親和性物 質 (例えば、第 2の抗体)側の双方に、互いに親和性の物質 (例えば、アビジン及び ピオチン、ダルタチオン及びダルタチオン Sトランスフェラーゼ）を結合させ、これら物 質を介して第 2の物質及び第 2の親和性物質を間接的に結合させる。
[0037] 第 2の物質と第 2の親和性物質とを直接的に結合させる場合、官能基を介して結合 させてもよぐ例えば、官能基を用いる場合、ゴッシュらの方法 (Ghosh et al : Bioc onjugate Chem.、 1、 71— 76、 1990)のマレイミドーチオールカップリングに 従って結合できる。具体的には、以下の 2つの方法が挙げられる。
[0038] 第 1の方法では、まず、核酸の 5 '末端にメルカプト基 (別名、スルフヒドリル基)を導 入する一方、抗体に 6—マレイミドへキサノイツクアシッドスクシンイミドエステル (例え ば、「EMCS (商品名）」（同仁ィ匕学研究所社製)）を反応させてマレイミド基を導入す る。次に、これら 2種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を介して結合させる。
[0039] 第 2の方法では、まず、第 1の方法と同様にして核酸の 5 '末端にメルカプト基を導 入し、このメルカプト基に更にホモ二官能性試薬である N, N- 1, 2—フエ-レンジマ レイミドと反応させることによって核酸の 5 '末端にマレイミド基を導入する一方、抗体 にメルカプト基を導入する。次に、これら 2種の物質をメルカプト基及びマレイミド基を 介して結合させる。
[0040] この他に、核酸をタンパク質に導入する方法としては、例えば、 Nucleic Acids R esearch 第 15卷 5275頁（1987年；)及び Nucleic Acids Research 第 16卷 36 71頁（1988年）に記載された方法が知られている。これらの技術は核酸と抗体の結 合に応用できる。
[0041] Nucleic Acids Research 第 16卷 3671頁（1988年）によると、まず、オリゴヌク レオチドを、シスタミン、カルポジイミド及び 1ーメチルイミダゾールと反応させることに よって、オリゴヌクレオチドの 5 '末端の水酸基にメルカプト基を導入する。メルカプト 基を導入したオリゴヌクレオチドを精製した後、ジチオトレイトールを用いて還元し、こ の後に 2、 2，ージピリジルジスルフイドを加えることによってオリゴヌクレオチドの 5，末 端にジスルフイド結合を介してピリジル基を導入する。一方、タンパク質に対しては、 イミノチアレンを反応させてメルカプト基を導入しておく。これらピリジルジスルフイド基 を導入したオリゴヌクレオチドとメルカプト基を導入したタンパク質を混合し、ピリジル 基とメルカプト基を特異的に反応させてタンパク質とオリゴヌクレオチドを結合させる。
[0042] Nulcleic Acids Reseach 第 15卷 5275頁（1987年）によると、まず、オリゴヌク レオチドの 3，末端にアミノ基を導入しておき、ホモ二官能性試薬であるジチオービス -プロピオニックアシッド N ヒドロキシスクシンイミドエステル（略称：ジチォ ビス プロピオ-ルー NHS)を反応させる。反応後、ジチオトレイトールを添加することに よりジチォ ビス プロピオ-ル NHS分子中のジスルフイド結合を還元して、オリ ゴヌクレオチドの 3，末端にメルカプト基を導入する。タンパク質の処理については、 特開平 5— 48100号公報に示すようなヘテロ二官能性架橋剤が用いられる。まず、 タンパク質中の官能基 (例えば、アミノ基)と反応しうる第 1の反応性基 (スクシンイミド 基)、及びメルカプト基と反応しうる第 2の反応性基 (例えば、マレイミド基等)を有する ヘテロ二官能性架橋剤と、タンパク質を反応させることにより、タンパク質に第 2の反 応性基を導入し、予め活性ィ匕されたタンパク試薬とする。このようにして得られたタン ノ ク試薬をチオールィ匕ポリヌクレオチドのメルカプト基へ共有結合させる。
[0043] 核酸以外のポリア-オンやポリカチオンを使用する場合にも、これらの末端等にメ ルカプト基を導入することで、上記と同様の操作で第 2の結合物を作製できる。
