ES2556354T3 - Método para la detección de neumococos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se obtiene por inmunización con antígeno F neumocócico copulado con una proteína de soporte seleccionada entre seroalbúmina bovina, hemocianina de lapa, ovalbúmina y un extracto de Ascaris, caracterizado por que el anticuerpo reconoce específicamente un antígeno F neumocócico, donde el anticuerpo no tiene reactividad cruzada con Haemophilus influenzae y no exhibe reactividad cruzada con un antígeno C-ps neumocócico.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

resultaron contener un anticuerpo que tiene fosforilcolina como epítopo, el cual es similar al anticuerpo HAS.

2) Comparación de la reactividad cruzada entre una pluralidad de especies bacterianas

5 Se investigó también la reactividad cruzada entre muchas especies bacterianas. Se repitió el procedimiento del Ejemplo 5-1), excepto por utilizar las bacterias enumeradas en la Tabla 1, para valorar así la reactividad del anticuerpo de la presente invención. La Fig. 5 muestra los resultados. El anticuerpo de la presente invención exhibía reactividad cruzada con S. mitis, de forma similar al caso del anticuerpo producido por Stuertz et al. (Stuertz et al., J. Clin. Microbiol. 36: 2346-2348 (1998)), pero no exhibía reactividad con otras bacteria.

10 [Tabla 1]

ATCC Nº

Bacterias Concentración bacteriana en el extracto (UFC/ml)

1

25285 Bacteroides fragilis 1,1E+07

2

BAA-589 Bordetelia pertussis 9,5E+07

3

66396 Candida albicans 6,0E+06

4

10700 Corynebacterium pseudodiphtheriticum 5,0E+07

5

14116 Cryptococcus neoformants 4,3E+05

6

8486 Eubacterium limosum 1,3E+07

7

9006 Haemophilus influenzae, a 2,7E+06

8

10211 Haemophilus influenzae, b 5,0E+06

9

9007 Haemophilus influenzae, c 3,9E+06

10

9008 Haemophilus influenzae,d 5,0E+06

11

8142 Haemophilus influenzae,e 4,5E+06

12

700222 Haemophilus influenzae,f 3,4E+06

13

7901 Haemophilus parainfluenzae 5,5E+07

14

9997 Klebsilla pneumoniae 3,6E+07

15

33152 Legionella pneumophila 3,6E+07

16

33153 Legionella pneumophila 9,5E+07

17

33216 Legionella pneumophila 1,0E+07

18

33270 Micromonas micros 4,1E+07

19

8193 Moraxella catarrhalis 5,0E+06

20

62501 Neisseria meningitidis 1,6E+07

21

15032 Prebotella intermedia 5,5E+07

22

25845 Prebotella melaninogenica 5,0E+07

23

9027 Pseudomonas aeruginosa 5,5E+07

24

700699 Staphylococcus aureus 2,7E+07

25

14776 Staphylococcus aureus 5,5E+07

26

33397 Streptococcus anginosus (grupo G) 3,3E+07

27

12386 Streptococcus agalactiae (grupo B) 4,1E+07

28

27513 Streplococcus constellaus 3,3E+07

29

27823 Streptococcus constellaus 1,2E+06

30

9528 Streplococcus equi (grupo C) 5,0E+06

31

9895 Streptococcus intermedius 7,0E+07

32

27335 Streptococcus intermedius 3,2E+07

33

49456 Streptococcus mitis 1,2E+07

34

35037 Streptococcus oralis (grupo A) 7,0E+05

35

49619 Streptococcus pneumoniae 1,2E+07

36

10556 Streptococcus sanguis 6,0E+07

37

9963 Streptococcus sp. (grupo F) 4,4E+07

38

8149 Haemophilus influenzae, sin tipo 1,1E+07

El anticuerpo antiantígeno F de la presente invención, que reconoce un resto de polisacárido, exhibía una gran

15 especificidad hacia el neumococo, en comparación con los anticuerpos antiantígeno F convencionales que emplean fosforilcolina como epítopo. Además, como el anticuerpo antiantígeno F de la presente invención no tiene reactividad hacia Haemophilus influenzae, que causa fácilmente una infección mixta con el neumococo en marcos clínicos, el anticuerpo de la invención es útil en pruebas clínicas sin sufrir interferencias por Haemophilus influenzae. Además, el sistema de ensayo ELISA que emplea el anticuerpo de la presente invención exhibía una sensibilidad de 0,041 a

20 10 ng/ml (mostrado en el Ejemplo 3), la cual es notablemente superior (aproximadamente 75 veces) en comparación

10 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

con las sensibilidades convencionalmente reportadas de los sistemas de ensayo ELISA (v.g., de 3,1 a 50 ng/ml, reportado por los antes mencionados Stuertz et al.).

