CN102617729A - 他克莫司免疫原、抗他克莫司特异性抗体和他克莫司检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种他克莫司免疫原、抗他克莫司特异性抗体和检测试剂。该他克莫司免疫原，其结构式如式(I)所示：
式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。本发明的他克莫司免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗他克莫司特异性抗体。本发明的抗他克莫司特异性抗体，特异性高，与他克莫司的结合力强，敏感度远高于现有的抗他克莫司抗体。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种他克莫司免疫原、抗他克莫司特异性抗体和他克莫司检测试剂。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus，FK506)，其结构式如式(II)所示。
式(II)
他克莫司是一种免疫抑制剂，是器官移植，特别是肾脏移植患者的常用药物，移植后合理服用他克莫司可使器官免遭排斥。他克莫司剂量不足会导致机体对移植器官产生排斥反应；而剂量过高又会引起严重的副反应，包括肾脏毒性，肝脏毒性和其他一系列的并发症。通过检测病人全血中的他克莫司浓度，并结合其它临床指征来合理用药，是确保器官移植接受者获得免疫抑制的最有效方法。
现有检测他克莫司的方法主要是高效液相色谱法(High performance liquidchromatography，HPLC)、液相色谱串联质谱联用法(Liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC/MS/MS)、放免法和荧光偏振法。HPLC及LC/MS/MS方法前处理复杂，耗时，费用及对人员操作要求高；放免法对操作人员有放射性危害；而荧光偏振法的试剂主要依赖进口，费用极其昂贵。
发明内容
本发明就是为了弥补上述方法存在的缺陷，研制出了一种含有他克莫司特异性抗体的免疫检验试剂。该检验试剂灵敏度高、特异性强，可用于样本中他克莫司含量的检测，用于正确指导临床给药剂量。
本发明的一个目的在于提供一种他克莫司免疫原。
本发明的另一个目的在于提供利用本发明他克莫司免疫原制备得到的抗他克莫司特异性抗体。
本发明的再一个目的在于提供一种含有本发明抗他克莫司特异性抗体的检测试剂。
本发明制备的他克莫司免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗他克莫司的特异性抗体。高效价的他克莫司特异性抗体研制的免疫试剂可以准确测定反应底物他克莫司。
为了达到上述目的，本发明所采取的技术方案如下：
他克莫司免疫原，其结构式如式(I)所示：
式(I)
式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。
优选的，具有免疫原性的载体采用足够大的具备免疫原性的物质即可，通常采用的免疫原性载体包括蛋白质和多肽。在本发明中载体优选为具有免疫原性的蛋白质，最常用的免疫原性载体包括血清蛋白，血蓝蛋白(KLH)和甲状腺球蛋白等。
在本发明的一种优选实施例中，上述他克莫司免疫原中R为N-(CH2)n-COO-或N-O-(CH2)n-COO-，n是1至20之间的整数。优选R为N-O-(CH2)n-COO-，n是1至10。更优选的R为N-O-(CH2)3-COO-。具有这种结构的他克莫司免疫原免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗他克莫司特异性抗体。
本发明所提供的他克莫司免疫原可以采用多种常规方法制备而得，对于这些常规的制备方法本领域技术人员在本发明所提供的他克莫司免疫原的结构式的基础上能够经过合理分析进而制备获得。
以下将给出一种他克莫司免疫原的制备方法，以供参考，具体制备方法如下：
(1)、制备具有式(III)中结构的他克莫司衍生物；
式(III)
(2)、将具有免疫原性的载体溶解形成具有免疫原性的载体溶液；
(3)、将具有式(III)中结构的他克莫司衍生物加入到上述具有免疫原性的载体溶液中，使具有式(III)中结构的他克莫司衍生物中连接基团所在部分和具有免疫原性的载体发生缩聚反应，形成的他克莫司免疫原。
当R为N-O-(CH2)3-COO时，上述他克莫司免疫原的合成途径和方法如下：
(1)、具有式(III)中结构的他克莫司衍生物的合成
①、制备具有连接基团(N-O-(CH2)3-COO-基团)的盐酸盐：
