TW201400500A - 抗脂阿拉伯甘露糖抗體及使用該抗體之分枝桿菌病的免疫分析法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種單株抗體及其用途,該單株抗體係如下述(A)所記載,並可與分枝桿菌,特別是結核菌的脂阿拉伯甘露糖專一性地結合:(A)含有下述(a)~(c)的重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(d)~(f)的輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的單株抗體:(a)由序列號碼1所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(b)由序列號碼2所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(c)由序列號碼3所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(d)由序列號碼4所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(e)由序列號碼5所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(f)由序列號碼6所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3。
Description
本發明關於一種與以結核菌為首的分枝桿菌中的脂阿拉伯甘露糖專一性地結合的單株抗體,特別是單鏈抗體(scFv)及其多價抗體。
另外,本發明關於一種使用該抗體之分枝桿菌檢測方法,其中還有結核診斷方法或結核診斷法、以及該方法所使用的分枝桿菌檢測劑(例如結核診斷劑)及分枝桿菌檢測用套組(例如結核診斷用套組)。
此外,本發明還關於一種使用該抗體,判定抗結核藥對於結核的治療效果之方法;以及該方法所使用的用以判定抗結核藥的治療效果的套組。
結核是在幾千年之間令人類受苦的感染症,在19世紀的歐洲,推測成年人口的1/4因為結核而死亡。因為生活水準提升並且在20世紀發現抗生物質,至1950年代,結核在已開發的工業國家形同根絕。然而,結核又成為再興感染症而造成嚴重威脅。目前世界人口中,推測每3人中會
有1人感染結核菌(潛在性結核)。概略估算世界上新發生全結核患者有940萬人,其中200萬人死亡。現況中,活動性結核患者的中約95%住在開發中國家,結核所造成的死者有99%集中在開發中國家。
1990年代以後,重新發現結核仍為世界上最大規模的感染症,以開發中國家為中心持續增加,而出現了正式的對策。以世界衛生組織(WHO)為中心而展開短程直接觀察治療法(DOTS:Directly Observed Treantment Short-couse),當事國、援助國及援助機構為了聯合進行防治而設立了「終止結核病夥伴組織」,在資金方面支援的系統成立了「全球愛滋、結核和瘧疾防治基金會」等,藉此,世界各國逐漸開始合作進行結核的防治。在結核防治之中,目前的技術整體而言,數十年未改善而持續使用的情形很多。因此,為了在開發中國家發揮出效果,新技術的開發成為當務之急。
結核的診斷,最重要的是早期發現結核菌的感染並且導入治療。特別是在排菌狀態的患者,使感染擴大至周圍的風險非常高,因此必須隔離在與周圍沒有接觸的環境來進行治療。為此進行的檢查已有「細菌學的結核診斷」,其中,以痰液抹片檢查最為普及。
痰液抹片檢查是直接以顯微鏡觀察檢查痰液抹片標本的方法(痰液抹片標本的直接鏡檢法),在一個世紀以前由羅伯.柯霍所確立的方法。將臨床檢查試樣中的結核病原體染色,而藉此鑑定分枝桿菌。現在使用的結核的診斷
法,實質上是使用柯霍所利用的技術來確立。結核菌抹片檢查為開發中國家的標準結核診斷法,並且為評估新檢查法的性能時的基準。
關於靈敏度高於痰液抹片檢查的方法,已確立了基因增幅法。基因增幅法是使用DNA聚合酶,以連鎖反應的方式使特定的DNA增幅之方法。原理為藉由使用欲增幅的DNA、與其兩端的序列互補的一對的DNA引子及耐熱性DNA聚合酶,重覆改變溫度,使欲檢查的DNA增幅。該基因增幅法雖然在靈敏度上令人滿意,但是在操作性、設備、價格層面看來,難以使用在開發中國家。