[0044] このようにして製造されるキットは、例えば以下のような方法で、検出対象を検出及 び Z又は定量するために使用できる。
[0045] <検出方法 >
本発明の検出方法は、まず第 1の結合物、第 2の結合物及び検体を混合し、刺激 応答性ポリマーが凝集する条件下において、刺激応答性ポリマーの分散の有無を判 定する工程を含む。手順の詳細を以下に説明する。
[0046] (混合養）
まず、第 1の結合物と第 2の結合物とを容器内で混合し、更に検体を添加して混合 物を得る。続いて、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する条件下におく。する と、検出対象が存在する場合には、刺激応答性ポリマーが第 2の結合物中の電荷に よって凝集阻害されて分散する一方、検出対象が存在しない場合には刺激応答性 ポリマーが凝集阻害されず凝集することになる。
[0047] この現象を、図 1〜図 2を参照しながら説明する。
[0048] 図 1に示されるように、第 1の結合物 10は刺激応答性ポリマー 11を含有し、この刺 激応答性ポリマー 11はアビジン 15及びピオチン 17を介して検出対象 50に対する第 1の抗体 13に結合されている。また、第 1の結合物 10は微粒子状の磁性物質 19を 含み、この磁性物質 19の表面に刺激応答性ポリマー 11が結合されている。一方、第 2の結合物 20は負電荷を有する第 2の物質 21を含み、この第 2の物質 21は検出対 象 50に対する第 2の抗体 23に結合されている。そして、第 1の抗体 13及び第 2の抗 体 23は、検出対象 50の異なる部位において、同時に検出対象 50に結合できる。
[0049] 図 2に示されるように、第 1の結合物 10、第 2の結合物 20及び検体の混合物を所定 条件下におくと、検出対象 50が存在する場合には、刺激応答性ポリマー 11が第 2の 結合物 20中の電荷によって凝集阻害されて分散する（図 2 (A) )一方、検出対象 50 が存在しない場合には刺激応答性ポリマー 11が凝集阻害されず凝集することになる (図 2 (B) )。
[0050] 刺激応答性ポリマーを凝集させるためには、例えば温度応答性ポリマーを用いた 場合、混合液の入った容器を温度応答性ポリマーの凝集する温度の恒温槽に移せ ばよい。また、 pH応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容器に酸溶液又は アルカリ溶液を加えればよい。光応答性ポリマーを用いた場合、混合液の入った容 器にポリマーを凝集できる波長の光を照射すればよい。
[0051] なお、温度応答性ポリマーの凝集は、第 1の結合物及び第 2の結合物の検出対象 への結合の前に行ってもよいし、同時並行的に行ってもよいが、処理時間を短縮でき る点で後者が好ましい。ただし、温度応答性ポリマーが凝集する条件が、第 1の結合 物及び第 2の結合物が検出対象に結合する条件と大幅に異なる場合、前者が好まし い。
[0052] ここで、下限臨界溶液温度及び上限臨界溶液温度は例えば以下のように決定する 。まず、試料を吸光光度計のセルに入れ、 1°CZ分の速度で試料を昇温する。この 間、 550nmにおける透過率変化を記録する。ここで、ポリマーが透明に溶解している ときの透過率を 100%、完全に凝集したときの透過率を 0%としたとき、透過率が 50 %になるときの温度を LCSTとして求める。
[0053] (判定）
分散の有無の判定は、例えば目視又は濁度測定で行うことができる。濁度は光散 乱装置での光透過率から算出でき、濁度が低ければ刺激応答性ポリマーの凝集が 阻害されており、検出物質の存在が示唆される。ここで、使用する光の波長は、磁性 物質の粒径等に応じ所望の検出感度が得られるよう適宜設定されてよい。光の波長 は、従来汎用の装置を利用できる点で、可視光の範囲内（例えば、 550nm)であるこ とが好ましい。
[0054] 目視又は濁度測定は、一定の時点で断続的に行ってもよいし、経時的に連続して 行ってもよい。また、ある時点における濁度測定値と、他の時点における濁度測定値 との差に基づ 、て判定を行ってもょ 、。