用有机溶剂A溶解10-50g的N-羟基-邻苯二甲酰亚胺、10-50g的5-溴戊酸乙酯，其中有机溶剂A的使用量根据需要在100-500mL左右。使其在第一催化剂的作用下进行加热反应，此时第一催化剂的使用量根据实际需要在1-10g左右，加热反应生成物经有机溶剂B萃取，干燥得到4-邻苯二甲酰亚胺氧基丁酸乙酯(Ethy4-(1，3-dioxoisoindolin-2-yloxy)butanoate)，即如下结构式(IV)中化合物。
用无机酸C溶解具有式(IV)中结构的化合物，无机酸C的使用量根据需要在100-400mL左右，经有机溶剂D萃取，干燥得到4-胺氧基丁酸(4-(aminooxy)butanoic acid)的盐酸盐，即如下结构式(V)中化合物，也就是具有连接基团(＝N-O-(CH2)3-COO-基团)的盐酸盐：
其中，具有式(IV)中结构的化合物和具有式(V)中结构的化合物结构如下：
式(IV) 式(V)
制备具有连接基团(N-O-(CH2)3-COO-基团)的盐酸盐化学反应式如下：
②、利用具有连接基团(N-O-(CH2)3-COO-基团)的盐酸盐制备具有式(III)中结构的他克莫司衍生物。
用有机溶剂D溶解0.5-5.0g的他克莫司、0.5-10g的具有式(V)中结构的化合物4-胺氧基丁酸的盐酸盐，其中有机溶剂D的使用量根据实际情况可以在10-50mL左右。使其在第二催化剂的作用下发生反应，此处第二催化剂的使用量根据实际需要可以在1.0-5.0g之间，反应后经浓缩，加水用有机溶剂E萃取，经干燥、浓缩和纯化得到具有式(III)中结构的他克莫司的衍生物。
利用具有连接基团(N-O-(CH2)3-COO-基团)的盐酸盐制备具有式(III)中结构的他克莫司衍生物的化学反应式如下：
(2)、载体溶液的制备：将具有免疫原性的蛋白质100-300mg溶于10-100ml的0.2M，pH 8.5磷酸盐缓冲液中。
(3)、他克莫司衍生物的活化及免疫原的合成：用有机溶剂A溶解50-500mg的具有式(III)中结构的他克莫司衍生物，此处有机溶剂A的使用量根据需要为5-50ml左右，通过1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)Carbodiimide，EDAC)的方法或EDAC和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，Sulfo-NHS)联合使用的方法进行活化的方法进行活化并与载体溶液进行交联反应，经透析纯化后得到具有免疫原性的他克莫司免疫原。
上述方法中所述的EDAC的方法是现有技术已知的，如文献Hermanson.Bioconjugate techniques.2nd edition，215-221.，中所记载的方法。
上述方法中可选的有机溶剂A包括但不限于二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)、二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)、甲醇或乙醇，优选DMF；可选的有机溶剂B包括但不限于乙酸乙酯(Ethyl acetate，EtOAc)，乙醚或氯仿，优选乙醚；可选的无机酸溶液C包括但不限于盐酸溶液或硫酸溶液，优选盐酸溶液。可选的有机溶剂D包括但不限于乙酸乙酯或乙醚，优选乙酸乙酯；可选的有机溶剂E包括但不限于乙酸乙酯，乙醚或氯仿，优选乙醚；可选的第一催化剂包括但不限于甲醇钠(NaOMe)，氧化钾或氧化钠，优选甲醇钠；可选的第二催化剂包括但不限于醋酸钠、对甲苯磺酸。
当R为N-(CH2)n-COO-时，除了制备具有连接基团(N-(CH2)3-COO-基团)的盐酸盐的步骤不同外，他克莫司免疫原的合成途径与R为N-O-(CH2)n-COO-时基本相同。
在本发明中还提供了一种抗他克莫司特异性抗体，由上述他克莫司免疫原免疫动物后生产得到。
本发明的抗体可以通过现有技术制备得到。在本发明中优选采用以下方法获得抗他克莫司特异性抗体：
(1)用磷酸盐缓冲液将合成的他克莫司免疫原稀释至0.5-5.0mg/mL；
(2)经常规弗氏佐剂法对动物进行注射，注射后抽取动物特异性抗血清，得到有效的抗体。
上述方法中，优选用磷酸盐缓冲液将他克莫司免疫原稀释至1.0-2.0mg/mL。本发明中所指的“抗体”不仅仅指完整的抗体分子，也包括保留完整抗体特异性结合能力的抗体片断或者衍生物。本发明的抗体可以是为多克隆抗体也可以是单克隆抗体，优选为多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过现有技术制备得到。获得多克隆抗体的典型方法是使用单一的免疫原，可选地加入佐剂后，在动物的一个或者多个部位进行免疫，宿主动物包括：兔，山羊，小鼠，绵羊，豚鼠或马。优选动物为家兔。动物定时采血得到适量的特异抗血清，抗血清可以纯化。单克隆抗体可通过体细胞杂交技术来制作。
