JP6622363B2 - 抗リポアラビノマンナン抗体及び当該抗体を用いた抗酸菌症のイムノアッセイ - Google Patents
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Description
(A)下記(a)〜(c)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(d)〜(f)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカーを介して接合してなるモノクローナル抗体:(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;
(B)下記(g)〜(i)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(j)〜(l)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカーを介して接合してなるモノクローナル抗体:(g)配列番号31で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(h)配列番号32で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(i)配列番号33で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(j)配列番号34で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(k)配列番号35で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(l)配列番号36で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3
(C)下記(m)〜(o)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(p)〜(r)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカーを介して接合してなるモノクローナル抗体:(m)配列番号47で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(n)配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(o)配列番号49で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(p)配列番号50で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(q)配列番号51で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(r)配列番号52で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
(II-1)非ヒト動物に、免疫原としてBCGを投与することにより、BCGに対する体液性免疫応答を誘導する工程を有する、抗酸菌のLAMに特異的に結合するモノクローナル抗体を製造するための、非ヒト動物の免疫方法。
当該非ヒト動物から当該抗体を産生する細胞を採取する工程を有する、
抗酸菌のLAMに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
当該非ヒト動物から抗酸菌のLAMに結合する抗体に対するmRNAを調製する工程、当該mRNAを鋳型としてcDNAを調製する工程、及び
当該cDNAを用いたファージディスプレイ法により抗酸菌のLAMに特異的に結合するモノクローナル抗体を採取する工程
を有する抗酸菌のLAMに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
当該非ヒト動物から当該抗体を産生する細胞を採取する工程を有する、
抗酸菌のLAMに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
当該非ヒト動物から抗酸菌のLAMに結合する抗体に対するmRNAを調製する工程、当該mRNAを鋳型としてcDNAを調製する工程、及び
当該cDNAを用いたファージディスプレイ法により抗酸菌のLAMに特異的に結合するモノクローナル抗体を採取する工程
を有する、抗酸菌のLAMに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法。
(III-1)下記の工程を有する、抗酸菌、好ましくは結核菌の検出方法:
(1)(I-1)乃至(I-16)のいずれかに記載するモノクローナル抗体を、被験者の生体試料と接触させる工程、及び
(2)上記モノクローナル抗体と抗酸菌、好ましくは結核菌のLAMとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌、好ましくは結核菌を測定する工程。
(IV-1)(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載する(A)のモノクローナル抗体を含む、結核診断剤。
(V-1)下記の工程を有する、被験試料中の抗酸菌LAMを測定する方法:
(1)(I-1)乃至(I-16)のいずれかに記載するモノクローナル抗体を、抗酸菌を含み得る被験試料と接触させる工程、及び
(2)上記モノクローナル抗体と抗酸菌のLAMとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌LAMを測定する工程。
(VI-1)(I-1)乃至(I-16)のいずれかに記載するモノクローナル抗体を含む、抗酸菌のリポアラビノマンナン検出剤。
(VII-1)下記の工程を有する被験試料について抗酸菌感染の有無を測定する方法 (1)検体試料を高熱煮沸滅菌、好ましくは高圧蒸気滅菌する工程、
(2) (I-1)乃至(I-16)のいずれかに記載するモノクローナル抗体、好ましくは(I-1)乃至(I-6)または(I-7)乃至(I-10)のいずれかに記載する(A)または(B)のモノクローナル抗体を、滅菌処理した被験試料とそれぞれ接触させる工程、
(3)上記本発明のモノクローナル抗体と抗酸菌LAMとの結合反応を指標として、被験試料中の抗酸菌LAMを測定する工程、及び
(4)被験試料に抗酸菌LAMが検出された場合に、被験試料が抗酸菌に感染していると判断する工程。
(VIII-1)下記の工程を有する、抗結核薬の結核治療効果を判定する方法:
(1)(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載する(A)のモノクローナル抗体を、抗結核薬投与前後の被験試料とそれぞれ接触させる工程、
(2)上記モノクローナル抗体と結核菌のLAMとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の被験試料中の結核菌LAMを測定する工程、及び
(3)抗結核薬投与前の被験試料に結核菌LAMが検出され、且つ抗結核薬投与後の被験試料に結核菌LAMが検出されない場合に抗結核薬の結核治療効果ありと、決定する工程。
(1)(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載する(A)のモノクローナル抗体を、抗結核薬投与前後の被験試料とそれぞれ接触させる工程、
