KR20140130699A - 항리포아라비노만난 항체 및 당해 항체를 사용한 항산균증의 이뮤노어세이 - Google Patents

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Abstract

항산균, 특히 결핵균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 하기 (A) 에 기재하는 모노클로날 항체 및 그 용도를 제공한다. (A) 하기 (a) ∼ (c) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (d) ∼ (f) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 모노클로날 항체 : (a) 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1, (b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2, (c) 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3, (d) 배열 번호 4 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1, (e) 배열 번호 5 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2, (f) 배열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3.

Description

항리포아라비노만난 항체 및 당해 항체를 사용한 항산균증의 이뮤노어세이 {ANTI-LIPOARABINOMANNAN ANTIBODY AND IMMUNOASSAY FOR MYCOBACTERIOSIS USING SAID ANTIBODY}
본 발명은 결핵균을 비롯한 항산균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 특히 1 개 사슬 항체 (scFv) 및 그 다가 항체에 관한 것이다.
또, 본 발명은 당해 항체를 사용한 항산균 검출 방법, 그 중에서도 결핵 진단 방법 또는 결핵 진단법, 그리고 당해 방법에 사용되는 항산균 검출제 (예를 들어 결핵 진단제) 및 항산균 검출용 키트 (예를 들어 결핵 진단용 키트) 에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 당해 항체를 사용하여 결핵에 대한 항결핵약의 치료 효과를 판정하는 방법, 그리고 당해 방법에 사용되는 항결핵약의 치료 효과를 판정하기 위한 키트에 관한 것이다.
결핵은 몇 천년 동안 인간들을 괴롭혀 온 감염증이고, 19 세기에는 유럽의 성인 인구의 1/4 이 결핵에 의해 사망했다고 추정된다. 생활 수준의 향상과 20 세기에 있어서의 항생 물질의 발견에 의해, 결핵은 1950년대까지 선진 공업국에 있어서는 근절된 것과 다름없었다. 그러나, 결핵은 여전히 재흥 감염증으로서 맹위를 떨치고 있다. 오늘날 세계 인구의 3 명에 1 명이 결핵균에 감염되어 있는 것으로 추측되고 있다 (잠재성 결핵). 세계에 있어서의 신발생 전체 결핵 환자는 940 만명으로 여겨지고, 그 중의 200 만명이 사망하고 있다고 개산되고 있다. 활동성 결핵 환자 중 약 95 ％ 가 개발 도상국에 살고 있으며, 결핵에 의한 사망자의 99 ％ 가 개발 도상국에 집중되어 있는 것이 현상황이다.
1990년대에 들어오고 나서 세계는 결핵이 도상국을 중심으로 여전히 최대의 감염증으로서 증가를 계속하고 있는 것을 다시 인식하고, 본격적인 대책에 나섰다. 세계 보건 기구 (WHO) 를 중심으로 한 직접 감시하 단기 화학 요법 (DOTS : Directly Observed Treantment Short-couse) 의 전개, 대책을 당사국·원조국·원조 기관의 제휴로 진행하기 위한 「스톱 결핵 파트너십」 의 설립, 자금면에서 지탱하는 시스템으로서의 「에이즈·결핵·말라리아 대책 세계 기금」 의 발족 등에 의해, 결핵 대책이 세계적 제휴하에 진행되게 되었다. 결핵 대책에 있어서의 현존의 기술은 전반적으로 몇 십년도 개선되지 않은 채로 사용되어 온 것이 많다. 그 때문에, 도상국에서 효과를 발휘하려면 신기술의 개발이 급무로 되고 있다.
결핵의 진단은 결핵균의 감염을 조기에 발견하여 치료로 유도하는 것이 가장 중요하다. 특히 배균 상태에 있는 환자는 주위에 감염을 확대시킬 리스크가 매우 높기 때문에, 주위와의 접촉이 없는 환경에 격리하여 치료할 필요가 있다. 그것을 위한 검사로서 「결핵의 세균학적 진단」 이 있으며, 그 중에서도 객담 도말 검사가 가장 보급되어 있다.
객담 도말 검사는 객담 도말 표본을 직접 현미경으로 관찰 검사하는 방법 (객담 도말 표본의 직접 경검법) 이고, 1 세기 이상 전에 로베르트 코흐에 의해 확립된 것이다. 임상 검사 시료로부터 결핵의 병원체를 염색함으로써, 항산균을 동정한다. 오늘날 사용되고 있는 결핵의 진단법은 코흐가 사용한 기술을 실질적으로 사용하여 확립된 것이다. 결핵균 도말 검사는 도상국에 있어서의 표준적인 결핵 진단법이고, 또, 새로운 검사법의 성능을 평가할 때의 기준으로 되고 있다.
객담 도말 검사보다 고감도인 방법으로서, 유전자 증폭법이 확립되어 있다. 유전자 증폭법은 DNA 폴리메라아제를 사용하여 연쇄 반응적으로 특정한 DNA 를 증폭시키는 방법이다. 원리는 증폭하고자 하는 DNA 와 그 양단의 배열에 상보적인 1 쌍의 DNA 프라이머 및 내열성 DNA 폴리메라아제를 사용하여, 온도 변화를 반복함으로써 검사하고 싶은 DNA 를 증폭시킨다고 하는 것이다. 당해 유전자 증폭법은 감도적으로는 만족되고 있지만, 조작성·설비·가격 면에 있어서 도상국에서 사용하는 것이 곤란한 상황이다.
최근의 세계적 동향으로서 다제내성 결핵의 만연을 배경으로, 배양 검사나 핵산 증폭 검사의 필요성에 관심이 모아지고 있다. 그러나, 다양한 세균학적 진단법이 있는 가운데, 객담 도말 검사 (객담의 직접 경검법) 는 여전히 결핵 대책 전략의 핵심에 위치하고 있다. 특히, 결핵이 만연하고 있는 자원이 부족한 도상국에서는, 객담 도말 검사는 유효한 진단 방법일 뿐만 아니라, 치료 효과를 판정하는 수단으로서도 중요한 역할을 하고 있다.
이와 같이, 객담 도말 검사는 결핵 제압의 기본 전략의 핵심임에도 불구하고, 많은 도상국에서는 세균학적 검사 종사자의 수는 절대적으로 부족하고, 그 질에도 문제가 많다고 여겨지고 있다. 이 검사의 유효성은 검사 기사의 기술에 의존하고 있기 때문에, 일상적인 훈련 및 품질 관리가 필수이고, 이것이 전체의 비용이 매우 증가하는 원인으로 되고 있다. 또, 도상국에서는, 검사실의 환경, 검사 기구, 검사 기술 등을 정비하는 데에 필요한 사회적 기반에 많은 과제를 안고 있으며, 이러한 요소가 복잡하게 얽혀, 결과적으로 검사의 질에 매우 악영향을 주고 있다.
또한, 객담 도말 검사는 항산균을 검출·동정하기 위한 검사이고, 결핵균을 검출하는 방법은 아니기 때문에, 당해 검사로 결핵균을 동정하는 것은 불가능하다.
선진국에 있어서의 결핵 치료는, 결핵균이 동정된 후, 약제에 의한 치료가 개시되는 데에 반해, 도상국에서 실시되는 DOTS 프로그램에 있어서는, 객담 도말 검사로 항산균이 검출되면, 결핵균의 동정을 실시하지 않고 약제에 의한 치료가 개시된다. 여기서, 결핵균 감염증과 비결핵성 항산균 감염증에서는 사용되는 약제는 상이함에도 불구하고, 기본적으로 비결핵성 항산균에 대해 치료 효과가 높은 약은 개발되어 있지 않기 때문에, 결핵균에 대한 약제로 치료가 이루어진다. 이 때문에, 환자는 약제에 의한 부작용이라는 리스크가 부담되게 된다. 이러한 리스크의 대표적인 예로는, 간장 기능의 저하나 실명 등의 심한 부작용이나, 약제 내성 비결핵성 항산균의 만연 등이 지적되고 있다.
이와 같이, 종래의 결핵의 진단이나 그 치료법에는, 몇 가지 문제점이 존재하고 있음에도 불구하고, 여전히 1882년에 개발된 코흐의 객담 도말 검사법이 크게 개량되지 않고, 결핵의 진단에 사용되고 있는 것이 현상황이다. 도상국·신흥국에 있어서의 검사실의 환경, 검사 기구, 검사 기술 등에 필요한 사회적 기반에 있어서의 과제를 해결하기 위해서는, 「전원이나 시설이 정비된 한정된 장소에 검체를 집약하여 하이 스루풋으로 고감도·저렴한 검사 방법을 확립」, 혹은 「전원을 필요로 하는 기기를 사용하지 않는 고감도·신속·간편·저렴한 포인트 오브 케어 테스트 (POCT) 를 확립」 의 2 가지 대책이 생각된다.
도상국·신흥국에 있어서도 한정된 극히 일부의 지역이면 전원이나 시설이 정비되어 있다. 또, 그러한 지역에서는 비교적 고도의 검사를 실시하고 있는 검사 센터가 이미 존재하고 있어, 일부의 부유층의 환자가 이용하는 것이 가능한 상태이다. 이와 같은 검사 센터를 이용함으로써, 검사실의 환경, 검사 기구, 검사 기술, 인재 등의 과제를 해결할 수 있다. 그 경우, 환자 또는 진료 현장으로부터 객담 검체를 검사 센터로 수송할 필요가 있다. 유전자 증폭 검사나 배양 검사에 사용하는 객담 검체의 수송에는 몇 가지 큰 제한이 존재한다. 컨태미네이션이나 잡균의 증식을 방지하기 위해 채담 후에는 신속하게 냉장 상태로 수송할 필요가 있다. 또, 배양 검사에서는 균을 증식할 수 있는 상태인 것이 중요하기 때문에, 유전자 검사 이상의 주의를 필요로 한다. 또한, 검체를 열처리 등의 멸균 조작을 가했을 경우, 양쪽 검사는 실시할 수 없게 되기 때문에, 엄중하게 관리된 상황에서 검체를 수송할 필요가 있다. 이와 같은 검체 수송에 있어서의 제한에 대해, 도상국·신흥국에서는 여전히 대응할 수 있는 시스템은 구축되어 있지 않기 때문에, 멸균 조작을 가한 검체에서도 검출하는 것이 가능한 측정 방법의 확립이 중요해진다.
POCT 의 경우에는, 임상 현장에 있어서, 단시간에 특별한 시설이나 기구를 사용하지 않고 측정할 수 있도록 하는 것이 중요하다. POCT 에서 가장 응용되고 있는 기술은 이뮤노크로마토그래피 테스트 (ICT) 이다. 일반적으로 ICT 는 ELISA 등의 면역 측정법에 비해 감도가 떨어지는 것으로 되어 있다. 따라서, POCT 에 의해 과제를 해결하기 위해서는 고감도로 검출할 수 있는 측정계를 구축하는 것이 중요해진다. 나아가서는, POCT 의 경우에는 검사 센터 등에서 사용되고 있는 안전 캐비넷 등을 사용한 검사 종사자에 대한 감염 방어책을 취하는 것이 곤란하기 때문에, 검체로부터의 감염 리스크를 저감시키기 위한 멸균 처리가 불가결하다.
이상과 같이, 「전원이나 시설이 정비된 한정된 장소에 검체를 집약하여 하이 스루풋으로 고감도·저렴한 검사 방법을 확립」 이나 「전원을 필요로 하는 기기를 사용하지 않는 고감도·신속·간편·저렴한 POCT 를 확립」 에는, 멸균 검체에서 고감도로 검출할 수 있는 측정법의 구축이 필요하다. 그러기 위해서는, 표적 항원의 선택이 중요하다. 결핵균 특이적인 항원으로는 Ag85 등의 단백 항원이 보고되고 있다. 그러나, 단백 항원은 생체 내에서의 분해·소화가 빨라, 감도를 얻는 것이 곤란하다.
항산균에 있어서의 주요한 항원은 세포막 및 세포벽의 주요 구성 성분인 당지질이다. 당지질 항원은 생체 내에서의 안정성도 높은 점에서, 유망한 표적 항원의 하나로서 생각되고 있다. 그 중에서도, LAM 은 균체 성분의 15 ％ 를 차지한다고 여겨지고, 양적으로도 주목받는 항원이다. 생체 검체 중의 항산균 LAM 을 검출하는 것을 목적으로 하여, 몇 가지의 PoAb 및 MoAb 를 제조한 보고가 있다 (비특허문헌 1 ∼ 4 참조). 그 중의 몇 가지는 객담 또는 뇨 중의 리포아라비노만난 (이하, 「LAM」 이라고도 한다) 을 검출하기 위한 ELISA 에 응용되고 있다. 그러나, 항산균에 있어서의 LAM 은 기본적 구조가 거의 동일하고 만노오스 캡의 구조에 미소한 차이가 관찰될 뿐이다. 특히 항산균 감염증의 기인균으로서 결핵균 다음으로 많은 Mycobacterium avium 이란, 만노오스 캡 구조도 거의 동일하다고 되어 있다 (비특허문헌 5 참조). 따라서, 항산균 중에서도 결핵균의 LAM 을 특이적으로 검출할 수 있는 모노클로날 항체가 요망되고 있다.
Aharona Glatman-Freedman, et al., "Monoclonal antibodies to surface antigens of Mycobacterium tuberculosis and their use in a modified Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay for detection of Mycobacteria.", Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1996, p.2795-2802 Lenka M. Pereira Arias-Bouda, et al., "Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples.", Journal of Clinical Microbiology, June 2000, p.2278-2283 Beston Hamasur, et al., "Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of maycobacterial lipoarabinomannan in urine." Journal of Microbiological Methods, 45, 2001, p.41-52 C. Boehme, et al., "Detection of mycobacterial lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis.", Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99, 2005, p.893-900 Lipoarabinomannans : from structure to biosynthesis. Jerome Nigou, Martine Gilleron, germain Puzo., Biochimine 85 (2003) 153-166 Winter 들, Annu. Rev. Immunol., 12 : 433, 1994 K. Zuberbuhler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009)
본 발명은 항산균의 리포아라비노만난 (이하, 「LAM」 이라고도 한다) 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (이하, 간단히 「MoAb」 라고도 칭한다), 특히 1 개 사슬 항체 및 그 다가 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또, 본 발명은 당해 항체를 사용한 항산균 검출 방법 또는 결핵 진단법, 그리고 당해 방법에 사용되는 항산균 검출제 (예를 들어 결핵 진단제) 및 항산균 검출용 키트 (예를 들어 결핵 진단용 키트) 를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 당해 항체를 사용하여 결핵에 대한 항결핵약의 치료 효과를 판정하는 방법, 그리고 당해 방법에 사용되는 항결핵약의 치료 효과를 판정하기 위한 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 면역 동물, 면역원, 또한 MoAb 의 제조 기술 및 선택 방법을 연구함으로써, 항산균 LAM 을 다른 세균의 LAM 이나 그것과 유사한 구조를 갖는 막항원과 구별하여 특이적으로, 또한 유전자 증폭 방법에 필적하는 높은 감도로 검출할 수 있는 항체 및 측정법의 확립에 성공하였다. 또 본 발명자들은 결핵균 LAM 을 비결핵성 항산균 LAM 과 구별하여 특이적으로 검출할 수 있는 항체 및 측정법의 확립에도 성공하였다.
즉, 본 발명은 하기의 실시형태를 갖는 것이다.
(I) 항산균의 리포아라비노만난 (LAM) 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체
(I-1) 하기 (A) ∼ (C) 중 어느 것에 기재하는 항산균의 LAM 에 대해 결합성을 갖는 모노클로날 항체 :
(A) 하기 (a) ∼ (c) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (d) ∼ (f) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 모노클로날 항체 :
(a) 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
(b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
(c) 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
(d) 배열 번호 4 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
(e) 배열 번호 5 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
(f) 배열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3 ;
(B) 하기 (g) ∼ (i) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (j) ∼ (l) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 모노클로날 항체 :
(g) 배열 번호 31 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
(h) 배열 번호 32 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
(i) 배열 번호 33 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
(j) 배열 번호 34 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
(k) 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
(l) 배열 번호 36 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3
(C) 하기 (m) ∼ (o) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (p) ∼ (r) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 모노클로날 항체 :
(m) 배열 번호 47 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
(n) 배열 번호 48 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
(o) 배열 번호 49 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
(p) 배열 번호 50 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
(q) 배열 번호 51 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
(r) 배열 번호 52 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3.
(I-2) (A) 에 기재하는 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역이 배열 번호 7 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1) 에 기재된 모노클로날 항체.
(I-3) (A) 에 기재하는 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역이 배열 번호 8 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1) 또는 (I-2) 에 기재하는 모노클로날 항체.
(I-4) (A) 에 기재하는 모노클로날 항체의 링커가 배열 번호 11 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것인 (I-1) 내지 (I-3) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체.
(I-5) (A) 에 기재하는 모노클로날 항체가 배열 번호 12 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1) 내지 (I-4) 중 어느 것에 기재된 모노클로날 항체.
(I-6) (A) 에 기재하는 모노클로날 항체가 결핵균, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 의 LAM 에 대해 특이적으로 결합성을 갖는 모노클로날 항체인 (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 것에 기재된 모노클로날 항체.
(I-7) (B) 에 기재하는 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역이 배열 번호 37 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1) 에 기재된 모노클로날 항체.
(I-8) (B) 에 기재하는 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역이 배열 번호 38 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1) 또는 (I-7) 에 기재하는 모노클로날 항체.
(I-9) (B) 에 기재하는 모노클로날 항체의 링커가 배열 번호 40 으로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것인 (I-1), (I-7) 및 (I-8) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체.
(I-10) (B) 에 기재하는 모노클로날 항체가 배열 번호 39 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1), 및 (I-7) 내지 (I-9) 중 어느 것에 기재된 모노클로날 항체.
(I-11) (C) 에 기재하는 모노클로날 항체의 중사슬 가변 영역이 배열 번호 53 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1) 에 기재된 모노클로날 항체.
(I-12) (C) 에 기재하는 모노클로날 항체의 경사슬 가변 영역이 배열 번호 54 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1) 또는 (I-11) 에 기재하는 모노클로날 항체.
(I-13) (C) 에 기재하는 모노클로날 항체의 링커가 배열 번호 11 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 것인 (I-1), (I-11) 및 (I-12) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체.
(I-14) (C) 에 기재하는 모노클로날 항체가 배열 번호 30 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 (I-1), 및 (I-11) 내지 (I-13) 중 어느 것에 기재된 모노클로날 항체.
(I-15) (B) 또는 (C) 에 기재하는 모노클로날 항체가 비결핵성 항산균에 대해 결합성을 갖는 것인 (I-1), 및 (I-7) 내지 (I-14) 중 어느 것에 기재된 모노클로날 항체.
(I-16) (A) ∼ (C) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체가 1 가 또는 2 가의 항체인 (I-1) 내지 (I-15) 중 어느 것에 기재된 모노클로날 항체.
(II) 항산균의 리포아라비노만난 (LAM) 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제조하기 위한 비인간 동물의 면역 방법, 및 당해 모노클로날 항체의 제조 방법
(II-1) 비인간 동물에 면역원으로서 BCG 를 투여함으로써, BCG 에 대한 체액성 면역 응답을 유도하는 공정을 갖는 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제조하기 위한 비인간 동물의 면역 방법.
(II-2) 비인간 동물이 토끼 또는 닭인 (II-1) 에 기재하는 면역 방법.
(II-3) 항산균이 결핵균, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 인 (II-1) 또는 (II-2) 에 기재된 면역 방법.
(II-4) 비인간 동물에 면역원으로서 BCG 를 투여함으로써, BCG 에 대한 체액성 면역 응답을 유도하여, 항산균의 LAM 에 결합하는 항체를 산생시키는 공정, 및
당해 비인간 동물로부터 당해 항체를 산생하는 세포를 채취하는 공정을 갖는
항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
(II-5) 비인간 동물에 면역원으로서 BCG 를 투여함으로써, BCG 에 대한 체액성 면역 응답을 유도하는 공정,
당해 비인간 동물로부터 항산균의 LAM 에 결합하는 항체에 대한 mRNA 를 조제하는 공정,
당해 mRNA 를 주형으로 하여 cDNA 를 조제하는 공정, 및
당해 cDNA 를 사용한 파지 디스플레이법에 의해 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 채취하는 공정
을 갖는 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
(II-6) 비인간 동물이 토끼 또는 닭인 (II-4) 또는 (II-5) 에 기재하는 제조 방법.
(II-7) 항산균이 결핵균, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 인 (II-4) 내지 (II-6) 중 어느 것에 기재된 제조 방법.
(II-8) 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 (I-1) 내지 (I-12) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체인 (II-4) 내지 (II-7) 중 어느 것에 기재하는 제조 방법.
(II-9) 결핵균, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 (I-1) 내지 (I-6) 에 있어서 (A) 에 기재하는 모노클로날 항체인 (II-4) 내지 (II-8) 중 어느 것에 기재하는 제조 방법.
(II-10) 비인간 동물에 면역원으로서 (I-1) 내지 (I-6) 의 (A) 에 기재하는 모노클로날 항체와 LAM 의 복합체를 투여함으로써, 당해 복합체에 대한 체액성 면역 응답을 유도하여, 항산균의 LAM 에 결합하는 항체를 산생시키는 공정, 및
당해 비인간 동물로부터 당해 항체를 산생하는 세포를 채취하는 공정을 갖는
항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
(II-11) 비인간 동물에 면역원으로서 (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체와 LAM 의 복합체를 투여함으로써, 당해 복합체에 대한 체액성 면역 응답을 유도하는 공정,
당해 비인간 동물로부터 항산균의 LAM 에 결합하는 항체에 대한 mRNA 를 조제하는 공정,
당해 mRNA 를 주형으로 하여 cDNA 를 조제하는 공정, 및
당해 cDNA 를 사용한 파지 디스플레이법에 의해 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 채취하는 공정
을 갖는 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
(II-12) 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 (I-1) 또는 (I-7) 내지 (I-12) 중 어느 것에 기재하는 (B) 의 모노클로날 항체인 (II-10) 또는 (II-11) 에 기재하는 제조 방법.
(III) 항산균, 바람직하게는 결핵균의 검출 방법
(III-1) 하기의 공정을 갖는 항산균, 바람직하게는 결핵균의 검출 방법 :
(1) (I-1) 내지 (I-16) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체를 피험자의 생체 시료와 접촉시키는 공정, 및
(2) 상기 모노클로날 항체와 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 과의 결합 반응을 지표로 하여, 피험 시료 중에 존재하는 항산균, 바람직하게는 결핵균을 측정하는 공정.
(III-2) 상기 결핵균의 검출 방법이 (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 사용하는 방법인 (II-1) 에 기재하는 검출 방법.
또한, 당해 검출 방법 중, 결핵균의 검출 방법은 피험자에 대해 결핵 이환의 유무를 진단하는 방법 (결핵 진단 방법) 이라고 바꿔 말할 수 있다.
(IV) 결핵 진단제 또는 진단용 키트
(IV-1) (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 함유하는 결핵 진단제.
(IV-2) (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 결핵균 검출 시약으로서 함유하는 결핵 진단용 키트.
(V) 항산균 리포아라비노만난 (LAM) 의 측정 방법
(V-1) 하기의 공정을 갖는 피험 시료 중의 항산균 LAM 을 측정하는 방법 :
(1) (I-1) 내지 (I-16) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체를 항산균을 함유할 수 있는 피험 시료와 접촉시키는 공정, 및
(2) 상기 모노클로날 항체와 항산균의 LAM 의 결합 반응을 지표로 하여, 피험 시료 중에 존재하는 항산균 LAM 을 측정하는 공정.
(V-2) 상기 측정 방법이 (2) 공정으로서 항산균 LAM 을 검출하는 공정을 갖는 항산균 LAM 의 정성 방법이거나, 또는 (2) 공정으로서 항산균 LAM 을 정량하는 공정을 갖는 항산균 LAM 의 정량 방법인 (V-1) 에 기재된 방법.
(V-3) 상기 항산균이 결핵균, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 인 (V-1) 또는 (V-2) 에 기재하는 방법.
(V-4) 모노클로날 항체로서, (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 (V-3) 에 기재하는 방법.
(VI) 항산균 리포아라비노만난 (LAM) 의 검출제 또는 검출용 키트
(VI-1) (I-1) 내지 (I-16) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체를 함유하는 항산균의 리포아라비노만난 검출제.
(VI-2) 모노클로날 항체가 (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체인 항산균의 리포아라비노만난 검출제.
(VI-3) 상기 항산균이 결핵균, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 인 (VI-2) 에 기재하는 방법.
(VI-4) (I-1) 내지 (I-16) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체를 항산균의 LAM 검출용 시약으로서 함유하는 항산균의 LAM 검출용 키트.
(VI-5) 모노클로날 항체가 (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체인 (VI-4) 에 기재하는 항산균의 LAM 검출용 키트.
(VI-6) 상기 항산균이 결핵균, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 인 (VI-5) 에 기재하는 항산균의 LAM 검출용 키트.
(VII) 멸균 검체에서의 측정 방법
(VII-1) 하기의 공정을 갖는 피험 시료에 대해 항산균 감염의 유무를 측정하는 방법
(1) 검체 시료를 고열 자비 멸균, 바람직하게는 고압 증기 멸균하는 공정,
(2) (I-1) 내지 (I-16) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체, 바람직하게는 (I-1) 내지 (I-6) 또는 (I-7) 내지 (I-10) 중 어느 것에 기재하는 (A) 또는 (B) 의 모노클로날 항체를 멸균 처리한 피험 시료와 각각 접촉시키는 공정,
(3) 상기 본 발명의 모노클로날 항체와 항산균 LAM 의 결합 반응을 지표로 하여 피험 시료 중의 항산균 LAM 을 측정하는 공정, 및
(4) 피험 시료에 항산균 LAM 이 검출되었을 경우에, 피험 시료가 항산균에 감염되어 있다고 판단하는 공정.
(VII-2) 상기 모노클로날 항체가 (I-1) 내지 (I-6) 또는 (I-7) 내지 (I-10) 중 어느 것에 기재하는 (A) 또는 (B) 의 모노클로날 항체이고, 상기 항산균이 결핵균인 (VII-1) 에 기재하는 측정 방법.
(VIII) 항결핵약의 결핵 치료 효과를 판정하는 방법
(VIII-1) 하기의 공정을 갖는 항결핵약의 결핵 치료 효과를 판정하는 방법 :
(1) (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 항결핵약 투여 전후의 피험 시료와 각각 접촉시키는 공정,
(2) 상기 모노클로날 항체와 결핵균의 LAM 의 결합 반응을 지표로 하여, 항결핵약 투여 전후의 피험 시료 중의 결핵균 LAM 을 측정하는 공정, 및
(3) 항결핵약 투여 전의 피험 시료에 결핵균 LAM 이 검출되고, 또한 항결핵약 투여 후의 피험 시료에 결핵균 LAM 이 검출되지 않는 경우에 항결핵약의 결핵 치료 효과 있음으로 결정하는 공정.