在本发明中还提供了一种他克莫司检测试剂，由上述抗他克莫司特异性抗体和指示试剂组成。指示试剂可以是酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂。优选地，指示试剂是酶试剂，由他克莫司酶标偶联物和酶底物所组成。
酶标偶联物的酶选自辣根过氧化物酶(Horse Radish Peroxidase，HRP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PDH)等，优选酶为HRP。
在本发明中，酶标偶联物可以通过以下制备方法获取：
(1)酶溶液制备
称取选自HRP、AP或G6PDH的酶，在室温条件下溶解于磷酸缓冲液中，终浓度为2-10mg/mL；
(2)使上述具有式(III)中结构的他克莫司衍生物活化及偶联物的合成。
用有机溶剂溶解上文所示的具有式(III)中结构的他克莫司衍生物，使其终浓度为1-50mg/mL，通过EDAC的方法或EDAC和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，Sulfo-NHS)联合使用的方法进行活化，并与酶溶液进行交联反应，经纯化和透析后得到他克莫司衍生物酶标偶联物。
上述步骤(2)中所使用的有机溶剂为：DMF、DMSO、甲醇或乙醇。
在本发明中，优选采用如下制备方法获取酶标偶联物：
(1)酶溶液制备：称取HRP在室温条件下溶解于磷酸缓冲液中，终浓度为3-5mg/mL；
(2)他克莫司衍生物的活化及偶联物的合成：用DMF溶解他克莫司衍生物，浓度为1-20mg/mL，通过EDAC的方法进行活化，并与HRP溶液进行交联反应，经纯化和透析后得到HRP-他克莫司偶联物。
本发明的他克莫司检测试剂，具有灵敏度高，特异性强，可以达到操作简便、周期短、成本低的要求。
附图说明
图1是他克莫司ELISA标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步说明本发明。
实施例1
他克莫司免疫原，其中R为N-O-(CH2)3-COO-，载体为牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin，BSA)。
制备方法如下：
步骤一、具有式(III)结构的他克莫司衍生物的合成
(1)制备具有式(IV)结构的化合物4-邻苯二甲酰亚胺氧基丁酸乙酯：
先用200mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解15.0g，93mmol N-羟基-邻苯二甲酰亚胺，得到N-羟基-邻苯二甲酰亚胺溶液，再加入4.97g，92mmol甲醇钠(NaOMe)和17.9g，92mmol 5-溴戊酸乙酯，得到第一混合溶液，将第一混合溶液在100℃温度下搅拌8-16小时，降温后加入水，得到第二混合溶液，将第二混合溶液用乙醚萃取，萃取后加浓碳酸钠洗涤，得到第一萃取物，并将第一萃取物在硫酸钠上干燥后得到20g，78％黄色油状物。
利用Bruker Avance III plus 400MHz对该黄色油状物质进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：NMR(400MHz，CDCl3)：1.24-1.29(3H，m)，2.06-2.12(2H，m)，2.62-2.65(2H，m)，4.13-4.19(2H，m)，4.25-4.28(3H，m)，7.74-7.77(2H，m)，7.81-7.85(2H，m)。表征为式(IV)所示的化学物质，即4-邻苯二甲酰亚胺氧基丁酸乙酯。
(2)制备具有连接基团(N-O-(CH2)3-COO-基团)的盐酸盐
用150mL 3N盐酸溶解10.0g，36mmol上述制得的4-邻苯二甲酰亚胺氧基丁酸乙酯，回流8-16h。降温后过滤，并用乙酸乙酯萃取，得到第二萃取物。将第二萃取物干燥，获得5g干燥物。
利用Bruker Avance III plus 400MHz对上述所获取的5g干燥物行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：NMR(400MHz，DMSO-d6)：1.81-1.88(2H，m)，2.34(2H，t，J＝7.2Hz)，4.05(2H，t，J＝6.4Hz)，11.06(3H，brs)。表征为式(V)所示的化学物，即4-(胺氧基)丁酸的盐酸盐。
(3)利用他克莫司制备具有＝N-O-(CH2)3-COO-基团的他克莫司衍生物