[0055] <定量方法 >
本発明の定量方法によれば、まず、第 1の結合物、第 2の結合物及び検体を混合し 、この混合物を刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におぐ次に、混合物の 濁度を測定し、検出対象の量と濁度との所定条件下における相関式に基づいて、検 体中の検出対象の量を算出する。前半部分の手順は前述した検出方法と類似する ので、説明を省略する。
[0056] (相関式）
上記所定条件と同一の条件における、検出対象の量と濁度との相関式を作成する 。この相関式を構成する検出対象の量と濁度との測定は、データが多い程に信頼性 の高い相関式が得られる。そこでデータは、 2以上の検出対象の量に関するものであ ればよぐ 3点以上の検出対象の量に関するものであることが好ましい。
[0057] ここで、検出対象の量と濁度との相関式は、検出対象の量と濁度との直接的な相関 を示す式のみならず、検出対象の量と濁度を反映するパラメータとの相関式であって ちょい。
[0058] (算出）
混合物の濁度測定値を、作成した相関式に代入することによって、検体中の検出 対象の量を算出できる。
[0059] (分離）
第 1の物質が微粒子状の磁性物質を含有する場合、本発明の検出方法又は定量 方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含むことが 好ましい。これによつて、凝集した磁性物質が、非凝集状態の磁性物質を含む夾雑 物から分離される。このため、分離した磁性物質の量、溶媒に分散した際の光透過 率等の測定値は、夾雑物の影響が除外され、検出物質の存在をより忠実に反映した ものとなる。 [0060] 磁力の付加は磁性物質に磁石を接近させて行うことができる。この磁石の磁力は、 用いる磁性物質が有する磁力の大きさによって異なる。磁石としては、例えばマダナ 社製ネオジ磁石が挙げられる。
[0061] また、磁力の付加は、判定の前又は判定と同時並行して行ってよいが、工程に費 やされる時間を短縮ィ匕できる点で同時並行が好ましい。なお、磁力を付加すると、凝 集した磁性物質は夾雑物を巻き込んで分離されるため、分離後における混合物の濁 度は、夾雑物が存在して!/、た場合の方がむしろ小さくなるものと推測される。
[0062] なお、検出方法又は定量方法における「濁度測定」には、濁度を直接的に測定す ることのみならず、濁度を反映するパラメータを測定することも包含される。かかるパラ メータとしては、複数時点での濁度測定値の差異、分離された凝集物量、分離後の 非凝集物の濁度等が挙げられる。ここで、複数時点のうちの 1点は、例えば、検出対 象が非存在である陰性対照に磁力を付加した際、濁度が最大値となる時点近傍であ ることが好ましい。これにより、別の時点での濁度測定値との差異が大きくなり、検出 対象の量をより正確に定量できることになる。
[0063] (検出対象）
検体中の検出対象としては、臨床診断に利用される物質が挙げられ、具体的には 、体液、尿、喀痰、糞便中等に含まれるヒトイムノグロブリン G、ヒトイムノグロブリン M、 ヒトイムノグロブリン A、ヒトイムノグロブリン E、ヒトアルブミン、ヒトフイブリノ一ゲン（フィ ブリン及びそれらの分解産物）、 a—フエトプロテイン (AFP)、 C反応性タンパク質 (C RP)、ミオグロビン、ガン胎児性抗原、肝炎ウィルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン (h CG)、ヒト胎盤性ラタトーゲン (HPL)、 HIVウィルス抗原、アレルゲン、細菌毒素、細 菌抗原、酵素、ホルモン (例えば、ヒト甲状腺刺激ホルモン (TSH)、インスリン等）、 薬剤等が挙げられる。
[0064] [キットの構成とその使用方法の例]
以下に、本発明の方法を利用するためのキットの構成とその使用方法の例を、検出 対象が抗原の場合につ!、て説明する。
[0065] 試薬キットは、例えば、下記の試薬から構成される。
抗原検出用試薬キット： 試薬 A：微粒子状の磁性物質及び検出対象の抗原に特異的に結合する第 1の抗 体が結合した温度応答性ポリマー