(VIII-2) 하기의 공정을 갖는 항결핵약의 결핵 치료 효과를 판정하는 방법 :
(1) (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 항결핵약 투여 전후의 피험 시료와 각각 접촉시키는 공정,
(2) 상기 모노클로날 항체와 결핵균의 LAM 의 결합 반응을 지표로 하여, 항결핵약 투여 전후의 피험 시료 중의 결핵균 LAM 을 정량하는 공정, 및
(3) 항결핵약 투여 후의 피험 시료 중의 결핵균 LAM 량 (투여 후 측정값) 과, 항결핵약 투여 전의 피험 시료 중의 결핵균 LAM 량 (투여 전 측정값) 을 대비하여, 투여 후 측정값이 투여 전 측정값보다 낮은 경우에 항결핵약의 결핵 치료 효과 있음으로, 그 이외의 경우에 항결핵약의 결핵 치료 효과 없음으로 결정하는 공정.
(IX) 항결핵약의 결핵 치료 효과 판정용 키트
(IX) (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 함유하는 항결핵약의 결핵 치료 효과 판정용 키트.
(X) 항산균 (결핵균) 검출 도구
(X-1) 모세관 현상에 의해 피험 시료를 이송할 수 있는 재료로 구성된 흡액편을 구비한 항산균, 바람직하게는 결핵균 검출 도구로서, 당해 흡액편이
(1) 피험 시료를 흡수 채취하는 시료 채취부,
(2) 항산균의 LAM 과 특이적으로 반응하는 표지되어 이루어지는 (I-1) 내지 (I-16) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체를 담지한 표지 항체부,
(3) 하기에 나타내는 테스트 결과 표시부를 구비한 판정부,
(a) 항산균의 LAM 과 특이적으로 반응하는 비표지의 (I-1) 내지 (I-16) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체를 고정시킨 테스트 결과 표시부,
(4) 상기 시료 채취부, 표지 항체부 및 판정부를 이동해 온 피험 시료의 잔액을 흡수하는 액 흡수부를 구비하는 것을 특징으로 하는 항산균, 바람직하게는 결핵균 검출 도구.
(X-2) 상기 (3) 판정부가 (a) 테스트 결과 표시부와 간격을 두고, 추가로 하기에 나타내는 컨트롤 표시부를 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 (X-1) 에 기재된 항산균, 바람직하게는 결핵균 검출 도구 :
(b) 표지되어 이루어지는 (I-1) 내지 (I-16) 중 어느 것에 기재하는 모노클로날 항체와 반응하는 비표지-항체를 고정시킨 컨트롤 표시부.
(X-3) 상기 모노클로날 항체가 (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 것에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체로서, 항산균이 결핵균, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 인 (X-1) 또는 (X-2) 에 기재하는 항산균 검출 도구.
본 발명에 의하면, 피험자의 생체 시료 (객담, 타액, 혈액, 폐 세정액, 위액, 뇨, 분편, 피부 또는 췌액) 중에 존재하는 항산균을 다른 균과 특이적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 항산균의 검출 방법은 유전자 증폭법에 의한 검출 방법과 동등한 감도와 특이성을 갖는다. 또 본 발명의 항산균의 검출 방법에 의하면, 생체 내의 항산균량을 결정할 수도 있기 때문에, 항산균, 특히 결핵의 치료 효과를 모니터링 할 수도 있다. 또한, 본 발명의 항산균의 검출 방법에 의하면, 측정 대상의 검체를 멸균 처리했을 경우에도, 멸균 처리로부터 적어도 1 주간 이내이면, 안정적으로 정밀도 높게 항산균을 검출할 수 있다. 이 때문에, 감염 방어를 위한 특별한 검체 수송 시스템이 정비되어 있지 않은 지역에서도, 검체를 멸균 처리함으로써 우송 등의 일반적인 검체의 수송이 가능하다.
또, 본 발명의 바람직한 양태에 의하면, 결핵 환자의 생체 시료 중에 존재하는 결핵균을 비결핵성 항산균과 구별하여 특이적으로 검출할 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 의해, 결핵균 감염의 유무를 정밀도 높게 진단할 수 있다. 또, 결핵 환자에 대한 항결핵약의 치료 효과를 정밀도 높게 판정할 수 있다.
도 1(A) 및 (B) 모두 본 발명의 결핵균 검출 도구 (결핵균 LAM 검출 도구) 의 일 양태를 나타내는 도면 (옆에서 본 도면) 이다. 도 (A) 는 판정부 (3) 에 테스트 결과 표시부 (a) 만을 갖는 양태, 도 (B) 는 판정부 (3) 에 테스트 결과 표시부 (a) 와 컨트롤 표시부 (b) 의 양방을 포함하는 양태이다. 부호 10 : 지지체, 부호 21 : 시료 채취부 (1) 를 구성하는 시트, 부호 22 : 표지 항체부 (2) 를 구성하는 시트, 부호 23 : 판정부 (3) 를 구성하는 시트, 부호 24 : 액 흡수부 (4) 를 구성하는 시트, (a) : 테스트 결과 표시부, (b) : 컨트롤 표시부, (1) : 시료 채취부, (2) : 표지 항체부, (3) : 판정부, (4) : 액 흡수부, P : 피험 시료가 흐르는 방법을 나타내는 화살표를 의미한다 (도 2 도 동일하다).
도 2 는 본 발명의 결핵균 검출 도구 (결핵균 LAM 검출 도구) 의 일 양태를 나타내는 도면 (사시도) 이다.
도 3 은 BGC 백신 및 H37Ra 사균체를 각각 피하 면역한 토끼의 혈중 항체가를 M. tuberculosis LAM (-■-) 및 M. avium LAM (-●-) 을 각각 고상화한 항원 플레이트를 사용한 ELISA 법으로 측정한 결과를 나타낸다 (참고예 1 (2)). (A) 는 BGC 백신을 면역한 토끼의 결과를, (B) 는 H37Ra 사균체를 면역한 토끼의 결과를 나타낸다.
도 4 는 LAM 반응성 scFv 의 아미노산 배열을 나타낸다. 구체적으로는, 상단은 HR37Ra 사균체를 면역한 토끼의 비장 세포로부터 제조한 scFv (Myco-scFv) 의 아미노산 배열 (배열 번호 30), 하단은 BCG 백신을 면역한 토끼의 비장 세포로부터 제조한 scFv (TB-scFv) 의 아미노산 배열 (배열 번호 12) 을 각각 중사슬 가변 영역의 CDR1 ∼ CDR3 영역, 링커, 및 경사슬 가변 영역의 CDR1 ∼ CDR3 영역의 위치와 함께 대비한 것이다. 또한, N 말단에 세린 잔기를 4 개 결합한 링커 배열의 N 말단측의 아미노산 영역이 VH 영역, C 말단측의 영역이 VL 영역을 나타낸다.
도 5 는 TB-scFv 의 LAM 반응성 평가의 결과를 나타낸다. BCG 백신을 면역한 토끼로부터 제조한 TB-scFv 의 LAM 에 대한 반응성을 M. tuberculosis LAM 및 M. avium LAM 을 개상화한 플레이트를 사용하여 ELISA 로 평가하였다. ■ 는 M. tuberculosis LAM 에 대한 반응성, ● 는 M. avium 에 대한 반응성을 나타낸다.
도 6 은 항산균 LAM 검출 ELISA 및 결핵균 LAM 검출 ELISA 의 평가 결과를 나타낸다. 항산균 LAM 검출 ELISA 및 결핵균 LAM 검출 ELISA 의 LAM 에 대한 반응성을 정제한 M. tuberculosis LAM 및 M. avium LAM 을 사용하여 평가하였다. ● 는 항산균 LAM 검출 ELISA 의 M. tuberculosis LAM 에 대한 반응성, ■ 는 항산균 LAM 검출 ELISA 의 M. avium 에 대한 반응성, ○ 는 결핵균 LAM 검출 ELISA 의 M. tuberculosis LAM 에 대한 반응성, □ 는 결핵균 LAM 검출 ELISA 의 M. avium LAM 에 대한 반응성을 나타낸다.
도 7 은 항체 조합의 평가 결과를 나타낸다. 항체 조합의 평가를 항산균 LAM 검출 ELISA 및 결핵균 LAM 검출 ELISA 로 항산균 임상 분리주를 사용하여 실시하였다. 각 주에 대한 반응성은 색의 농담에 의해 나타냈다. myco 는 항산균 LAM 검출 ELISA, TB 는 결핵균 LAM 검출 ELISA 의 결과를 나타낸다.
도 8 은 항산균 LAM 검출 이뮤노크로마토 테스트 및 결핵균 LAM 검출 이뮤노크로마토 테스트의 평가 결과를 나타낸다. 항산균 LAM 검출 이뮤노크로마토 테스트 및 결핵균 LAM 검출 이뮤노크로마토의 LAM 에 대한 반응성을 정제한 M. tuberculosis LAM (A 및 B), 및 M. avium LAM (C 및 D) 을 사용하여 평가하였다. 도면 중, 「myco」 는 항산균 LAM 검출 이뮤노크로마토 테스트, 「TB」 는 결핵균 LAM 검출 이뮤노크로마토 테스트를 나타낸다.
도 9 는 LAM 에 대한 닭 항혈청의 항체가를 나타낸다 (실시예 5). -●- 는 정제한 결핵균 (M. tuberculosis) 아오야마 B 주의 LAM 에 대한 반응성, -■- 는 정제한 M. avium 의 LAM 에 대한 반응성을 나타낸다.
도 10 은 닭 scFv 라이브러리로부터 단리한 1 개 사슬 항체 G3-scFv 의 아미노산 배열을, 중사슬 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역, GS 링커 영역, 그리고 경사슬 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 위치와 함께 나타낸다.
도 11 은 2 가 항체를 사용한 LAM 검출용 ELISA 의 반응성을 나타낸다 (실시예 7). -●- 는 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 BCG 에 대한 반응성, -■- 는 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 BCG 에 대한 반응성을 나타낸다.
도 12 는 2 가 항체를 사용한 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 검출 감도를 나타낸다 (실시예 8). 도면 중, 표는 유전자 증폭 검사 (NAAT) 와 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 검출 감도를 대비한 것이다.
도 13 은 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 구강 내 세균과의 교차 반응성 시험의 결과를 나타낸다 (실시예 9). 도면 중, 「Na」 는 N. asteroids, 「Nf」 는 N. faroinica, 「Sg」 는 Streptomyces, 「Ca」 는 C. albicans, 「Ai」 는 actinomycete, 「Tp」 는 T. paurometabolum 의 균체를 의미한다. 이들 배양균체 및 BCG 배양균체로부터 각각 추출한 LAM 을 사용하여, 항산균 LAM 검출용 ELISA 를 실시한 결과를 나타낸다.
도 14 는 2 가 항체를 사용한 LAM 검출 ELISA 의 항산균 임상 분리에 대한 반응성을 나타낸다 (실시예 10). 도면 중, A 는 결핵균 임상 분리주 38 주의 측정 결과, B 는 비결핵성 항산균 29 주 (M. avium 23 주, M. intracellulare 6 주) 의 측정 결과를 나타낸다. A 및 B 모두 도면의 검은봉은 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 측정 결과, 흰봉은 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 측정 결과를 나타낸다. B 의 비결핵성 항산균 29 주에 있어서, 1 ∼ 23 번이 M. avium 23 주, 24 ∼ 29 번이 M. intracellulare 6 주의 결과이다.
도 15 는 항산균 LAM 검출용 ELISA 와 결핵균 LAM 검출용 ELISA 에 있어서의 반응성의 비율 (항산균 LAM 검출용 ELISA 의 값/결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 값) 을 나타낸다.
도 16 은 2 가 항체를 사용한 항산균 LAM 검출용 ELISA (우측 도면) 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA (좌측 도면) 의 임상 객담 검체에 대한 반응성을 나타낸다 (실시예 11). I 는 Smear test (직접 도말 검사) 음성이고 또한 유전자 증폭 검사 음성의 검체군, II 는 Smear test 가 scanty 또한 유전자 증폭 검사 음성의 검체, III 은 Smear test 음성이고 또한 유전자 증폭 검사 양성의 검체군, IV 는 Smear test 가 scanty 또한 유전자 증폭 검사 양성의 검체군, V 는 Smear test 가 1+ 인 검체군, VI 은 Smear test 가 2+ 인 검체군, VII 은 Smear test 가 3+ 인 검체군의 결과를 나타낸다. 또한, Smear test 에서 1+ 이상의 검체는 모두 유전자 증폭 검사 양성이다. 또, 점선은 잠정적인 커트 오프값을 나타낸다.
도 17 은 LAM 검출용 ELISA 로 검출되는 LAM 농도와 균체량의 상관 관계를 나타낸다 (실시예 11). I 는 Smear test 음성이고 또한 유전자 증폭 검사 음성의 검체군, II 는 Smear test 음성이고 또한 유전자 증폭 검사 양성의 검체군, III 은 Smear test 가 scanty 또한 유전자 증폭 검사 양성의 검체군, IV 는 Smear test 가 1+ 인 검체군, V 는 Smear test 가 2+ 인 검체군, VI 은 Smear test 가 3+ 인 검체군의 결과를 나타낸다. 또한, Smear test 에서 1+ 이상의 검체는 모두 유전자 증폭 검사 양성이다. 또, 선은 각 검체군에 있어서의 LAM 농도의 평균값을 나타낸다.
도 18 은 멸균 처리에 대한 항산균의 LAM 의 안정성을 나타낸다. 흰봉은 멸균 처리를 실시하지 않은 균체, 검은봉은 100 ℃ 에서 30 분간 자비 처리한 균체, 회색봉은 고압 증기 멸균 (오토클레이브 121 ℃ 에서 15 분) 처리한 균체의 측정 결과를 나타낸다 (실시예 12).
도 19 는 고압 증기 멸균 (오토클레이브) 처리 후의 LAM 보존 안정성을 나타낸다. 흰봉은 고압 증기 멸균 처리 직후의 균체를 측정한 결과, 검은봉은 고압 증기 멸균 처리 후 7 일간 25 ℃ 로 방치한 균체의 측정 결과를 나타낸다 (실시예 12).
(I) 항산균 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체
결핵균은 마이코박테륨과 마이코박테륨속 (Mycobacterium) 에 속하고, 다른 마이코박테륨속 세균과 함께, 항산균이라고 불리는 세균군의 일종이다. 그러나, 37 ℃ 에서 증식 가능하지만 28 ℃ 에서 증식하지 않는 점, 및 내열성의 카탈라아제를 갖는 점 등에서, 다른 항산균 (비결핵성 항산균) 과 구별된다. 당해 결핵균으로는, 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis, 인간형 결핵균), 소형 결핵균 (M. bovis, 소형균, 소균), 마이코박테륨·아프리칸스 (M. africans), 쥐형 결핵균 (M. microti) 의 4 종류가 알려져 있다. 이 중, 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 이 결핵의 원인균으로서 인간에 대한 병원성을 나타내는 것 외에, M. bovis 와 M. africans 가 매우 드물게 인간에게 감염된다. M. microti 는 인간에 대한 병원성을 가지지 않는다. 또 M. bovis 를 장기간 계대 배양하여 약독화한 것이 BCG 이고, 결핵 예방을 위한 백신 (약독생균 백신) 으로서 이용되고 있다.
본 발명이 대상으로 하는 모노클로날 항체 (이하, 「MoAb」 라고도 한다) 는 항산균을 생체 내에 존재하는 다른 균과 구별하여 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 항체이다. 보다 구체적으로는, 항산균의 리포아라비노만난 (LAM) 과 다른 세균의 LAM 유사 항원을 구별하여, 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체이다. 여기서 LAM 은 결핵균을 비롯한 마이코박테륨속의 세균 (항산균) 의 세포벽이나 세포막을 구성하는 주요한 리포글리칸의 하나이다. LAM 은 통상적으로 만노실포스파티딜이노시톨앵커 (MPI), D-만난 코어 및 D-아라비난 도메인을 함유하는 당 백본과 캡핑 모티브를 함유하지만, 균의 종류에 따라, 분자 내에 함유되는 당 (예를 들어 만노오스) 잔기의 수, 당 사슬의 분지 구조, 아실기의 수, 및 아실기를 구성하는 지방산의 종류가 상이하다.
본 발명의 MoAb 에는, 구체적으로는 하기 (a) ∼ (c) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (d) ∼ (f) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 구조를 갖는 항체가 함유된다. 당해 MoAb 를 편의상 「MoAb1」 이라고도 칭한다.
(a) 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
(b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
(c) 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
(d) 배열 번호 4 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
(e) 배열 번호 5 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
(f) 배열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3.
또 본 발명의 MoAb 에는, 구체적으로는 하기 (g) ∼ (i) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (j) ∼ (l) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 구조를 갖는 항체도 포함된다. 당해 MoAb 를 편의상 「MoAb2」 라고도 칭한다.
(g) 배열 번호 31 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
(h) 배열 번호 32 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
(i) 배열 번호 33 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
(j) 배열 번호 34 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
(k) 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
(l) 배열 번호 36 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3.
또한, 본 발명의 MoAb 에는, 구체적으로는 하기 (m) ∼ (o) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (p) ∼ (r) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 구조를 갖는 항체도 포함된다. 당해 MoAb 를 편의상 「MoAb3」 이라고도 칭한다.
(m) 배열 번호 47 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
(n) 배열 번호 48 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
(o) 배열 번호 49 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
(p) 배열 번호 50 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
(q) 배열 번호 51 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
(r) 배열 번호 52 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3.
여기서 "CDR" 이란, "Complementarity Determining Reagion" 의 약기이고, 상보성 결정 영역이라고도 칭해진다. CDR 이란 이뮤노글로블린의 가변 영역에 존재하는 영역이고, 항체가 갖는 항원에 대한 특이적인 결합에 깊게 관여하는 영역이다. 그 중에서도 "중사슬 CDR" 이란, 이뮤노글로블린의 중사슬의 가변 영역에 존재하는 CDR 이고, "경사슬 CDR" 이란, 이뮤노글로블린의 경사슬의 가변 영역에 존재하는 CDR 을 의미한다.
중사슬 가변 영역은 상기의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 영역이고, 또 경사슬 가변 영역은 상기의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 영역이다. 이들 CDR1 ∼ CDR3 의 배치 순서는 특별히 제한되지 않지만, 중사슬 가변 영역도, 또 경사슬 가변 영역도 모두 바람직하게는 N 측으로부터 C 측의 방향으로 CDR1, CDR2 및 CDR3 의 순서로 연속 또는 다른 아미노산 배열을 개재하여 배치된다.
본 발명의 MoAb 의 중사슬 가변 영역 또는/및 경사슬 가변 영역은, 상기 가변 영역에 있어서의 상기 CDR1 ∼ CDR3 이외의 영역에, 다른 아미노산 배열로서, 프레임 워크 영역 (이하, 간단히 「FR」 이라고 한다) 이라고 칭해지는 아미노산 배열을 가질 수 있다. 당해 FR 의 아미노산 배열은 이뮤노글로블린의 중사슬 가변 영역 또는 경사슬 가변 영역의 프레임 워크 영역 (FR) 에서 유래하는 아미노산 배열 그 자체이어도 되고, 또 그 변이체이어도 되고, 또한 FR 에서 유래하는 아미노산 배열의 일부에 제한 효소 인식 부위를 도입하는 등, 일부 개변한 것이어도 된다.
이뮤노글로블린의 중사슬 가변 영역에 있어서, 예를 들어, 중사슬 가변 영역의 N 말단과 상기 CDR1 사이의 영역은 「FR1」, CDR1 과 CDR2 사이의 영역은 「FR2」, CDR2 와 CDR3 사이의 영역은 「FR3」, CDR3 과 중사슬 가변 영역의 C 말단 사이의 영역은 「FR4」 로 각각 정의된다. 또 동일하게, 이뮤노글로블린의 경사슬 가변 영역에 있어서, 예를 들어, 경사슬 가변 영역의 N 말단과 상기 CDR1 사이의 영역은 「FR1」, CDR1 과 CDR2 사이의 영역은 「FR2」, CDR2 와 CDR3 사이의 영역은 「FR3」, 「CDR3」 과 가변 영역의 C 말단 사이의 영역은 「FR4」 로 각각 정의된다.
이들 FR 은 항원 인식 배열로서 중요한 상기 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 각각 연결하는 링커로서의 기능을 가짐과 함께, 가변 영역의 입체 구조 형성에 기여하는 영역이기도 하다.
본 발명의 MoAb1 의 중사슬 가변 영역은 바람직하게는 배열 번호 7 로 나타내는 119 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖고, 또 경사슬 가변 영역은 바람직하게는 배열 번호 8 로 나타내는 112 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는다. 중사슬 가변 영역의 아미노산 배열을 나타내는 배열 번호 7 중, N 말단에서 30 번째까지의 영역이 중사슬 가변 영역의 「FR1」, 31 번째에서 35 번째의 아미노산 영역이 중사슬 가변 영역의 「CDR1」 (배열 번호 1), 36 번째에서 49 번째의 아미노산 영역이 「FR2」, 50 번째에서 65 번째의 아미노산 영역이 「CDR2」 (배열 번호 2), 66 번째에서 96 번째의 아미노산 영역이 「FR3」, 97 번째에서 106 번째의 아미노산 영역이 「CDR3」 (배열 번호 3) 및 107 번째에서 119 번째의 아미노산 영역이 「FR4」 에 상당한다.
또, 본 발명의 MoAb1 의 경사슬 가변 영역의 아미노산 배열을 나타내는 배열 번호 8 중, N 말단에서 23 번째까지의 영역이 경사슬 가변 영역의 「FR1」, 24 번째에서 36 번째의 아미노산 영역이 경사슬 가변 영역의 「CDR1」 (배열 번호 4), 37 번째에서 51 번째의 아미노산 영역이 「FR2」, 52 번째에서 58 번째의 아미노산 영역이 「CDR2」 (배열 번호 5), 59 번째에서 89 번째의 아미노산 영역이 「FR3」, 90 번째에서 102 번째의 아미노산 영역이 「CDR3」 (배열 번호 6), 및 103 번째에서 112 번째의 아미노산 영역이 「FR4」 에 상당한다.
본 발명의 MoAb2 의 중사슬 가변 영역은 바람직하게는 배열 번호 37 로 나타내는 130 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖고, 또 경사슬 가변 영역은 바람직하게는 배열 번호 38 로 나타내는 116 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는다. 중사슬 가변 영역의 아미노산 배열을 나타내는 배열 번호 37 중, N 말단에서 35 번째까지의 영역이 중사슬 가변 영역의 「FR1」, 36 번째에서 40 번째의 아미노산 영역이 중사슬 가변 영역의 「CDR1」 (배열 번호 31), 41 번째에서 54 번째의 아미노산 영역이 「FR2」, 55 번째에서 74 번째의 아미노산 영역이 「CDR2」 (배열 번호 32), 75 번째에서 106 번째의 아미노산 영역이 「FR3」, 107 번째에서 119 번째의 아미노산 영역이 「CDR3」 (배열 번호 33) 및 120 번째에서 130 번째의 아미노산 영역이 「FR4」 에 상당한다.
또, 본 발명의 MoAb2 의 경사슬 가변 영역의 아미노산 배열을 나타내는 배열 번호 38 중, N 말단에서 20 번째까지의 영역이 경사슬 가변 영역의 「FR1」, 21 번째에서 28 번째의 아미노산 영역이 경사슬 가변 영역의 「CDR1」 (배열 번호 34), 29 번째에서 44 번째의 아미노산 영역이 「FR2」, 45 번째에서 51 번째의 아미노산 영역이 「CDR2」 (배열 번호 35), 52 번째에서 83 번째의 아미노산 영역이 「FR3」, 84 번째에서 95 번째의 아미노산 영역이 「CDR3」 (배열 번호 36), 및 96 번째에서 116 번째의 아미노산 영역이 「FR4」 에 상당한다.
본 발명의 MoAb3 의 중사슬 가변 영역은 바람직하게는 배열 번호 53 으로 나타내는 121 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖고, 또 경사슬 가변 영역은 바람직하게는 배열 번호 54 로 나타내는 110 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는다. 중사슬 가변 영역의 아미노산 배열을 나타내는 배열 번호 53 중, N 말단에서 30 번째까지의 영역이 중사슬 가변 영역의 「FR1」, 31 번째에서 35 번째의 아미노산 영역이 중사슬 가변 영역의 「CDR1」 (배열 번호 47), 36 번째에서 49 번째의 아미노산 영역이 「FR2」, 50 번째에서 65 번째의 아미노산 영역이 「CDR2」 (배열 번호 48), 66 번째에서 96 번째의 아미노산 영역이 「FR3」, 97 번째에서 108 번째의 아미노산 영역이 「CDR3」 (배열 번호 49) 및 109 번째에서 121 번째의 아미노산 영역이 「FR4」 에 상당한다.
또, 본 발명의 MoAb3 의 경사슬 가변 영역의 아미노산 배열을 나타내는 배열 번호 54 중, N 말단에서 23 번째까지의 영역이 경사슬 가변 영역의 「FR1」, 24 번째에서 34 번째의 아미노산 영역이 경사슬 가변 영역의 「CDR1」 (배열 번호 50), 35 번째에서 49 번째의 아미노산 영역이 「FR2」, 50 번째에서 56 번째의 아미노산 영역이 「CDR2」 (배열 번호 51), 57 번째에서 87 번째의 아미노산 영역이 「FR3」, 88 번째에서 100 번째의 아미노산 영역이 「CDR3」 (배열 번호 52), 및 101 번째에서 110 번째의 아미노산 영역이 「FR4」 에 상당한다.