最近世界的動向,以多劑耐性結核的蔓延為背景,而開始關心培養檢查或核酸增幅檢查的必要性。然而,在各種細菌學的診斷法中,痰液抹片檢查(痰液的直接鏡檢法)依然在結核防治策略的核心位置。尤其是在結核蔓延且資源缺乏的開發中國家,痰液抹片檢查為有效的診斷方法,不僅如此,在判定治療效果的手段方面也扮演重要的角色。
像這樣,痰液抹片檢查為結核防治的基本策略的核心,儘管如此,在許多開發中國家,細菌學檢查從業人員的人數為絕對不足,其素質方面也被認為有很多問題。此檢查的有效性需依賴檢查技師的技術,因此必須進行日常訓練及品質管理,這會使得全體費用大幅增加。另外,在開發中國家仍然有許多檢查室的環境、檢查器具、檢查技術等的整建上所必然產生的社會基礎方面的課題,這些
要素複雜地牽連,就結果而言,對於檢查的品質造成許多不良影響。
再者,痰液抹片檢查是用來檢測、鑑定分枝桿菌的檢查,而並非檢測結核菌的方法,因此不能以該檢查來鑑定結核菌。
已開發國家的結核治療,是在鑑定結核菌之後,開始利用藥劑進行治療,相對於此,在開發中國家進行的DOTS計畫中,若在痰液抹片檢查檢測到分枝桿菌,則不進行結核菌的鑑定即開始利用藥劑進行治療。此處,結核菌感染症與非結核性分枝桿菌感染症所使用的藥劑不同,但是基本上對於非結核性分枝桿菌治療效果高的藥仍未被開發出來,因此是藉由對結核菌的藥劑進行治療。因此,患者會遭遇藥劑產生副作用這樣的風險。關於該風險代表性的例子,有報告指出肝臟機能的降低或失明等的嚴重副作用、或藥劑耐性非結核性分枝桿菌的蔓延等。
像這樣,以往的結核診斷或其治療法存在幾個問題點,然而在現況上,在1882年所開發出的柯霍痰液抹片檢查法並未經過大幅改良,而仍使用於結核的診斷。為了解決開發中國家、新興國家的檢查室的環境、檢查器具、檢查技術等所必然產生的社會基礎方面的課題,而考慮「確立在整建電源或設施受到限制的場所將檢體集中,高流通量且高靈敏度、低價的檢查方法」或「確立不使用須要電源的機器,且高靈敏度、迅速、簡便、低價的定點照護測試(POCT)」這兩個對策。
即使在開發中國家、新興國家,如果是受限的極小部分的地區也會整建電源或設施。另外,在這種地區已存在可進行較高度檢查的檢查中心,一部分富裕階層的患者可利用。藉由利用這種檢查中心,可解決檢查室的環境、檢查器具、檢查技術、人才等的課題。此情況下,必須由患者或診療現場將痰液檢體運送至檢查中心。在基因增幅檢查或培養檢查所使用的痰液檢體的運送方面存在幾個大的限制。為了防止污染或雜菌增殖,在採痰後必須迅速以冷藏狀態運送。另外,在培養檢查時,保持在菌體可增殖的狀態是很重要的,因此必須比基因檢查更加注意。再者,對檢體實施熱處理等的滅菌操作的情況,這兩種檢查會變得無法實施,因此必須在嚴格管理的狀況下運送檢體。對於這種檢體運送的限制,開發中國家、新興國家仍未建立相對應的系統,因此確立一種即使是實施滅菌操作的檢體也能夠進行檢測的測定方法變得很重要。
在POCT的情況,在臨床現場能夠以短時間且不使用特別的設施或器具進行測定是很重要的。POCT最廣泛應用的技術是免疫層析測試(ICT)。一般認為,ICT與ELISA等的免疫測定方法相比,靈敏度較差。所以,為了藉由POCT解決課題,重要的是建立出能夠以高靈敏度檢測的測定系統。此外,在POCT的情況,難以採用在檢查中心等使用安全櫃以防止檢查從業人員感染的策略,因此為了降低受到檢體感染的風險,必須進行滅菌處理。
如以上所述,為了「確立在整建電源或設施受到
限制的場所將檢體集中,高流通量且靈敏度高、低價的檢查方法」或「確立不使用須要電源的機器且靈敏度高、迅速、簡便、低價的POCT」,必須制定出能夠以高靈敏度對滅菌檢體進行檢測的測定方法。因此標的抗原的選擇很重要。關於結核菌特異的抗原,有文獻報告出Ag85等的蛋白抗原。然而,蛋白抗原在生物體內會快速分解.消化,而難以得到靈敏度。
分枝桿菌中主要的抗原為細胞膜及細胞壁的主要構成成分的糖脂質。糖脂質抗原在生物體內的安定性高,因此被認為是其中一個有利用價值標的抗原。其中,LAM被認為占菌體成分的15%,在含量上是受到矚目的抗原。有文獻報告指出,為了檢測生物體檢體中的分枝桿菌LAM,而製作了幾種PoAb及MoAb(參照非專利文獻1~4)。其中的幾種是應用於用以檢測痰液或尿中的脂阿拉伯甘露糖(以下亦稱為「LAM」)的ELISA。然而,分枝桿菌中的LAM,其基本構造幾乎相同,只有在帶甘露糖帽的構造觀察到微小的差異。特別是分枝桿菌感染症的病原菌中,僅次於結核菌的Mycobacterium avium,其帶甘露糖帽構造也被認為幾乎相同(參照非專利文獻5)。所以希望有一種即使在分枝桿菌之中也能夠專一性地檢測結核菌的LAM的單株抗體。