試薬 B：第 1の抗体とは異なる部位を認識し、検出対象の抗原に同時に結合しうる 第 2の抗体が結合した、電荷を有する化合物
試薬 C :被測定物質の標準品 (具体例として、精製抗原が挙げられる。 ) o 試薬 D：希釈用バッファー（上記試薬の希釈用、並びに被測定試料の希釈用に使 用可能なバッファーであって、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファ一等が挙げられる o )
[0066] また、濁度を測定する装置としては、容器内をポリマーが凝集する温度に保温でき
、 200ηπ！〜 900nmの透過光を照射できる従来周知の装置が使用できる。
[0067] 上記した試薬力もなるキットは、例えば、以下の方法で使用できる。
[0068] まず、試薬 A 5〜： LOOO /z Lと試薬 B 5〜： LOOO /z Lとを混合する。試薬 Aと試薬 B の入った溶液中に（1)被測定物質の標準品を添加した陽性対照、（2)何も添加しな い陰性対照、（3)被検液の 5〜： LOOO /z Lを添加したサンプル、を準備し、一定時間、 ポリマーが分散する温度 (例えば約 0〜30°C)で反応させる。温度応答性ポリマーを 用いた場合、反応後、そのポリマーの凝集温度 (例えば 42°C)に保温された容器に 反応液を入れ、 550nmの透過光を照射して濁度を測定し、抗原の有無の判定又は 抗原の定量を行う。
[0069] 上記とは別の使用方法として、試薬 Aと上記（1)、（2)、及び（3)を一定時間ポリマ 一が分散する温度で反応させた後、試薬 Bを添加し、一定時間反応後、凝集温度に 保温された容器に反応液を入れ、 550nmの透過光を照射して濁度を測定し、抗原 の有無の判定又は抗原の定量を行ってもょ 、。
実施例
[0070] <実施例 1 >
[キットの作製]
(第 1の結合物の調製）
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン (TSH)に対する第 1の親和性物 質としての抗体（クローン： 195マウス、マウス IgG、 Leinco Technology, Inc.製） を、従来周知の sulfo— NHS— Biotin法 (旭テクノグラス社）によりピオチン化し、ビ ォチン標識抗 TSHベータ抗体を調製した。
一方、ストレプトアビジンが結合された微粒子状の磁性物質であるマダナビート株 式会社製の Therma— Max LSA Streptavidin (0. 4質量0 /0) 250 Lを 1. 5mL マイクロチューブにとり、このマイクロチューブを 42°Cに加熱することで、 Therma— Max LSA Streptavidinを凝集させ、磁石で回収した後、上清を除去した。ここに TBSバッファー（20mM Tris— HC1、 150mM NaCl、 pH7. 5) 250 Ι^を加え、 冷却することで凝集物を分散させた。この分散液に、 PBSバッファー（0. 01M リン 酸ノ ッファー、 0. 0027Μ 塩ィ匕カリウム、 0. 137M 塩ィ匕ナ卜リウム、 pH7. 4)に溶 解したピオチン標識抗 TSH jS抗体 50/z UO. 75mgZmL)をカ卩え、室温で 15分間 転倒混和した。マイクロチューブを 42°Cに加熱して Therma— Max LSA Strepta vidinを凝集させ、磁石で回収した後、上清部分を除去し、余分なピオチン標識抗 T SHベータ抗体を分離した (BZF分離)。ここに TBSバッファー 250 Lをカ卩え、冷却 することで凝集物を分散させた。続いて、過剰量のピオチンを添加して、ストレブトァ ビジンのピオチン結合部位を被覆した後、余分なピオチンを分離した (BZF分離)。 更に 0. 5% (wZv) BSA (シグマ社製）、 0. 5% (wZv)Tween (登録商標） 20、 10 mM EDTAを含有させた PBSバッファー（pH7. 4)溶液に分散させることで、第 1の 結合物を調製した。
(第 2の結合物の調製）