이들 배열 번호 7, 37 및 53 에 나타내는 중사슬 가변 영역의 FR1 ∼ FR4 에 상당하는 아미노산 배열, 그리고 배열 번호 8, 38 및 54 에 나타내는 경사슬 가변 영역의 FR1 ∼ FR4 에 상당하는 아미노산 배열은, 모두 본 발명의 MoAb1 및 MoAb 2 의 효과가 저해되지 않는 한, 변이 도입이 실시되어 있어도 된다. 여기서 「본 발명 MoAb1, MoAb 2 및 MoAb3 의 효과」 란, 특별히 언급하지 않는 한, 항산균 LAM 에 대한 결합성, 바람직하게는 항산균 LAM 에 대한 특이적인 결합성을 의미한다. 그 중에서도 「본 발명 MoAb1 의 효과」 란, 결핵균 LAM 에 대한 결합성, 바람직하게는 결핵균 LAM 에 대한 특이적인 결합성을 의미한다. 이러한 변이 도입수는, 모두 특별히 제한되지 않지만, 변이 전의 아미노산 배열과 85 ％ 이상, 바람직하게는 90 ％ 이상, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상, 특히 바람직하게는 98 ％ 이상, 동일성을 갖도록 변이 도입수로 할 수 있다. 또한, 여기서 말하는 변이 도입으로는, 아미노산의 치환, 결실 및 삽입을 들 수 있다. 또, 중사슬 가변 영역의 FR1 및/또는 경중 사슬 가변 영역의 FR4 에 제한 효소 인식 부위가 도입되어 있어도 된다.
또 상기 MoAb1 및 MoAb3 으로 나타내는 중사슬 가변 영역 FR1 ∼ FR4 및 경사슬 가변 영역 FR1 ∼ FR4 는 모두 토끼에서 유래하는 아미노산 배열이고, 상기 MoAb2 로 나타내는 중사슬 가변 영역 FR1 ∼ FR4 및 경사슬 가변 영역 FR1 ∼ FR4 는 모두 닭에서 유래하는 아미노산 배열이지만, 본 발명 MoAb 의 효과를 저해하지 않는 한, 어느 동물종에서 유래하는 프레임 워크 영역이어도 된다. 이러한 동물종으로는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 인간, 토끼, 닭, 말, 암소, 염소, 양, 개, 마우스, 햄스터, 및 래트 등을 들 수 있다. 바람직하게는 토끼, 닭 또는 인간에서 유래하는 아미노산 배열이고, 보다 바람직하게는 인간이다. 또한, 인간 유래의 FR1 ∼ FR4 의 아미노산 배열은 공지된 바이며 (Kabat, et al. US Department of Health AND human Services, NIH (1991), USA), 예를 들어 NCBI 의 웹 사이트에 기재되어 있다.
본 발명의 MoAb 는 상기 구성을 갖는 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 구조를 갖는다. 여기서 「링커」 는 본 발명 MoAb 의 효과를 저해하지 않는 한 특별히 제한되지 않고, 통상적으로 아미노산수가 8 ∼ 30 정도인 아미노산 배열, 바람직하게는 8 ∼ 20 정도인 아미노산 배열, 보다 바람직하게는 8 ∼ 15 정도인 아미노산 배열로 이루어지는 링커 배열을 갖는 펩티드를 들 수 있다. 바람직한 링커 배열로는 제한되지는 않지만, 예를 들어 GS 링커 배열 [(Gly-Gly-Gly-Ser : 배열 번호 9) n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser : 배열 번호 10) n [n 은 반복 횟수]] 등을 들 수 있다. 바람직하게는 이러한 GS 링커 배열을 1 ∼ 3 회 (n 은 1 ∼ 3 의 정수) 반복한 배열을 갖는 펩티드를 링커로서 사용한다. 후술하는 실시예에서는, 상기 GS 링커 배열을 3 회 반복한 배열 (GGGGSGGGGSGGGGS : 배열 번호 11) 을 갖는 펩티드 (실시예 1), 및 배열 (GGGGSGGDGSGGGGS : 배열 번호 40) 을 갖는 펩티드 (실시예 6) 를 링커로서 사용하고 있다.
본 발명의 MoAb1 의 바람직한 양태로서, 배열 번호 12 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 사슬 항체를 들 수 있다. 또 MoAb2 의 바람직한 양태로서, 배열 번호 39 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 사슬 항체를 들 수 있다. 또한, MoAb3 의 바람직한 양태로서, 배열 번호 30 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 1 개 사슬 항체를 들 수 있다.
이러한 본 발명의 모노클로날 항체에는, 결핵균을 비결핵성 항산균과 구별하여 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 항체가 함유된다. 보다 구체적으로는, 결핵균의 리포아라비노만난 (LAM) 과 비결핵성 항산균의 LAM 을 구별하여 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체이다. 당해 모노클로날 항체로는 전술하는 MoAb1 을 들 수 있다. 여기서 본 발명의 MoAb 가 비결핵균 항산균과 구별하여 특이적으로 인식하는 결핵균으로는, 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 및 소형 결핵균 (M. bovis) 이고, 보다 바람직하게는 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 이다.
결핵균 LAM 에 대한 반응을 경합법으로 비교했을 경우, 결핵균 LAM 에 비해 10 배 이상의 비결핵성 항산균 LAM 이 필요한 경우에는, 결핵균 LAM 에 대해 특이적 결합성을 갖는다고 할 수 있다. 또한, 본 발명의 MoAb 는, 고정화 항체와 검출 항체에 사용하여 LAM 을 사이에 두고 검출했을 경우, 결핵균 LAM 에 비해 비결핵성 항산균 LAM 의 반응성이 1/100 이하로 저하된 경우에는, 결핵균 LAM 에 대해, 보다 바람직한 결합 특이성을 갖는 것으로 판단할 수 있다.
항체의 친화성은, 종래의 기술을 사용하여 예를 들어 125I 표지 IgG 또는 그 프래그먼트의 포화 결합 등온선을 측정하거나, 또는 Analyzing Data with GraphPad Prizm (1999), GraphPad Software Onc., San Diego, CA 의 Motilsky 에 의해 기재되도록 하여 비선형 회귀 분석을 사용하는 비표지 IgG 에 의한 125IgG 의 상동 치환에 의해 용이하게 측정할 수 있다. 그 밖에, 당업계에서 알려져 있는 방법으로 측정할 수 있지만, 이러한 방법으로서, Scatchard 들, Ann. NY Acd. Sci., 51, 660 (1949) 에 기재되어 있는 방법을 예시할 수 있다.
본 발명의 MoAb 는 제한되지는 않지만, 항원으로서 결핵균을 사용한 파지 디스플레이법 (G. Smith, Science, 228, 1315 (1985)) 에 따라 제조할 수 있다. 여기서 결핵균으로는, 전술하는 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis, 인간형 결핵균), 소형 결핵균 (M. bovis, 소형균, 소균), 마이코박테륨·아프리칸스, 및 쥐형 결핵균을 들 수 있다. 바람직하게는, 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis, 인간형 결핵균), 소형 결핵균 (M. bovis, 소형균, 소균), 마이코박테륨·아프리칸스이고, 보다 바람직하게는 소형 결핵균이다. 전술한 바와 같이, 소형 결핵균 (M. bovis) 을 장기간 계대 배양하여 약독화한 것이 BCG 이다.
당해 BCG 를 항원으로 하여 파지 디스플레이를 사용하여, 본 발명의 MoAb 를 제조하는 방법을 실시예에 기재한다. 전술하는 바와 같이, 본 발명의 MoAb 는 구강 내 세균 등의 다른 세균과 구별하여 항산균을 특이적으로 인식하는 것, 보다 구체적으로는, 다른 세균의 LAM 유사 항원과 구별하여 항산균 LAM 에 대해 특이적으로 결합하는 것 ; 바람직하게는 비결핵성 항산균과 구별하여 결핵균을 특이적으로 인식하는 것, 보다 구체적으로는, 비결핵성 항산균 LAM 과 구별하여 결핵균 LAM 에 대해 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하지만, 이러한 MoAb 는 BCG 를 면역원으로 함으로써 제조할 수 있다.
또한, BCG 란, 전술하는 바와 같이, 소형 결핵균 (M. bovis) 으로부터 제조되는 약독주로서, 항원성은 갖지만, 인간에 대한 독성은 소실 또는 감약되어 이루어지는 세균을 의미하지만, 본 발명에서는 그뿐만 아니라, 당해 세균으로부터 제조되는 BCG 백신도 포함하여 「BCG」 라고 칭한다.
또 본 발명의 모노클로날 항체에는 상기에서 설명하는 1 개 사슬 항체의 다가 항체도 함유된다. 다가 항체에는, 2 가 항체, 3 가 항체, 및 4 가 항체가 함유되지만, 바람직하게는 2 가 항체이다. 이들 다가 항체는 정법에 따라 제조할 수 있고 (비특허문헌 7 : K. Zuberbuhler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009)), 구체적으로는 예를 들어 2 가 항체의 경우, 1 개 사슬 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 각각의 정상 영역의 유전자와 접합하고, 그것을 포유 동물 세포에서 발현할 수 있는 벡터로 클로닝 후, 포유 동물 세포에서 형질 전환하여 배양함으로써 제조할 수 있다.
(II) 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제조하기 위한 비인간 동물의 면역 방법, 및 당해 모노클로날 항체의 제조 방법
또한, 본 발명은 항산균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 MoAb 를 제조하기 위한 비인간 동물의 면역 방법, 및 당해 면역 방법을 이용한 상기 MoAb 의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 MoAb 를 제조하기 위한 비인간 동물의 면역 방법, 및 당해 면역 방법을 이용한 상기 MoAb 의 제조 방법에 관한 것이다.
(II-1) 면역 방법
항산균 LAM 의 기본적 구조는 거의 동일하고, 만노오스 캡의 구조에 미소한 차이가 관찰될 뿐이다. 이러한 항산균 LAM 에 대한 항체를 제조하는 경우, 면역원으로서, H37Rv 등의 인간형 결핵균 표준주를 사용하여 비인간 동물을 면역하는 것이 일반적이다. 이렇게 함으로써, 항산균의 LAM 에 넓게 반응하는 항체를 제조할 수 있다.
이에 대해, 소형 결핵균 (M. bovis) 으로부터 제조되는 약독주 또는 그것으로부터 제조되는 백신, 즉 BCG 를 면역원으로서 사용하여 비인간 동물을 면역하면, 비결핵성 항산균의 LAM 과 구별하여 결핵균의 LAM, 바람직하게는 인간형 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 특이성이 높은 항체를 얻을 수 있다. 본 발명은 바람직한 양태로서, 인간 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 MoAb 를 제조하기 위한 면역법으로서, BCG 를 면역원 (면역 항원) 으로서 사용하여 비인간 동물을 면역하는 방법을 제공한다.
여기서 비인간 동물로는, 인간 이외의 동물이면 되고, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 원숭이, 개, 염소, 양, 돼지, 말, 암소 등의 포유 동물이나, 닭, 집오리, 칠면조 및 메추라기 등의 조류를 들 수 있다. 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 및 토끼 등의 포유 동물 (작은 동물) 이고, 보다 바람직하게는 토끼이다.
결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 MoAb 를 제조하기 위한 본 발명의 면역 방법은 BCG 를 면역원 (면역 항원) 으로서 사용하여 비인간 동물을 면역하는 것을 특징으로 하는 것이고, 면역 수법은 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법을 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
예를 들어, BCG 를 필요에 따라 아쥬반트와 함께, 피하, 정맥 내, 또는 복강 내에 주사 등에 의해 투여하는 방법을 들 수 있다. 바람직하게는 피하 투여이다. 여기서 아쥬반트로는 제한되지 않지만, 예를 들어, 프로이드의 완전 아쥬반트, 및 프로이드의 불완전 아쥬반트를 예시할 수 있다. 또한, BCG 의 투여는, 첫 회 투여 (첫 회 면역) 후, 2 주간 정도의 간격을 두고 2 ∼ 5 회 정도 실시하는 것이 바람직하다.
이렇게 하여 면역된 비인간 동물의 비장 세포는 결핵균의 LAM, 바람직하게는 인간형 결핵균의 LAM 에 특이성이 높은 항체를 제조하기 위한 세포로서 유용하다. 당해 비장은, BCG 첫 회 면역으로부터 수 십일 ∼ 수 개월 후에 면역 비인간 동물로부터 취출되어, 결핵균의 LAM, 바람직하게는 인간형 결핵균의 LAM 에 특이성이 높은 항체의 제조 및 취득에 사용된다.
구체적으로는 예를 들어, 면역 비인간 동물로부터 적출한 비장으로부터 조제한 세포 (항체 산생 세포) 를 폴리에틸렌글리콜법이나 전기 자극 등의 정법에 따라 미에로마 세포와 융합하고, HAT 선택 배지를 사용하여 배양함으로써 하이브리도마를 취득하며, 이어서 하이브리도마 중에서, 한계 희석법 등의 정법을 사용함으로써 결핵균의 LAM 에 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 스크리닝함으로써, 결핵균의 LAM 에 특이성이 높은 MoAb 를 산생하는 하이브리도마를 취득할 수 있다. 이와 같이 하여 클로닝된 하이브리도마를 정법에 따라 배양함으로써, 원하는 결핵균의 LAM, 바람직하게는 인간형 결핵균의 LAM 에 특이성이 높은 MoAb 를 조제 취득할 수 있다.
결핵균 및 비결핵성 항산균의 구별에 상관없이, 넓게 항산균의 LAM 에 선택적으로 결합하는 MoAb 를 조제 취득하는 방법으로는, 상기로 얻어지는 결핵균의 LAM, 바람직하게는 인간형 결핵균의 LAM 에 특이성이 높은 항체와 LAM 의 복합체를 사용하여 항체를 선택하는 방법을 들 수 있다. 이 경우, 면역 수법은 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 여기서 「복합체」 란, 결핵균의 LAM 에 특이성이 높은 항체와 LAM 이 항원 항체 복합체를 형성한 것을 말하고, ELISA 에 의한 해석으로 당해 복합체의 생성을 확인할 수 있다.
(II-2) 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 MoAb 의 제조 방법
항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 MoAb 는 상기 면역 방법으로 면역된 비인간 동물 (면역 비인간 동물) 을 이용함으로써 제조할 수 있다.
이러한 방법으로서 하나의 방법으로는, 전술하는 바와 같이, 면역 비인간 동물로부터 비장을 적출하고, 적출한 비장으로부터 조제한 세포 (항체 산생 세포) 를 폴리에틸렌글리콜법이나 전기 자극 등의 정법에 따라 미에로마 세포와 융합하고, 얻어진 하이브리도마 중에서 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 MoAb 를 산생하는 하이브리도마를 취득하며, 이어서 당해 하이브리도마를 배양하는 방법을 들 수 있다. 이렇게 하여, 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM, 보다 바람직하게는 인간형 결핵균의 LAM 에 특이성이 높은 MoAb 를 조제 취득할 수 있다. 여기서, 하이브리도마의 배양은 마우스나 토끼 등의 비인간 동물의 복강 내에서 실시해도 되고, 또 디쉬 등을 사용하여 인비트로에서 실시해도 된다. 전자의 방법, 요컨대 비인간 동물의 복강 내에서 하이브리도마를 배양하는 경우에는, 배양 후에 당해 비인간 동물의 복수를 채취하고, 그 복수로부터 원하는 MoAb 를 단리·정제한다. 후자의 방법, 요컨대 인비트로에서 하이브리도마를 배양하는 경우에는, 배양 후에 얻어진 배양액으로부터 원하는 MoAb 를 단리·정제한다. 모노클로날 항체의 정제 방법으로는, 항체의 서브 클래스가 IgG 인 경우에는, 예를 들어 프로테인 A 를 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용하는 방법을 들 수 있다.
또 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 MoAb 는 최근 개발된 파지 디스플레이법 (비특허문헌 6 : Winter 들, Annu. Rev. Immunol., 12 : 433, 1994) 을 사용함으로써 제조할 수도 있다. 구체적으로는, 상기의 방법으로 면역된 면역 비인간 동물로부터 비장을 적출하고, 적출한 비장으로부터 Total RNA 또는 mRNA 를 조제하며, 당해 RNA 를 주형으로 하여 cDNA 를 조제하고, 항체 가변 영역을 코드하는 1 개 사슬 항체 (scFV : single chain fragment of variable region) 의 유전자를 제조한다. 여기서 항체 가변 영역은 중사슬 가변 영역 (VH 영역) 과 경사슬 가변 영역 (LH 영역) 의 2 영역을 포함하는 것이면 되고, 그 한정에 있어서, VH 영역과 LH 영역 사이에 임의의 펩티드 링커를 함유하는 것이어도 된다. 당해 펩티드 링커로는, 예를 들어, (I) 에 기재하는 바와 같이 8 ∼ 30 정도의 아미노산 배열로 이루어지는 링커 배열을 갖는 펩티드를 들 수 있고, 당해 링커 배열로는 GS 링커 배열을 예시할 수 있다.
그리고, 당해 유전자를 파지미드 벡터에 클로닝하여 대장균에 이입한 후, 파지를 감염시켜, scFV 항체를 파지 피막 상에 발현시킬 수 있다 (scFV 디스플레이 파지 라이브러리의 조제).
비인간 동물의 면역 방법으로서, BCG 를 면역원 (면역 항원) 으로서 사용한 경우, 상기와 같이 하여 scFV 항체를 발현시킨 scFV 디스플레이 파지 라이브러리에 대해, 면역 항원으로서 사용한 BCG 를 사용한 바이오패닝, 이어서 결핵균의 LAM, 바람직하게는 인간 결핵균의 LAM 을 고상화한 항원 플레이트를 사용한 바이오패닝을 실시함으로써, 결핵균의 LAM, 바람직하게는 인간 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (scFV 항체) 를 취득 제조하는 것이 가능해진다.
또, 항산균의 LAM 에 특이성이 높은 MoAb (1 개 사슬 항체) 를 선택하는 방법으로서, scFV 항체를 발현시킨 scFV 디스플레이 파지 라이브러리로부터 항 LAM 항체를 고상화한 담체에 LAM 을 포착시킨 항체 항원 복합체를 사용한 바이오패닝을 실시함으로써, 결핵균 및 비결핵성 항산균의 구별에 상관없이, 넓게 항산균의 LAM 에 선택적으로 결합하는 1 개 사슬 항체 (scFV 항체) 를 취득 제조하는 것이 가능해진다.
또한, 여기서 Total RNA 또는 mRNA 의 조제, cDNA 의 조제, 파지미드에 대한 서브 클로닝이나 대장균에의 이입, 파지의 감염, 항산균의 LAM, 바람직하게는 결핵균의 LAM, 보다 바람직하게는 인간 결핵균의 LAM 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (scFV 항체) 의 스크리닝 방법 (바이오패닝) 은 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있고, 구체적으로는 후술하는 실시예의 기재를 참고로 하여 실시할 수 있다.
(III) 항산균, 특히 결핵균의 검출 방법, 및 그에 사용하는 항산균 (특히 결핵균) 검출 도구
상기 본 발명의 MoAb 는 항산균, 바람직하게는 결핵균의 검출에 사용할 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명의 MoAb 를 사용함으로써, 피험자가 항산균, 특히 결핵균을 보유하고 있는지 여부, 요컨대 피험자가 항산균, 특히 결핵균에 감염되어 있는지 여부를 진단·검사할 수 있다.
본 발명의 항산균, 특히 결핵균의 검출 (진단·검사) 은 하기의 (1) 및 (2) 의 공정을 실시함으로써 실시할 수 있다.
(1) 본 발명의 MoAb 를 피험자의 생체 시료 (피험 시료) 와 접촉시키는 공정, 및
(2) 본 발명의 MoAb 와 항산균 LAM, 특히 결핵균 LAM 과의 결합 반응을 지표로 하여 피험 시료 중에 존재하는 결핵균을 측정하는 공정.
(1) 의 공정에서 본 발명의 MoAb 와 접촉시키는 피험자의 생체 시료 (피험 시료) 로는, 항산균, 특히 결핵균이 존재할 수 있는 생체 시료이면 되고, 예를 들어 객담, 타액, 혈액 (혈청, 혈장), 폐 세정액, 위액, 뇨, 분편, 피부, 췌액 등을 들 수 있다. 바람직하게는 객담, 타액, 및 혈액, 보다 바람직하게는 객담, 및 타액이다.
여기서 측정의 대상이 되는 피험자는 바람직하게는 인간이지만, 그 밖에, 말, 암소, 염소, 양, 개, 닭, 마우스, 햄스터, 및 래트 등의 동물을 대상으로 할 수도 있다.
본 발명의 MoAb 와 생체 시료를 접촉시키는 조건은 본 발명의 MoAb 와 항산균 LAM, 바람직하게는 결핵균 LAM 과의 결합 반응이 저해되지 않는 조건이면 특별히 제한되지 않고, 통상적인 면역 반응에 있어서의 조건이 채용된다. 일반적으로는 45 ℃ 이하, 바람직하게는 약 4 ∼ 40 ℃, 보다 바람직하게는 25 ∼ 40 ℃ 정도의 온도 조건하에서, 본 발명의 MoAb 와 항산균, 바람직하게는 결핵균을 함유할 수 있는 생체 시료를 공존시켜, 약 0.5 ∼ 40 시간, 바람직하게는 1 ∼ 20 시간 정도, 방치 혹은 인큐베이션하는 방법을 들 수 있다. 또, 결합 반응에 사용되는 용매 및 그 pH 도 당해 반응에 악영향을 주지 않는 것이면 특별히 제한되지 않고, 통상적인 방법에 따라 또는 그에 준해 pH 가 약 5 ∼ 9 정도가 되도록 완충액 (예를 들어, 시트르산 완충액, 인산 완충액, 트리스염 완충액, 아세트산 완충액 등) 을 사용할 수도 있다.
(1) 의 공정은 본 발명의 MoAb 를 고정화 (고상화) 한 상태 (고체의 담체에 결합시킨 상태) 로 실시할 수 있다. 당해 고정화에는, 본 발명의 MoAb 가 고체의 담체에 탈착 가능한 상태로 결합되어 있는 경우와, 탈착 불가능한 상태로 결합되어 있는 경우의 양방이 포함된다.
MoAb 를 고정화하기 위해서 사용되는 고체의 담체로는, 이 기술 분야에 있어서 관용의 각종 담체를 이용할 수 있으며, 예를 들어 유리, 셀룰로오스 분말, 세파덱스, 세파로오스, 폴리스티렌, 여과지, 카르복시메틸셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 이온 교환 수지, 덱스트란, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 나일론, 유리 비즈, 비단, 폴리아민-메틸비닐에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체 등의 여러 가지 소재로 이루어지는 스틱, 비즈, 플레이트 (마이크로 플레이트를 포함한다), 시험관 등을 넓게 예시할 수 있다.
고정화 방법에 대해서도 특별히 제한은 없고, 각종 고체 담체에 따라 물리적 결합 및 화학적 결합 중 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, 공유 결합법으로서 디아조법, 펩티드법 (산아미드 유도체법, 카르복실클로라이드 수지법, 카르보디이미드 수지법, 무수 말레산 유도체법, 이소시아네이트 유도체법, 브롬화시안 활성화 다당체법, 셀룰로오스카르보네이트 유도체법, 축합 시약을 사용하는 방법 등), 알킬화법, 가교 시약에 의한 담체 결합법 (예를 들어 가교 시약으로서 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트 등을 사용하는 것), Ugi 반응에 의한 담체 결합법 등의 화학적 반응 : 혹은 이온 교환 수지와 같은 담체를 사용하는 이온 결합법 : 유리 비즈 등의 다공성 유리를 담체로서 사용하는 물리적 흡착법 등을 예시할 수 있다.
(2) 의 공정에 있어서 본 발명의 MoAb 는 임의의 표지 물질로 표지한 상태로 사용할 수 있다. 여기서 표지 물질로는, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 알칼리포스파타아제 등의 효소 ; 플루오레세인이소시아네이트, 로다민 등의 형광 물질 ; 32P 나 125I 등의 방사성 물질 ; 금 콜로이드나 백색 콜로이드 등의 금속 콜로이드, 적색이나 청색 등의 안료로 착색된 폴리스티렌 라텍스 등의 합성 라텍스 및 천연 고무 라텍스 등의 라텍스 등의 발색 물질 (정색 물질) ; 화학 발광 물질 등을 예시할 수 있다. 이들 표지 물질에 의한 MoAb 의 표지는 각종 표지 물질에 따라 정법에 따라 실시할 수 있다.
(2) 의 공정은 본 발명의 MoAb 와 항산균, 바람직하게는 결핵균 LAM 과의 결합 반응으로 얻어지는 면역 복합체 (항원 항체 결합물) 를 검출·측정하는 공정이다. 여기서 면역 복합체 (항원 항체 결합물) 의 검출·측정 방법 그리고 그들의 조건은 특별히 제한되지 않고, 통상적인 면역 측정법에서 사용되는 것과 동일하거나 혹은 그에 준한 방법 및 조건을 채용할 수 있다. 구체적으로는, MoAb 의 표지에 사용한 표지 물질의 종류에 따라, 예를 들어 방사성 동위 원소 면역 측정법 (RIA 법), ELISA 법, 형광 항체법, 플라크법, 스포트법, 응집법, 옥터로니법 (Ouchterlony) 등의 일반의 면역 화학적 측정법에 있어서 사용되는 여러 가지 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 「하이브리도마법과 모노클로날 항체」, 주식회사 R & D 플래닝 발행, 제 30-53 페이지, 1982년 3월 5일 발행 등 참조). 감도나 간편성의 점에서, 바람직하게는 ELISA 법이, 보다 바람직하게는 샌드위치법에 따라 실시할 수 있다.
예를 들어, 고상화 샌드위치법에 의하면, 측정 대상인 피험 시료 중의 항산균, 바람직하게는 결핵균은 예를 들어 다음과 같이 하여 측정할 수 있다.
먼저, 측정 대상인 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 과 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체를 고정화 (탈착 가능한 상태에서의 고정화, 및 탈착 가능한 상태에서의 고정화를 포함한다) 시켜 이루어지는 고상화 항체에, 측정 대상인 항산균, 바람직하게는 결핵균을 함유할 수 있는 피험 시료로서의 생체 시료 (예를 들어, 객담, 타액 또는 혈액 등) 를 첨가하여 항원 항체 반응을 실시하게 한다. 이어서, 미결합 물질을 예를 들어 세정에 의해 제거하고, 측정 대상인 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 과 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체를 첨가하고, 상기로 생성한 항원 항체 결합물에 있어서의 측정 대상균과 반응시켜, 반응에 의해 생긴 항원 항체 결합물 (「항체-항산균-항체」 의 복합물, 바람직하게는 「항체-결핵균-항체」 의 복합물) 의 존재를 검출하거나 (정성 측정), 또는 그 양을 측정한다 (정량 측정). 당해 방법에 있어서, 본 발명에서는, 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 과 특이적으로 항원 항체 반응하는 항체로서, 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 을 사용한다.