非專利文獻1:Aharona Glatman-Freedman, et al.,
“Monoclonal antibodies to surface antigens of Mycobacterium tuberculosis and their use in a modified Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay for detection of Mycobacteria.”, Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1996, p.2795-2802
非專利文獻2:Lenka M. Pereira Arias-Bouda, et al.,“Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples.”, Journal of Clinical Microbiology, June 2000, p.2278-2283
非專利文獻3:Beston Hamasur, et al., “Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of maycobacterial lipoarabinomannan in urine.” Journal of Microbiological Methods, 45,2001, p.41-52
非專利文獻4:C. Boehme, et al., “Detection of mycobacterial lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis.”, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99, 2005, p.893-900
非專利文獻5:Lipoarabinomannans: from structure to biosynthesis. Jerome Nigou, Martine Gilleron, germain Puzo., Biochimine 85 (2003) 153-166
非專利文獻6:Winter et.al, Annu. Rev. Immunol., 12:433, 1994
非專利文獻7:K. Zuberbuhler, Protein Engineering,
Design & Selection, 22, 169 (2009)
本發明目的為提供一種與分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖(以下亦稱為「LAM」)專一性地結合的單株抗體(以下亦簡稱「MoAb」),特別是單鏈抗體及其多價抗體。
另外,本發明目的為提供一種使用該抗體之分枝桿菌檢測方法或結核診斷法;以及該方法所使用的分枝桿菌檢測劑(例如結核診斷劑)及分枝桿菌檢測用套組(例如結核診斷用套組)。
此外,本發明目的為提供一種使用該抗體判定抗結核藥對於結核的治療效果之方法;以及用以判定該方法所使用的抗結核藥的治療效果的套組。
本發明人等針對免疫動物、免疫源、以及MoAb的製作技術及選擇方法進行研究,區別出分枝桿菌LAM和其他細菌的LAM或具有與其類似的構造的膜抗原,成功地確立了能夠專一性地且以匹敵基因增幅法的高靈敏度進行檢測的抗體及測定方法。另外,本發明人等還成功地確立了一種可區別出非結核性分枝桿菌LAM,而專一性地檢測出結核菌LAM的抗體及測定方法。
亦即,本發明包括下述實施形態。
(I)與分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖(LAM)專一性
地結合的單株抗體