まず、検出対象としてのヒト甲状腺刺激ホルモン (TSH)に対する第 2の親和性物 質としての抗体（クローン： 176マウス、マウス IgG、 Leinco Technology, Inc.製、 lmg/mL) lmLに 2 メルカプトエタノール 6mgをカ卩え、 37°Cで 120分反応させた 。反応後、 Slide—A— Lyzer (商品名） 透析カセット、 10K MWCO (Pierce)によ り、 PBSバッファー 500mLに対して透析し、過剰の 2 メルカプトエタノールを除き、 限界排除分子量 10000の限外濾過膜（MILLIPORE社製 [Amicon Ultra 4 Ultracel 100k])を用いて 0. 5mLに濃縮し、マウス抗 TSH α抗体の還元抗体を 得た。この還元抗体 0. 5mLと 100 Lマレイミド化ポリアクリル酸ナトリウム（33mgを PBSバッファー lmLに溶解したもの）とを 4°Cで 1晚反応させ、続いて Superdex— 2 00 10/300GL (GEヘルスケア社製）を用いてゲル濾過することで、標識抗体を作 成した。この標識抗体 (この抗体は、ポリアクリル酸抗 TSH a抗体結合物ともいう。）を 0. 5% (wZv) BSA (シグマ社製）、 0. 5% (wZv)Tween (登録商標） 20ZPBS (p H7. 4)、 10mM EDTAの水溶液でタンパク質濃度 4 g/mLに希釈することで、 第 2の結合物を調製した。
[0072] なお、上記マレイミド化ポリアクリル酸ナトリウムは、次のように調製した。
まず、窒素ガス導入管、温度計、及び撹拌装置を付した lOOmLの三口フラスコ内 で、アクリル酸 (和光純薬工業社製) 2g、 2—アミノエタンチオール (和光純薬工業社 製） 0. 021g、及びァゾビスイソブチ口-トリル（和光純薬工業社製） 0. 023gを N, N —ジメチルホルムアミド 50mLに溶解し、 1時間窒素置換を行った。その後、 70°Cで 7 時間重合反応を行った。得られた反応液を、 10mLまで減圧濃縮し、粘稠状の物が 粉状になるまでジェチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈殿をろ過し、更に真空 乾燥機で 1晚乾燥することで、アミノ基末端ポリアクリル酸を得た (収量 1. 5g) 0次に アミノ基末端ポリアクリル酸をマレイミド化した。窒素ガス導入管、及び撹拌装置を付 した 50mLのナスフラスコに、アミノ基末端ポリアクリル酸 0. 5g及び N, N—ジメチル ホルムアミド 10mLを入れ、溶解した。そこに EMCS (N— (6—マレイミドカプロイロキ シ)スクシンイミド）（同仁ィ匕学研究所社製) 3mgを加え、一晩反応した。得られた反応 液を、 lmLまで減圧濃縮し、粘稠な物が粉状になるまでジェチルエーテルで再沈殿 を行った。 白色沈殿をろ過し、更に真空乾燥機で、 1晚乾燥しマレイミド基末端ポリア クリル酸を得た。分子量は約 130000 (東ソ一社製、 TSKgel Super AW3000、 6 mm ID. X 150mm、移動相 0. 1M 硝酸ナトリウム）であり、収量は 0. 4gであった
[0073] (試料の調製）
ヒト甲状腺刺激ホルモン（TSH ; Aspen Bio Pharma, Inc.製、活性 8. 5IU/m g、 WHO80/558)を PBSノ ッファー (pH7. 4)に 30 μ g/mLとなるように溶解した 。この溶液をビトロス TSHキヤリブレータ l (TSH : OmIU/L、ォーソ 'タリ-カル 'ダイ ァグノスティックス社製）で 0. 06mIUZL、 0. 0012mIUZLとなるよう希釈したもの を、それぞれ試料とした。 [0074] [定量]
図 3に示されるように、従来汎用されている分光光度計用セミミクロセル 71の光路外 に、寸法 5mm X 9m X 2mmのネオジム永久磁石 73 (西興産業社製）を取り付けた。 このセル 71を、セル温度制御機が設けられた可視紫外分光光度計 UV— 3101PC ( 島津製作所製)内に設置し、 37°Cのもと 10分間以上保持した。
[0075] 図 4は、実施例に係る定量方法の手順を示すフローチャートである。定量方法は、 上記の第 1の結合物、第 2の結合物及び試料を混合する工程 (ST10)と、混合物の 濁度を測定する工程 (ST20)とを含む。
[0076] (混合）