상기 항원 항체 결합물 (「항체-항산균-항체」의 복합물, 바람직하게는 「항체-결핵균-항체」의 복합물) 의 측정은, 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 과 항원 항체 반응을 실시하는 어느 일방의 항체 (본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1) 로서, 전술하는 임의의 표지 물질로 표지한 항체 (표지화 항체) 를 사용함으로써 간편하게 실시할 수 있다. 보다 간편하게는, 금 콜로이드 등의 착색 라텍스 입자 등을 표지하여 이루어지는 항체를 사용한 이뮤노크로마토법의 채용을 예시할 수 있다. 이들 측정 수법에 있어서의 각종 수단의 선택이나 그들의 개변 등은 모두 당업자가 잘 알고 있으며, 본 발명에 있어서는 그것들 각 수법 중 어느 것에 의한 것으로도 할 수 있다 [「임상 검사법 제요」, 카네하라 출판, 1995년 등 참조] .
당해 방법은, 예를 들어, 하기 구조를 갖는 항산균 검출 도구, 바람직하게는 결핵균 검출 도구 (간단히 「검출 도구」 라고도 한다) 를 사용함으로써 실시할 수도 있다. 당해 검출 도구는 인간이나 동물의 체액 (객담, 타액 및 뇨를 포함한다) 에 있어서의 항산균, 바람직하게는 결핵균의 존재, 요컨대 항산균, 바람직하게는 결핵균의 감염의 유무를 판정하기 위한 도구이고, 모세관 현상에 의해 피험 시료를 이송할 수 있는 재료로 구성된 흡액편을 구비하고 있다.
당해 흡액편은,
(i) 피험 시료를 흡수 채취하는 시료 채취부,
(ii) 피험 시료의 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 과 특이적으로 반응하는 표지-항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb) 를 담지한 표지 항체부,
(iii) 하기에 나타내는 테스트 결과 표시부를 구비한 판정부,
(a) 항산균, 바람직하게는 결핵균의 LAM 과 특이적으로 반응하는 비표지-항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb) 를 고정시킨 테스트 결과 표시부, 및
(iv) 상기 시료 채취부, 표지 항체부 및 판정부를 이동해 온 피험 시료의 잔액을 흡수하는 액 흡수부를 구비하고 있다.
또한, 상기 (iii) 판정부는, (a) 테스트 결과 표시부에 더하여, 그것과 간격을 두고 하기에 나타내는 컨트롤 표시부를 구비하고 있어도 된다 :
(b) 표지-항항산균 LAM 항체 (본 발명 MoAb), 바람직하게는 표지-항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb1) 와 반응하는 비표지-항항산균 LAM 항체 (본 발명 MoAb), 바람직하게는 비표지-항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb1) 를 고정시킨 컨트롤 표시부.
당해 검출 도구에 의하면, (a) 테스트 결과 표시부의 발색의 유무로, 피험 시료 중에 항산균, 바람직하게는 결핵균의 존재를 판정할 수 있다.
본 발명의 검출 도구는, 모세관 작용 또는 크로마토그래피 작용 (본 발명에서는 이들을 대체로 「모세관 현상」 이라고 한다) 에 의해, 피험 시료를 이송할 수 있는 재료로 이루어지는 흡액편을 구비한다. 그 흡액편은 시트상의 세편 (細片) (이하, 「시트상 세편」 이라고 한다) 으로 할 수 있고, 그 시트상 세편은, 1 장의 시트에 의해, 혹은 복수장의 시트를 중첩하거나 또는 연결하여 형성할 수 있다. 혹은, 흡액편은 가늘고 긴 봉상의 세편으로 하는 등, 액의 흡수 및 모세관 현상에 의한 이송이 가능한 여러 가지 형태로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 도구는 또한 상기의 흡액편을 지지하는 지지체를 구비하는 것이어도 된다.
이 흡액편을 위한 재료로는, 용매 (물, 혈청, 뇨 그 밖의 생체 시료), 피험 성분 (결핵균 등의 항산균), 및 피험 성분을 함유하는 복합체 (예를 들어, 표지된 항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb1) 와 결핵균의 복합체 [표지 항체-결핵균], 또는 당해 복합체와 비표지-항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb1) 의 복합체 [표지 항체-결핵균-항체]) 가 침투 가능한 다공 구조 또는 모세관 구조를 갖고, 피험 성분을 함유하는 피험 시료를 (1) 시료 채취부에 적용 (채취, 적하, 첨가) 했을 경우에, 피험 시료가 도중에 상기 항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb1) 나 복합체 (표지 항체-결핵균) 를 함유하면서도, 다공 구조 또는 모세관 구조 내를 이동 (전개) 할 수 있는 재료이면 되고, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 전술하는 고체 담체를 들 수 있다. 이들 중, 보다 바람직하게는 유기 다공질체이다. 또한, 유기 다공질체의 예로는, 셀룰로오스 등의 천연 섬유, 셀룰로오스아세테이트 등의 반합성 섬유나 니트로셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르 등의 합성 섬유 등으로 형성된 섬유 집합체, 다공질 폴리프로필렌, 다공질 폴리스티렌, 다공질 폴리메타크릴산메틸, 다공질 나일론, 다공질 폴리술폰, 다공질 불소 수지, 친수성기가 도입된 불화폴리비닐리덴 등의 다공질 합성 수지 등을 들 수 있다. 바람직하게는 셀룰로오스 등의 천연 섬유, 또는 셀룰로오스아세테이트 등의 반합성 섬유나 니트로셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체이다.
흡액편의 크기는 특별히 제한되지 않는다. 폭 (단변의 길이) 이 2 ∼ 20 ㎜ 정도, 바람직하게는 4 ∼ 10 ㎜ 정도의 범위에 있고, 길이 (장변의 길이) 가 20 ∼ 200 ㎜, 바람직하게는 30 ∼ 150 ㎜ 의 범위에 있는 크기인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 실시형태에 관련된 검출 도구를 도면을 참조하면서 설명한다.
도 1(A) 및 (B) 에 본 발명의 검출 도구의 일 양태를 나타낸다. 당해 도 1(A) 및 (B) 는 본 발명의 검출 도구를 옆에서 본 도면이다. 이러한 검출 도구에 있어서, 흡액편은 피험 시료를 채취 (첨가) 하는 시료 채취부 (1), 표지 항체부 (2), 및 테스트 결과 표시부 (a) 를 구비한 판정부 (3), 그리고 이들 시료 채취부, 표지 항체부, 및 판정부를 이동해 온 피험 시료의 잔액을 흡수하는 액 흡수부 (4) 를 구비한다. 또 도 1(B) 는, 상기 판정부 (3) 에 있어서, 테스트 결과 표시부 (a) 에 더하여 컨트롤 표시부 (b) 를 구비하는 검출 도구를 나타낸다.
도 1 에 나타내는 예에서는, 흡액편은 복수의 시트편에 의해 형성된 시트상 세편으로 되어 있지만, 시트상 세편은 동일 재료로 이루어지는 1 장의 시트로 이루어지는 것이어도 되고, 또 동일하거나 또는 상이한 재질로 이루어지는 복수장의 시트편으로 전체로서 하나의 시트를 형성하여 이루어지는 것이어도 된다. 또한, 시트 전체가 복수장의 시트로 이루어지는 것이어도 되고, 부분적으로 복수장의 시트로 형성되는 부분을 갖는 것이어도 된다.
도 1 에서 나타내는 예에서는, 지지체 (10) 상에 시트상 세편이 접착되어 있다. 이 시트상 세편은 길이 방향의 일단측으로부터 타단측으로 순서대로 시료 채취부 (1) 를 형성하는 시트 (21), 표지 항체부 (2) 를 형성하는 시트 (22), 판정부 (3) 를 형성하는 시트 (23), 액 흡수부 (4) 를 형성하는 시트 (24) 를 구비하고 있다. 또, 도 2 에 나타내는 바와 같이, 시트 (21) 의 단부가 시트 (22) 의 단부와 겹치도록, 또 시트 (22) 의 단부가 시트 (23) 의 단부와 겹치도록, 또한 시트 (23) 의 단부가 시트 (24) 의 단부와 겹치도록 구성할 수도 있다. 이러한 구성을 취함으로써 액의 이동을 보다 순조롭게 할 수 있다.
시료 채취부 (1) 는 측정 대상으로 하는 피험 시료를 흡수 채취하는 부분 (피험 시료 공급부) 이다. 피험 시료로는, 본 발명이 측정 대상으로 하는 피험자의 생체 시료를 들 수 있다.
당해 시료 채취부 (1) 는, 도 1 및 도 2 에 예시하는 바와 같이, 시트상 세편의 단부 (시단부 (始端部)) 에 위치할 수 있다.
표지 항체부 (2) 는, 전술하는 바와 같이, 시료 채취부 (1) 의 종단부와 접촉하거나 (도 1), 또는 당해 시료 채취부 (1) 와 일부를 겹친 상태로 형성된다 (도 2). 당해 표지 항체부 (2) 는 피험 시료에 함유되는 항산균 LAM, 바람직하게는 결핵균 LAM 과 특이적으로 반응하여 결합하는 항체를 탈리 가능한 상태로 함유한다. 구체적으로는 본 발명의 검출 도구는, 표지 항체부 (2) 를 구성하는 시트 (22) 에, 항산균 LAM, 바람직하게는 결핵균 LAM 과 항원 항체 반응에 의해 특이적으로 결합하는 항항산균 LAM 항체 (본 발명 MoAb), 바람직하게는 항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb1) 를 탈리 가능한 상태로 함유한다. 여기서 본 발명 MoAb 는 전술하는 임의의 표지 물질로 표지된 상태로, 즉 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb) 로서, 또 MoAb1 은 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 로서 사용된다.
표지 항체부 (2) 는, 시트상 세편에 채용되는 재료 중에서도, 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 를 탈리 가능한 상태로 함유하고, 시료 채취부 (1) 로부터 이동해 온 피험 시료 중의 피험 성분 (항산균, 바람직하게는 결핵균) 과 반응하여 형성되는 항원-항체 복합체 (항산균 LAM 과 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb) 의 복합체, 바람직하게는 결핵균 LAM 과 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 의 복합체) 를 피험 시료의 판정부 (3) 로의 이동에 수반하여, 도 1 중, 화살표 P 로 나타내는 방향으로 이동시킬 수 있는 성질을 구비한 친수성 또한 흡수성의 재료로 구성되는 것이 바람직하다.
또한, 표지 항체부 (2) 에 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 (표지-항결핵균 LAM 항체) (표지-본 발명 MoAb1) 을 탈리 가능한 상태로 담지시키는 방법으로는 제한되지 않지만, 표지-본 발명 MoAb, 바람직하게는 표지-본 발명 MoAb1 을 함유하는 용액을 표지 항체부 (2) 에 함침 또는 부착시키는 방법을 예시할 수 있다. 또, 표지 항체부 (2) 에 피험 시료 중에 함유되는 피험 성분 (항산균, 바람직하게는 결핵균) 을 빠짐없이 결합시키기 위해, 당해 표지 항체부 (2) 에는 상기의 표지-본 발명 MoAb, 바람직하게는 표지-본 발명 MoAb1 을 과량으로 담지시켜 두는 것이 바람직하다.
판정부 (3) 는 상기 시료 채취부 (1) 로부터 표지 항체부 (2) 를 지나 이동해 온 피험 시료를 다시 액 흡수부 (4) 까지 이송하는 부분이고, 그 이송 영역 상에, 이송하는 피험 시료 중에 함유되는 특정 성분 (항산균 LAM 과 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb) 의 복합체, 바람직하게는 결핵균 LAM 과 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 의 복합체) 을 포착하고, 그 포착 결과를 표시하는 부분 [테스트 결과 표시부 (a)] 을 포함한다. 이 테스트 결과 표시부 (a) 에 나타내는 결과에 기초하여, 피험 시료의 항산균, 바람직하게는 결핵균의 존재의 유무가 판정 가능하게 되는 점에서, 당해 표시부 (a) 를 포함하는 영역을 「판정부 (3)」 라고 칭한다.
본 발명의 검출 도구는, 이러한 판정부 (3) 에 있어서, 테스트 결과 표시부 (a) 에 더하여, 컨트롤 표시부 (b) 를 구비하고 있어도 된다. 또한, 이러한 테스트 결과 표시부 (a), 및 컨트롤 표시부 (b) 는 각각 순차 간격을 두고 배치된다.
테스트 결과 표시부 (a) 에는, 항산균 LAM 과 특이적으로 반응하는 비표지의 항체 [비표지-항항산균 LAM 항체], 바람직하게는 결핵균 LAM 과 특이적으로 반응하는 비표지의 항체 [비표지-항결핵균 LAM 항체] 가 과량으로 고정되어 있다. 이 때문에, 상기 표지 항체부 (2) 에서의 항원 항체 반응에 의해 표지-본 발명 MoAb 와 결합한 항산균, 바람직하게는 표지-본 발명 MoAb1 과 결합한 결핵균은, 표지-본 발명 MoAb, 바람직하게는 표지-본 발명 MoAb1 의 복합체의 상태로, 이 테스트 결과 표시부 (a) 에 포착되고, 그 포착량에 따른 강도로 표지 물질에서 기인하는 발색을 나타낸다.
또한, 여기서 비표지-항항산균 LAM 항체를 구성하는 항항산균 LAM 항체로는, 항산균의 LAM 과 특이적으로 결합하는 본 발명의 MoAb (본 발명 MoAb) 를 동일하게 사용할 수 있다. 또, 여기서 비표지-항결핵균 LAM 항체를 구성하는 항결핵균 LAM 항체로는, 결핵균의 LAM 과 특이적으로 결합하는 본 발명의 MoAb1 (본 발명 MoAb1) 을 동일하게 사용할 수 있다.
컨트롤 표시부 (b) 에는, 상기 표지 항체부 (2) 에 함유시킨 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 와 반응하는 비표지-항체 (제 2 항체) 가 소정량 고정되어 있다. 당해 컨트롤 표시부 (b) 는, 피험 시료의 이동 방향 (도 1 중, p 의 방향) 으로, 테스트 결과 표시부 (a) 와 간격을 두고, 테스트 결과 표시부 (a) 및 컨트롤 표시부 (b) 의 순서로 배치할 수 있다. 컨트롤 표시부 (b) 에는, 선행하는 시트편으로부터 이동해 오는 피험 시료 중에 함유되는 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 와 반응하는 비표지-항체 (제 2 항체) 가 과잉량 고정되어 있다.
이 때문에, 이러한 컨트롤 표시부 (b) 에는, 표지 항체부 (2) 로부터 탈리하여 피험 시료 중에 방출된 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 가 포착되고, 컨트롤 표시부 (b) 에 고정된 상기 제 2 항체의 양에 따른 강도로, 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 의 표지 물질에서 기인하는 발색을 나타낸다.
여기서 비표지-항체 (제 2 항체) 는 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 와 결합하는 것이면 된다. 이러한 비표지-항체 (제 2 항체) 는 제한되지 않지만, 예를 들어 항산균의 LAM binding protein, 음이온성 입자 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 검출 도구를 사용한 결핵균의 측정은 판정부 (3) 에 있어서의 테스트 결과 표시부 (a) 에 있어서의 발색의 유무를 지표로 하여 실시된다. 이 때, 필요에 따라, 판정부 (3) 에 있어서의 컨트롤 표시부 (b) 에 있어서의 발색의 유무도 판단에 사용할 수 있다. 테스트 결과 표시부 (a) 에 있어서의 발색이 관찰되지 않는 경우에도, 상기 컨트롤 표시부 (b) 에서 발색이 관찰되는 경우에는, 측정은 정상적으로 실시되고 있으며, 측정 결과를 음성으로 판단할 수 있다. 그러나, 상기 컨트롤 표시부 (b) 에서 발색이 관찰되지 않는 경우에는, 측정이 정상적으로 실시되지 않은 것을 나타내고, 테스트 결과 표시부 (a) 의 결과를 가지고 음성으로 판단할 수는 없다.
판정부 (3) 는 시트상 세편에 채용되는 재료 중에서도 여러 가지 성분을 함유하는 피험 시료를 액 흡수부 (4) 에 모세관 현상에 의해 이동시킬 수 있으며, 테스트 결과 표시부 (a) 에 상기의 비표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 를, 또 컨트롤 표시부 (b) 에 상기의 비표지-항체 (제 2 항체) 를 안정적으로 고정화시킬 수 있는 성질을 구비한 친수성 또한 흡수성의 재료로 구성되는 것이 바람직하다.
액 흡수부 (4) 는 상기 시료 채취부 (1) 로부터 표지 항체부 (2), 및 판정부 (3) (테스트 결과 표시부 (a), 또는 테스트 결과 표시부 (a) 와 컨트롤 표시부 (b)) 를 지나, 화살표 P 의 방향으로 이동해 온 피험 시료의 잔액을 흡수하는 부분이다. 이 때문에, 액 흡수부 (4) 는, 시트상 세편에 채용되는 재료 중에서도, 친수성 및 흡수성이 우수한 것이 바람직하지만, 보다 바람직하게는 흡수한 액을 이수 (離水) 하지 않는 성질을 구비한 재료 또는 탄력성이 있는 재료로 구성되는 것이 바람직하다. 이러한 재료로서, 구체적으로는 여과지나 친수성 섬유의 부직포 등을 들 수 있고, 여과지와 부직포의 적층체도 사용할 수 있다.
본 발명의 검출 도구는 기본적으로 상기 구성을 구비한 시트상 세편으로 이루어지지만, 상기 시트상 세편에 더하여, 추가로 지지체 (10) 를 구비할 수도 있다. 이러한 지지체 (10) 는 상기 시트상 세편을 유지할 수 있는 재질 및 형태를 구비하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 시트상 세편의 이면 (하층면) 에 적층하여 사용되는 시트상의 지지체이어도 되고, 또 시트상 세편을 수납하는 하우징 형태의 지지체이어도 된다.
시트상의 지지체로는, 예를 들어 각종 플라스틱제의 시트 (플라스틱 시트), 경질지, 알루미늄제 등의 금속 (합금을 포함한다) 제 시트, 예를 들어 이질 또는 동질의 복수의 종이를 접착한 (첩합 (貼合) 한) 복층지, 플라스틱 시트와 종이를 접착한 (첩합) 것, 종이와 금속제 시트를 접착한 (첩합) 것, 플라스틱 시트와 종이와 금속제 시트를 접착한 (첩합) 것, 종이에 방수용 등의 코팅을 실시한 것 등을 들 수 있다. 바람직하게는 방수 기능을 갖는 것이다.
하우징 형태의 지지체는 폴리염화비닐, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 아크릴산폴리머 등, 불투습성의 재료로 이루어지는 것이 바람직하지만, 지제 (紙製) 이어도 발수 가공이 되어 있으면 사용할 수 있다. 하우징에는 적어도 내부에 수납되는 상기 시트상 세편의 시료 채취부 (1) 에 대응하여 「채액창」, 판정부 (3) 의 테스트 결과 표시부 (a) 에 대응하여 「판정 표시창」, 및 컨트롤 표시부 (b) 에 대응하여 「컨트롤 표시창」 이 형성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 「판정 표시창」 과 「컨트롤 표시창」 은 개개로 형성되어 있어도 되지만, 하나의 창으로서 형성되어 있어도 된다.
전술하는 시트상 세편을 구비하는 본 발명의 검출 도구는, 그 사용시에, 먼저 시료 채취부 (1) 에 피험 시료를 함침시킨다. 그렇게 하면, 시료 채취부 (1) 에 흡수된 피험 시료가 시트상 세편 중을 모세관 현상에 의해 침투하여, 먼저 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 가 탈리 가능하게 담지되어 있는 표지 항체부 (2) 에 이른다. 여기서, 피험 시료 중의 피험 성분 (결핵균) 이 상기 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 와 항원 항체 반응에 의해 특이적으로 결합한다. 이어서, 피험 시료는, 「항산균과 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb) 의 복합체」 (「결핵균과 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 의 복합체」) 와, 「결핵균과 결합하지 않았던 잉여의 표지-결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb)」 (「결핵균과 결합하지 않았던 잉여의 표지-결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1)」) 를 따르면서, 판정부 (3) 의 테스트 결과 표시부 (a) 에 이른다. 테스트 결과 표시부 (a) 에는 항산균과 특이적으로 결합하는 비표지-항항산균 LAM 항체 (본 발명 MoAb), 바람직하게는 결핵균과 특이적으로 결합하는 비표지-항결핵균 LAM 항체 (본 발명 MoAb1) 가 안정적으로 고정되어 있으므로, 여기에 피험 시료 중의 「항산균과 특이적으로 결합한 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb)」, 바람직하게는 「결핵균과 특이적으로 결합한 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1)」 가 포착되어 집적된다. 그 결과, 테스트 결과 표시부 (a) 는 포착된 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 포착된 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 의 표지 물질에 기초하여 피험 시료 중에 함유되는 항산균, 바람직하게는 결핵균의 양에 따른 강도로 발색한다. 이로써, 피험 시료 중의 항산균, 바람직하게는 결핵균의 유무나 양적 비율을 검지할 수 있다.
다음으로 피험 시료는 「항산균과 결합하지 않았던 잉여의 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb)」, 바람직하게는 「결핵균과 결합하지 않았던 잉여의 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1)」 를 따르면서, 판정부 (3) 의 컨트롤 표시부 (b) 에 이른다. 컨트롤 표시부 (b) 에는 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb) 와 결합하는 제 2 항체 [비표지-항체], 바람직하게는 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 와 결합하는 제 2 항체 [비표지-항체] 가 일정한 양으로 안정적으로 고정되어 있으므로, 여기에 피험 시료 중의 상기의 잉여의 표지-항항산균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb), 바람직하게는 표지-항결핵균 LAM 항체 (표지-본 발명 MoAb1) 가 포착되어 집적된다. 그 결과, 컨트롤 표시부 (b) 는 컨트롤 표시부 (b) 에 고정화된 제 2 항체의 양 (또는 제 2 항체와 결합한 표지-항체의 양) 에 따른 강도로 발색한다.
이들 외에, 본 발명의 검출 도구는 본 발명의 범위를 일탈하지 않고 여러 가지 변형 양태가 가능하다. 상기의 본 발명의 검출 도구에는, 그 밖에 당해 검출 도구의 사용 방법이나 판정 방법에 대해 설명한 사양서를 첨부할 수 있고, 본 발명은 이러한 검출 도구와 사양서가 세트로 된 판정 키트를 제공하는 것이다.
(IV) 결핵 진단제 또는 진단용 키트
전술하는 항산균 검출 방법 및 항산균 검출 도구는 피험자의 생체 시료 중의 항산균의 존재를 검출하기 위해서 사용된다. 특히 모노클로날 항체로서 본 발명의 MoAb1 을 사용하는 경우, 상기 항산균으로서 바람직하게는 결핵균을 예시할 수 있다. 요컨대, 전술하는 항산균 검출 방법 및 항산균 검출 도구는 피험자에 있어서의 항산균, 특히 결핵균 감염의 유무를 진단하기 위해서 사용된다.
따라서, 전술하는 본 발명 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 은 결핵 진단제로서 유용하고, 본 발명은 이러한 본 발명 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 을 함유하는 결핵 진단제를 제공하는 것이다. 당해 본 발명 MoAb 는 임의의 고체의 담체에 탈착 가능하게 또는 탈착 불가능하게 고정화되어 있어도 되고, 또 임의의 표지 물질로 표지되어 있어도 된다.
또 상기 본 발명의 항산균, 특히 결핵균 검출 방법을 실시할 때에 있어서는, 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 을 결핵균 검출 시약으로서 함유하는 결핵 진단용 키트를 이용함으로써 간편하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기하는 결핵 검출 방법을 실시하기 위한 결핵 진단용 키트를 제공하는 것이다. 당해 결핵 진단용 키트는 피험 시료 중에 존재하는 결핵균을 항원 항체 반응을 이용하여 검출 측정하기 위한 시약 키트이다. 당해 키트는 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 을 함유하는 것이면 되고, 전술하는 결핵균 검출 도구, 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 과 반응하는 제 2 항체, 또는 항체 검출 시약 등을 함유하고 있어도 된다. 또, 당해 진단용 키트에는, 측정의 실시의 편익을 위해, 추가로 적당한 반응액, 희석액, 세정액, 반응 정지액, 표지 활성 측정 시약 등이 함유되어 있어도 된다.
(V) 항산균 LAM (특히 결핵균 LAM) 의 측정 방법, 항산균 LAM (특히 결핵균 LAM) 검출제 또는 검출용 키트
본 발명의 MoAb 는 항산균의 리포아라비노만난 (LAM) 을 특이적으로 인식하여 결합하는 항체이다. 이 때문에, 전술하는 본 발명의 항산균 검출 방법은 항산균 LAM 의 측정에도 응용할 수 있다.
구체적으로는 본 발명의 항산균 LAM 의 측정 방법은 하기의 공정을 실시함으로써 실시할 수 있다.
(1) 본 발명 MoAb 를 항산균을 함유할 수 있는 피험 시료와 접촉시키는 공정, 및
(2) 본 발명 MoAb 와 항산균의 LAM 의 결합 반응을 지표로 하여 피험 시료 중에 존재하는 항산균 LAM 을 측정하는 공정.
이들 (1) 및 (2) 의 공정은 전술하는 「(II) 항산균의 검출 방법」 에서 설명한 (1) 및 (2) 공정에 각각 대응하는 공정이고, 여기서도 상기 (II) 에서의 기재를 원용할 수 있다. 또, 당해 항산균 LAM 의 측정도 전술하는 「(II) 항산균의 검출 방법」 에서 설명한 항산균 검출 도구를 동일하게 사용하여 실시할 수 있다 (또한, 이 경우 「항산균 LAM 검출 도구」 라고 바꾸어 말할 수도 있다).
또한, 상기 본 발명 MoAb 중 MoAb1 은 결핵균의 리포아라비노만난 (LAM) 을 특이적으로 인식하여 결합하는 항체이기 때문에, 상기하는 본 발명의 항산균 검출 방법은 결핵균 검출 방법으로서 결핵균 LAM 의 측정에도 응용할 수 있다.
여기서, 항산균 LAM, 바람직하게는 결핵균 LAM 의 측정은 항산균 LAM, 바람직하게는 결핵균 LAM 을 검출하기 위한 정성 측정, 및 항산균 LAM, 바람직하게는 결핵균 LAM 의 양을 측정하기 위한 정량 측정이 포함된다. 정량 측정은 제한되지는 않지만, 예를 들어, 본 발명 MoAb 와 이미 알려진 양의 항산균 LAM, 바람직하게는 결핵균 LAM 과의 반응으로부터 미리 검량선을 제조해 두고, 당해 검량선으로부터 피험 시료 중에 함유되는 미지량의 항산균 LAM, 바람직하게는 결핵균 LAM 의 양을 산출하는 방법을 예시할 수 있다.