他克莫司衍生物的制备方法如下：用25mL甲醇溶解2.7g，3.4mmol他克莫司，加入5.23g 33.6mmol上述制备的4-(胺氧基)丁酸的盐酸盐和3.09g，37.7mmol醋酸钠，形成第三混合物。将第三混合物搅拌8-16h，搅拌后浓缩，并加入水后用乙酸乙酯萃取，得到第三萃取物。将第三萃取物用浓碳酸钠洗涤后在硫酸钠上干燥，过滤和浓缩，得到浓缩物。用Prep-HPLC提纯该浓缩物，获得1.41g白色物质。
利用Bruker Avance III plus 400MHz对上述所获取的1.41g白色物质进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：1H NMR(400MHz，CDCl3)：0.69-0.89(11H，m)，1.27-1.63(17H，m)，1.90-2.33(16H，m)，2.93-3.02(2H，m)，3.19-3.45(13H，m)，3.68-3.80(1H，m)，3.96-4.06(3H，m)，4.28-4.40(2H，m)，4.45-5.00(7H，m)，5.14-5.30(1H，m)，5.53-5.64(1H，m)。其表征为式(III)所示的化学物，即具有式(III)结构的他克莫司衍生物。
(4)利用色谱/质谱技术(LCMS)对得到的具有式(III)结构的他克莫司衍生物进行分析鉴定
仪器：安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200系列，离子源采用正离子或负离子化模式。色谱柱规格为：Welchrom XB-C18(50×4.6mm，5μm)，柱温为30℃，流速为1.5mL/min，流动相为乙腈-水，比例为60％-95％。
鉴定结果：该具有式(III)结构的他克莫司衍生物纯度＞98％，分子量为904，保留时间为2.8min，分子离子为905(M+1)。
步骤二、将具有免疫原性的载体溶解形成具有免疫原性的载体溶液：
将牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)(200mg)溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中，得到BSA溶液；
步骤三、将BSA与他克莫司衍生物通过N-O-(CH2)3-COO-基团连接形成所述的他克莫司免疫原
他克莫司免疫原的合成方法如下：将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的他克莫司衍生物、3.5ml DMF、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH5.0的磷酸钾缓冲液、200mg EDAC、50mg N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，Sulfo-NHS)，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min，得到第四混合溶液；将溶解好的第四混合溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌8-16h，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到他克莫司免疫原。
实施例2
抗他克莫司特异性抗体的制备，制备方法如下：
(1)用磷酸盐缓冲液(PBS)将由实施例1合成的他克莫司免疫原稀释至1.5mg/ml，得到抗原溶液，然后用抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对家兔进行注射；
(2)2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂混合后对家兔注射一次，之后每隔四周一次，共两次，抽取家兔的抗血清，获得有效的抗体。
实施例3
他克莫司检测试剂的制备，
原料：上述实施例2中的抗他克莫司的特异性抗体、他克莫司酶标偶联物和含有常规的ELISA检测用的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(3，3’5，5’-Tetramethylbenzidine，TMB)的底物溶液。
他克莫司酶标偶联物的制备方法如下：
称取20mg HRP在室温条件下溶解于5ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；称取5mg的具有式(III)结构的他克莫司衍生物于小烧杯中，并依次加入350μL DMF、350μL无水乙醇、700μL 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、20mgEDAC和3mg Sulfo-NHS，在室温条件下搅拌反应30min；随后将活化的他克莫司衍生物滴加到HRP溶液中，在2-8℃条件下搅拌8-16h，并将偶联的抗原进行透析纯化得到HRP-他克莫司偶联物。