Ejemplo de referencia 2: Medios inmunocromatográficos

En la presente invención, se puede llevar a cabo una inmunocromatografía por una técnica convencional. Por ejemplo, se pueden emplear medios cromatográficos, incluyendo tiras y otros materiales, según se muestra en la Fig. 6. Una realización de los medios cromatográficos tiene, en un lado del substrato, tal como una lámina base de plástico en un extremo, una porción de aplicación de muestra (almohadilla de muestra) y una porción que mantiene un anticuerpo antiantígeno F marcado en estado seco (almohadilla de conjugado), una porción de nitrocelulosa y una porción para absorber el exceso de cantidad de la muestra (almohadilla de absorción). En caso de que la solución de anticuerpo antiantígeno F marcado y una muestra sean absorbidas por la almohadilla de muestra, se puede omitir la almohadilla de conjugado. La almohadilla de muestra, la almohadilla de conjugado y la almohadilla de absorción están preferiblemente formadas por fibra de vidrio, celulosa, algodón o un material poroso formado por una mezcla de éstos (v.g., papel de filtro). Se prefiere nitrocelulosa con un tamaño de poro de 1,0 a 20 m (preferiblemente de 5,0 a 15,0 m).

Sobre la porción de nitrocelulosa, se aplica el anticuerpo policlonal antiantígeno F purificado antes mencionado (concentración: de 0,1 a 10 mg/ml, preferiblemente de 0,2 a 5 mg/ml) (véase la línea de ensayo). Sobre el área apartada de la línea de ensayo, por ejemplo, se aplica una IgG de cabra o de ratón que tiene actividad anti-IgG de conejo (concentración: de 0,1 a 10 mg/ml) (véase la línea de control). Después de secar, se bloquea el medio cromatográfico con proteína, polímero, etc. Como ejemplos del material de bloqueo que puede ser utilizado en la invención, se incluyen proteínas, tales como leche desnatada, BSA, caseína y gelatina, y polímeros, tales como alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP) y polietilenglicol (PEG).

El material marcador del anticuerpo es preferiblemente oro coloidal con un tamaño de partícula de 20 a 150 nm (preferiblemente de 30 a 100 nm). Como alternativa, se pueden emplear también partículas de látex coloreadas y otros metales coloidales. Estos materiales de marcaje se unen a un anticuerpo por adsorción directa de los mismos sobre partículas de coloides o de látex, unión covalente a través de otra proteína, unión covalente a través de grupos funcionales sobre las partículas de látex u otro método apropiado. De forma similar al caso de la nitrocelulosa, se puede bloquear el material de marcaje usando proteínas, tales como leche desnatada, BSA, caseína y gelatina, y polímeros, tales como alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona (PVP) y polietilenglicol (PEG). Se impregna entonces el material poroso antes mencionado con el anticuerpo policlonal antiantígeno F marcado producido por el método antes mencionado y una proteína, tal como leche desnatada, BSA, caseína o gelatina, o un polímero tal como PVA, PVP o PEG, y un sacárido, y se seca, para obtener así una almohadilla de conjugado. La almohadilla de conjugado, una almohadilla de muestra, una almohadilla de absorción y la porción de nitrocelulosa formadas mediante el método anterior se apilan sobre el substrato, para fabricar así una tira inmunocromatográfica. Se puede usar la tira, cuando está dentro de un estuche de plástico o tiene un sello laminado unido a la misma (Figs. 6C y 6D).

Ejemplo 6: Evaluación del rendimiento de la inmunocromatografía en sándwich empleando anticuerpos antiantígeno F

Se fabricó una tira inmunocromatográfica que tenía una almohadilla de conjugado que albergaba un anticuerpo antiantígeno F marcado con oro coloidal en estado seco. Se diluyó una muestra, tal como un exudado, un frotis, un esputo, sangre, líquido cefalorraquídeo u orina con origen en otitis media, neumonía, meningitis, etc., con un tampón fosfato que contenía surfactante o similar. Se sumergió una tira cromatográfica en la muestra diluida (extracto de muestra), para revelar así la muestra (Fig. 7A). A los quince minutos de iniciar el revelado, se comprobó visualmente si la muestra era positiva o negativa. Como resultado, se observó una línea roja en la posición de la línea de ensayo cuando la concentración de antígeno F cayó dentro del rango de 10 a 0,6 ng/ml, con lo que se confirmó que la muestra era positiva. Por el contrario, en caso de usar un tampón en lugar del antígeno F, no se observó ninguna línea roja en la posición de la línea de ensayo, con lo que se confirmó que la muestra era negativa (Fig. 7B). Mediante la misma técnica, se estudió un extracto bacteriano que tenía una concentración celular conocida por medio de la misma tira inmunocromatográfica. Cuando sólo se aplicó tampón (concentración celular: 0), no se observó ninguna línea en la posición de la línea de ensayo, lo cual era similar al caso anterior. Por el contrario, cuando se aplicó un extracto de neumococos, la línea de ensayo pudo confirmar una concentración celular de 103 UFC/ml, lo que indica que la muestra era positiva (Fig. 7C).

11

Claims (1)

1. imagen1