이러한 측정에 있어서, 본 발명 MoAb 는 항산균 LAM 검출용 시약으로서 유용하고, 본 발명은 이러한 본 발명 MoAb 를 항산균 LAM 검출용 시약으로서 함유하는 항산균 LAM 검출제를 제공하는 것이다. 그 중에서도 본 발명의 MoAb1 은 결핵균 LAM 검출용 시약으로서 유용하고, 본 발명은 이러한 본 발명 MoAb1 을 결핵균 LAM 검출용 시약으로서 함유하는 결핵균 LAM 검출제를 제공하는 것이다. 이들 본 발명 MoAb 는 임의의 고체의 담체에 탈착 가능하게 또는 탈착 불가능하게 고정화되어 있어도 되고, 또 임의의 표지 물질로 표지되어 있어도 된다.
상기 본 발명의 항산균 LAM 측정 방법을 실시할 때에는, 본 발명의 MoAb 를 항산균 LAM 검출 시약으로서 함유하는 항산균 LAM 검출용 키트를 이용함으로써 간편하게 실시할 수 있다. 또 상기 본 발명의 결핵균 LAM 측정 방법을 실시할 때에는, 본 발명의 MoAb 중, MoAb1 을 결핵균 LAM 검출 시약으로서 함유하는 결핵균 LAM 검출용 키트를 이용함으로써 간편하게 실시할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기하는 항산균 LAM 측정 방법을 실시하기 위한 항산균 LAM 검출용 키트, 특히 결핵균 LAM 측정 방법을 실시하기 위한 결핵균 LAM 검출용 키트를 제공하는 것이다. 당해 항산균 LAM 검출용 키트, 특히 결핵균 LAM 검출용 키트는 피험 시료 중에 존재하는 항산균, 특히 결핵균의 LAM 을 항원 항체 반응을 이용하여 검출 측정하기 위한 시약 키트이다. 당해 항산균 LAM 검출용 키트는 본 발명의 MoAb 를 함유하는 것이고, 또 결핵균 LAM 검출용 키트는 본 발명의 MoAb1 을 함유하는 것이면 되고, 전술하는 항산균 LAM 검출 도구 (또는 결핵균 LAM 검출 도구), 본 발명의 MoAb (또는 MoAb1) 와 반응하는 제 2 항체, 또는 항체 검출 시약 등을 함유하고 있어도 된다. 또, 당해 진단용 키트에는, 측정의 실시의 편익을 위해, 추가로 적당한 반응액, 희석액, 세정액, 반응 정지액, 표지 활성 측정 시약 등이 함유되어 있어도 된다.
(VI) 멸균 검체에서의 측정 방법
(III) 에서 전술하는 본 발명의 항산균 또는 결핵균 검출 방법은 바이오해저드 프리의 측정 방법으로서 응용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 바이오해저드 프리인 측정 방법은 하기의 공정을 실시함으로써 실시할 수 있다.
(1) 검체 시료를 고열 자비 멸균, 바람직하게는 고압 증기 멸균한다.
(2) 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 을 멸균 처리한 피험 시료와 각각 접촉시키는 공정,
(3) 상기 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 과 결핵균 LAM 의 결합 반응을 지표로 하여 피험 시료 중의 결핵균 LAM 을 측정하는 공정, 및
(4) 피험 시료에 결핵균 LAM 이 검출되었을 경우에, 피험 시료가 결핵균에 감염되어 있다고 판단하는 공정.
(VII) 항결핵약의 결핵 치료 효과를 판정하는 방법
(III) 에서 전술하는 본 발명의 항산균, 특히 결핵균 검출 방법은 항결핵약의 결핵 치료 효과의 판정에도 응용할 수 있다.
구체적으로는 본 발명의 항결핵약의 결핵 치료 효과의 판정 방법은 하기의 공정을 실시함으로써 실시할 수 있다.
(1) 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 을 항결핵약 투여 전후의 피험 시료와 각각 접촉시키는 공정,
(2) 상기 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 과 결핵균 LAM 의 결합 반응을 지표로 하여 항결핵약 투여 전후의 피험 시료 중의 결핵균 LAM 을 측정하는 공정, 및
(3) 항결핵약 투여 전의 피험 시료에 결핵균 LAM 이 검출되고, 또한 항결핵약 투여 후의 피험 시료에 결핵균 LAM 이 검출되지 않는 경우에 항결핵약의 결핵 치료 효과 있음으로 판단하는 공정.
이들 (1) 및 (2) 의 공정은 전술하는 「(III) 항산균, 특히 결핵균의 검출 방법」 에서 설명한 (1) 및 (2) 의 공정에 각각 대응하는 공정이고, 피험 시료로서, 결핵에 이환된 (결핵균에 감염된) 결핵 환자의 피험 시료로서, 항결핵약 투여 전 (결핵 치료 전) 의 피험 시료 및 항결핵약 투여 후 (결핵 치료 후) 의 피험 시료를 대상으로 하는 것 이외에는, 상기 (III) 에 기재하는 방법을 동일하게 실시할 수 있다. 또, (2) 에서 실시하는 결핵균 LAM 의 측정도 전술하는 「(III) 항산균, 특히 결핵균의 검출 방법」 에서 설명한 결핵균 검출 도구를 동일하게 사용하여 실시할 수 있다 (또한, 이 경우 「결핵균 LAM 검출 도구」 라고 바꾸어 말할 수도 있다).
여기서 항결핵약으로는, 종래부터 공지된 리팜피신, 이소니아지드 (이소니코틴산하이드라지드), 피라지나미드, 스트렙토마이신 또는 그 염, 에탐부톨 또는 그 염을 들 수 있지만, 이들 항결핵약에 한정되지 않고, 결핵균에 대한 살균 작용 (항결핵 작용) 이 관찰되는 승인 또는 비승인의 약이 포함된다.
상기 (2) 공정의 결과, 항결핵약 투여 전의 피험 시료에 결핵균 LAM, 바꾸어 말하면 결핵균이 검출되고, 또한 항결핵약 투여 후의 피험 시료에 결핵균 LAM (결핵균) 이 검출되지 않는 경우에는, 당해 항결핵약에 대해 대상으로 하는 결핵 환자에 대해 결핵 치료 효과가 있었다고 항결핵약의 유효성을 판단할 수 있다.
한편, 상기 (2) 공정의 결과, 항결핵약 투여 전의 피험 시료에 결핵균 LAM, 바꾸어 말하면 결핵균이 검출되고, 또한 항결핵약 투여 후의 피험 시료에도 결핵균 LAM (결핵균) 이 검출된 경우에는, 또한 항결핵약 투여 전후에서 검출된 결핵균의 양을 대비할 수 있다. 여기서, 항결핵약 투여 전후에서 결핵균량의 저하가 관찰되는 경우에는, 당해 항결핵약에 대해 대상으로 하는 결핵 환자에 대해 결핵 치료 효과가 있을 가능성이 시사되기 때문에, 의료 종사자에 대해 당해 항결핵약을 계속적으로 사용한다는 치료의 선택을 부여할 수 있다. 이에 대해, 항결핵약 투여 전후에서 결핵균량의 저하가 관찰되지 않는 경우에는, 당해 항결핵약에 대해 대상으로 하는 결핵 환자에 대해 결핵 치료 효과가 없다고 관찰되기 때문에, 의료 종사자에 대해 당해 항결핵약의 사용을 중지하고, 다른 치료로 전환한다는 치료의 선택을 부여할 수 있다.
이러한 방법에 있어서, 본 발명 MoAb, 특히 MoAb1 은 항결핵약의 결핵 치료 효과 판정 시약으로서 유용하고, 본 발명은 이러한 본 발명 MoAb, 특히 MoAb1 을 결핵 치료 효과 판정 시약으로서 함유하는 결핵 치료 효과 판정제를 제공하는 것이다. 당해 본 발명 MoAb, 특히 MoAb1 은 임의의 고체의 담체에 탈착 가능하게 또는 탈착 불가능하게 고정화되어 있어도 되고, 또 임의의 표지 물질로 표지되어 있어도 된다.
또 상기 본 발명의 판정 방법을 실시할 때에는, 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 을 항결핵약의 결핵 치료 효과 판정 시약으로서 함유하는 결핵 치료 효과 판정용 키트를 이용함으로써 간편하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기하는 항결핵약의 결핵 치료 효과 판정 방법을 실시하기 위한 결핵 치료 효과 판정용 키트를 제공하는 것이다. 당해 결핵 치료 효과 판정용 키트는 결핵 환자에 대한 항결핵제에 의한 치료 효과를 치료 전후의 피험 시료 중에 존재하는 결핵균의 LAM 을 항원 항체 반응을 이용하여 검출 측정하여 판정하기 위한 시약 키트이다. 당해 키트는 본 발명의 MoAb, 바람직하게는 MoAb1 을 함유하는 것이면 되고, 전술하는 결핵균 LAM 검출 도구, 본 발명의 MoAb 와 반응하는 제 2 항체, 또는 항체 검출 시약 등을 함유하고 있어도 된다. 또, 당해 진단용 키트에는, 측정의 실시의 편익을 위해, 추가로 적당한 반응액, 희석액, 세정액, 반응 정지액, 표지 활성 측정 시약 등이 함유되어 있어도 된다.
활동성 결핵에 대한 일반적 치료는 4 종류 이상의 치료약을 6 개월간 투여함으로써 실시된다. 결핵 감염이 의심되는 경우, 먼저, 질·닐센 염색 또는 형광 염색에 의한 도말 검사가 실시된다. 객담 검체 1 ㎖ 중에 10,000 개 이상의 균이 있으면 도말 양성이 된다. 객담 도말 양성 환자는 감염원으로서 임상상, 또는 공중 위생상 특별히 중요해지고 있다. 그 때문에, 도말 양성 환자는 결핵 병동에서의 입원 치료가 필요하다. 통원 치료로 전환하는 하나의 지표는 3 일간 연속해서 도말 검사 결과가 음성이 되는 것이다. 본 발명에 의한 결핵균 LAM 검출법은 객담, 타액, 혈액 등의 생체 시료 중의 LAM 농도를 정량하는 것이 가능하다. 따라서, 객담, 타액, 혈액 등의 생체 시료 중의 LAM 을 측정함으로써, 치료 약제 유효성의 모니터링이 가능하고, 또한 배균 상태의 음성화 판단에도 응용 가능하다.
실시예
이하, 본 발명의 구성 및 그 효과를 실시예를 사용하여 설명한다. 단, 본 발명은 이러한 실시예의 기재에 전혀 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1 ∼ 4]
1. 재료의 조제
(1-1) 올리고화 LAM 의 제조, 및 면역 항원의 조제
인간형 결핵균인 M. tuberculosis 의 LAM (아오야마 B 주 유래, 나칼라이 테스크) 3 ㎎ 을 50 mM 의 아세트산 완충액 (pH 4.5) 으로 투석하고, 1 ㎎/㎖ 의 농도로 조정한 후, 200 mM 의 과요오드산 수용액을 150 ㎕ 첨가하고, 차광하 4 ℃ 에서 7 분간 교반하였다. 교반 후 에틸렌글리콜을 35 ㎕ 첨가하고, 소형 칼럼 PD-10 (GE 사 제조) 으로 겔 여과 (0.1 M 탄산수소나트륨, pH 8.3) 를 실시하여 1 ㎖ 씩 분획하였다. 분획 샘플은 페놀-황산법으로 당을 검출하고, 당이 검출된 분획을 순수에서 투석을 실시한 후에 동결 건조시켰다.
동결 건조시킨 올리고화 LAM 3 ㎎ 을 0.5 ㎖ 의 순수에서 용해하였다. 이것에 아세토니트릴에 용해한 100 ㎎/㎖ 의 1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄테트라플루오로붕산을 12 ㎕ 첨가하고, 약 1 분간 교반한 후, 0.2 M 의 트리에틸아민을 12 ㎕ 첨가하고 2 분간 교반하였다. 다음으로, 이것에 0.5 M 의 탄산수소나트륨 완충액 (pH 8.5) 으로 용해한 0.6 M 의 아디프산디하이드라지드를 0.53 ㎖ 첨가하고, 4 ℃ 에서 10 시간 교반한 후, 순수로 약 1 시간 투석하였다.
투석 후의 용액에 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 을 300 ㎍, 200 mM 인산 완충액 (pH 5.0) 을 30 ㎕, 100 mM 의 N-하이드록시술포숙신이미드나트륨을 45 ㎕ 첨가한 후, 추가로 1 M 의 에틸렌디클로라이드를 65 ㎕ 첨가하고 4 ℃ 에서 3 시간 이상 교반하였다. 최종적으로, 인산 완충액으로 투석을 실시하여, 면역 항원용의 올리고화 LAM-KLH 로 하였다. 또한, 당해 올리고화 LAM-KLH 는 아쥬반트 (Completea 또는 Incomplete Freund's adjuvant, DIFCO 사 제조) 와 1 : 1 (올리고화 LAM-KLH : 아쥬반트 [중량비]) 의 비율로 혼합하여 면역원으로 하였다.
(1-2) BCG 백신, 및 면역 항원의 조제
BCG 백신으로서, 닛폰 BCG 제조 (주) 제조의 동결 건조 BCG 백신 (승인 번호 20300AMZ00767000) 을 사용하였다. 면역에는 당해 동결 건조 BCG 백신 100 ㎎ (습중량) 에 생리 식염수 1 ㎖ 를 첨가하여 혼합한 것을 사용하였다.
(1-3) H37Ra 사균체, 및 면역 항원의 조제
H37Ra 사균체로서, DIFCO 사 제조의 M. TUBERCULOSIS H37Ra (동결 건조품) 를 사용하였다. 면역에는 당해 동결 건조 H37Ra 사균체를 100 ㎎ (건중량) 에 생리 식염수 1 ㎖ 를 첨가하여 혼합한 것을 사용하였다.
(1-4) scFv 단편 제조용 프라이머의 제조
1 개 사슬 항체 (scFv) 의 제조에 사용한 프라이머의 이름, 염기 배열, 및 용도를 표 1 에 나타낸다. VH 영역 증폭용 프라이머로서 sense primer 4 종류와 antisense primer 1 종류, VL 영역 증폭용 프라이머로서 sense primer 4 종류와 antisense primer 4 종류, 중사슬 가변 영역 단편과 경사슬 가변 영역 단편을 연결하는 링커 (GS 링커) 증폭용 프라이머로서 sense primer 1 종류와 antisense primer 1 종류, 및 제한 효소 (Sfi-I, Not-I) 인식 영역을 증폭시키기 위한 프라이머 2 종류를 합성하였다. 또한, 배열표의 배열 번호 13 ∼ 29 에 기재된 아미노산 배열은 당해 표 1 에 위에서부터 차례로 기재하는 프라이머의 아미노산 배열에 대응하고 있다.
Figure pct00001
(1-5) scFv 파지 라이브러리의 제조
면역 항원으로서, BCG 백신 또는 HR37Ra 사균체를 각각 사용하여 토끼를 면역하였다 (상기 (1-2) 및 (1-3), 그리고 참고예 1 (2) 참조). 면역 종료 후에 토끼의 비장을 적출하고, RPMI (무혈청) 배지 중에서 조직을 녹여 Total RNA 를 추출하고, 얻어진 Total RNA 로부터 cDNA 를 합성하였다. 또한, Total RNA 의 추출은 RNA 추출 키트 (QIAGEN 사) 를 사용하여 조작 순서서에 따라 실시하였다. 또, Total RNA 로부터의 cDNA 합성은 cDNA 합성 키트 (Invitrogen 사) 를 사용하여 조작 순서서에 따라 실시하였다.
합성한 cDNA 를 주형으로 하여, 상기 표 1 에 기재하는 특이적 프라이머를 사용하여, VH 유전자 단편 및 VL 유전자 단편을 증폭시켰다. 구체적으로는 VH 유전자 단편은 RabVH-F1 과 RabVH-R, RabVH-F2 와 RabVH-R, RabVH-F3 과 RabVH-R, 및 RabVH-F4 와 RabVH-R 의 4 종류의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다. VL 유전자 단편은 RabVκ-F1 과 RabVκ-R1, RabVκ-F1 과 RabVκ-R2, RabVκ-F1 과 RabVκ-R3, RabVκ-F2 와 RabVκ-R1, RabVκ-F2 와 RabVκ-R2, RabVκ-F2 와 RabVκ-R3, RabVκ-F3 과 RabVκ-R1, RabVκ-F3 과 RabVκ-R2, RabVκ-F3 과 RabVκ-R3, RabVλ-F 와 RabVλ-R 의 10 종류의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다. 얻어진 유전자 증폭 산물은 1.5 ％ 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 목적 분자량의 유전자 증폭 산물을 겔로부터 추출하여 정제하였다.
정제한 VH 유전자 증폭 산물 및 VL 유전자 증폭 산물을 GS 링커 (GGGGSGGGGSGGGGS : 배열 번호 11) 를 사용하여 접합하였다. VH 유전자 증폭 산물의 3' 말단에 상동성 배열을 갖는 RS1 과 VH 유전자를 혼합하고, PCR 을 5 사이클 실시함으로써, VH 유전자 증폭 산물의 3' 말단에 GS 링커를 부가하였다. 동일하게, VL 유전자 증폭 산물의 5' 말단에 상동성 배열을 갖는 RS2 와 VL 유전자를 혼합하고, PCR 을 5 사이클 실시함으로써, VL 유전자 증폭 산물의 5' 말단에 GS 링커를 부가하였다. GS 링커를 부가한 VH 유전자 증폭 산물과 VL 유전자를 혼합하고, PCR 을 10 사이클 실시함으로써, GS 링커를 개재하여 VH 유전자와 VL 유전자가 접합한 scFv 유전자 (VH 유전자/GS 링커/VL 유전자) 를 제조하였다. 이렇게 하여 제조한 scFv 유전자를 주형으로, 제한 효소 배열을 부가한 프라이머 (표 1 중, 「RS-Sfi」 및 「RS-Not」 참조) 를 사용하여 30 사이클 PCR 로 증폭시키고, 최종적으로 제한 효소 Sfi-I 및 Not-I 를 사용하여 절단하였다.
이어서 제한 효소로 처리한 scFv 유전자를 항체 디스플레이용 파지미드 벡터 pCANTAB5E (GE 사 제조) 의 Sfi-I 및 Not-I 부위에 삽입하고, 대장균 JM109 주를 일렉트로포레이션법에 의해 형질 전환하였다. 그 후, LB-Amp/Glu 한천 배지 (150 ㎍/㎖ 암피실린, 1 ％ 글루코오스, 1.5 ％ 한천을 함유하는 LB 배지) 에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하고, 생성한 콜로니를 모두 회수하였다.
당해 형질 전환 대장균을 파장 600 ㎚ 의 흡광도 (OD600) = 0.2 가 되도록 LB 배지에서 조제한 후, 헬퍼 파지 M13K07 (Invitrogen 사 제조) (1012 cfu) 과 혼합하여, 37 ℃ 에서 30 분간 정치 배양하고, 또한 1 ℓ 의 LB-Amp/Kan 액체 배지 (150 ㎍/㎖ 암피실린, 100 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지) 에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양함으로써, scFv 디스플레이 파지 라이브러리를 제조하였다.
최종적으로, 이 scFv 디스플레이 파지 라이브러리는 PEG/NaCl 용액으로 농축하고, 약 1 x 1012 cfu/㎖ 농도가 되도록 PBS 로 조제하여 바이오패닝에 사용하였다.
(1-6) 가용성 scFv (1 개 사슬 항체) 의 제조
가용성 scFv 는 대장균 발현 벡터 pET22b(+) (Novagen 사 제조) 를 이용하여 제조하였다. 목적으로 하는 scFv 유전자를 sense primer 와 antisense primer 에 의해 증폭시킴으로써, 5' 말단에 Not I, 3' 말단에 Nco I 의 제한 효소 배열을 부가하였다.
Not I 및 Nco I 로 처리한 scFv 유전자를 대장균 발현 벡터 pET22b(+) 에 삽입한 후, 숙주 대장균 Rosseta (Novagen 사) 를 형질 전환하였다. 형질 전환한 대장균은 LB-Amp/Glu 한천 배지에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하고, 콜로니를 2 ㎖ 의 LB-Amp 액체 배지에서 25 ℃ 에서 8 시간 배양하였다. 배양액 2 ㎖ 를 200 ㎖ 의 LB-Amp 액체 배지에 첨가하고, 30 ℃ 에서 16 시간 배양함으로써 배양 상청에 가용성 scFv (1 개 사슬 항체) 를 분비시켰다.
배양 상청으로부터의 가용성 scFv 의 정제는 Ni 세파로오스를 충전한 칼럼 (Ni 칼럼) (GE 사 제조) 을 사용한 어피니티 정제에 의해 실시하였다. 배양 상청에 3 배량의 100 mM 인산 완충액을 첨가하고, Ni 칼럼에 첨가함으로써 가용성 scFv 를 결합시켰다. 10 mM 이미다졸을 함유하는 100 mM 인산 완충액으로 칼럼을 세정 후, 500 mM 이미다졸을 함유하는 100 mM 인산 완충액으로 가용성 scFv 를 용출시켰다.
이어서, 용출액을 인산 완충액으로 하룻밤 투석함으로써 이미다졸을 제거하고, 가용성 scFv (1 개 사슬 항체) 를 취득하였다.
(1-7) 항체의 비오틴 표지
상기로 조제한 1 개 사슬 항체 (scFv), 및 폴리클로날 항체 (PoAb) 의 비오틴 표지는 PIERCE 사의 Sulfo-NHS-LC-Biotin 표지 키트를 사용하여, 장려되고 있는 키트 조작 순서에 따라 실시하였다.
2. 측정 방법
(2-1) 혈중 항체가의 측정 (ELISA)
각 항원을 면역한 토끼 및 마우스로부터 채취한 혈청의 혈중 항체가의 확인은 하기의 ELISA 에 의해 실시하였다.
정제한 인간형 결핵균 M. tuberculosis 의 LAM (아오야마 B 주 유래, 나칼라이 테스크), 또는 정제한 비결핵성 항산균 M. avium 의 LAM (혈청형 B 주 유래, 나칼라이 테스크) 을 각각 100 ㎕/㎖ 농도가 되도록 PBS 로 조제하였다. 96 웰 마이크로 플레이트의 각 웰에 각 LAM 용액을 100 ㎕/웰의 비율로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 반응 후, 1 ％ 스킴 밀크를 함유하는 인산 완충액 중에서 블로킹을 실시하여 항원 플레이트를 제조하였다.
1 차 반응은 반응 완충액 (1 ％ BSA [소 태아 알부민], 1 ％ 스킴 밀크, 0.14 M NaCl, 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 pH 7.8 의 트리스 완충액) 으로 희석한 토끼 혈청 또는 마우스 혈청을 상기 항원 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시킴으로써 실시하였다. 이어서 미반응 항체를 3 회 세정함으로써 제거하였다. 2 차 반응은 상기 1 차 반응액에 반응 완충액으로 5,000 배 희석한 HRP 표지 항토끼 IgG (EPITOMICS 사 제조) 또는 HRP 표지 항마우스 IgG (Zymed 사 제조) 를 100 ㎕ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시킴으로써 실시하였다. 이어서, 미반응 항체를 3 회 세정함으로써 제거하였다.
발색 반응은 상기 2 차 반응물에 100 ㎕ 의 TMB [3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine] 용액을 첨가하고, 실온에서 10 분간 방치함으로써 실시하였다. 발색 후, 100 ㎕ 의 1 N 황산 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 검출은 파장 450 - 650 ㎚ 의 흡광도 (OD450-600 ㎚) 를 측정함으로써 실시하였다.
(2-2) 바이오패닝
바이오패닝은 제 1 공정 내지 제 4 공정으로 이루어지는 4 개의 공정에 의해 실시하였다.
제 1 공정 내지 제 3 공정으로서, 면역 항원 (BCG 백신 또는 H37Ra 사균체) 과 결합하는 파지 클론의 농축을 실시하였다. 반응 완충액 (1 ％ BSA, 1 ％ 스킴 밀크, 0.14 M NaCl, 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 pH 7.8 의 트리스 완충액) 으로 1 x 1011 cfu/500 ㎕ 로 조제한 scFv 디스플레이 파지 라이브러리 (「1. 재료의 조제」 의 (1-5) 참조) 를 BCG 백신 또는 H37Ra 사균체 1 ㎎ 과 혼합하고, 25 ℃ 에서 2 시간 반응하였다. 반응 후, 원심 분리 (10,000 rpm 10 분) 에 의해 집균하고, 상청을 제거하였다. 집균한 균체에 PBS 를 첨가하여 혼합한 후, 다시 원심 분리에 의해 집균함으로써 세정을 실시하였다. 세정 조작은 5 회 실시하였다. 균체에 결합한 파지는 500 ㎕ 의 용출액 (0.1 ％ BSA 를 함유하는 0.1 N HCl 용액을 1 M 글리신 용액으로 pH 2.2 로 조제) 으로 용출 후, 500 ㎕ 의 중화액 (1 M 트리스 완충액 pH 9.1) 을 첨가함으로써 중화하였다. 중화한 파지 풀은 대장균 JM109 주에 감염 후, LB-Amp/Glu 한천 배지에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하고, 콜로니를 회수하였다. LB 배지에서 OD 600 ㎚ = 0.2 가 되도록 조제한 형질 전환 대장균과 헬퍼 파지 M13K07 (Invitrogen 사 제조) (1012 cfu) 을 37 ℃ 에서 30 분간 정치 배양한 후, 100 ㎖ 의 LB-Amp/Kan 액체 배지를 첨가하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 파지 배양액은 PEG/NaCl 용액으로 농축하고, 약 1 x 1012 cfu/㎖ 농도로 인산 완충액으로 조제하였다. 균체에 의한 바이오패닝은 3 회 실시하였다.