(I-1)一種單株抗體,其係如下述(A)~(C)之任一者所記載,且對於分枝桿菌的LAM具有結合性:(A)含有下述(a)~(c)的重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(d)~(f)的輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的單株抗體:(a)由序列號碼1所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(b)由序列號碼2所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(c)由序列號碼3所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(d)由序列號碼4所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(e)由序列號碼5所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(f)由序列號碼6所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3;(B)含有下述(g)~(i)的重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(j)~(l)的輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的單株抗體:(g)由序列號碼31所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(h)由序列號碼32所表示的胺基酸序列所構成的重鏈
CDR2、(i)由序列號碼33所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(j)由序列號碼34所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(k)由序列號碼35所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(l)由序列號碼36所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3(C)含有下述(m)~(o)的重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(p)~(r)的輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的單株抗體:(m)由序列號碼47所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(n)由序列號碼48所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(o)由序列號碼49所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(p)由序列號碼50所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(q)由序列號碼51所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(r)由序列號碼52所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3。
(I-2)如(I-1)記載之單株抗體,其中,(A)所記載之單株抗體的重鏈可變區域係由序列號碼7所表示的胺基酸序列所構成。
(I-3)如(I-1)或(I-2)所記載之單株抗體,其中,(A)所記載之單株抗體的輕鏈可變區域係由序列號碼8所表示的胺基酸序列所構成。
(I-4)如(I-1)至(I-3)之任一者所記載之單株抗體,其中,(A)所記載之單株抗體的連接子係具有序列號碼11所表示的胺基酸序列。
(I-5)如(I-1)至(I-4)之任一者所記載之單株抗體,其中,(A)所記載之單株抗體為由序列號碼12所表示的胺基酸序列所構成。
(I-6)如(I-1)至(I-5)之任一者所記載之單株抗體,其中,(A)所記載之單株抗體係對於結核菌甚至人型結核菌(M.tuberculosis)的LAM具有專一性地結合性的單株抗體。
(I-7)如(I-1)記載之單株抗體,其中,(B)所記載之單株抗體的重鏈可變區域係由序列號碼37所表示的胺基酸序列所構成。
(I-8)如(I-1)或(I-7)所記載之單株抗體,其中,(B)所記載之單株抗體的輕鏈可變區域係由序列號碼38所表示的胺基酸序列所構成。
(I-9)如(I-1)、(I-7)及(I-8)之任一者所記載之單株抗體,其中(B)所記載之單株抗體的連接子係具有序列號
碼40所表示的胺基酸序列。