第 1の結合物 150 L及び第 2の結合物 120 Lをマイクロチューブ内に注ぎ、ボ ルテックスミキサで 1秒間撹拌した。このマイクロチューブ内に各試料 750 Lを添カロ し、再びボルテックスミキサで 60秒間撹拌した。
[0077] (相関式の作製）
この撹拌液をセル 71内に分注し、分光光度計に添付の使用説明書に従ってゼロ 補正し、波長 420nmの光を用いて、直ちにスリット幅 10mmで、 1200秒間にわたつ て連続して測定した。この結果を図 5に示す。
[0078] 図 5に示されるように、約 600秒までは、 TSHの量が高い程、濁度が低いことが分 かった。これは、 TSHを中心に近接して配置されるため、刺激応答性ポリマーが第 2 の結合物の電荷によって凝集阻害されて分散したためである。一方、約 600秒付近 から、 TSHの量と濁度との関係が反転し始め、時間の経過とともに濁度が初期値より も低下する。これは、凝集した磁性物質が磁石に吸着されて分離されるからであると 推測される。
[0079] 次に、各試料について、 0秒、 600秒、 1000秒の 3点での測定値の差異を表した。
この結果を図 6〜図 8に示す。
[0080] 図 6〜図 8に示されるように、 0秒、 600秒、 1000秒のうちの 2点間の測定値の差異 は、いずれも TSHの量に依存するものであった。とりわけ、 600秒での測定値と 100 0秒での測定値との差異は最も大きぐ最も高感度に検出又は定量できることが分か つた。これにより、陰性対照（つまり、 TSH量がゼロ）に磁力を付加した際、濁度が最 大値となる時点近傍 (600秒)を測定時点の 1つとして選択することが好ま 、ことが 確認された。
[0081] [再現性評価]
上記の第 1の結合物、第 2の結合物及び試料を 4°Cの喑所内で保存し、 1日 1回ず つ 3日間、同様の手順で濁度の測定を行った。この結果を表 1に示す。
[0082] [表 1]
Figure imgf000021_0001
[0083] 表 1に示されるように、 3日間にわたるいずれの時点間でも、 CV (変動係数）は 5. 8 以下という低い値であった。よって、実施例の系によれば高い再現性が得られること が確認された。
[0084] <実施例 2 >
分光光度計用セミミクロセル 71の光路外に、ネオジム永久磁石 73 (西興産業社製) を取り付けな力つたことを除き、実施例 1と同様の手順で、 TSH量がゼロの試料の濁 度を測定した。この結果を、実施例 1における TSH量がゼロの試料の濁度と併せて 図 9に示す。
[0085] 図 9に示されるように、約 600秒まで実施例 1及び 2での濁度は略等しぐ実施例 2 での濁度は約 600秒以降では飽和していた。この結果は、約 600秒までの時間では 、磁力を付加しなくとも一定の高感度で検出又は定量でき、更なる高感度で検出又 は定量する場合には磁力を付加して約 600秒での測定値と、それ以後の時点での 測定値との差異を利用すべきであることを示唆するものである。
[0086] [比較例]
上記の試料について、種々の系を用いて TSH量を測定した。この結果から推定さ れる各系の検出限界値を表 2に示す。 [0087] [表 2]
Figure imgf000022_0001
[0088] 表 2に示されるように、従来の系では、検出限界値が 0. 0025-0. 005mIUZLで あった。これにより、 0. 0012mIUZLでも検出できた実施例は、従来の系に比べ格 段に検出感度が高いことが確認された。
[0089] し力も、どの時点においても TSHの量に依存して、濁度に差異が存在することから 、検体中の TSHの検出に使用できた。 1000秒以内という検出時間は、約 38分間費 やす従来技術（図 10参照）に比べて、かなり短いものである。また、以上の ST10及 び ST20という操作を、実際の検体について行うだけで検出物質を検出又は定量で きるので、手順が簡便である。
[0090] つまり、本発明は、酵素基質反応を利用せずに濁度を測定する系であるため、手 順が簡便でありつつ、従来の系に比べて格段に高い検出感度を有し、しかも短時間 で検出'定量を完了できるという画期的な効果を有することが示された。
