JPWO2013118844A1 - 検出対象の検出及び定量のための方法及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、前記検体とを混合し、この混合物に前記刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加することで、凝集した前記結合物を分離し、その後の前記混合物における前記検出対象を検出する工程を有する方法。
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、前記検体とを混合し、この混合物に前記刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加することで、凝集した前記結合物を分離し、その後の前記混合物における前記検出対象の量を定量する工程を有する方法。
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、
前記検出対象に対する親和性物質と、を備えるキット。
結合物は、刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と、検出対象以外の物質(つまり、除去すべき非特異反応物質)に対する親和性物質とが結合したものである。
刺激応答性物質は、外的な刺激に応答して構造変化を起こし、凝集及び分散を調整できる物質である。刺激としては、特に限定されないが、温度変化、光の照射、酸又は塩基の添加(pHの変化)、電場変化等が挙げられる。
親和性物質は、非特異反応物質の抗原決定基を認識するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。ここで用いる抗体は、いかなるタイプの免疫グロブリン分子であってもよく、Fab等の抗原結合部位を有する免疫グロブリン分子断片であってもよい。
結合物は、凝集性物質と親和性物質とを結合することによって作製する。この結合方法は、特に限定されないが、例えば、凝集性物質側(例えば刺激応答性物質部分)及び親和性物質(例えば、抗体)側の双方に、互いに親和性の物質(例えば、アビジン及びビオチン、グルタチオン及びグルタチオンSトランスフェラーゼ)を結合させ、これら物質を介して凝集性物質及び親和性物質を結合させる。
(非特異反応物質に対する親和性物質が結合した刺激応答性磁性微粒子の調製)
まず、非特異反応物質としてのヒトIgMに対するリガンドとしての抗体を、従来周知のsulfo−NHS−Biotin法(旭テクノグラス社)によりビオチン化し、ビオチン標識抗ヒトIgM抗体を調製した。
「ルミパルスII TP−N」及び「エスルラインTP」(富士レビオ社)にて陰性となったヒト血清を、トレポネーマ抗体キット「メディエースTPLA」(積水メディカル社)及び生化学自動分析装置「CA−90」(古野電気社)を用いて測定し、陽性と判別される(非特異反応による擬陽性と疑われる)ヒト血清のうち、「ビトロス マイクロチップ IgM」(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社)にてIgM濃度を測定し300mg/dL以上となったものを、検体として採用した。これとは別に、「ルミパルスII TP−N」(富士レビオ社)、「エスルラインTP」(富士レビオ社)及びトレポネーマ抗体キット「メディエースTPLA」(積水メディカル社)の測定結果(陽性、陰性)が一致したヒト血清を各々、陽性対照検体及び陰性対照検体として採用した。
生化学自動分析装置「CA−90」のディスポーサブルプラスチックキュベットの測光面と直交する面に、寸法1mm×1mm×1mmのネオジム磁石(ネオマグ社)を接着させたものを反応キュベットとして準備した。
「メディエースTPLA」キットのうち、検体希釈用緩衝液を、上で調製した、ヒトIgMに対する親和物質が結合した刺激応答性磁性粒子溶液へと置き換え、「メディエースTPLA」キットのうち梅毒陽性標準血清(A):5濃度で標準曲線を作製した。
使用した試薬及び器材と、その略称を以下に示す。
1.JNC社製「Therma−Max LSA Streptavidin(30)」
:「TM−LSA(30)」(濃度:2mg/ml)
2.Life Technologies Corporation製「Dynabeads MyOne(商標)Streptavidin C1」
:「DyMOS−C1」(ビーズ平均粒径:1μm、濃度:10mg/ml)
3.分光光度計用セミミクロセル
4.西興産業社製ネオジム永久磁石(寸法:5×9×2mm)
5.エッペンドルフピペット100μL、及びエッペンドルフ100μLチップ
11 刺激応答性物質
13 抗体(親和性物質)
19 磁性物質
50 非特異反応物質
A 凝集状態の結合物
C 担体
M 磁石
T 検出対象
Claims (11)
- 検体中の検出対象を検出する方法であって、
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、前記検体とを混合し、この混合物に前記刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加することで、凝集した前記結合物を分離し、その後の前記混合物における前記検出対象を検出する工程を有する方法。 - 前記検出対象の検出は、凝集した前記結合物を、前記混合物が収容されている容器内で固液分離させた状態で行う請求項1記載の方法。
- 前記検出対象の検出は、前記検出対象に対する親和性物質が担持された担体を、前記混合物と混合し、前記担体の凝集の有無により判別する工程を含む請求項1又は2記載の方法。
- 前記検出対象の検出は、検出感度を増加させる増感剤を添加した状態で行う請求項1から3いずれか記載の方法。
- 検体中の検出対象を定量する方法であって、
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、前記検体とを混合し、この混合物に前記刺激応答性物質が凝集する条件下で磁力を付加することで、凝集した前記結合物を分離し、その後の前記混合物における前記検出対象の量を定量する工程を有する方法。 - 前記検出対象の定量は、凝集した前記結合物を、前記混合物が収容されている容器内で固液分離させた状態で行う請求項5記載の方法。
- 前記検出対象の定量は、前記検出対象に対する親和性物質が担持された担体を、前記混合物と混合し、前記担体の凝集の程度を検出する工程を含む請求項5又は6記載の方法。
- 前記検出対象の定量は、検出感度を増加させる増感剤を添加した状態で行う請求項5から7いずれか記載の方法。
- 検体中の検出対象を検出及び/又は定量するためのキットであって、
刺激応答性物質及び微粒子状の磁性物質を含有する凝集性物質と前記検出対象以外の物質に対する親和性物質とが結合した結合物と、
前記検出対象に対する親和性物質と、を備えるキット。 - 前記親和性物質は、担体に担持された形態である請求項9記載のキット。
- 検出感度を増加させる増感剤を更に備える請求項9又は10記載のキット。
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