(I-10)如(I-1)、及(I-7)至(I-9)之任一者所記載之單株抗體,其中,(B)所記載之單株抗體係由序列號碼39所表示的胺基酸序列所構成。
(I-11)如(I-1)記載之單株抗體,其中,(C)所記載之單株抗體的重鏈可變區域係由序列號碼53所表示的胺基酸序列所構成。
(I-12)如(I-1)或(I-11)所記載之單株抗體,其中,(C)所記載之單株抗體的輕鏈可變區域係由序列號碼54所表示的胺基酸序列所構成。
(I-13)如(I-1)、(I-11)及(I-12)之任一者所記載之單株抗體,其中,(C)所記載之單株抗體的連接子係具有序列號碼11所表示的胺基酸序列。
(I-14)如(I-1)、及(I-11)至(I-13)之任一者所記載之單株抗體,其中,(C)所記載之單株抗體係由序列號碼30所表示的胺基酸序列所構成。
(I-15)如(I-1)、及(I-7)至(I-14)之任一者所記載之單株抗體,其中,(B)或(C)所記載之單株抗體對於非結核性分枝桿菌具有結合性。
(I-16)如(I-1)至(I-15)之任一者所記載之單株抗體,其中,(A)~(C)之任一者所記載之單株抗體係一價或二價之抗體。
(II)一種非人動物的免疫方法,其係用以製造與分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖(LAM)專一性地結合的單株
抗體;及該單株抗體的製造方法
(II-1)一種非人動物的免疫方法,其係包括藉由對於非人動物投予BCG作為免疫原,誘導出對於BCG的體液性免疫反應之步驟,並且用以製造與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體。
(II-2)如(II-1)所記載之免疫方法,其中,非人動物為兔子或雞。
(II-3)如(II-1)或(II-2)所記載的免疫方法,其中,分枝桿菌係結核菌甚至人型結核菌(M.tuberculosis)。
(II-4)一種與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體的製造方法,其係包括:藉由對於非人動物投予BCG作為免疫原,誘導出對於BCG的體液性免疫反應,而產生與分枝桿菌的LAM結合的抗體之步驟;及由該非人動物採取產生該抗體的細胞之步驟。
(II-5)一種與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體的製造方法,其係包括:藉由對非人動物投予BCG作為免疫原,誘導出對於BCG的體液性免疫反應之步驟;由該非人動物調製出對應於與分枝桿菌的LAM結合的抗體的mRNA之步驟;以該mRNA作為模板調製出cDNA之步驟;及藉由使用該cDNA的噬菌體展示法,採取與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體之步驟。
(II-6)如(II-4)或(II-5)所記載之製造方法,其中,非人動物為兔子或雞。
(II-7)如(II-4)至(II-6)之任一者所記載之製造方法,其中,分枝桿菌係結核菌甚至人型結核菌(M.tuberculosis)。
(II-8)如(II-4)至(II-7)之任一者所記載之製造方法,其中,與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體為(I-1)至(I-12)之任一者所記載之單株抗體。
(II-9)如(II-4)至(II-8)之任一者所記載之製造方法,其中,與結核菌甚至人型結核菌(M.tuberculosis)的LAM專一性地結合的單株抗體係如(I-1)至(I-6)中的(A)所記載之單株抗體。
(II-10)一種與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體的製造方法,其係包括:藉由對非人動物投予如(I-1)至(I-6)之(A)所記載之單株抗體與LAM的複合體作為免疫原,誘導出對於該複合體的體液性免疫反應,而產生與分枝桿菌的LAM結合的抗體之步驟、及由該非人動物採取產生該抗體的細胞之步驟。
(II-11)一種與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體的製造方法,其係包括:藉由對非人動物投予如(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體與LAM的複合體作為免疫原,誘導出對於該複合體的體液性免疫反應之步驟、