[0091] <実施例 3 >
(ピオチン含有ポリ（N—イソプロピルアクリルアミド）の合成）
窒素ガス導入管、温度計及び撹拌装置を付した 200mLの三口フラスコ内で、 N— イソプロピルアクリルアミド 13. 6g、ピオチンモノマー〔N—ビォチ二ルー N'—メタタリ ロイルトリメチレンアミド〕 0. 42g、 2—アミノエタンチオール (和光純薬工業社製) 0. 2 g及びァゾビスイソブチ口-トリル 0. 2gをメタノール lOOmLに溶解し、 30分間窒素置 換を行った。その後、 70°Cで 7時間重合反応を行った。得られた反応液を減圧濃縮 し、得られた固体をアセトンに溶かし、ジェチルエーテルで再沈殿を行った。白色沈 殿を濾過し、更に真空乾燥機で 1晚乾燥することで、ピオチン含有ポリ（N—イソプロ ピルアクリルアミド）を 11. 84g得た。得られたピオチン含有ポリ（N—イソプロピルァク リルアミド）の分子量は約 29000 (Shodex GPC LF— 804、 8mm ID. X 300m m、移動相 THF)であった。
なお、ピオチンモノマー〔N—ピオチュル N，一メタクリロイルトリメチレンアミド〕の 調製は、特開 2005— 82538号公報に記載の方法を用いて、以下の通り行った。
N— (3—ァミノプロピル)メタクリルアミド塩酸塩 18g、ピオチン 24g及びトリェチルァ ミン 30gを 300mlの N, N ジメチルホルムアミド（DMF)に溶解し、 0°Cに冷却した。 ジフエ-ルホスフォ-ルアジド 28gを 50mlの DMFに溶解させた溶液を 1時間かけて 、この混合物中に滴下した。滴下終了後、 0°Cで 3時間攪拌し、更に室温（20°C)で 1 2時間攪拌した。この後、減圧下で、溶媒を留去し、クロ口ホルム一メタノール混合溶 媒を用いて、カラムクロマトグラフィーで精製し、 N—ピオチニル N '—メタクリロイル トリメチレンアミドを得た。
[0092] (ストレプトアビジン結合 N—イソプロピルアクリルアミドの調製）
ピオチン含有ポリ（N—イソプロピルアクリルアミド） lOOmgを TBSバッファー 10mL に溶解し、 0. 1 % (w/v)とした。 0. 1 % (w/v)ピオチン含有ポリ（N—イソプロピル アクリルアミド） 3mLに、 10mg/mLになるように精製水（MILLIPORE社製 Direc t Q (商品名）で精製した水）に溶解したストレプトアビジン (和光純薬工業社製） 15 μ Lを添カ卩し、 30分間氷上で静置して反応させることで、ストレプトアビジン結合ポリ（ Ν イソプロピルアクリルアミド）の TBS溶液を得た。
[0093] (マウス抗 TSH a抗体結合ポリ（N—イソプロピルアクリルアミド）の調製）
ストレプトアビジン結合ポリ（N—イソプロピルアクリルアミド）の TBS溶液 625 μ に 、ピオチン標識マウス抗 TSH a抗体 (コスモバイオ社 (商品コード T103)より購入し たマウス抗 TSH a抗体（Leinco Technology, Inc.製）を sulfo— NHS— Biotin 法 (旭テクノグラス社)でピオチンィ匕したもの） 100 Lを添加し、 30分間氷上で静置 して反応させ、マウス抗 TSH a抗体結合ポリ（N—イソプロピルアクリルアミド）の TBS 溶液を得た。
[0094] (ポリアクリル酸抗 TSH β抗体結合物の調製）
マウス抗 TSH a抗体の代わりにマウス抗 TSH β抗体を用いた点を除き、実施例 2 と同様の手順でポリアクリル酸抗 TSH β抗体結合物を調製した。
[0095] (抗 TSH a抗体結合ポリ（N—イソプロピルアクリルアミド） ポリアクリル酸抗 TSH β抗体結合物による TSHの検出）
マウス抗 TSH a抗体結合ポリ（N—イソプロピルアクリルアミド） TBS溶液 25 μ の 入った 1. 5mLのチューブを 4本（a、 b、 c及び d)用意した。各チューブにビトロス TS Hキヤリブレーター 1 (ォーソ 'タリ-カル 'ダイァグノスティックス社製、商品コード 06 5002) 5 μ Lと、各濃度の TSHの TBS溶液 10 L (aは TSH濃度 0、 bは TSH濃度 0. 001 μ ζ μ ^ cは TSH濃度 0. 01 μ g/ μ L、 dは TSH濃度 0. 1 g/ L)と の混合物を添カ卩し、更に TBSバッファー 165 Lをカ卩え、 5分間、氷上にて静置した 。その後、各チューブにポリアクリル酸抗 TSH |8抗体結合物 5 Lを添加し、 30分間 氷上にて静置したものを測定サンプルとした。