(2)上記モノクローナル抗体と結核菌のLAMとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の被験試料中の結核菌LAMを定量する工程、及び
(3)抗結核薬投与後の被験試料中の結核菌LAM量(投与後測定値)と、抗結核薬投与前の被験試料中の結核菌LAM量(投与前測定値)を対比して、投与後測定値が投与前測定値よりも低い場合に抗結核薬の結核治療効果ありと、それ以外の場合に抗結核薬の結核治療効果なしと、決定する工程。
(IX)(I-1)乃至(I-6)のいずれかに記載する(A)のモノクローナル抗体を含む、抗結核薬の結核治療効果判定用キット。
(X-1)毛細管現象によって被験試料を移送できる材料で構成された吸液片を備えた、抗酸菌、好ましくは結核菌検出具であって、当該吸液片が
(1)被験試料を吸収採取する試料採取部、
(2)抗酸菌のLAMと特異的に反応する、標識されてなる(I-1)乃至(I-16)のいずれかに記載するモノクローナル抗体を担持した標識抗体部、
(3)下記に示す、テスト結果表示部を備えた判定部、
(a) 抗酸菌のLAMと特異的に反応する、非標識の(I-1)乃至(I-16)のいずれかに記載するモノクローナル抗体を固定したテスト結果表示部、
(4)上記試料採取部、標識抗体部及び判定部を移動してきた被験試料の残液を吸収する液吸収部を備えることを特徴とする、抗酸菌、好ましくは結核菌検出具。
(b) 標識されてなる(I-1)乃至(I-16)のいずれかに記載するモノクローナル抗体と反応する非標識−抗体を固定したコントロール表示部。
結核菌は、マイコバクテリウム科マイコバクテリウム属(Mycobacterium)に属し、他のマイコバクテリウム属細菌とともに、抗酸菌と呼ばれる細菌群の一種である。しかし、37℃で増殖可能であるが28℃で増殖しない点、及び耐熱性のカタラーゼを有する点等で、他の抗酸菌(非結核性抗酸菌)と区別される。当該結核菌としては、結核菌(Mycobacterium tuberculosis、ヒト型結核菌)、ウシ型結核菌(M. bovis、ウシ型菌、ウシ菌)、マイコバクテリウム・アフリカンス (M. africans)、ネズミ型結核菌(M. microti)の4種類が知られている。このうち、ヒト型結核菌(M.tuberculosis)が結核の原因菌としてヒトへの病原性を示すほか、M. bovisとM. africansがまれにヒトに感染する。M. microtiはヒトに対する病原性を持たない。またM. bovisを長期間継代培養して弱毒化したものがBCGであり、結核予防のためのワクチン(弱毒生菌ワクチン)として利用されている。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
(h)配列番号32で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(i)配列番号33で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(j)配列番号34で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(k)配列番号35で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(l)配列番号36で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
(n)配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(o)配列番号49で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(p)配列番号50で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(q)配列番号51で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(r)配列番号52で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
また本発明は、抗酸菌のLAMに特異的に結合するMoAbを製造するための非ヒト動物の免疫方法、及び当該免疫方法を利用した上記MoAbの製造方法に関する。より好ましくは、結核菌のLAMに特異的に結合するMoAbを製造するための非ヒト動物の免疫方法、及び当該免疫方法を利用した上記MoAbの製造方法に関する。
抗酸菌LAMの基本的構造はほとんど同じで、マンノースキャップの構造に微小な違いが認められるだけである。かかる抗酸菌LAMに対する抗体を作製する場合、免疫原としてH37Rvなどのヒト型結核菌標準株を用いて非ヒト動物を免疫するのが一般的である。こうすることで、抗酸菌のLAMに広く反応する抗体を作製することができる。
上記本発明のMoAbは、抗酸菌、好ましくは結核菌の検出に使用することができる。言い換えると、本発明のMoAbを用いることで、被験者が抗酸菌、特に結核菌を保有しているか否か、つまり被験者が抗酸菌、特に結核菌に感染しているか否かを診断・検査することができる。
(1)本発明のMoAbを、被験者の生体試料(被験試料)と接触させる工程、及び
(2)本発明のMoAbと抗酸菌LAM、特に結核菌LAMとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する結核菌を測定する工程。
(i)被験試料を吸収採取する試料採取部、
(ii)被験試料の抗酸菌、好ましくは結核菌のLAMと特異的に反応する標識−抗結核菌LAM抗体(本発明MoAb)を担持した標識抗体部、
(iii)下記に示す、テスト結果表示部を備えた判定部、
(a) 抗酸菌、好ましくは結核菌のLAMと特異的に反応する非標識−抗結核菌LAM抗体(本発明MoAb)を固定したテスト結果表示部、および
(iv)上記試料採取部、標識抗体部及び判定部を移動してきた被験試料の残液を吸収する液吸収部を備えている。
(b) 標識−抗抗酸菌LAM抗体(本発明MoAb)、好ましくは標識−抗結核菌LAM抗体(本発明MoAb1)と反応する非標識−抗抗酸菌LAM抗体(本発明MoAb)、好ましくは非標識−抗結核菌LAM抗体(本発明MoAb1)を固定したコントロール表示部。
片は、1枚のシートにより、或いは複数枚のシートを重ね合わせるかまたは連結して、形成することができる。或いは、吸液片は、細長い棒状の細片とする等、液の吸収及び毛細管現象による移送が可能な種々の形態とすることができる。なお、本発明の検出具は、さらに上記の吸液片を支持する支持体を備えるものであってもよい。
前述する抗酸菌検出方法及び抗酸菌検出具は、被験者の生体試料中の抗酸菌の存在を検出するために使用される。特にモノクローナル抗体として本発明のMoAb1を用いる場合、上記抗酸菌として、好ましくは結核菌を例示することができる。つまり、前述する抗酸菌検出方法及び抗酸菌検出具は、被験者における抗酸菌、特に結核菌感染の有無を診断するために使用される。
本発明のMoAbは、抗酸菌のリポアラビノマンナン(LAM)を特異的に認識し、結合する抗体である。このため、前述する本発明の抗酸菌検出方法は、抗酸菌LAMの測定にも応用することができる。
(1)本発明MoAbを、抗酸菌を含み得る被験試料と接触させる工程、及び