제 4 공정으로서, M. tuberculosis 의 정제 LAM 또는 M. avium 의 정제 LAM 을 고상화한 항원 플레이트 (정제 LAM 고상화 마이크로타이터 플레이트) 를 사용한 바이오패닝을 실시하였다. 구체적으로는, 제 3 공정으로 얻어진 균체 결합 파지 풀을 정제 LAM 고상화 마이크로타이터 플레이트에 첨가하고, 25 ℃ 에서 2 시간 반응 후, 미반응 파지를 반응 완충액으로 10 회 세정함으로써 제거하였다. LAM 에 결합한 파지를 100 ㎕ 의 용출액으로 용출한 후, 100 ㎕ 의 중화액 (1 M 트리스 완충액 pH 9.1) 을 첨가함으로써 중화하였다. 중화한 파지 풀은 대장균 JM109 주에 감염 후, LB-Amp/Glu 한천 배지에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
참고예 1 LAM 에 대한 항혈청의 제조
(1) LAM 에 대한 폴리클로날 항체 (PoAb) 를 제조하기 위해, 올리고화 LAM 을 토끼에 면역하였다. 올리고화 LAM 으로서 구체적으로는, 상기 「1. 재료의 조제」 의 (1-1) 에 기재된 방법으로 면역 항원으로서 제조한 올리고화 LAM-KLH 를 사용하였다. 당해 올리고화 LAM-KLH 를 아쥬반트 (프로이드의 불완전 아쥬반트) 와 1 : 1 (올리고화 LAM-KLH : 아쥬반트 [중량비]) 의 비율로 혼합하고, 당해 혼합물을 100 ㎍, 토끼의 피하 (2 마리 : Rab-1 및 2) 에 투여하며, 그 후, 14 일 간격으로 4 회의 면역을 실시하였다. 5 회째의 면역 종료 후에 채혈을 실시하고, 상기 「2. 측정 방법」 의 (2-1) 에 기재하는 ELISA 법에 따라, 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 의 LAM 및 비결핵성 항산균 (M. Avium) 의 LAM 에 대한 혈중 항체가를 측정하였다.
M. tuberculosis 의 LAM 을 고상화한 항원 플레이트에서 평가한 결과, 피하 면역을 실시한 2 마리 (Rab-1 및 2) 에 있어서, 384,000 배 희석의 혈청으로 충분한 항체가의 상승이 확인되었다. 이들 토끼 (Rab-1 및 2) 의 항혈청은 M. Avium 의 LAM 을 고상화한 항원 플레이트에 대해서도 동일하게 결합 반응을 나타내고, 토끼 (Rab-1 및 2) 의 항혈청은 M. tuberculosis 와 M. Avium 의 양방의 LAM 에 대해 동등한 반응성을 나타내는 것이 확인되었다. 요컨대, 올리고화 LAM (올리고화 LAM-KLH) 을 면역 항원으로서 조제한 토끼의 항혈청 (폴리클로날 항체) 은 항산균의 LAM 전반에 반응하여 결핵균 LAM 에 대한 특이성은 관찰되지 않았다.
(2) 다음으로, 면역 항원으로서 BCG 백신 및 H37Ra 사균체를 각각 사용하여, 상기와 동일하게, 14 일 간격으로 4 회 토끼에 피하 면역을 실시하였다. 구체적으로는, 상기 「1. 재료의 조제」 의 (1-2) 또는 (1-3) 에 기재된 방법으로 조제한 BCG 백신 또는 H37Ra 사균체를 각각 100 ㎎ 함유하는 생리 식염수 1 ㎖ 를 1 회 면역당 전체량, 토끼에 피하 면역하였다.
2 회 면역 후의 토끼의 혈중 항체가를 상기와 동일하게, 「2. 측정 방법」 의 (2-1) 에 기재하는 ELISA 법에 의해 측정하였다. 구체적으로는, BCG 백신 및 H37Ra 사균체를 각각 면역한 토끼로부터 제조한 혈청의 항체가를 정제된 M. tuberculosis 의 LAM 및 M. avium 의 LAM 을 각각 고상화한 항원 플레이트를 사용하여 평가하였다. 면역 항원으로서 BCG 백신을 사용했을 경우의 결과를 도 3(A) 에, H37Ra 사균체를 사용했을 경우의 결과를 도 3(B) 에 나타낸다. 각 도면 중, 「-■-」 는 M. tuberculosis 의 LAM 에 대한 반응성, 「-●-」 는 M. avium 의 LAM 에 대한 반응성을 나타낸다.
도 3 에 나타내는 바와 같이, BCG 백신 및 H37Ra 사균체는 모두 농도 의존적으로 LAM 에 대해 유의하게 항체가가 상승하는 것이 확인되었다. 또, M. tuberculosis 와 M. avium 중 어느 쪽의 LAM 에 대해서도 동등한 반응성을 나타냈다.
이상과 같이, 올리고화 LAM, BCG 백신 및 H37Ra 사균체를 각각 면역 항원으로 했을 경우, 이들 항원에 대한 항혈청 (폴리클로날 항체) 은 모두 항산균의 LAM 전반에 반응하여, 결핵균 LAM 에 대한 특이성은 관찰되지 않았다.
실시예 1 LAM 에 대한 1 개 사슬 항체 (scFv) 의 제조
(1) LAM 에 대한 scFv 의 제조
참고예 1 에 있어서, 올리고화 LAM, BCG 백신 또는 HR37Ra 사균체의 각각에서 면역한 토끼로부터 채취한 비장의 세포로부터 1 개 사슬 항체 scFv 를 단리하였다.
구체적으로는, 「1. 재료의 조제」 의 (1-5) 에 기재하는 방법에 따라, 각 토끼의 비장으로부터 Total RNA 를 조제하고, 이것으로부터 합성한 cDNA 를 주형으로 하여, 표 1 에 기재하는 각종 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시함으로써, VH 유전자 증폭 산물 및 VL 유전자 증폭 산물을 조제하였다.
이어서 VH 유전자와 VL 유전자를 GS 링커 (GGGGSGGGGSGGGGS : 배열 번호 11) 를 개재하여 접합한 scFv 유전자 (VH 유전자/GS 링커/VL 유전자) 를 제조하고, 이것으로부터 「1. 재료의 조제」 의 (1-5) 에 기재하는 방법에 따라, scFv 디스플레이 파지 라이브러리를 제조하였다. 각 라이브러리의 타이터는 약 106 cfu 인 점에서, 106 개의 다양성을 가진 라이브러리라고 추측할 수 있다.
BCG 백신을 면역한 토끼의 비장 세포로부터 제조한 scFv 디스플레이 파지 라이브러리는, 항원으로서 BCG 백신을 사용한 바이오패닝 (「2. 측정 방법」 의 (2-2) 참조) 을 3 회 실시한 후에, 4 회째에 M. tuburculosis 의 LAM 을 고상화한 마이크로 플레이트를 사용하여 바이오패닝을 실시하였다.
동일하게, HR37Ra 사균체를 면역한 토끼의 비장 세포로부터 제조한 scFv 디스플레이 파지 라이브러리는, 항원으로서 H37Ra 사균체에 의한 바이오패닝을 3 회 실시한 후에, 4 회째에 M. tuburculosis 의 LAM 을 고상화한 마이크로 플레이트에 의한 바이오패닝을 실시하였다.
최종적으로 얻어진 각 패닝 풀로부터 200 클론을 무작위로 선택하여 LAM 반응성 클론을 스크리닝하였다. 그 결과, 각 라이브러리로부터 각각 약 10 클론 정도의 LAM 반응성 클론이 얻어졌다.
염기 배열을 해석한 결과, 각 라이브러리로부터 얻어진 클론의 염기 배열은 거의 일치하고 있는 것이 확인되었다.
이상의 조작에 의해, BCG 백신을 면역한 토끼의 비장 세포의 scFv 디스플레이 파지 라이브러리 및 HR37Ra 사균체를 면역한 토끼의 비장 세포의 scFv 디스플레이 파지 라이브러리로부터, 각각 1 클론의 scFv (1 개 사슬 항체) 를 단리하는 것에 성공하였다.
HR37Ra 사균체를 면역한 토끼의 비장 세포로부터 제조한 1 개 사슬 항체 scFv (Myco-scFv) 의 아미노산 배열 (배열 번호 30) 및 BCG 백신을 면역한 토끼의 비장 세포로부터 제조한 1 개 사슬 항체 scFv (TB-scFv) 의 아미노산 배열 (배열 번호 12) 을, 중사슬 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역 ; GS 링커 ; 및 경사슬 가변 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역의 위치와 함께 도 4 에 나타낸다.
(2) scFv 의 LAM 반응성
BCG 백신을 면역한 토끼의 비장 세포로부터 조제한 scFv 디스플레이 파지 라이브러리로부터 얻어진 1 개 사슬 항체 scFv (TB-scFv), 및 HR37Ra 사균체를 면역한 토끼의 비장 세포로부터 조제한 scFv 디스플레이 파지 라이브러리로부터 얻어진 1 개 사슬 항체 scFv (Myco-scFv) 의 각각에 대해 LAM 에 대한 반응성을 평가하였다.
구체적으로는 먼저, 각 1 개 사슬 항체 scFv (TB-scFv, Myco-scFv) 를 「1. 재료의 조제」 의 (1-6) 에 기재하는 방법에 따라 가용화하여 가용성 scFv 를 조제하였다. 이어서, 이들을 동 (1-7) 에 기재하는 방법에 따라 비오틴 표지하고, 정제한 M. tuberculosis 및 M. avium 의 LAM 을 각각 고상화한 항원 플레이트 (정제 LAM 고상화 마이크로타이터 플레이트) 에 대한 반응성을 「2. 측정 방법」 의 (2-1) 에 기재하는 ELISA 법에 의해 측정하여 평가하였다.
1 개 사슬 항체 TB-scFv 와, M. tuberculosis 의 LAM (-■-) 및 M. avium 의 LAM (-●-) 의 각각의 반응성을 도 5 에 나타낸다. 도 5 에 나타내는 바와 같이, TB-scFv 를 1000 ng/㎖, 500 ng/㎖, 250 ng/㎖, 125 ng/㎖, 62.5 ng/㎖, 31.25 ng/㎖, 15.625 ng/㎖, 및 7.8125 ng/㎖ 의 농도로 LAM 을 고상화한 항원 플레이트에서, M. tuberculosis 의 LAM 및 M. avium 의 LAM 을 반응시킨 결과, M. tuberculosis 의 LAM (-■-) 에 대해서는, TB-scFv 250 ng/㎖ 농도에서 OD 값 (450 ㎚) 이 3 을 초과하여 반응이 최대값에 이르고 있는 데에 반해, M. avium 의 LAM (-●-) 에는, TB-scFv 1000 ng/㎖ 농도에서도 OD 값 (450 ㎚) 은 2 정도로 반응이 최대값에 이르지 않은 것이 확인되었다. 한편, 결과는 나타내지 않지만, Myco-scFv 는 M. tuberculosis 와 M. avium 의 양방의 LAM 에 대해 거의 동등한 반응성을 나타냈다.
이상의 결과로부터, BCG 백신을 면역원으로서 조제된 1 개 사슬 항체 TB-scFv 는, 인간형 결핵균 M. tuberculosis 의 LAM 에 대해, 비결핵성 항산균 M. avium 의 LAM 보다 강한 반응성을 가진 특이적 항체인 것이 확인되었다.
실시예 2 LAM 검출 ELISA 의 구축
참고예 1 및 실시예 1 로 제조한 항체 3 종류 (올리고화 LAM 면역 토끼 폴리클로날 항체 (이하, 「Myco-Poly」 라고 한다) (참고예 1), H37Ra 사균체 면역 토끼 모노클로날 항체 (Myco-svFv) 및 BCG 백신 면역 토끼 모노클로날 항체 (TB-scFv) (이상, 실시예 1)) 의 특징을 표 2 에 정리하였다.
Figure pct00002
이들 각 항체의 반응 특이성을 기초로 각 항체를 조합하여, 항산균 LAM 검출용 ELISA 와 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 2 종류를 구축하였다.
(1) 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 제조
항산균 LAM 검출용 ELISA 의 구축은 포착용 항체로서 Myco-Poly 를 플레이트에 고상화하고, 또 검출용 항체로서 Myco-scFv 를 비오틴 표지하여 사용하였다.
Myco-poly 를 10 ㎍/㎖ 농도로 인산 완충액으로 조제하였다. 96 웰 마이크로 플레이트에 100 ㎕/웰의 비율로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 반응 후, 1 ％ 스킴 밀크를 함유하는 인산 완충액 중에서 블로킹을 실시함으로써 항체 플레이트를 제조하였다.
1 차 반응은 반응 완충액 (1 ％ BSA, 1 ％ 스킴 밀크, 0.14 M NaCl, 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 pH 7.8 의 트리스 완충액) 으로 희석한 항산균을 함유할 수 있는 피험 시료를, 상기 항체 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 씩 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응 후, 3 회 세정을 실시하였다. 2 차 반응은 반응 완충액으로 5,000 배 희석한 비오틴 표지-항 Myco-scFv 를 상기 항체 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 씩 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응 후, 3 회 세정함으로써 미반응 항체를 제거하였다. 3 차 반응은 반응 완충액으로 10,000 배 희석한 아비딘 표지 HRP (MILLIPORE 사 제조) 를 100 ㎕ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응 후, 3 회 세정함으로써 미반응 아비딘 표지 HRP 를 제거하였다.
발색 반응은 각 웰에 100 ㎕ 의 TMB 용액을 첨가하고, 실온에서 10 분간 방치함으로써 실시하며, 발색 후, 100 ㎕ 의 1 N 황산 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 발색 강도의 검출은 파장 450 - 650 ㎚ 의 흡광도를 측정함으로써 실시하였다.
(2) 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 제조
결핵균 LAM 검출 ELISA 는 포착용 항체 및 검출용 항체 모두 TB-scFv 를 사용하여 구축하였다. 포착용 항체 및 검출용 항체로서 TB-scFv 를 사용하는 것 이외에는, 상기 (1) 과 동일하게 하여 결핵균 LAM 검출 ELISA 를 제조하였다.
(3) 각 LAM 검출용 ELISA 의 평가
(1) 및 (2) 로 각각 제조한 항산균 LAM 검출 ELISA 및 결핵균 LAM 검출 ELISA 의 LAM 에 대한 반응성을, 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 의 정제 LAM 및 항산균 (M. avium) 의 정제 LAM 을 사용하여 평가하였다.
결과를 도 6 에 나타낸다. 도면 중, ● 는 항산균 LAM 검출 ELISA 의 M. tuberculosis LAM 에 대한 반응성, ■ 는 항산균 LAM 검출 ELISA 의 M. avium 에 대한 반응성, ○ 는 결핵균 LAM 검출 ELISA 의 M. tuberculosis LAM 에 대한 반응성, □ 는 결핵균 LAM 검출 ELISA 의 M. avium LAM 에 대한 반응성을 나타낸다.
도 6 으로부터 알 수 있는 바와 같이, 항산균 LAM 검출용 ELISA 는 M. tuberculosis 의 LAM (-■-) 및 M. avium 의 LAM (-●-) 모두 동등하게 검출하는 것이 가능하였다. 한편, 결핵균 LAM 검출용 ELISA 는 결핵균 (M. tuberculosis) 의 LAM 에 대해서는 100 ng/㎖ 로 OD 값 (450 ㎚) 이 3 이상이 되어 반응이 거의 최대값에 이르고 있는 데에 반해, 항산균 (M. avium) 의 LAM 에 대해서는 100 ng/㎖ 농도에서도 대부분 반응성을 나타내지 않는 것이 확인되었다.
실시예 3 항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 항산균 및 결핵균의 LAM 에 대한 항체 반응성의 평가 (항산균 임상 분리주 사용)
실시예 2 로 구축한 항산균 LAM 검출용 ELISA 와 결핵균 LAM 검출용 ELISA 를 사용하여, 항산균 및 결핵균의 LAM 에 대한 항체 반응성을 도 7 에 나타내는 각종 항산균 임상 분리주를 사용하여 평가하였다.
구체적으로는, 항산균 임상 분리주로서, M. tuberculosis 38 주 (도 7 의 A 표 및 B 표 참조) 의 배양액, 및 MAC 증의 기인균인 M. avium 23 주와 M. intracellulare 6 주 (도 7 의 C 표 및 D 표 참조) 의 배양액을 사용하였다. 각 항산균 임상 분리주를 액체 배지 (10 ％ ADC Enrichment : BD 사 제조를 함유하는 7H9 Broth : BD 사 제조) 에서 컨플루언트까지 37 ℃ 에서 배양하고, 배양액을 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.
동결 보존한 배양액을 융해한 후, 등량의 Y-PER (단백 추출 시약 : Thermo 사 제조) 과 혼합한 후, 95 ℃ 에서 10 분간 가열 처리를 실시하였다. 원심 분리 (10,000 rpm, 10 분) 에 의해 집균한 후, 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 4 배량의 반응 완충액 (1 ％ 스킴 밀크, 0.5 ％ BSA, 0.05 ％ Tween 20, 및 0.1 ％ XL-II 를 함유하는 인산 완충액) 을 첨가하고, 100 ㎕ 를 실시예 2 로 구축한 항산균 LAM 검출용 ELISA 와 결핵균 LAM 검출용 ELISA 에 제공하여 LAM 에 대한 항체 반응성을 측정하였다.
ELISA 에 의한 측정 결과는 표준품으로서 사용한 정제 M. tuberculosis 의 LAM 에 대한 항체 반응성과 비교함으로써 값 부여를 실시하였다. 결과를 도 7 에 나타낸다.
도 7 에 나타내는 바와 같이, 항산균 LAM 검출용 ELISA (도 7 의 각 표 중, 「myco」 에 기재된 열 참조) 에서는, M. tuberculosis 38 주, M. avium 23 주, M. intracellulare 6 주 모두에 반응성을 나타냈다. 한편, 결핵균 LAM 검출용 ELISA (도 7 의 각 표 중 「TB」 에 기재된 열 참조) 는, M. tuberculosis 38 주 중 34 주로, 높은 비율로 반응성을 나타냈지만, M. avium 23 주 및 M. intracellulare 6 주에는 전혀 반응성을 나타내지 않았다.
이와 같이, 실시예 2 로 구축한 항산균 LAM 검출용 ELISA 는 항산균의 LAM 과의 반응성이 우수하고, 항산균의 LAM 을 넓게 검출할 수 있는 것이 판명되었다. 이에 대해, 실시예 2 로 구축한 결핵균 LAM 검출용 ELISA 는 주간 (株間) 에 있어서의 반응성에 차이가 있어, 항산균 LAM 검출용 ELISA 에 비해 반응이 특이적이었다. 요컨대, 실시예 2 로 구축한 결핵균 LAM 검출용 ELISA 는 결핵균의 LAM 을 특이적으로 검출하며, 감도는 90 ％, 특이도는 100 ％ 로 양호한 결과를 나타냈다.
이상의 결과로부터, 실시예 2 로 구축한 항산균 LAM 검출용 ELISA (포착 항체 : Myco-Poly, 검출용 항체 : Myco-scFv) 에 의하면, 넓게 항산균의 LAM 을 검출하는 것이 가능하고, 또 실시예 2 로 구축한 결핵균 LAM 검출용 ELISA (포착 항체 : TB-scFv, 검출용 항체 : TB-scFv) 에 의하면, 비결핵성 항산균의 LAM 과 구별하여 결핵균의 LAM 을 특이적으로 검출하는 것이 가능하다는 것이 확인되었다.
실시예 4 LAM 검출용 이뮤노크로마토법의 구축
ELISA 에 의해 평가한 항체의 조합을 사용하여, 항산균 LAM 검출용과 결핵균 LAM 검출용의 이뮤노크로마토 테스트의 구축을 실시하였다.
(1) 항산균 LAM 검출용 이뮤노크로마토법
항산균 LAM 검출용 이뮤노크로마토 테스트의 구축에는, 포착용 항체로서 Myco-Poly 를 니트로셀룰로오스막에 고상화하고, 또 검출용 항체로서 Myco-scFv 를 금 콜로이드 표지하여 사용하였다.
니트로셀룰로오스막 (Millipore 사 제조 : 캐필러리 플로우 타임 240) 에, Myco-Poly (포착용 항체) 를 3.0 ㎎/㎖ (인산 완충액) 의 농도로 도포하고, 50 ℃ 에서 20 시간 건조시켰다. 흡수 패드를 니트로셀룰로오스 기판에 첩부 (貼付) 한 이뮤노크로마토스트립은 라미네이트 시일을 붙이고, 4 ㎜ 폭으로 절단하여 1 테스트용의 스트립으로 하였다.
Myco-scFv 의 금 콜로이드 표지에는 40 ㎚ 사이즈의 금 콜로이드를 사용하였다. 금 콜로이드 (OD = 1) 에 Myco-scFv 를 2.0 ㎍/㎖ 농도로 첨가하고, 20 분간 실온에서 반응시켰다. 항체 결합시의 완충액은 2 mM TES [N-Tris(hydroxy methyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid] (pH 7.5) 를 사용하였다. 금 콜로이드 표지 후, 2 mM Borax [Sodium Tetraborate Decahydrate], 1.5 ％ BSA (pH 9.0) 에서 300 rpm, 5 분간, 실온에서 반응함으로써 블로킹을 실시하였다. 블로킹 조작 후, 4620 × g, 20 분간, 4 ℃ 에서 원심 분리를 실시하여 상청을 제거하였다. 얻어진 침사를 금 콜로이드 표지 항체 희석 용액 (10 mM Borax, 5 ％ Sucrose, 1 ％ BSA (pH 9.0)) 에 현탁한 후, 0.1 ㎛ 필터로 여과하였다.
측정 방법은, 추출액 (72 mM 인산 2 수소나트륨 2 수화물, 4.5 ％ 알부민 소 혈청 유래, 0.9 ％ 카세인, 0.09 ％ Triton X-305, 0.1 ％ 아지화나트륨, 10.0 ％ Y-PER, 수산화나트륨 적당량, 염산 적당량, pH 7.0) 으로, 항산균을 함유할 수 있는 피험 시료를 희석한 후, 금 콜로이드 표지 항체 용액을 적당량 첨가하고, 이것에 상기로 제조한 스트립을 삽입하여 피험 시료를 전개하였다. 전개 개시 후 7 분에 스트립을 옮기고, 계면 활성제 (0.1 ％ Tween 20) 를 함유하는 인산 완충액으로 세정 조작을 8 분간 실시한 후, 양성·음성의 판정을 육안으로 실시하였다.
(2) 결핵균 LAM 검출용 이뮤노크로마토법
결핵균 LAM 검출용 이뮤노크로마토는 포착용 항체 및 검출용 항체 모두 TB-scFv 를 사용하여 구축하였다. 그 이외의 구축 방법 및 측정 방법은 상기 (1) 의 항산균 LAM 검출용 이뮤노크로마토 테스트의 구축 방법 및 측정 방법과 동일하게 하여 실시하였다.
(3) 각 LAM 검출용 이뮤노크로마토법의 평가
(1) 및 (2) 로 각각 제조한 항산균 LAM 검출용 이뮤노크로마토 및 결핵균 LAM 검출용 이뮤노크로마토의 LAM 에 대한 반응성을, 정제한 M. tuberculosis 의 LAM 및 M. avium 의 LAM 을 사용하여 평가하였다.
결과를 도 8 에 나타낸다.
M. tuberculosis 의 LAM 을 항산균 LAM 검출용 및 결핵균 LAM 검출용의 이뮤노크로마토법으로 측정한 결과, 모두 테스트에 있어서도, 라인을 육안으로 확인할 수 있었다 (myco : 항산균 LAM 검출용, TB : 결핵균 LAM 검출용) (도 A 및 B). 동일하게, M. avium 의 LAM 을 양 검출계로 측정한 결과, 항산균 LAM 검출용 이뮤노크로마토 테스트 (myco) 는, 도 C 및 D 에 나타내는 바와 같이, M. tuberculosis 의 LAM 을 측정했을 경우와 동등한 라인을 육안으로 확인할 수 있었다. 한편, 결핵균 LAM 검출용 이뮤노크로마토법 (TB) 에서는, 1000 ng/㎖ 의 고농도에 있어서도 라인은 검출되지 않았다 (도 D).
이상의 결과로부터, BCG 백신을 면역원으로서 조제한 1 개 사슬 항체 TB-scFv 는 이뮤노크로마토 테스트에 있어서도 인간형 결핵균 (M. tuberculosis) 의 LAM 을 특이적으로 검출하는 것이 가능하다는 것이 나타났다.
이상의 실시예 1 ∼ 4 에 나타내는 바와 같이, 이번에 결핵균의 LAM 에 특이적으로 반응하는 1 개 사슬 항체 (scFv (TB-scFv)) 를 단리하고, 당해 TB-scFv 에서 LAM 을 측정함으로써, 결핵균의 LAM 을 특이적으로 검출할 수 있는 측정계의 확립에 성공하였다. TB-scFv 를 사용한 측정계는 ELISA 나 이뮤노크로마토 테스트에 응용할 수 있어, 간편·신속한 결핵 감염증의 진단을 가능하게 한다고 생각된다.
[실시예 5 ∼ 12]
3. 재료의 조제
(3-1) BCG 백신, 및 면역 항원의 조제
BCG 백신으로서, 닛폰 BCG 제조 (주) 제조의 동결 건조 BCG 백신 (승인 번호 20300AMZ00767000) 을 사용하였다. 면역에는, 당해 동결 건조 BCG 백신 100 ㎎ (습중량) 에 생리 식염수 1 ㎖ 를 첨가하여 혼합한 것을 사용하였다.
(3-2) 닭 scFv 파지 라이브러리의 제조
면역 항원으로서 BCG 백신을 사용하여 닭을 면역하였다 (상기 (3-1) 및 실시예 6 참조). 면역 종료 후, 닭으로부터 비장을 적출하고, RPMI (무혈청) 배지 중에서 조직을 용해하여 Total RNA 를 추출하였다. Total RNA 의 추출은 RNA 추출 키트 (QIAGEN 사) 를 사용하여 조작 순서서에 따라 실시하였다. 또, Total RNA 로부터의 cDNA 합성은 cDNA 합성 키트 (Invitrogen 사) 를 사용하여 조작 순서서에 따라 실시하였다.
합성한 cDNA 를 주형으로 하여, 표 3 에 기재하는 프라이머를 사용하여 VH 유전자 단편 및 VL 유전자 단편을 증폭시켰다. 구체적으로는, VH 유전자 단편은 Sfi1-CκVH F 와 GSL-CκVH R 의 프라이머 세트에 의해, VL 유전자 단편은 GSL-CκVL F 와 Not1-CκVL R 의 프라이머 세트에 의해 각각 증폭시켰다.
Figure pct00003
얻어진 유전자 증폭 산물은 1.5 ％ 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리하여, 목적 분자량의 유전자 증폭 산물을 겔로부터 추출하여 정제하였다.
정제한 VH 유전자 산물 및 VL 유전자 산물을 GS 링커 (배열 번호 40) 에 의해 접합하였다. VH 유전자 산물의 3' 말단에 상동성 배열을 갖는 CκVL-GSL-VH R (배열 번호 46) 과 VH 유전자를 혼합하고, PCR 을 5 사이클 실시함으로써 VH 유전자의 3' 말단에 GS 링커를 부가하였다. 동일하게, VL 유전자 산물의 5' 말단에 상동성 배열을 갖는 CκVH-GSL-VL F (배열 번호 45) 와 VL 유전자를 혼합하고, PCR 을 5 사이클 실시함으로써 VL 유전자의 5' 말단에 GS 링커를 부가하였다. GS 링커를 부가한 VH 유전자와 VL 유전자를 혼합하고, PCR 을 10 사이클 실시함으로써 VH 유전자/GS 링커 유전자/VL 유전자를 접합한 scFv 유전자 (닭 scFv 유전자) 를 제조하였다. 최종적으로 제한 효소 Sfi I 및 Not I 를 사용하여 절단하였다.