由該非人動物調製出對應於與分枝桿菌的LAM結合的抗體的mRNA之步驟、以該mRNA作為模板調製出cDNA之步驟、及藉由使用該cDNA的噬菌體展示法,採取與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體之步驟。
(II-12)如(II-10)或(II-11)所記載之製造方法,其中與分枝桿菌的LAM專一性地結合的單株抗體為(I-1)或(I-7)至(I-12)之任一者所記載之(B)之單株抗體。
(III)分枝桿菌甚至結核菌的檢測方法(III-1)一種分枝桿菌甚至結核菌的檢測方法,其係包含下述步驟:(1)使(I-1)至(I-16)之任一者所記載之單株抗體與受試者的生物體試樣接觸之步驟;及(2)以上述單株抗體與分枝桿菌甚至結核菌的LAM的結合反應作為指標,測定受測試樣中所存在的分枝桿菌甚至結核菌之步驟。
(III-2)如(II-1)所記載之檢測方法,其中,上述結核菌的檢測方法為使用如(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體之方法。
此外,該檢測方法之中、結核菌的檢測方法可改稱為診斷受試者有無罹患結核之方法(結核診斷方法)。
(IV)結核診斷劑或診斷用套組
(IV-1)一種結核診斷劑,其係含有如(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體。
(IV-2)一種結核診斷用套組,其係含有如(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體作為結核菌檢測試劑。
(V)分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)之測定方法(V-1)一種測定受測試樣中的分枝桿菌LAM之方法,其係包括下述步驟:(1)使如(I-1)至(I-16)之任一者所記載之單株抗體與可含有分枝桿菌的受測試樣接觸之步驟;及(2)以上述單株抗體與分枝桿菌的LAM的結合反應作為指標,測定受測試樣中所存在的分枝桿菌LAM之步驟。
(V-2)如(V-1)記載之方法,其中,上述測定方法的步驟(2)係包括檢測分枝桿菌LAM之步驟之分枝桿菌LAM的定性方法,或步驟(2)係包括對於分枝桿菌LAM進行定量之步驟之分枝桿菌LAM的定量方法。
(V-3)如(V-1)或(V-2)所記載之方法,其中,上述分枝桿菌係結核菌甚至人型結核菌(M.tuberculosis)。
(V-4)如(V-3)所記載之方法,其中,單株抗體採用如(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體。
(VI)分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)之檢測劑或檢測用套組
(VI-1)一種分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖檢測劑,其係含有如(I-1)至(I-16)之任一者所記載之單株抗體。
(VI-2)一種分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖檢測劑,其中,單株抗體係(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之
單株抗體。
(VI-3)如(VI-2)所記載之方法,其中,上述分枝桿菌係結核菌甚至人型結核菌(M.tuberculosis)。
(VI-4)一種分枝桿菌的LAM檢測用套組,其係含有如(I-1)至(I-16)之任一者所記載之單株抗體作為分枝桿菌的LAM檢測用試劑。
(VI-5)如(VI-4)所記載之分枝桿菌的LAM檢測用套組,其中,單株抗體係(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體。
(VI-6)如(VI-5)所記載之分枝桿菌的LAM檢測用套組,其中,上述分枝桿菌係結核菌甚至人型結核菌(M.tuberculosis)。
(VII)對滅菌檢體的測定方法