(2)本発明MoAbと抗酸菌のLAMとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌LAMを測定する工程。
(III)で前述する本発明の抗酸菌または結核菌検出方法は、バイオハザードフリーの測定方法として応用することができる。具体的には、本発明のバイオハザードフリーな測定方法は、下記の工程を行うことによって実施することができる。
(3)上記本発明のMoAb、好ましくはMoAb1と結核菌LAMとの結合反応を指標として、被験試料中の結核菌LAMを測定する工程、及び
(4)被験試料に結核菌LAMが検出された場合に、被験試料が結核菌に感染していると判断する工程。
(III)で前述する本発明の抗酸菌、特に結核菌検出方法は、抗結核薬の結核治療効果の判定にも応用することができる。
(1)本発明のMoAb、好ましくはMoAb1を、抗結核薬投与前後の被験試料とそれぞれ接触させる工程、
(2)上記本発明のMoAb、好ましくはMoAb1と結核菌LAMとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の被験試料中の結核菌LAMを測定する工程、及び
(3)抗結核薬投与前の被験試料に結核菌LAMが検出され、且つ抗結核薬投与後の被験試料に結核菌LAMが検出されない場合に抗結核薬の結核治療効果ありと、判断する工程。
項1.抗酸菌のリポアラビノマンナンに対して結合性を有する、下記(A)及び(C)のモノクロ一ナル抗体を含む抗酸菌検出用キット:
(A)下記(a)〜(c)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(d)〜(f)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とがリンカ一を介して接合してなるモノクロ一ナル抗体:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;
(C)下記(m)〜(o)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(p)〜(r)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカ一を介して接合してなるモノクロ一ナル抗体:
(m)配列番号47で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(n)配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(o)配列番号49で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(p)配列番号50で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(q)配列番号51で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(r)配列番号52で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
(g)配列番号31で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(h) 配列番号32で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(i)配列番号33で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(j)配列番号34で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(k)配列番号35で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(l)配列番号36で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
(A)下記(a)〜(c)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(d)〜(f)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカ一を介して接合してなるモノクロ一ナル抗体:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;
(C)下記(m)〜(o)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(p)〜(r)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカ一を介して接合してなるモノクロ一ナル抗体:
(m)配列番号47で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(n)配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(o)配列番号49で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(p)配列番号50で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(q)配列番号51で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(r)配列番号52で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;
(B) 下記(g)〜(i)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(j)〜(l)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカーを介して接合してなることを特徴とする、モノクロ一ナル抗体:
(g)配列番号31で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(h) 配列番号32で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(i)配列番号33で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(j)配列番号34で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(k)配列番号35で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(l)配列番号36で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。
(1)項1に記載する(A)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、被験者の生体試料(被験試料)と接触させる工程、及び
(2)項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)のモノクローナル抗体に捕捉された抗酸菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌を測定する工程。