上述抗他克莫司特异性抗体性能测试如下：
(1)标准品的制备：
将他克莫司粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml和0ng/ml的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mM Tris，145mM NaCl和0.25％的BSA。
(2)利用他克莫司的ELISA检验方法制备标准曲线：
用PBS将实施例2中所制备的抗他克莫司抗体稀释成1∶8000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；
用PBS将上述包被有抗他克莫司抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用PBS洗涤3次，加入20μL/孔的标准品。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-他克莫司偶联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μL TMB底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL终止液(2M硫酸)，测定450nm的吸光值。
根据各标准品的所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如附图1所示。
(3)应用实施例3中所制备的他克莫司检测试剂进行样本中他克莫司的回收试验，以确定实施例3中所制备的他克莫司检测试剂可以用于全血样本中他克莫司的检测。回收试验，步骤如下：
制作全血样本，制备方法为：将他克莫司粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1mg/ml的储存液，并将此储存液稀释于空白全血中，至终浓度分别为0.00，5.00，10.00，50.00ng/mL，形成空白、低、中、高浓度的全血样本。上述空白全血为不含他克莫司的健康人全血。
测试方法：利用上述他克莫司的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的全血样本代替标准品，测试上述空白、低、中、高浓度的全血样本在450nm条件下的吸光值。对照图1中所示的他克莫司ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中他克莫司含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中他克莫司的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表1他克莫司的ELISA检测回收实验
| 血清样品 | 空白 | 低 | 中 | 高 |
| 样品浓度(ng/ml) | 0.00 | 5.00 | 10.00 | 50.00 |
| 测试1 | 0.15 | 4.92 | 9.66 | 46.65 |
| 测试2 | 0.06 | 4.56 | 8.95 | 48.92 |
| 测试3 | 0.18 | 5.24 | 11.00 | 46.05 |
| 平均值(ng/ml) | 0.13 | 4.91 | 9.87 | 47.21 |
| 回收率(％) | - | 98.20 | 98.70 | 94.42 |
由表1中结果可知：采用本发明他克莫司检测试剂测定不同浓度的样品中的他克莫司回收率都较好高，均＞90％，说明本发明所述的他克莫司检测试剂可以用于样本中他克莫司的检测，并且结果准确，可信。
(3)药物干扰试验
试验方法：选取46种常用化合物和药物进行药物干扰检测，调整其浓度为10.0μg/ml，利用上述他克莫司的ELISA检验方法测试进行复孔测定。
干扰试验的具体步骤如下：
用PBS将实施例2的抗所制备的抗他克莫司抗体稀释成1∶8000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；