(VII-1)一種對於受測試樣測定分枝桿菌感染的有無之方法,其係包括下述步驟:(1)將檢體試樣高熱煮沸滅菌甚至高壓蒸氣滅菌之步驟;(2)使如(I-1)至(I-16)之任一者所記載之單株抗體甚至如(I-1)至(I-6)或(I-7)至(I-10)之任一者所記載之(A)或(B)之單株抗體分別與滅菌處理後的受測試樣接觸之步驟;(3)以上述本發明之單株抗體與分枝桿菌LAM的結合反應作為指標,測定受測試樣中的分枝桿菌LAM之步驟;及(4)在受測試樣檢測到分枝桿菌LAM的情況,判斷為受測試樣感染到分枝桿菌之步驟。
(VII-2)如(VII-1)所記載之測定方法,其中,上述單株抗體係(I-1)至(I-6)或(I-7)至(I-10)之任一者所記載之(A)或(B)之單株抗體,上述分枝桿菌係結核菌。
(VIII)判定抗結核藥的結核治療效果之方法
(VIII-1)一種判定抗結核藥的結核治療效果之方法,其係包含下述步驟:(1)使如(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體分別與抗結核藥投予前後的受測試樣接觸之步驟;(2)以上述單株抗體與結核菌的LAM的結合反應作為指標,測定抗結核藥投予前後的受測試樣中的結核菌LAM之步驟;及(3)在抗結核藥投予前的受測試樣檢測到結核菌LAM,且抗結核藥投予後的受測試樣並未檢測到結核菌LAM的情況,判定為抗結核藥具有結核治療效果之步驟。
(VIII-2)一種判定抗結核藥的結核治療效果之方法,其係包含下述步驟:(1)使如(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體分別與抗結核藥投予前後的受測試樣接觸之步驟、(2)以上述單株抗體與結核菌的LAM的結合反應作為指標,對於抗結核藥投予前後的受測試樣中的結核菌LAM進行定量之步驟、及(3)比較抗結核藥投予後的受測試樣中的結核菌LAM量(投予後的測定值)與抗結核藥投予前的受測試樣中的結核菌LAM量(投予前的測定值),投予後測定值低於投予前
的測定值的情況,判定為抗結核藥具有結核治療效果,其他情況判定為抗結核藥沒有結核治療效果之步驟。
(IX)抗結核藥的結核治療效果判定用套組
(IX)一種抗結核藥的結核治療效果判定用套組,其係含有如(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體。
(X)分枝桿菌(結核菌)檢測工具
(X-1)一種分枝桿菌甚至結核菌檢測工具,其係具備由可藉由毛細現象運送受測試樣的材料所構成的吸液片之分枝桿菌甚至結核菌檢測工具,其特徵為:該吸液片係具備:(1)吸收採取受測試樣的試樣採取部、(2)擔持與分枝桿菌的LAM專一性地反應且經過標記的如(I-1)至(I-16)之任一者所記載之單株抗體的標記抗體部、(3)具備下述所表示之測試結果顯示部之判定部、(a)將與分枝桿菌的LAM專一性地反應,未經過標記的如(I-1)至(I-16)之任一者所記載之單株抗體固定的測試結果顯示部、(4)將移動至上述試樣採取部、標記抗體部及判定部的受測試樣的殘液加以吸收的液體吸收部。
(X-2)如(X-1)記載之分枝桿菌甚至結核菌檢測工具,其中,上述(3)判定部係在距離(a)測試結果顯示部一段間隔進一步具備下述所表示之控制組顯示部:(b)將與經過標記的如(I-1)至(I-16)之任一者所記載
之單株抗體反應的未標記-抗體固定的控制組顯示部。
(X-3)如(X-1)或(X-2)所記載之分枝桿菌檢測工具,其中,上述單株抗體係(I-1)至(I-6)之任一者所記載之(A)之單株抗體,分枝桿菌係結核菌甚至人型結核菌(M.tuberculosis)。
依據本發明,能夠與其他菌具有專一性,而檢測出受試者的生物體試樣(痰液、唾液、血液、肺洗淨液、胃液、尿、糞便、皮膚或胰液)中所存在的分枝桿菌。本發明之分枝桿菌的檢測方法,係具有與利用基因增幅法的檢測方法同等的靈敏度與專一性。另外,依據本發明之分枝桿菌的檢測方法亦可決定生物體內的分枝桿菌量,因此亦可監測分枝桿菌甚至結核的治療效果。進一步依據本發明之分枝桿菌的檢測方法,即使在對作為測定對象的檢體實施滅菌處理後的情況,只要在滅菌處理後至少1週以內,仍可安定且高精密度地檢測出分枝桿菌。因此,即使在並未整建用來防止感染的特別檢體運送系統的地區,亦可藉由對檢體實施滅菌處理進行郵送等的一般的檢體運送。
另外,依據本發明之合適形態,可區別出非結核性分枝桿菌,而專一性地檢測出結核患者的生物體試樣中所存在的結核菌。因此,藉由本發明,能夠以高精密度診斷出有無結核菌感染。另外,還能夠以高精密度判定抗結核藥對於結核患者的治療效果。
10‧‧‧支持體
21‧‧‧構成試樣採取部(1)之薄片
22‧‧‧構成標記抗體部(2)之薄片