(1)項1に記載する(A)のモノクローナル抗体及び項2に記載する(B)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、被験者の生体試料(被験試料)と接触させる工程、及び
(2)項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)及び(B)のモノクローナル抗体に捕捉された抗酸菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌を測定する工程。
(1)項1に記載する(A)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、被験者の生体試料(被験試料)と接触させる工程、及び
(2)項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)のモノクローナル抗体に捕捉された抗酸菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌リポアラビノマンナンを測定する工程。
(1)抗酸菌のリポアラビノマンナンに対して結合性を有する項1に記載する(A)のモノクローナル抗体、及び項2に記載する(B)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、被験者の生体試料と接触させる工程、及び
(2)項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)及び(B)のモノクローナル抗体に捕捉された抗酸菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌リポアラビノマンナンを測定する工程。
(2)の測定工程において抗酸菌リポアラビノマンナンを検出する工程を有する、抗酸菌リポアラビノマンナンの定性方法であるか、または
(2)の測定工程において抗酸菌リポアラビノマンナンを定量する工程を有する、抗酸菌リポアラビノマンナンの定量方法である、項8または9に記載の測定方法。
抗結核薬投与前後の各被験試料を対象として
(1)項1に記載する(A)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、抗結核薬投与前後の各被験試料と接触させる工程、
(2)項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)のモノクローナル抗体に捕捉された結核菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の各被験試料に存在する結核菌リポアラビノマンナンを測定する工程、及び
(3)抗結核薬投与前の被験試料に結核菌リポアラビノマンナンが検出され、且つ抗結核薬投与後の被験試料に結核菌リポアラビノマンナンが検出されない場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果ありと、決定する工程。
(1)項1に記載する(A)のモノクローナル抗体及び項2に記載する(B)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、抗結核薬投与前後の各被験試料と接触させる工程、
(2)項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)及び(B)のモノクローナル抗体に捕捉された結核菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の各被験試料中の結核菌リポアラビノマンナンを測定する工程、及び
(3)抗結核薬投与前の被験試料に結核菌リポアラビノマンナンが検出され、且つ抗結核薬投与後の被験試料に結核菌リポアラビノマンナンが検出されない場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果ありと、決定する工程。
(1)項1に記載する(A)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、抗結核薬投与前後の各被験試料と接触させる工程、
(2)項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)のモノクローナル抗体に捕捉された結核菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の各被験試料中の結核菌リポアラビノマンナンを定量する工程、及び
(3)抗結核薬投与後の被験試料中の結核菌リポアラビノマンナン量(投与後測定値)と、抗結核薬投与前の被験試料中の結核菌リポアラビノマンナン量(投与前測定値)を対比して、投与後測定値が投与前測定値よりも低い場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果ありと、それ以外の場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果なしと、決定する工程。
(1)項1に記載する(A)のモノクローナル抗体及び項2に記載する(B)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、抗結核薬投与前後の各被験試料と接触させる工程、
(2)項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)及び(B)のモノクローナル抗体に捕捉された結核菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の各被験試料中の結核菌リポアラビノマンナンを定量する工程、及び
(3)抗結核薬投与後の被験試料中の結核菌リポアラビノマンナン量(投与後測定値)と、抗結核薬投与前の被験試料中の結核菌リポアラビノマンナン量(投与前測定値)を対比して、投与後測定値が投与前測定値よりも低い場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果ありと、それ以外の場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果なしと、決定する工程。
(1)被験試料を吸収採取する試料採取部、
(2)抗酸菌のリポアラビノマンナンと特異的に反応する、標識されてなる項1または2に記載する(A)〜(C)のいずれかのモノクローナル抗体を担持した標識抗体部、
(3)下記に示す、テスト結果表示部を備えた判定部、
(a) 抗酸菌のリポアラビノマンナンと特異的に反応する、非標識の項1または2に記載する(A)〜(C)のいずれかのモノクローナル抗体とを固定したテスト結果表示部、
(4)上記試料採取部、標識抗体部及び判定部を移動してきた被験試料の残液を吸収する液吸収部
を備えることを特徴とする、抗酸菌検出具。
(a) テスト結果表示部と間隔をおいて、さらに下記に示すコントロール表示部を備えていることを特徴とする、項17記載の抗酸菌検出具:
(b) 標識されてなる項1または2に記載する(A)〜(C)のいずれかのモノクローナル抗体と反応する非標識−抗体を固定したコントロール表示部
を備えた判定部である、項17に記載する抗酸菌検出具。
1.材料の調製
(1-1)オリゴ化LAMの作製、及び免疫抗原の調製