用PBS将上述包被有抗他克莫司抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭8-16h。PBS洗涤3次；然后用PBS洗涤3次，加入20μL/孔的浓度为10.0μg/ml的干扰药物；加入100μL/孔工作浓度的HRP-他克莫司偶联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μL TMB底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL终止液(2M硫酸)。测定450nm的吸光值。定标结果如表2所示。
表2
由表2中测试结果可知，按他克莫司ELISA检验的方法对上述化合物进行复孔测定，结果均小于0.1μg/ml。可见，本发明的抗体是抗他克莫司特异性抗体。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.他克莫司免疫原，其结构式如式(I)所示：
式(I)
式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。
2.根据权利要求1所述的他克莫司免疫原，其特征在于：载体为具有免疫原性的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的他克莫司免疫原，其特征在于：R为N-(CH2)n-COO-，或者所述R为N-O-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数；
优选地，R为N-O-(CH2)n-COO-，n为1至20之间的整数；更为优选地，所述R为N-O-(CH2)3-COO-。
4.一种抗他克莫司特异性抗体，由权利要求1-3中任意一项所述的他克莫司免疫原免疫动物后生产得到。
5.一种他克莫司检测试剂，含有权利要求4所述的抗他克莫司特异性抗体和指示试剂。
6.根据权利要求5所述的他克莫司检测试剂，其特征在于：所述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂和化学发光试剂；优选地，所述指示试剂为酶试剂，由他克莫司酶标偶联物和酶底物所组成；更为优选地，所述抗他克莫司特异性抗体结合在稳定的表面上。
7.一种权利要求1中所述的他克莫司免疫原的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、制备具有式(III)中结构的他克莫司衍生物；
式(III)
(2)、将具有免疫原性的载体溶解形成具有免疫原性的载体溶液；
(3)、将具有式(III)中结构的他克莫司衍生物加入到上述具有免疫原性的载体溶液中，使具有式(III)中结构的他克莫司衍生物中连接基团所在部分和具有免疫原性的载体发生缩聚反应，形成的他克莫司免疫原。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：当R为N-O-(CH2)3-COO时，所述步骤(1)包括：
用有机溶剂D溶解0.5-5.0g他克莫司和0.5-10g 4-胺氧基丁酸的盐酸盐，使两者在第二催化剂的作用下发生反应，反应后经浓缩，加水用有机溶剂E萃取，经干燥、浓缩和纯化得到具有式(III)中结构的他克莫司的衍生物；
优选地，所述有机溶剂D为乙酸乙酯，乙醚或氯仿；
优选地，所述有机溶剂E为乙酸乙酯或乙醚；
优选地，所述第二催化剂为醋酸钠或对甲苯磺酸。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：当R为N-O-(CH2)3-COO时，所述步骤(1)中4-胺氧基丁酸的盐酸盐的制备方法如下：
用有机溶剂A溶解10-50g N-羟基-邻苯二甲酰亚胺和10-50g的5-溴戊酸乙酯，使其在第一催化剂的作用下进行加热反应，生成物经有机溶剂B萃取，干燥得到4-邻苯二甲酰亚胺氧基丁酸乙酯；
用无机酸C溶解4-邻苯二甲酰亚胺氧基丁酸乙酯，经有所述机溶剂D萃取，萃取物经干燥得到所述4-(胺氧基)丁酸的盐酸盐；
优选地，所述有机溶剂A为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇或乙醇；
优选地，所述有机溶剂B为乙酸乙酯，乙醚或氯仿；
优选地，所述有机溶剂C为盐酸溶液或硫酸溶液；
优选地，所述第二催化剂为甲醇钠，氧化钾或氧化钠。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：当R为N-O-(CH2)3-COO时，所述步骤(3)包括：
用所述有机溶剂A溶解上述具有式(III)中结构的他克莫司衍生物，通过EDAC的方法或EDAC和N-羟基琥珀酰亚胺联合使用的方法进行活化并与载体溶液进行交联反应，反应获取物经透析纯化后得到具有免疫原性的他克莫司免疫原。
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