이어서 제한 효소에 의해 처리한 scFv 유전자를 항체 디스플레이용 파지미드 벡터 pCANTAB5E 의 Sfi-I 및 Not-I 부위에 삽입하고, 대장균 JM109 주에 일렉트로포레이션법에 의해 형질 전환한 후, LB-Amp/Glu 한천 배지 (150 ㎍/㎖ 암피실린, 1 ％ 글루코오스, 1.5 ％ 한천을 함유하는 LB 배지) 에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하고, 생성한 콜로니를 모두 회수하였다.
당해 형질 전환 대장균을 파장 600 ㎚ 의 흡광도 (OD600 ㎚) 가 0.2 가 되도록 LB 배지에서 조제한 후, 헬퍼 파지 M13K07 (1012 cfu) 과 혼합하여, 37 ℃ 에서 30 분간 정치 배양한 후, 추가로 1 ℓ 의 LB-Amp/Kan 액체 배지 (150 ㎍/㎖ 암피실린, 100 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지) 에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양함으로써, 닭의 scFv 디스플레이 파지 라이브러리를 제조하였다.
최종적으로, 이 scFv 디스플레이 파지 라이브러리는, PEG/NaCl 용액으로 농축하여, 약 1 x 1012 cfu/㎖ 농도가 되도록 PBS 로 조제하여 바이오패닝에 사용하였다.
(3-3) 닭 scFv 라이브러리를 사용한 항원 바이오패닝
항원 바이오패닝은 제 1 공정 내지 제 4 공정으로 이루어지는 4 개의 공정에 의해 실시하였다.
제 1 공정 내지 제 3 공정으로서, 면역 항원 (BCG 백신) 과 결합하는 파지 클론의 농축을 실시하였다. 반응 완충액 (1 ％ BSA, 1 ％ 스킴 밀크, 0.14 M Nacl, 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 pH 7.8 의 트리스 완충액) 으로 1 x 1011 cfu/500 ㎕ 로 조제한 닭 scFv 디스플레이 파지 라이브러리 (「3. 재료의 조제」 의 (3-2) 참조) 를 BCG 백신 1 ㎎ 과 혼합하여, 25 ℃ 에서 2 시간 반응하였다. 반응 후, 원심 분리 (10,000 rpm 10 분) 에 의해 집균하고, 상청을 제거하였다. 집균한 균체에 PBS 를 첨가하여 혼합한 후, 다시 원심 분리에 의해 집균함으로써 세정을 실시하였다. 세정 조작은 5 회 실시하였다. 균체에 결합한 파지는, 500 ㎕ 의 용출액 (0.1 ％ BSA 를 함유하는 0.1 N HCl 용액을 1 M 글리신 용액으로 pH 2.2 로 조정) 으로 용출 후, 500 ㎕ 의 중화액 (1 M 트리스 완충액 pH 9.1) 을 첨가함으로써 중화하였다. 중화한 파지 풀은 대장균 JM109 주에 감염 후, LB-Amp/Glu 한천 배지에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하고, 콜로니를 회수하였다. LB 배지에서 OD600 ㎚ = 0.2 로 조제한 형질 전환 대장균과 헬퍼 파지 M13K07 (1012 cfu) 을 37 ℃ 에서 30 분간 정치 배양한 후, 100 ㎖ 의 LB-Amp/Kan 액체 배지를 첨가하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 파지 배양액은, PEG/NaCl 용액으로 농축하고, 약 1 x 1012 cfu/㎖ 농도로 인산 완충액으로 조제하였다. 균체에 의한 바이오패닝은 3 회 실시하였다.
제 4 공정으로서, TB-scFv 를 고상화한 플레이트에 M. tuberculosis 의 정제 LAM 을 반응시켜, TB-scFV 와 LAM 의 복합체를 사용한 바이오패닝을 실시하였다. TB-scFv 를 5 ㎍/㎖ 농도로 고상화한 마이크로 플레이트에 M. tuberculosis 의 정제 LAM 을 10 ㎍ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 세정 후에, 제 3 공정으로 얻어진 균체 결합 파지 풀을 첨가하고, 25 ℃ 에서 2 시간 반응시키며, 이어서, 미반응 파지를 반응 완충액으로 10 회 세정함으로써 제거하였다. TB-scFv 와 LAM 의 복합체에 결합한 파지를 100 ㎕ 의 용출액으로 용출한 후, 100 ㎕ 의 중화액 (1 M 트리스 완충액 pH 9.1) 을 첨가함으로써 중화하였다. 중화한 파지 풀은, 대장균 JM109 주에 감염 후, LB-Amp/Glu 한천 배지에서 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다.
(3-4) LAM 결합 닭 scFv 클론의 선택
LAM 결합 scFv 는 LAM 에 특이적으로 반응하는 파지 클론의 선택을 파지 ELISA 법에 의해 실시하였다. 상기 (3-3) 에서 설명하는 닭 scFv 라이브러리를 사용한 항원 바이오패닝의 제 4 공정으로 얻어진 파지 풀을 단일 콜로니로서 배양하고, 얻어진 단일 콜로니를 50 ㎕ 의 LB-Amp 배지에서 37 ℃ 에서 8 시간 배양하였다. 이것에 50 ㎕ 의 헬퍼 파지 M13K07 (1012 cfu/㎖) 액을 감염시킨 후, 400 ㎕ 의 LB-Amp/Kan 액체 배지를 첨가하고 37 ℃ 에서 하룻밤 배양하여, 단일 파지 클론의 배양액을 제조하였다.
파지 ELISA 는 TB-scFv 를 5 ㎍/㎖ 농도로 고상화한 마이크로 플레이트에 M. tuberculosis 의 정제 LAM 을 10 ㎍ 첨가하고 25 ℃ 에서 1 시간 반응시켜, TB-scFv 와 LAM 의 복합체를 형성시키고, 당해 복합체에 반응하는 클론을 스크리닝함으로써 실시하였다. 1 차 반응은 90 ㎕ 의 반응 완충액 (1 ％ BSA, 1 ％ 스킴 밀크, 0.05 ％ Tween 20 을 함유하는 인산 완충액) 과 10 ㎕ 의 scFv 디스플레이 파지 배양액을 LAM 고상화 플레이트에 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응함으로써 실시하며, 이어서 미반응 파지를 3 회 세정하여 제거하였다. 2 차 반응은 상기 1 차 반응액에 상기와 동일한 반응 완충액으로 5,000 배 희석한 HRP 표지 항 M13 파지 p8 단백질 항체를 100 ㎕ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시킴으로써 실시하였다. 이어서 미반응 항체를 3 회 세정하여 제거하였다. 발색 반응은 2 차 반응액에 100 ㎕ 의 TMB 용액을 첨가하고, 실온에서 10 분간 반응시킴으로써 실시하며, 발색한 후, 100 ㎕ 의 1 N 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 검출은 파장 450 - 650 ㎚ 의 흡광도 (OD450-650 ㎚) 를 측정함으로써 실시하였다.
LAM 에 반응성을 갖는 클론을 PCR 함으로써 scFv 유전자를 증폭시켜, 다이렉트 시퀀스법에 의해 유전자 배열을 결정하였다.
(3-5) 2 가 항체를 사용한 ELISA 의 평가에 사용하는 검체
2 가 항체를 사용한 항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 평가는, 항산균 임상 분리주 (M. tuberculosis 38 주, M. avium 23 주, M. intracellulare 6 주) 에 더하여, BCG, 구강 내 세균 6 종류 (N. asteroids, N. farcinica, S. globisporus, C albicans, A. israelii, T. paurometabolum), 및 객담 검체 (54 예) 를 사용하여 실시하였다. 배양 균체 및 객담 검체로부터의 LAM 추출은 모두 동일 조건으로 실시하였다. 샘플에 최종 농도가 0.4 M 이 되도록 NaOH 를 첨가하여 혼합한 후, 30 분간 자비하였다. 자비 후에 인산 완충액을 첨가하여 중화하였다.
4. 측정 방법
(4-1) 2 가 항체의 제조
1 개 사슬 항체 scFv 로부터 2 가 항체로의 개변은 일반적 수법에 의해 실시하였다. 토끼 정상 영역을 갖는 포유 동물 세포 발현 벡터 (상품명 ; pFUSEss-CHIg-rG*03 및 pFUSE2ss-CLIg-rk1, InvivoGen 사 제조) 에, VH 영역 유전자 및 VL 영역 유전자를 Myc0-scFv (배열 번호 30), TB-scFv (배열 번호 12), 및 G3-scFv (배열 번호 39) 로부터 각각 클로닝하여, VH 발현 벡터 및 VL 발현 벡터를 제조하였다. VH 발현 벡터와 VL 발현 벡터를 혼합하여 CHO 세포에 도입하였다. 당해 벡터 도입 세포를 4 일간 배양한 후에 배양 상청을 회수하고, 배양 상청으로부터 Protein A (Biorad 사 제조) 를 사용하여, 각각 2 가 항체 (2 가 Myco-scFv, 2 가 TB-scFv, 및 2 가 G3-scFv) 를 단리 정제하였다.
(4-2) 2 가 항체의 비오틴 표지
2 가 항체의 비오틴 표지는 PIERCE 사의 Sulfo-NHS-LC-Biotin 표지 키트를 사용하여, 키트에 부속된 조작 순서서의 기재에 따라 실시하였다. 비오틴 표지화 항체는 ELISA 측정계의 구축에 사용하였다.
(4-3) 2 가 항체를 사용한 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 구축
2 가 항체에 의한 항산균 LAM 검출용 ELISA 는 2 가 TB-scFv, 2 가 G3-scFv, 및 2 가 Myco-scFv (「2 가 항체의 제조」 의 (4-1) 참조) 를 사용하여 구축하였다.
2 가 TB-scFv 와 2 가 G3-scFv 를 동량 혼합하고, 5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 인산 완충액으로 조제하였다. 이것을 96 웰 마이크로 플레이트에 100 ㎕/웰의 비율로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 반응한 후, 1 ％ 스킴 밀크를 함유하는 인산 완충액 중에서 블로킹을 실시함으로써 상기 2 가 항체를 고상화한 항체 플레이트를 제조하였다.
1 차 반응은 상기의 항체 플레이트의 웰에 반응 완충액 (1 ％ BSA, 1 ％ 스킴 밀크, 0.14 M Nacl, 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 pH 7.8 의 트리스 완충액) 으로 희석한 샘플을 100 ㎕ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 30 분 반응시킴으로써 실시하며, 이어서 3 회의 세정을 실시하였다. 2 차 반응은 상기 1 차 반응액에 상기와 동일한 반응 완충액으로 5,000 배 희석한 비오틴 표지 2 가 Myco-scFv 를 100 ㎕ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 30 분 반응시킴으로써 실시하며, 이어서, 미반응 항체를 3 회 세정하여 제거하였다. 3 차 반응은 상기 2 차 반응물에 상기와 동일한 반응 완충액으로 10,000 배 희석한 아비딘 표지 HRP 를 100 ㎕ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 30 분 반응시킴으로써 실시하며, 이어서 미반응 아비딘 표지 HRP 를 3 회 세정하여 제거하였다. 발색 반응은 3 차 반응물에 100 ㎕ 의 TMB 용액을 첨가하고, 실온에서 10 분간 반응시킴으로써 실시하였다. 발색 후, 100 ㎕ 의 1 N 황산 용액으로 반응을 정지시켰다. 검출은 파장 450 - 650 ㎚ 의 흡광도 (OD450-650 ㎚) 를 측정함으로써 실시하였다.
(4-4) 2 가 항체를 사용한 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 구축
2 가 항체에 의한 결핵균 LAM 검출용 ELISA 는 포착용 항체에 2 가 TB-scFv 를 사용하고, 검출 항체에는 비오틴 표지한 2 가 Myco-scFv 를 사용하였다. 포착용 항체로서 2 가 TB-scFv, 검출 항체로서 비오틴 표지 2 가 Myco-scFv 를 사용하는 것 이외에는, 상기 (4-3) 에 기재하는 항산균 LAM 검출용 ELISA 와 동일하게 하여 결핵균 LAM 검출용 ELISA 를 구축하였다.
실시예 5 닭에 대한 면역, 및 LAM 에 대한 닭 항혈청의 항체가 평가
닭에 대한 면역은 「3. 시료의 조제」(3-1) 에 기재하는 방법으로 조제한 BCG 백신 (100 ㎎ 습중량/1 ㎖ 생리 식염수) 을 전체량 피하 면역함으로써 실시하였다. 14 일 간격으로 4 회의 면역을 실시한 후, 닭의 혈중 항체가를 ELISA 에 의해 평가하였다.
정제한 인간형 결핵균 M. tuberculosis 의 LAM (아오야마 B 주 유래, 나칼라이 테스크), 또는 정제한 M. avium 의 LAM (혈청형 B 주 유래, 나칼라이 테스크) 을 100 ㎕/㎖ 농도가 되도록 PBS 로 조정하였다. 이것을 96 웰 마이크로 플레이트에 100 ㎕/웰의 비율로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 반응 후, 1 ％ 스킴 밀크를 함유하는 인산 완충액 중에서 블로킹을 실시함으로써 항원 플레이트를 제조하였다.
1 차 반응은 반응 완충액 (1 ％ BSA, 1 ％ 스킴 밀크, 0.14 M Nacl, 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 pH 7.8 의 트리스 완충액) 으로 희석한 닭 혈청을 상기 항원 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 씩 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시킴으로써 실시하며, 이어서 미반응 항체를 3 회 세정하여 제거하였다. 2 차 반응은 상기 1 차 반응액에, 상기와 동일한 반응 완충액으로 5,000 배 희석한 HRP 표지 항닭 IgY 를 100 ㎕ 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시킴으로써 실시하며, 이어서 미반응 항체를 3 회 세정하여 제거하였다. 발색 반응은 100 ㎕ 의 TMB 용액을 첨가하여 실온에서 10 분간 반응시킴으로써 실시하고, 발색 후, 100 ㎕ 의 1 N 황산 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 검출은 파장 450 - 650 ㎚ 의 흡광도 (OD450-650 ㎚) 를 측정함으로써 실시하였다.
결과를 도 9 에 나타낸다. 도면 중, 「-■-」 는 닭 항혈청의 정제 M. tuberculosisLAM 에 대한 반응성, 「-●-」 는 닭 항혈청의 정제 M. avium LAM 에 대한 반응성을 나타낸다. 도 9 에 나타내는 바와 같이, BCG 백신에 의한 닭에 대한 면역에 의해, LAM 에 대한 항체가가 충분히 상승하는 것이 확인되었다. 또, 결핵균의 LAM 및 항산균의 LAM 중 어느 것에 대해서도 동등한 반응성을 나타냈다.
실시예 6 LAM 에 대한 닭 scFv (1 개 사슬 항체) 의 제조
(1) LAM 에 대한 닭 scFv (1 개 사슬 항체) 의 제조
BCG 백신을 면역한 닭의 비장 세포로부터 1 개 사슬 항체 scFv 를 단리하였다. 구체적으로는 「3. 재료의 조제」 의 (3-2) 에 기재하는 방법에 따라, 닭의 비장으로부터 Total RNA 를 조제하고, 이것으로부터 합성한 cDNA 를 주형으로 하여, 표 3 에 기재하는 각종 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시함으로써, VH 유전자 증폭 산물 및 VL 유전자 증폭 산물을 조제하였다. 이어서, VH 유전자와 VL 유전자를 GS 링커 (배열 번호 40) 를 개재하여 접합한 닭 1 개 사슬 항체 (VH 유전자/GS 링커/VL 유전자) 를 제조하고, 이것으로부터 scFv 디스플레이 파지 라이브러리를 제조하였다. 각 라이브러리의 타이터는 약 106 cfu 인 점에서, 106 개의 다양성을 가진 라이브러리라고 추측할 수 있다.
제조한 scFv 디스플레이 파지 라이브러리를 사용하여, BCG 백신에 의한 바이오패닝을 3 회 실시하였다. 4 회째의 패닝은, TB-scFv 와는 상이한 에피토프를 인식하는 1 개 사슬 항체 scFv 를 단리하는 것을 목적으로, TB-scFv 를 고상화한 마이크로 플레이트에 M. tuburculosis 의 LAM (아오야마 B 주 유래) 을 반응시켜 형성시킨 복합체를 사용하였다. TB-scFv 를 고상화한 마이크로 플레이트에 M. tuburculosis 의 LAM 용액을 반응시키고, 3 회 세정 후에 BCG 패닝 파지 풀을 첨가하고, 2 시간 25 ℃ 에서 반응하였다. 반응 후, 3 회 세정하여 LAM 결합 파지를 용출하였다. 최종적으로 각 패닝 풀로부터 200 클론을 무작위로 선택하여, LAM 반응성 클론을 TB-scFv 와 LAM 의 복합체를 사용하여 스크리닝을 실시하였다. 각 라이브러리로부터 각각 약 10 클론 정도의 LAM 반응성 클론이 얻어졌다. 염기 배열을 해석한 결과로부터, 각 라이브러리로부터 얻어진 클론의 배열은 대부분 일치하고 있는 것이 확인되었다.
이상으로부터, BCG 백신으로 면역한 닭의 비장으로부터 조제한 scFv 디스플레이 파지 라이브러리로부터, 1 클론의 1 개 사슬 항체 scFv (G3-scFv) 를 단리하는 것에 성공하였다. 닭 비장 라이브러리로부터 단리한 1 개 사슬 항체 G3-scFv 의 아미노산 배열 (배열 번호 39) 을, 중사슬 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역, GS 링커, 그리고 경사슬 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 위치와 함께 도 10 에 나타낸다.
(2) 닭 scFv (1 개 사슬 항체) 의 LAM 반응성
상기로 제조한 G3-scFv 의 반응성을 정제 M. tuberculosis 의 LAM 및 M. avium 의 LAM 을 고상화한 플레이트를 사용하여 평가하였다. 구체적으로는, G3-scFv 를 「1. 재료의 조제」 의 (1-6) 에 기재하는 방법에 따라 가용화하여 가용화 G3-scFv 를 조제하였다. 이어서 동 (1-7) 에 기재하는 방법에 따라 비오틴 표지하고, 정제한 M. tuberculosis 의 LAM 및 M. avium 의 LAM 을 각각 고상화한 항원 플레이트 (정제 LAM 고상화 마이크로타이터 플레이트) 에 대한 반응성을 ELISA 법에 의해 측정하여 평가하였다.
그 결과, G3-scFv 는 결핵균의 LAM 및 항산균의 LAM 중 어느 것에 대해서도 동등한 반응성을 나타냈다. 이 결과로부터, 닭의 1 개 사슬 항체 G3-scFv 는 결핵균 LAM 을 함유하는 항산균 LAM 전반에 반응성을 갖는 항체라고 생각되었다.
실시예 7 2 가 항체를 사용한 LAM 검출용 ELISA 의 구축
실용화를 고려하여, 「2 가 항체 제조」 의 (4-1) 에 기재하는 방법에 따라, 실시예 1 및 6 으로 제조한 3 종류의 1 개 사슬 항체 scFv (Myco-svFv, TB-scFv, G3-scFv) 를 2 가 항체로 개변하고, 당해 2 가 항체의 반응 특이성을 기초로, 항산균 LAM 검출용 ELISA 와 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 2 종류를 구축하였다. 구체적으로는 항산균 LAM 검출용 ELISA 는 포착용 항체로서 2 가 TB-scFv 와 2 가 G3-scFv 를 혼합하여 플레이트에 고상화하고, 검출용 항체로서 2 가 Myco-scFv 를 비오틴 표지한 것을 사용하였다. 결핵균 LAM 검출용 ELISA 는 포착용 항체로서 2 가 TB-scFv 를 플레이트에 고상화하고, 검출용 항체로서 2 가 Myco-scFv 를 비오틴 표지한 것을 사용하였다. 자세한 것은 「4. 측정 방법」 의 (4-3) 및 (4-4) 에 기재한 바와 같다.
구축한 항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 평가는 BCG 배양균체로부터 추출한 LAM 을 측정함으로써 실시하였다 (도 11). 그 결과, 도 11 에 나타내는 바와 같이, 항산균 LAM 검출용 ELISA (-■-) 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA (-●-) 에 의해, 모두 동등한 감도로 BCG 의 LAM 을 검출하는 것이 가능하였다.
실시예 8 2 가 항체를 사용한 LAM 검출 ELISA 의 검출 감도 평가
2 가 항체를 사용한 ELISA 의 감도 평가를 실시하기 위해, BCG 배양균체를 106 cfu/㎖ 로부터 61 cfu/㎖ 까지 희석하고, 그 희석액의 일부로부터 유전자를 추출하여 유전자 증폭 검사 (NAAT) 를 실시하며, 일부로부터 LAM 을 추출하여 항산균 LAM 검출용 ELISA 를 실시하였다.
항산균 LAM 검출용 ELISA 의 결과를 도 12 에 나타낸다. 도 12 중의 표에 나타내는 바와 같이, 유전자 증폭 검사 (NAAT) 의 검출 감도는 약 500 cfu/㎖ 인 데에 반해, 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 검출 감도는 약 250 cfu/㎖ 였다. 유전자 증폭 검사가 표적으로 하고 있는 반복 배열은, 균주에 의해 반복수에 차이가 있기 때문에, 균주에 의해 검출 감도에 차이가 나는 것으로 되어 있다. BCG 의 반복 배열은 적기 때문에 유전자 검사의 감도가 낮게 나와 있지만, 일반적으로 반복 배열이 많은 균주에서 검출 감도가 100 cfu/㎖ 로 되어 있다.
이상의 결과로부터, 2 가 항체를 사용한 본 발명의 항산균 LAM 검출용 ELISA 는 유전자 증폭 검사보다 높거나, 혹은 동등한 검출 감도를 갖는 매우 고감도인 면역 측정법인 것이 증명되었다.
실시예 9 2 가 항체를 사용한 LAM 검출 ELISA 의 교차 반응성 시험
구강 내 세균에는 LAM 의 구성 성분과 유사한 구조의 막 항원을 갖는 종류가 존재한다. 객담 검체 중의 항산균의 LAM 이나 결핵균의 LAM 을 검출하는 경우, 이들 구강 내 세균과의 교차 반응성이 매우 문제가 되어, 객담을 사용한 항산균 및 결핵균의 검출 면역 측정법을 확립하는데 장해의 하나로 되고 있다.
여기서는 LAM 검출 ELISA 의 구강 내 세균에 대한 교차 반응성을 확인하기 위해, N. asteroids (약칭 「Na」), N. farcinica (약칭 「Nf」), S. globisporus (약칭 「Sg」), C albicans (약칭 「Ca」), A. israelii (약칭 「Ai」), 및 T. paurometabolum (약칭 「Tp」) 을 각각 액체 배양하고, 106 cfu/㎖ 및 108 cfu/㎖ (Ca 만 107 cfu/㎖) 로 조정한 후, BCG 배양 균체와 동일하게 하여 LAM 을 추출하고, LAM 검출용 ELISA 로 측정하였다. 도 13 에 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 결과를 나타낸다.
도 13 으로부터 알 수 있는 바와 같이, 컨트롤에 사용한 BCG 의 반응성이 105 cfu/㎖ 농도로 최대값에 이르고 있는 데에 반해, 각 구강 내 세균은 108 cfu/㎖ 의 고농도 균체량이어도 전혀 반응성을 나타내지 않았다. 결핵균 LAM 검출용 ELISA 에서도 완전히 동일한 결과를 나타냈다.
이상의 결과는, 우리가 취득한 1 개 사슬 항체 scFv (Myco-svFv, TB-scFv, G3-scFv) 는 항산균 및 결핵균의 LAM 에 대해 높은 친화성을 가지고 있으며, 이들을 2 가 항체로서 조합하여 사용함으로써 항산균 (결핵균을 함유한다) 을 유전자 증폭 검사와 동등한 고감도화에 검출하는 것이 가능한 것, 또한 구강 내 세균과는 전혀 교차 반응성을 가지지 않는 매우 선택적이고 특이적인 항체 및 측정법인 것이 증명되었다.
실시예 10 2 가 항체를 사용한 LAM 검출용 ELISA 의 임상 분리주에 의한 평가
2 가 항체를 사용한 항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 를 항산균 임상 분리주를 사용하여 평가하였다.
임상 분리주로서 M. tuberculosis 38 주, 및 MAC 증의 기인균인 M. avium 23 주와 M. intracellulare 6 주를 사용하고, 이들 배양균체로부터 LAM 을 추출하여, 2 가 항체를 사용한 항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 를 실시하였다. 결과를 도 14 에 나타낸다.
도 14 의 A 는 결핵균 임상 분리주 (M. tuberculosis) 38 주에 대한 항산균 LAM 검출용 ELISA (검은봉) 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA (흰봉) 의 결과를 나타낸다. B 는 비결핵성 항산균 29 주 (M. avium 23 주와 M. intracellulare 6 주) 에 대한 항산균 LAM 검출용 ELISA (검은봉) 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA (흰봉) 의 결과를 나타낸다.
항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 모두, M. tuberculosis 38 주, M. avium 23 주, M. intracellulare 6 주 모두에 반응성을 나타냈다. 단, 항산균 LAM 검출용 ELISA 는 결핵균 및 비결핵성 항산균에 동등하게 반응하고 있는 데에 반해, 결핵균 LAM 검출용 ELISA 는 비결핵성 항산균에 대해 낮은 반응성을 나타냈다.
결핵균과 비결핵성 항산균의 구별을 LAM 검출용 ELISA 의 결과만으로 감별하는 것을 목적으로, 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 값과 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 값의 비 (항산균 LAM 검출용 ELISA 의 값/결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 값) 를 산출하였다 (도 15). 그 결과, 결핵균에 대해서는 양 측정값의 비가 3 배를 초과하는 것은 38 주 중 겨우 1 주뿐이었다. 한편, 비결핵성 항산균에 대해서는 29 주 중 23 주가 3 배 이상의 비를 나타냈다.