ヒト型結核菌であるM. tuberculosisのLAM(青山B株由来、ナカライテスク)3mgを50mMの酢酸緩衝液(pH4.5)にて透析し、1mg/mLの濃度に調整した後、200mMの過ヨウ素酸水溶液を150μL添加し、遮光下4℃で7分間攪拌した。攪拌後エチレングリコールを35μL添加し、小型カラムPD-10(GE社製)でゲルろ過(0.1M炭酸水素ナトリウム、pH8.3) を行って1mLずつ分画した。分画サンプルは、フェノール−硫酸法にて糖を検出し、糖が検出された分画を純水にて透析を行った後に凍結乾燥した。
BCGワクチンとして、日本ビーシージー製造(株)製の凍結乾燥BCGワクチン(承認番号20300AMZ00767000)を用いた。免疫には、当該凍結乾燥BCGワクチン100mg(湿重量)に生理食塩水1 mlを加えて混合したものを使用した。
H37Ra死菌体として、DIFCO社製のM. TUBERCULOSIS H37Ra(凍結乾燥品)を用いた。免疫には、当該凍結乾燥H37Ra死菌体を100mg(乾重量)に生理食塩水1 mlを加えて混合したものを使用した。
一本鎖抗体(scFv)の作製に用いたプライマーの名前、塩基配列、及び用途を表1に示す。VH領域増幅用プライマーとしてsense primer4種類とantisense primer1種類、VL領域増幅用プライマーとしてsense primer4種類とantisense primer4種類、重鎖可変領域断片と軽鎖可変領域断片とを連結するリンカー(GSリンカー)増幅用プライマーとしてsense primer1種類とantisense primer1種類、及び制限酵素(Sfi-I、Not-I)認識領域を増幅するためのプライマー2種類を合成した。なお、配列表の配列番号13〜29記載のアミノ酸配列は、当該表1に上から順番に記載するプライマーのアミノ酸配列に対応している。
免疫抗原として、BCGワクチンまたはHR37Ra死菌体をそれぞれ用いてウサギを免疫した(上記(1-2)及び(1-3)、並びに参考例1(2)参照)。免疫終了後にウサギの脾臓を摘出し、RPMI(無血清)培地中で組織を溶かして、Total RNAを抽出し、得られたTotal RNAからcDNAを合成した。なお、Total RNAの抽出はRNA抽出キット(QIAGEN社)を用いて、操作手順書に従って行った。また、Total RNAからのcDNA合成は、cDNA合成キット(Invitrogen社)を用いて、操作手順書に従って行った。
可溶性scFvは、大腸菌発現ベクターpET22b(+)(Novagen社製)を利用して作製した。目的とするscFv遺伝子を、sense primerとantisense primerにより増幅することで、5’末端にNot I、3’末端にNco Iの制限酵素配列を付加した。
上記で調製した一本鎖抗体(scFv)、およびポリクローナル抗体(PoAb)のビオチン標識はPIERCE社のSulfo-NHS-LC-Biotin標識キットを用いて、奨励されているキット操作手順に従って行った。
(2-1)血中抗体価の測定(ELISA)
各抗原を免疫したウサギ及びマウスから採取した血清の血中抗体価の確認は、下記のELISAにより行った。
バイオパニングは、第1工程から第4工程からなる4つの工程により行った。
(1)LAMに対するポリクローナル抗体(PoAb)を作製するために、オリゴ化LAMをウサギに免疫した。オリゴ化LAMとして、具体的には、上記「1.材料の調製」の(1-1)に記載の方法で免疫抗原として作製したオリゴ化LAM-KLHを用いた。当該オリゴ化LAM-KLHを、アジュバント(フロイドの不完全アジュバント)と1:1(オリゴ化LAM-KLH:アジュバント[重量比])の割合で混合し、当該混合物を100μg、ウサギの皮下(2匹:Rab-1及び2)に投与し、その後、14日間隔で4回の免疫を行った。5回目の免疫終了後に採血を行い、上記「2.測定方法」の(2-1)に記載するELISA法に従って、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)のLAM及び非結核性抗酸菌(M. Avium)のLAMに対する血中抗体価を測定した。
(1)LAMに対するscFvの作製
参考例1において、オリゴ化LAM、BCGワクチンまたはHR37Ra死菌体のそれぞれで免疫したウサギから採取した脾臓の細胞より、一本鎖抗体scFvを単離した。
BCGワクチンを免疫したウサギの脾臓細胞から調製したscFvディスプレイファージライブラリーから得られた一本鎖抗体scFv(TB-scFv)、及びHR37Ra死菌体を免疫したウサギの脾臓細胞から調製したscFvディスプレイファージライブラリーから得られた一本鎖抗体scFv(Myco-scFv)のそれぞれについて、LAMに対する反応性を評価した。
参考例1及び実施例1で作製した抗体3種類(オリゴ化LAM免疫ウサギポリクローナル抗体(以下、「Myco-Poly」という)(参考例1)、H37Ra死菌体免疫ウサギモノクローナル抗体(Myco-svFv)及びBCGワクチン免疫ウサギモノクローナル抗体(TB-scFv)(以上、実施例1))の特徴を表2にまとめた。
抗酸菌LAM検出用ELISAの構築は、捕捉用抗体としてMyco-Polyをプレートに固相化し、また検出用抗体としてMyco-scFvをビオチン標識して使用した。
結核菌LAM検出ELISAは、捕捉用抗体および検出用抗体ともにTB-scFvを用いて構築した。捕捉用抗体および検出用抗体としてTB-scFvを用いる以外は、上記(1)と同様にして、結核菌LAM検出ELISAを作製した。
(1)及び(2)でそれぞれ作製した抗酸菌LAM検出ELISAおよび結核菌LAM検出ELISAのLAMに対する反応性を、ヒト型結核菌(M. tuberculosis)の精製LAM及び抗酸菌(M. avium)の精製LAMを用いて評価した。
実施例2で構築した抗酸菌LAM検出用ELISAと結核菌LAM検出用ELISAを用いて、抗酸菌および結核菌のLAMに対する抗体反応性を、図7に示す各種の抗酸菌臨床分離株を用いて評価した。
ELISAによって評価した抗体の組み合わせを用いて、抗酸菌LAM検出用と結核菌LAM検出用のイムノクロマトテストの構築を行った。
抗酸菌LAM検出用イムノクロマトテストの構築には、捕捉用抗体としてMyco-Polyをニトロセルロース膜に固相化し、また検出用抗体としてMyco-scFvを金コロイド標識して使用した。
結核菌 LAM検出用イムノクロマトは、捕捉用抗体および検出用抗体ともにTB-scFvを用いて構築した。それ以外の構築方法および測定方法は、上記(1)の抗酸菌LAM検出用イムノクロマトテストの構築方法及び測定方法と同様にして行った。
(1)及び(2)でそれぞれ作製した抗酸菌LAM検出用イムノクロマトおよび結核菌LAM検出用イムノクロマトのLAMに対する反応性を、精製したM. tuberculosisのLAMおよびM. aviumのLAMを用いて評価した。
3.材料の調製
(3-1)BCGワクチン、及び免疫抗原の調製
BCGワクチンとして、日本ビーシージー製造(株)製の凍結乾燥BCGワクチン(承認番号20300AMZ00767000)を用いた。免疫には、当該凍結乾燥BCGワクチン100mg(湿重量)に生理食塩水1 mlを加えて混合したものを使用した。
免疫抗原としてBCGワクチンを用いてニワトリを免疫した(上記(3-1)及び実施例6参照)。免疫終了後、ニワトリから脾臓を摘出し、RPMI(無血清)培地中で組織を溶解し、Total RNAを抽出した。Total RNAの抽出はRNA抽出キット(QIAGEN社)を用いて、操作手順書に従って行った。またTotal RNAからのcDNA合成は、cDNA合成キット(Invitrogen社)を用いて、操作手順書に従って行った。