[0096] 恒温槽で分光光度計 UVmini (島津製作所社製)のセルホルダを 31. 5°Cに保温 した。サンプルの入っていない石英セル（QS, Hella,光路長 10mm)をセルホルダ に置き、 5分間静置した。その後、石英セル内にチューブ a中の測定サンプル 200 Lを添カ卩し、その 6分後に吸光度を測定した。チューブ b〜d中のサンプルについても 、同様の手順で吸光度を測定した。その結果、吸光度は、 aが 0. 216、 b力 . 199、 c力 SO. 176、 d力 SO. 168であった。
[0097] 以上の結果により、 TSHの濃度に応じて吸光度が変化すること、換言すれば、吸 光度を測定することで TSHの濃度を定量できることが示された。つまり、本発明に係 る方法は、二次抗体、発光試薬、発光検出装置等の特殊な試薬、機器を必要とせず 、検出対象を迅速、安価且つ簡便に検出、定量できる新規な方法であることが確認 された。

Claims

請求の範囲
[1] 検出対象を検出及び Z又は定量するためのキットであって、
刺激応答性ポリマーを含有する第 1の物質と前記検出対象に対する第 1の親和性 物質とが結合した第 1の結合物と、
電荷を有する第 2の物質と前記検出対象に対する第 2の親和性物質とが結合した 第 2の結合物と、を含み、
第 1の親和性物質と第 2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、 同時に前記検出対象に結合できることを特徴とするキット。
[2] 第 1の物質が、微粒子状の磁性物質を含むことを特徴とする請求項 1に記載のキッ
[3] 第 2の物質が、親水性の高分子化合物であることを特徴とする請求項 1又は 2に記 載のキット。
[4] 第 2の物質が、ポリア-オン又はポリカチオンであることを特徴とする請求項 1〜3の いずれか 1項に記載のキット。
[5] ポリア-オンが、核酸又はポリアクリル酸であることを特徴とする請求項 4に記載のキ ッ卜。
[6] ポリカチオンが、ポリアルキルアミン又はポリエチレンィミンであることを特徴とする請 求項 4に記載のキット。
[7] 検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第 1の物質と前記検出対象に対する第 1の親和性 物質とが結合した第 1の結合物と、電荷を有する第 2の物質と前記検出対象に対する 第 2の親和性物質とが結合した第 2の結合物と、前記検体とを混合し、刺激応答性ポ リマーが凝集する条件下におき、前記刺激応答性ポリマーの分散の有無を判定する 工程を含み、
第 1の親和性物質と第 2の親和性物質が、前記検出対象の異なる部位において、 同時に前記検出対象に結合できることを特徴とする方法。
[8] 第 1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む ことを特徴とする請求項 7に記載の方法。
[9] 検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性ポリマーを含有する第 1の物質と前記検出対象に対する第 1の親和性 物質とが結合した第 1の結合物と、電荷を有する第 2の物質と前記検出対象に対する 第 2の親和性物質とが結合した第 2の結合物と、前記検体とを混合し、この混合物を 刺激応答性ポリマーが凝集する所定条件下におき、
前記混合物の濁度を測定し、前記検出対象の量と濁度との前記所定条件下にお ける相関式に基づいて、前記検体中の検出対象の量を算出することを含む方法。
[10] 第 1の物質が微粒子状の磁性物質を含有し、
前記方法は、磁力を付加することで、凝集した磁性物質を分離することを更に含む ことを特徴とする請求項 9に記載の方法。
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