이상의 결과는 LAM 용 검출용 ELISA 는 주간차의 영향을 거의 받지 않고 LAM 을 검출하는 것이 가능한 것을 나타내고 있다. 또한, 양 측정계의 비 (항산균 LAM 검출용 ELISA 의 값/결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 값) 를 산출함으로써, 결핵균과 비결핵성 항산균을 감도 97 ％, 특이성 80 ％ 의 양호한 성적으로 감별 (식별) 하는 것이 가능하며, 이 점에서 본 발명의 방법이 「항산균 전반을 검출할 수 있고, 또한 결핵균과 비결핵성 항산균의 식별도 가능」 한 LAM 검출용 ELISA 로서 세계에서 처음의 면역 측정계인 것이 증명되었다.
실시예 11 2 가 항체를 사용한 LAM 검출 ELISA 의 임상 객담 검체에 의한 평가
실시예 7 로 구축한 2 가 항체를 사용한 LAM 검출용 ELISA 의 성능을 평가하기 위해, 54 예의 임상 객담 검체를 사용하여 평가를 실시하였다. 평가는 직접 도말 검사 (Smear) 및 유전자 증폭 검사 (NAAT) 의 양방에서 실시하였다. 직접 도말 검사 및 유전자 증폭 검사의 결과를 표 4 에 정리하였다.
Figure pct00004
직접 도말 검사에서 양성예 (3+, 2+, 1+, Scanty) 는 43 예, 유전자 증폭 검사에서 양성예 (+) 는 45 예였다. 이들 중, 양쪽 검사에서 양성으로 되었던 것이 42 예, 양쪽 검사에서 음성으로 되었던 것이 8 예, 또한 유전자 증폭 검사만으로 양성으로 되었던 것이 3 예였다.
임상 객담 검체로부터 LAM 을 추출하고, 항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 에 의해 각각 측정한 결과를 표 5 및 도 16 에 나타낸다. 표 5 에는, 항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 검출률도 아울러 나타낸다.
Figure pct00005
표 5 에 나타내는 바와 같이, 항산균 LAM 검출용 ELISA 및 결핵균 LAM 검출용 ELISA 의 결과는 대부분 동일하였다. 도말 검사에서 1+ 이상의 균체량이 확인되고 있는 군에 있어서는, ELISA 의 반응성이 대부분의 검체에서 최대값에 이르고 있다. 균체량이 적은 Scanty 에 관해서도, 50 ％ 의 검체에 있어서 ELISA 의 반응성이 최대값에 이르고 있다. 또한, 유전자 증폭 검사에서만 양성으로 판정된 균체량이 매우 적은 3 예에 있어서도, 모두가 유전자 증폭 검사에서 음성으로 판단된 검체보다 높은 값을 나타냈다. 항산균 LAM 검출용 ELISA 에서는, 유전자 증폭 검사에서 양성으로 판단된 모든 검체로부터 LAM 을 검출할 수 있었지만, 유전자 증폭 검사에서 음성으로 판단된 검체로부터는 1 예도 LAM 을 검출할 수 없었다. 즉, 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 감도 및 특이성은 유전자 증폭 검사와 비교했을 경우 100 ％ 일치하였다. 결핵균 LAM 검출용 ELISA 에 있어서도, 유전자 증폭 검사가 양성이고 또한 Smear test 에서 scanty 로 판정된 1 예만이 유전자 증폭 검사와 불일치했던 것 이외에는 모두 유전자 증폭 검사와 일치하였다. 또 불일치했던 1 예도 커트 오프값을 조금 밑돈 것뿐이었다.
이상의 결과는 본 발명의 LAM 검출용 ELISA 가 유전자 증폭 검사와 동등한 감도 및 특이성으로 항산균 감염증 환자를 스크리닝하여 선별할 수 있는 검사인 것을 나타내고 있다.
다음으로, LAM 검출용 ELISA 의 값이 균량과 상관하는 것을 확인하기 위해, 희석 측정을 실시하였다.
객담 검체로부터의 추출 용액을 5 배, 25 배, 및 125 배로 희석하고, 정제 LAM 을 표준품으로 하여 동시에 측정하여 LAM 농도를 산출하였다. 결과를 도 17 에 나타낸다.
검체를 유전자 증폭 검사 및 도말 검사 (Smear test) 를 기초로 균량에 의해 군 분류를 하여 (I : 유전자 증폭 검사 및 도말 검사 모두 음성, II : 유전자 증폭 검사 양성 및 도말 검사 음성, III : 유전자 증폭 검사 양성 및 도말 검사 scanty, IV : 도말 검사 1+, V : 도말 검사 2+, VI : 도말 검사 3+), LAM 농도 (pg/㎖) 와 비교하였다. 그 결과, 도 17 에 나타내는 바와 같이, 균량이 적은 군으로부터 많은 군 (I → VI) 에 걸쳐 LAM 농도의 평균값도 상승하고 있으며, 균량과 LAM 농도는 정 (正) 의 상관을 나타냈다. 이상의 결과로부터, LAM 농도를 정량함으로써 균량을 예측할 수 있는 것이 나타났다.
이들 결과는 본 발명의 방법이 유전자 증폭 검사와 동등한 감도 및 특이성을 갖고, 또한 균량을 결정할 수 있는 검사인 것을 나타내고 있으며, 결핵의 치료 모니터링 등에 응용할 수 있는 것이 증명되었다.
실시예 12 LAM 의 안정성 평가
객담 검체를 수송하는 경우, 감염성의 문제로 엄중한 관리하 수송하는 것이 필요하다. 이 경우, 비용이 높아지고, 또한 이용할 수 있는 지역이 한정되어 온다. 객담 검체를 채취 후에 멸균했을 경우, 통상적인 수송을 하는 것이 가능해진다. 항산균을 완전하게 멸균하려면 30 분 이상의 자비나 가압 증기 멸균 (오토클레이브 등) 에 의한 처리가 필요하다. 이와 같은 처리를 실시했을 경우, LAM 의 구조가 변화하는 것이 예측된다. 우리는 상기에서 구축한 LAM 검출 ELISA 가 가혹한 멸균 처리에 대해 내성이고, 올바르게 LAM 을 검출할 수 있는지 여부를 검토하였다.
BCG 배양균체를 오토클레이브 처리 (121 ℃, 20 분) 한 균체 (오토클레이브 처리균), 100 ℃ 에서 30 분간 자비 처리한 균체 (자비 처리균), 및 미처리균으로부터 각각 LAM 을 추출하여, 항산균 LAM 검출용 ELISA 로 측정을 실시하였다. 결과를 도 18 에 나타낸다. 미처리균 (흰봉) 과, 자비 처리균 (검은봉) 및 오토클레이브 처리균 (회색봉) 을 비교하면, 어느 쪽도 완전히 동일한 값이고, 자비나 오토클레이브와 같은 가혹한 처리를 받은 균체에 있어서도, 미처리균과 동일하게, LAM 을 측정하는 것이 가능하다는 것이 나타났다.
또한, 가장 가혹한 처리인 오토클레이브 처리 (121 ℃, 20 분) 한 균체를 사용하여 보존 안정성의 평가를 실시하였다. 오토클레이브 처리한 BCG 균체를 25 ℃ 에서 7 일간 방치한 후, 추출한 LAM 에 대해 항산균 LAM 검출용 ELISA 를 실시하였다. 그 결과 (검은봉) 와, 오토클레이브 처리 직후의 BCG 균체로부터 추출한 LAM 에 대한 항산균 LAM 검출용 ELISA 의 결과 (흰봉) 를 도 19 에 나타낸다. 도 19 로부터 알 수 있는 바와 같이, 양자에 거의 차이는 없고, 오토클레이브 처리 후에 7 일간 방치한 균체에 있어서도 처리 직후의 균체와 동등한 결과가 얻어지고 있어, 적어도 멸균 처리 후 1 주간은 측정 가능하다는 것이 나타났다.
이상의 결과로부터, 본 측정계는 가압 증기 멸균 (오토클레이브) 과 같은 가혹한 처리를 실시한 균체를 대상으로 해도 측정하는 것이 가능하여, 처리 후 적어도 1 주간은 안정적으로 측정할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 특별한 검체 수송 시스템이 정비되어 있지 않은 지역에 있어서도, 우편 등의 일반적 수송 시스템에 의한 검체 발송이 가능해져, 시간적으로도 1 주간 정도의 유예가 있기 때문에 검체 수송의 지연도 문제가 되지 않는다고 생각된다.
프리 텍스트
배열 번호 9 및 10 은 GS 링커 배열의 단위 아미노산 배열을, 배열 번호 11 및 40 은 본 발명에서 사용한 링커 배열의 아미노산 배열을 나타낸다. 배열 번호 13 ∼ 16 은 항체 중사슬 가변 영역의 센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 17 은 항체 중사슬 가변 영역의 안티센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 18 ∼ 20 및 24 는 항체 경사슬 가변 영역의 센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 21 ∼ 23 및 25 는 항체 경사슬 가변 영역의 안티센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 26 은 GS 링커의 센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 27 은 GS 링커의 안티센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 28 은 제한 효소 (Sfi-I) 사이트의 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 29 는 제한 효소 (Not-I) 사이트의 프라이머의 아미노산 배열을 나타낸다 (표 1 참조).
또, 배열 번호 41 은 항체 중사슬 가변 영역의 센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 42 는 항체 중사슬 가변 영역의 안티센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 43 은 항체 경사슬 가변 영역의 센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 44 는 항체 경사슬 가변 영역의 안티센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 45 는 GS 링커의 센스 프라이머의 아미노산 배열 : 배열 번호 46 은 GS 링커의 안티센스 프라이머의 아미노산 배열을 나타낸다 (표 3 참조).
SEQUENCE LISTING <110> OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Antibody to lipoarabinomannan and immunoassay of mycobacteriosis with the antibody <130> P12-189 <150> JP 2012-044796 <151> 2012-02-29 <160> 54 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Leporidae <400> 1 Thr Tyr Tyr Met Thr 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Leporidae <400> 2 Thr Ile Asp Ser Tyr Gly Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Leporidae <400> 3 Asp Asp Leu Gly Trp Asn Asn Asp Asn Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Leporidae <400> 4 Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Gly Asn Asn Gln Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Leporidae <400> 5 Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Leporidae <400> 6 Cys Gly Gly Tyr Lys Gly Ser Thr Thr Asp Gly Ala Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Leporidae <400> 7 Ala Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Ser Tyr Gly Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Gln Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Met Thr Gly Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Arg 85 90 95 Asp Asp Leu Gly Trp Asn Asn Asp Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ser Ser 115 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Leporidae <400> 8 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Lys Ser Val Pro Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Ser Val Tyr Gly Asn 20 25 30 Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val 65 70 75 80 Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Tyr Lys Gly Ser 85 90 95 Thr Thr Asp Gly Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker <400> 9 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 246 <212> PRT <213> Leporidae <400> 12 Ala Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Ser Tyr Gly Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Gln Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Met Thr Gly Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Arg 85 90 95 Asp Asp Leu Gly Trp Asn Asn Asp Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser 130 135 140 Lys Ser Val Pro Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser 145 150 155 160 Glu Ser Val Tyr Gly Asn Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Gln Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Asp Val Val Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gly Gly Tyr Lys Gly Ser Thr Thr Asp Gly Ala Ala Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Glu Val Val Val Lys 245 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH region sense primer <400> 13 gccggccgcc cagtcggtgg aggagtccrg g 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH region sense primer <400> 14 gccggccgcc cagtcggtga aggagtccga g 31 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH region sense primer <400> 15 gccggccgcc cagtcgytgg aggagtccgg g 31 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH region sense primer <400> 16 gccggccgcc cagsagcagc tgrtggagtc cgg 33 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH region antisense primer <400> 17 cctccacctg aggatgarga gayggtgacc agggtgcc 38 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region sense primer <400> 18 gcggatcgga gctcgtgmtg acccagactc ca 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region sense primer <400> 19 gcggatcgga gctcgatmtg acccagactc ca 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region sense primer <400> 20 gcggatcgga gctcgtgatg acccagactg aa 32 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region antisense primer <400> 21 acctgcggcc gcttaggatc tccagctcgg tccc 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region antisense primer <400> 22 acctgcggcc gcttttgatt tccacattgg tgcc 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region antisense primer <400> 23 acctgcggcc gcttttgacs accacctcgg tccc 34 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region sense primer <400> 24 gcggatcgga gctcgtgctg actcagtcgc cctc 34 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region antisense primer <400> 25 acctgcggcc gcgcctgtga cggtcagctg ggtccc 36 <210> 26 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GS linker sense primer <400> 26 tcatcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcggagctc 60 g 61 <210> 27 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GS linker antisense primer <400> 27 cgagctccga tccgccaccg ccagagccac ctccgcctga accgcctcca cctgaggatg 60 a 61 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sfi-I site primer <400> 28 agcggcccag ccggccgccc ag 22 <210> 29 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Not-I site primer <400> 29 acctgcggcc gc 12 <210> 30 <211> 246 <212> PRT <213> Leporidae <400> 30 Ala Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asn Tyr 20 25 30 Pro Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Glu Asp Ser Gly Arg Ile Lys Asp Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Met Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Leu Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg 85 90 95 Asp Ala Gly Trp Ser Trp Trp Thr Gln Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro 130 135 140 Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln 145 150 155 160 Ala Asn Glu Asn Ile Gly Arg Phe Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser 180 185 190 Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Gly Val His Cys Asp Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys 210 215 220 Leu Gly Gly Pro Asn Asn Val Val Asp Gly Ala Ser Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Glu Val Val Val Lys 245 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 31 Ser Phe Asn Met His 1 5 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 32 Gly Ile Ser Gly Asp Asp Ser Arg Tyr Thr Tyr Thr Asn Tyr Ala Pro 1 5 10 15 Ala Val Lys Gly 20 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 33 Asp Phe Ser Asp Gly Ser Gly Ala Asp His Ile Asp Ala 1 5 10 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 34 Ser Gly Ser Ser Ser Trp Tyr Gly 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 35 Ser Asn Asp Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 36 Gly Thr Tyr Asp Ser Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Val 1 5 10 <210> 37 <211> 130 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 37 Met Ala Leu Pro Ala Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu 1 5 10 15 Gln Thr Pro Gly Gly Val Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe 20 25 30 Thr Phe Ser Ser Phe Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Gly Asp Asp Ser Arg Tyr Thr 50 55 60 Tyr Thr Asn Tyr Ala Pro Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg 65 70 75 80 Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala 85 90 95 Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Phe Ser Asp Gly Ser 100 105 110 Gly Ala Asp His Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val 115 120 125 Ser Ser <210> 38 <211> 116 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 38 Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 1 5 10 15 Lys Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Trp Tyr Gln Gln 20 25 30 Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Ser Asn Asp Lys 35 40 45 Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser 50 55 60 Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Gly Thr Tyr Asp Ser Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Val Phe 85 90 95 Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His 100 105 110 His His His His 115 <210> 39 <211> 261 <212> PRT <213> Gallus gallus domesticus <400> 39 Met Ala Leu Pro Ala Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu 1 5 10 15 Gln Thr Pro Gly Gly Val Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe 20 25 30 Thr Phe Ser Ser Phe Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 35 40 45 Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly Ile Ser Gly Asp Asp Ser Arg Tyr Thr 50 55 60 Tyr Thr Asn Tyr Ala Pro Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg 65 70 75 80 Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala 85 90 95 Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Phe Ser Asp Gly Ser 100 105 110 Gly Ala Asp His Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val 115 120 125 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr 145 150 155 160 Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Trp Tyr Gly Trp Tyr Gln 165 170 175 Gln Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val Ile Tyr Ser Asn Asp 180 185 190 Lys Arg Pro Ser Asn Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Ala Ser Gly 195 200 205 Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Gly Val Gln Val Glu Asp Glu Ala 210 215 220 Val Tyr Phe Cys Gly Thr Tyr Asp Ser Ser Ala Arg Tyr Ile Gly Val 225 230 235 240 Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu Ala Ala Ala Leu Glu His 245 250 255 His His His His His 260 <210> 40 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker <400> 40 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH region sense primer with Sfi I site <400> 41 ctatgcggcc cagccggccg ccgtgacgtt ggacgag 37 <210> 42 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH region anti sense primer <400> 42 cctccaccgg aggagacgat gacttcggtc c 31 <210> 43 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region sense primer <400> 43 gcggatcggc cctgactcag ccgtcctcgg tgtc 34 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VL region anti sense primer with Not I site <400> 44 acctgcggcc gctaggacgg tcagg 25 <210> 45 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GS linker sense primer <400> 45 tcctccggtg gaggcggttc aggcggagat ggctctggcg gtggcggatc ggccctg 57 <210> 46 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> GS linker anti sense primer <400> 46 cagggccgat ccgccaccgc cagagccatc tccgcctgaa ccgcctccac cggagg 56 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Leporidae <400> 47 Asn Tyr Pro Met Cys 1 5 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Leporidae <400> 48 Cys Ile Glu Asp Ser Gly Arg Ile Lys Asp Ala Ser Trp Ala Lys Gly 1 5 10 15 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Leporidae <400> 49 Asp Ala Gly Trp Ser Trp Trp Thr Gln Leu Asp Leu 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Leporidae <400> 50 Gln Ala Asn Glu Asn Ile Gly Arg Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Leporidae <400> 51 Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Leporidae <400> 52 Cys Leu Gly Gly Pro Asn Asn Val Val Asp Gly Ala Ser 1 5 10 <210> 53 <211> 121 <212> PRT <213> Leporidae <400> 53 Ala Gln Ser Val Lys Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Ile Thr Asn Tyr 20 25 30 Pro Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Cys Ile Glu Asp Ser Gly Arg Ile Lys Asp Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Met Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Leu Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg 85 90 95 Asp Ala Gly Trp Ser Trp Trp Thr Gln Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 110 <212> PRT <213> Leporidae <400> 54 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Asn Glu Asn Ile Gly Arg Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val His Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Pro Asn Asn Val Val 85 90 95 Asp Gly Ala Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys 100 105 110

Claims (27)

  1. 하기 (A) ∼ (C) 중 어느 것에 기재하는 항산균의 리포아라비노만난에 대해 결합성을 갖는 모노클로날 항체 :
    (A) 하기 (a) ∼ (c) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (d) ∼ (f) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 모노클로날 항체 :
    (a) 배열 번호 1 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
    (b) 배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
    (c) 배열 번호 3 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
    (d) 배열 번호 4 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
    (e) 배열 번호 5 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
    (f) 배열 번호 6 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3 ;
    (B) 하기 (g) ∼ (i) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (j) ∼ (l) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체 :
    (g) 배열 번호 31 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
    (h) 배열 번호 32 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
    (i) 배열 번호 33 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
    (j) 배열 번호 34 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
    (k) 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
    (l) 배열 번호 36 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3.
    (C) 하기 (m) ∼ (o) 의 중사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 중사슬 가변 영역과, 하기 (p) ∼ (r) 의 경사슬 CDR1 ∼ CDR3 을 함유하는 경사슬 가변 영역이 링커를 개재하여 접합하여 이루어지는 모노클로날 항체 :
    (m) 배열 번호 47 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR1,
    (n) 배열 번호 48 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR2,
    (o) 배열 번호 49 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 CDR3,
    (p) 배열 번호 50 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR1,
    (q) 배열 번호 51 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR2,
    (r) 배열 번호 52 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 CDR3.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (A) 에 기재하는 모노클로날 항체가 배열 번호 12 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 모노클로날 항체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (B) 에 기재하는 모노클로날 항체가 배열 번호 39 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 모노클로날 항체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (C) 에 기재하는 모노클로날 항체가 배열 번호 30 으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것인 모노클로날 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    1 가 또는 2 가의 항체인 것을 특징으로 하는 모노클로날 항체.
  6. 하기의 공정을 갖는 항산균의 검출 방법 :
    (1) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 모노클로날 항체를 피험자의 생체 시료와 접촉시키는 공정, 및
    (2) 상기 모노클로날 항체와 항산균의 리포아라비노만난의 결합 반응을 지표로 하여 피험 시료 중에 존재하는 항산균을 측정하는 공정.
  7. 제 6 항에 있어서,
    모노클로날 항체로서, 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 사용하여, 항산균 중 결핵균을 특이적으로 검출하는 방법인 것을 특징으로 하는 항산균의 검출 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 모노클로날 항체를 함유하는 항산균의 리포아라비노만난 검출제.
  9. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 모노클로날 항체를 항산균의 리포아라비노만난 검출용 시약으로서 함유하는 항산균의 리포아라비노만난 검출용 키트.
  10. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 함유하는 결핵 진단제.
  11. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 결핵균 검출 시약으로서 함유하는 결핵 진단용 키트.
  12. 하기의 공정을 갖는 피험 시료 중의 항산균 리포아라비노만난을 측정하는 방법 :
    (1) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 모노클로날 항체를 항산균을 함유할 수 있는 피험 시료와 접촉시키는 공정, 및
    (2) 상기 모노클로날 항체와 항산균의 리포아라비노만난의 결합 반응을 지표로 하여 피험 시료 중에 존재하는 항산균 리포아라비노만난을 측정하는 공정.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 측정 방법이,
    (2) 공정으로서 항산균 리포아라비노만난을 검출하는 공정을 갖는 항산균 리포아라비노만난의 정성 방법이거나, 또는
    (2) 공정으로서 항산균 리포아라비노만난을 정량하는 공정을 갖는 항산균 리포아라비노만난의 정량 방법인 측정 방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    모노클로날 항체로서 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 사용하여, 항산균 리포아라비노만난 중 결핵균 리포아라비노만난을 특이적으로 측정하는 방법인 방법.
  15. 하기의 공정을 갖는 항결핵약의 결핵 치료 효과를 판정하는 방법 :
    (1) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 항결핵약 투여 전후의 피험 시료와 각각 접촉시키는 공정,
    (2) 상기 모노클로날 항체와 결핵균의 리포아라비노만난의 결합 반응을 지표로 하여, 항결핵약 투여 전후의 피험 시료 중의 결핵균 리포아라비노만난을 측정하는 공정, 및
    (3) 항결핵약 투여 전의 피험 시료에 결핵균 리포아라비노만난이 검출되고, 또한 항결핵약 투여 후의 피험 시료에 결핵균 리포아라비노만난이 검출되지 않는 경우에 항결핵약의 결핵 치료 효과 있음으로 결정하는 공정.
  16. 하기의 공정을 갖는 항결핵약의 결핵 치료 효과를 판정하는 방법 :
    (1) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 항결핵약 투여 전후의 피험 시료와 각각 접촉시키는 공정,
    (2) 상기 모노클로날 항체와 결핵균의 리포아라비노만난의 결합 반응을 지표로 하여, 항결핵약 투여 전후의 피험 시료 중의 결핵균 리포아라비노만난을 정량하는 공정, 및
    (3) 항결핵약 투여 후의 피험 시료 중의 결핵균 리포아라비노만난량 (투여 후 측정값) 과, 항결핵약 투여 전의 피험 시료 중의 결핵균 리포아라비노만난량 (투여 전 측정값) 을 대비하여, 투여 후 측정값이 투여 전 측정값보다 낮은 경우에 항결핵약의 결핵 치료 효과 있음으로, 그 이외의 경우에 항결핵약의 결핵 치료 효과 없음으로 결정하는 공정.
  17. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 함유하는 항결핵약의 결핵 치료 효과 판정용 키트.
  18. 모세관 현상에 의해 피험 시료를 이송할 수 있는 재료로 구성된 흡액편을 구비한 항산균 검출 도구로서, 당해 흡액편이
    (1) 피험 시료를 흡수 채취하는 시료 채취부,
    (2) 항산균의 리포아라비노만난과 특이적으로 반응하는 표지되어 이루어지는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 모노클로날 항체를 담지한 표지 항체부,
    (3) 하기에 나타내는 테스트 결과 표시부를 구비한 판정부,
    (a) 항산균의 리포아라비노만난과 특이적으로 반응하는 비표지의 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 모노클로날 항체를 고정시킨 테스트 결과 표시부,
    (4) 상기 시료 채취부, 표지 항체부 및 판정부를 이동해 온 피험 시료의 잔액을 흡수하는 액 흡수부를 구비하는 것을 특징으로 하는 항산균 검출 도구.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 (3) 판정부가 (a) 테스트 결과 표시부와 간격을 두고, 추가로 하기에 나타내는 컨트롤 표시부를 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 항산균 검출 도구 :
    (b) 표지되어 이루어지는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 모노클로날 항체와 반응하는 비표지-항체를 고정시킨 컨트롤 표시부.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
    모노클로날 항체로서 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체를 함유하고, 항산균으로서 결핵균을 검출하기 위한 것인 항산균 검출 도구.
  21. 비인간 동물에 면역원으로서 BCG 를 투여함으로써, BCG 에 대한 체액성 면역 응답을 유도하는 공정을 갖는 결핵균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 제조하기 위한 비인간 동물의 면역 방법.
  22. 비인간 동물에 면역원으로서 BCG 를 투여함으로써, BCG 에 대한 체액성 면역 응답을 유도하여 인간 결핵균의 리포아라비노만난에 결합하는 항체를 산생시키는 공정, 및
    당해 비인간 동물로부터 당해 항체를 산생하는 세포를 채취하는 공정을 갖는, 인간 결핵균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
  23. 비인간 동물에 면역원으로서 BCG 를 투여함으로써, BCG 에 대한 체액성 면역 응답을 유도하는 공정,
    당해 비인간 동물로부터 인간 결핵균의 리포아라비노만난에 결합하는 항체에 대한 mRNA 를 조제하는 공정,
    당해 mRNA 를 주형으로 하여 cDNA 를 조제하는 공정, 및
    당해 cDNA 를 사용한 파지 디스플레이법에 의해 결핵균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 채취하는 공정을 갖는, 인간 결핵균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
  24. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
    인간 결핵균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재하는 (A) 의 모노클로날 항체인 제조 방법.
  25. 비인간 동물에 면역원으로서 제 1 항에 기재하는 항체와 리포아라비노만난의 복합체를 투여함으로써, 당해 복합체에 대한 체액성 면역 응답을 유도하여 항산균의 리포아라비노만난에 결합하는 항체를 산생시키는 공정, 및
    당해 비인간 동물로부터 당해 항체를 산생하는 세포를 채취하는 공정을 갖는
    항산균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
  26. 비인간 동물에 면역원으로서 제 1 항에 기재하는 항체와 리포아라비노만난의 복합체를 투여함으로써, 당해 복합체에 대한 체액성 면역 응답을 유도하는 공정,
    당해 비인간 동물로부터 결핵균의 리포아라비노만난에 결합하는 항체에 대한 mRNA 를 조제하는 공정,
    당해 mRNA 를 주형으로 하여 cDNA 를 조제하는 공정, 및
    당해 cDNA 를 사용한 파지 디스플레이법에 의해 항산균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 채취하는 공정을 갖는, 항산균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 제조 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    항산균의 리포아라비노만난에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 제 1 항에 기재하는 모노클로날 항체인 제조 방법.
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