抗原バイオパニングは、第1工程から第4工程からなる4つの工程により行った。
Mを反応させ、TB-scFVとLAMの複合体を用いたバイオパニングを行った。TB-scFvを5μg/ml濃度で固相化したマイクロプレートにM. tuberculosisの精製LAMを10μg添加して、25℃で1時間反応させた。洗浄後に、第3工程で得られた菌体結合ファージプールを添加し、25℃にて2時間反応させ、次いで、未反応ファージを反応緩衝液にて10回洗浄することにより除去した。TB-scFvとLAMの複合体に結合したファージを、100μLの溶出液にて溶出した後、100μLの中和液(1M トリス緩衝液pH 9.1)を加えることにより中和した。中和したファージプールは、大腸菌JM109株に感染後、LB-Amp/Glu寒天培地にて37℃で一晩培養した。
LAM結合scFvは、LAMに特異的に反応するファージクローンの選択をファージELISA法により行った。上記(3-3)で説明するニワトリscFvライブラリーを用いた抗原バイオパニングの第4工程で得られたファージプールを単一コロニーとして培養し、得られた単一コロニーを50μLのLB-Amp培地にて37℃で8時間培養した。これに50μLのヘルパーファージM13K07(1012cfu/mL)液を感染させた後、400μLのLB-Amp/Kan液体培地を加えて37℃で一晩培養し、単一ファージクローンの培養液を作製した。
二価抗体を用いた抗酸菌LAM検出用ELISA及び結核菌LAM検出用ELISAの評価は、抗酸菌臨床分離株(M. tuberculosis 38株、M. avium 23株、M. intracellulare 6株)に加えて、BCG、口腔内細菌6種類(N. asteroids,N.farcinica, S. globisporus, C albicans, A. israelii, T. paurometabolum)、および喀痰検体(54例)を用いて行った。培養菌体および喀痰検体からのLAM抽出は全て同一条件で行った。サンプルに最終濃度が0.4MになるようにNaOHを添加して混合した後、30分間煮沸した。煮沸後にリン酸緩衝液を添加して中和した。
(4-1)二価抗体の作製
一本鎖抗体scFvから二価抗体への改変は一般的手法により行った。ウサギ定常領域を有する哺乳動物細胞発現ベクター(商品名;pFUSEss-CHIg-rG*03およびpFUSE2ss-CLIg-rk1,InvivoGen社製)に、VH領域遺伝子およびVL領域遺伝子をMyc0-scFv(配列番号30)、TB-scFv(配列番号12)、およびG3-scFv(配列番号39)よりそれぞれクローニングし、VH発現ベクターおよびVL発現ベクターを作製した。VH発現ベクターとVL発現ベクターを混合し、CHO細胞に導入した。当該ベクター導入細胞を4日間培養した後に培養上清を回収し、培養上清からProtein A(Biorad社製)を用いて、それぞれ二価抗体(2価Myco-scFv、2価TB-scFv、および2価G3-scFv)を単離精製した。
二価抗体のビオチン標識はPIERCE社のSulfo-NHS-LC-Biotin標識キットを用いて、キットに付属の操作手順書の記載に従って行った。ビオチン標識化抗体は、ELISA測定系の構築に用いた。
二価抗体による抗酸菌LAM検出用ELISAは2価TB-scFv、2価G3-scFv、および2価Myco-scFv(「二価抗体の作製」の(4-1)参照)を用いて構築した。
二価抗体による結核菌LAM検出用ELISAは、捕捉用抗体に2価TB-scFvを用い、検出抗体にはビオチン標識した2価Myco-scFvを用いた。捕捉用抗体として2価TB-scFv、検出抗体としてビオチン標識2価Myco-scFvを用いる以外は、上記(4-3)に記載する抗酸菌LAM検出用ELISAと同様にして、結核菌LAM検出用ELISAを構築した。
ニワトリへの免疫は、「3.試料の調製」(3-1)に記載する方法で調製したBCGワクチン(100mg湿重量/1ml生理食塩水)を全量、皮下免疫することで行った。14日間隔で4回の免疫を行った後、ニワトリの血中抗体価をELISAにより評価した。
(1)LAMに対するニワトリscFv(一本鎖抗体)の作製
BCGワクチンを免疫したニワトリの脾臓細胞より一本鎖抗体scFvを単離した。具体的には、「3.材料の調製」の(3-2)に記載する方法に従って、ニワトリの脾臓からTotal RNAを調製し、これから合成したcDNAを鋳型として、表3に記載する各種のプライマーを用いてPCRを実施することにより、VH遺伝子増幅産物及びVL遺伝子増幅産物を調製した。次いで、VH遺伝子とVL遺伝子とをGSリンカー(配列番号40)を介して接合したニワトリ一本鎖抗体(VH遺伝子/GSリンカー/VL遺伝子)を作製して、これからscFvディスプレイファージライブラリーを作製した。各ライブラリーのタイターは約106cfuであることから、106個の多様性を有したライブラリーであると推測できる。
上記で作製したG3-scFvの反応性を精製M. tuberculosisのLAMおよびM. avium のLAMを固相化したプレートを用いて評価した。具体的には、G3-scFvを「1.材料の調製」の(1-6)に記載する方法に従って可溶化して可溶化G3-scFvを調製した。次いで同(1-7)に記載する方法に従ってビオチン標識し、精製したM. tuberculosisのLAMおよびM. avium のLAMをそれぞれ固相化した抗原プレート(精製LAM固相化マイクロタイタープレート)に対する反応性をELISA法により測定して評価した。
実用化を考慮して、「二価抗体作製」の(4-1)に記載する方法に従って、実施例1及び6で作製した3種類の一本鎖抗体scFv(Myco-svFv、TB-scFv、G3-scFv)を二価抗体に改変し、当該二価抗体の反応特異性をもとに、抗酸菌LAM検出用ELISAと結核菌 LAM検出用ELISAの2種類を構築した。具体的には、抗酸菌LAM検出用ELISAは、捕捉用抗体として2価TB-scFvと2価G3-scFvを混合してプレートに固相化し、検出用抗体として2価Myco-scFvをビオチン標識したものを使用した。結核菌LAM検出用ELISAは、捕捉用抗体として2価TB-scFvをプレートに固相化し、検出用抗体として2価Myco-scFvをビオチン標識したものを使用した。詳細は、「4.測定方法」の(4-3)及び(4-4)に記載した通りである。
二価抗体を用いたELISAの感度評価を行うため、BCG培養菌体を106cfu/mlから61 cfu/mlまで希釈し、その希釈液の一部より遺伝子を抽出して遺伝子増幅検査(NAAT)を行い、一部よりLAMを抽出して抗酸菌LAM検出用ELISAを行った。
口腔内細菌にはLAMの構成成分と類似した構造の膜抗原を有する種類が存在する。喀痰検体中の抗酸菌のLAMや結核菌のLAMを検出する場合、これら口腔内細菌との交差反応性が非常に問題となり、喀痰を用いた抗酸菌及び結核菌の検出免疫測定法を確立するうえで障害の一つとなっている。
二価抗体を用いた抗酸菌LAM検出用ELISA及び結核菌LAM検出用ELISAを、抗酸菌臨床分離株を用いて評価した。
実施例7で構築した二価抗体を用いたLAM検出用ELISAの性能を評価するため、54例の臨床喀痰検体を用いて評価を行った。評価は直接塗抹検査(Smear)および遺伝子増幅検査(NAAT)の両方から行った。直接塗抹検査および遺伝子増幅検査の結果を表4にまとめた。
喀痰検体を輸送する場合、感染性の問題で厳重な管理のもと輸送することが必要となる。この場合、コストが高くなり、さらに利用できる地域が限定されてくる。喀痰検体を採取後に滅菌した場合、通常の輸送をすることが可能となる。抗酸菌を完全に滅菌するには30分以上の煮沸や加圧蒸気滅菌(オートクレーブ等)による処理が必要である。このような処理を行った場合、LAMの構造が変化することが予測される。我々は、上記で構築したLAM検出ELISAが、過酷な滅菌処理に対して耐性であり、正しくLAMを検出できるか否かを検討した。
Claims (20)
- 抗酸菌のリポアラビノマンナンに対して結合性を有する、下記(A)及び(C)のモノクロ一ナル抗体を含む抗酸菌検出用キット:
(A)下記(a)〜(c)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(d)〜(f)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカ一を介して接合してなるモノクロ一ナル抗体:(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;
(C)下記(m)〜(o)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(p)〜(r)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカ一を介して接合してなるモノクロ一ナル抗体:
(m)配列番号47で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(n)配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(o)配列番号49で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(p)配列番号50で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(q)配列番号51で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(r)配列番号52で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。 - 抗酸菌のリポアラビノマンナンに対して結合性を有する、下記(B)のモノクローナル抗体をさらに含む、請求項1に記載の抗酸菌検出用キット:
(B) 下記(g)〜(i)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(j)〜(l)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカーを介して接合してなることを特徴とする、モノクロ一ナル抗体:
(g)配列番号31で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(h) 配列番号32で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(i)配列番号33で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(j)配列番号34で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(k)配列番号35で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(l)配列番号36で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。 - 抗酸菌のうち結核菌を特異的に検出するための試薬キットであることを特徴とする、請求項1または2に記載の抗酸菌検出用キット。
- 抗酸菌のリポアラビノマンナンに対して結合性を有する、下記(A)及び(C)のモノクロ一ナル抗体、または抗酸菌のリポアラビノマンナンに対して結合性を有する、下記(A)、(B)及び(C)に記載する、モノクロ一ナル抗体を含む、結核診断剤:
(A)下記(a)〜(c)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(d)〜(f)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカ一を介して接合してなるモノクロ一ナル抗体:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(c)配列番号3で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(d)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(e)配列番号5で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(f)配列番号6で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;
(C)下記(m)〜(o)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(p)〜(r)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカ一を介して接合してなるモノクロ一ナル抗体:
(m)配列番号47で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(n)配列番号48で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(o)配列番号49で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(p)配列番号50で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(q)配列番号51で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(r)配列番号52で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3;
(B) 下記(g)〜(i)の重鎖CDR1〜CDR3を含む重鎖可変領域と、下記(j)〜(l)の軽鎖CDR1〜CDR3を含む軽鎖可変領域とが、リンカーを介して接合してなることを特徴とする、モノクロ一ナル抗体:
(g)配列番号31で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、
(h) 配列番号32で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、
(i)配列番号33で示されるアミノ酸配列からなる重鎖CDR3、
(j)配列番号34で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、
(k)配列番号35で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、
(l)配列番号36で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3。 - 下記の工程を有する、抗酸菌の検出方法:
(1)請求項1に記載する(A)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、被験者の生体試料(被験試料)と接触させる工程、及び
(2)請求項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)のモノクローナル抗体に捕捉された抗酸菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌を測定する工程。 - 下記の工程を有する、抗酸菌の検出方法:
(1)請求項1に記載する(A)のモノクローナル抗体及び請求項2に記載する(B)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、被験者の生体試料(被験試料)と接触させる工程、及び
(2)請求項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)及び(B)のモノクローナル抗体に捕捉された抗酸菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌を測定する工程。 - 抗酸菌のうち結核菌を特異的に検出する方法であることを特徴とする、請求項5に記載する抗酸菌の検出方法。
- 下記の工程を有する、被験試料中の抗酸菌リポアラビノマンナンを測定する方法:
(1)請求項1に記載する(A)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、被験者の生体試料(被験試料)と接触させる工程、及び
(2)請求項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)のモノクローナル抗体に捕捉された抗酸菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌リポアラビノマンナンを測定する工程。 - 下記の工程を有する、被験試料中の抗酸菌リポアラビノマンナンを測定する方法:
(1)抗酸菌のリポアラビノマンナンに対して結合性を有する請求項1に記載する(A)のモノクローナル抗体、及び請求項2に記載する(B)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、被験者の生体試料と接触させる工程、及び
(2)請求項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)及び(B)のモノクローナル抗体に捕捉された抗酸菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、被験試料中に存在する抗酸菌リポアラビノマンナンを測定する工程。 - 前記測定方法が、
(2)の測定工程において抗酸菌リポアラビノマンナンを検出する工程を有する、抗酸菌リポアラビノマンナンの定性方法であるか、または
(2)の測定工程において抗酸菌リポアラビノマンナンを定量する工程を有する、抗酸菌リポアラビノマンナンの定量方法である、請求項8または9に記載の測定方法。 - 抗酸菌リポアラビノマンナンのうち結核菌リポアラビノマンナンを特異的に測定する方法である、請求項8に記載する方法。
- 下記の工程を有する、抗結核薬の結核治療効果を判定する方法:
抗結核薬投与前後の各被験試料を対象として
(1)請求項1に記載する(A)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、抗結核薬投与前後の各被験試料と接触させる工程、
(2)請求項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)のモノクローナル抗体に捕捉された結核菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の各被験試料に存在する結核菌リポアラビノマンナンを測定する工程、及び
(3)抗結核薬投与前の被験試料に結核菌リポアラビノマンナンが検出され、且つ抗結核薬投与後の被験試料に結核菌リポアラビノマンナンが検出されない場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果ありと、決定する工程。 - 下記の工程を有する、抗結核薬の結核治療効果を判定する方法:
(1)請求項1に記載する(A)のモノクローナル抗体を捕捉抗体として、抗結核薬投与前後の各被験試料と接触させる工程、
(2)請求項1に記載する(C)のモノクローナル抗体を検出用抗体として、(1)工程で(A)のモノクローナル抗体に捕捉された結核菌のリポアラビノマンナンとの結合反応を指標として、抗結核薬投与前後の各被験試料中の結核菌リポアラビノマンナンを定量する工程、及び
(3)抗結核薬投与後の被験試料中の結核菌リポアラビノマンナン量(投与後測定値)と、抗結核薬投与前の被験試料中の結核菌リポアラビノマンナン量(投与前測定値)を対比して、投与後測定値が投与前測定値よりも低い場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果ありと、それ以外の場合に、投与した抗結核薬について結核治療効果なしと、決定する工程。 - 抗結核薬の結核治療効果判定用キットである、請求項1または2に記載する抗酸菌検出キット。
- 毛細管現象によって被験試料を移送できる材料で構成された吸液片を備えた、抗酸菌検出具であって、当該吸液片が
(1)被験試料を吸収採取する試料採取部、
(2)抗酸菌のリポアラビノマンナンと特異的に反応する、標識されてなる請求項1または2に記載する(A)〜(C)のいずれかのモノクローナル抗体を担持した標識抗体部、
(3)下記に示す、テスト結果表示部を備えた判定部、
(a) 抗酸菌のリポアラビノマンナンと特異的に反応する、非標識の請求項1または2に記載する(A)〜(C)のいずれかのモノクローナル抗体を固定したテスト結果表示部、
(4)上記試料採取部、標識抗体部及び判定部を移動してきた被験試料の残液を吸収する液吸収部
を備えることを特徴とする、抗酸菌検出具。 - 上記(3)判定部が、
(a) テスト結果表示部と間隔をおいて、さらに下記に示すコントロール表示部を備えていることを特徴とする、請求項17記載の抗酸菌検出具:
(b) 標識されてなる請求項1または2に記載する(A)〜(C)のいずれかのモノクローナル抗体と反応する非標識−抗体を固定したコントロール表示部
を備えた判定部である、請求項15に記載する抗酸菌検出具。 - 前記(A)〜(C)のモノクローナル抗体が一価又は二価の抗体であることを特徴とする、請求項1または2に記載の抗酸菌検出キット。
- 前記(A)のモノクロ一ナル抗体が配列番号12で示されるアミノ酸配列からなるものである、請求項1または2に記載の抗酸菌検出用キット。
- 前記(B)のモノクローナル抗体が配列番号39で示されるアミノ酸配列からなるものである、請求項2に記載の抗酸菌検出用キット。
- 前記(C)に記載するモノクローナル抗体が配列番号30で示されるアミノ酸配列からなるものである、請求項1または2に記載の抗酸菌検出用キット。
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