23‧‧‧構成判定部(3)之薄片
24‧‧‧構成液體吸收部(4)之薄片
(a)‧‧‧測試結果顯示部
(b)‧‧‧控制組顯示部
(1)‧‧‧試樣採取部
(2)‧‧‧標記抗體部
(3)‧‧‧判定部
(4)‧‧‧液體吸收部
P‧‧‧表示受測試樣的流動方法的箭號
圖1的(A)及(B)皆為表示本發明之結核菌檢測工具(結核菌LAM檢測工具)的一個形態之圖(由橫向觀察之圖)。圖(A)係判定部(3)僅具有測試結果顯示部(a)的形態,圖(B)係判定部(3)含有測試結果顯示部(a)與控制組顯示部(b)兩者的形態。符號10:支持體、符號21:構成試樣採取部(1)之薄片、符號22:構成標記抗體部(2)之薄片、符號23:構成判定部(3)之薄片、符號24:構成液體吸收部(4)之薄片、(a):測試結果顯示部、(b):控制組顯示部、(1):試樣採取部、(2):標記抗體部、(3):判定部、(4):液體吸收部、P:表示受測試樣的流動方法的箭號(圖2亦相同)。
圖2表示本發明之結核菌檢測工具(結核菌LAM檢測工具)的一個形態之圖(斜視圖)。
圖3表示對於分別以BGC疫苗及H37Ra死菌體進行皮下免疫的兔子的血中抗體價,藉由使用分別將M.tuberculosis LAM(-■-)及M.avium LAM(-●-)固相化的抗原盤的ELISA法進行測定的結果(參考例1(2))。(A)表示以BGC疫苗免疫的兔子的結果,(B)表示對於H37Ra死菌體免疫的兔子的結果。
圖4表示LAM反應性scFv的胺基酸序列。具體而言,上段為由以HR37Ra死菌體免疫的兔子的脾臟細胞所製作出的scFv(Myco-scFv)的胺基酸序列(序列號碼30),下段為由以BCG疫苗免疫的兔子的脾臟細胞所製作出的scFv(TB-scFv)的胺基酸序列(序列號碼12),分別與重鏈可變區域的CDR1~CDR3區域、連接子、及輕鏈可變區域的
CDR1~CDR3區域的位置作比較。此外,N末端結合4個絲胺酸殘基的連接子序列的N末端側的胺基酸區域表示VH區域,C末端側的區域表示VL區域。
圖5表示TB-scFv的LAM反應性評估的結果。對於由以BCG疫苗免疫的兔子所製作出的TB-scFv的LAM的反應性,使用將M.tuberculosis LAM及M.avium LAM固相化的盤,藉由ELISA進行評估。■表示對M.tuberculosis LAM的反應性、●表示對M.avium的反應性。
圖6表示分枝桿菌LAM檢測ELISA及結核菌LAM檢測ELISA的評估的結果。對於分枝桿菌LAM檢測ELISA及結核菌LAM檢測ELISA對LAM的反應性,使用純化的M.tuberculosis LAM及M.avium LAM進行評估。●表示分枝桿菌LAM檢測ELISA對M.tuberculosis LAM的反應性、■表示分枝桿菌LAM檢測ELISA對M.avium的反應性、○表示結核菌LAM檢測ELISA對M.tuberculosis LAM的反應性、□表示結核菌LAM檢測ELISA對M.avium LAM的反應性。
圖7A~D表示抗體組合的評估結果。藉由分枝桿菌LAM檢測ELISA及結核菌LAM檢測ELISA,並使用分枝桿菌臨床分離株,進行抗體組合的評估。對各株的反應性,係藉由色的濃淡來表示。myco表示分枝桿菌LAM檢測ELISA、TB表示結核菌LAM檢測ELISA的結果。
圖8表示分枝桿菌LAM檢測免疫層析測試及結核菌LAM檢測免疫層析測試的評估結果。分枝桿菌LAM檢測免疫層析測試及結核菌LAM檢測免疫層析對LAM的反應
性,是使用純化的M.tuberculosis LAM(A及B)、及M.avium LAM(C及D)進行評估。圖中,「myco」表示分枝桿菌LAM檢測免疫層析測試、「TB」表示結核菌LAM檢測免疫層析測試。
圖9表示雞抗血清對於LAM的抗體價(實施例5)。-●-表示對純化的結核菌(M.tuberculosis)青山B株的LAM的反應性、-■-表示對純化的M.avium的LAM的反應性。
圖10表示由雞scFv庫所分離出的單鏈抗體G3-scFv之胺基,並且一併表示重鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3區域、GS連接子區域,以及輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3區域的位置。
圖11表示利用二價抗體的LAM檢測用ELISA之反應性(實施例7)。-●-表示結核菌LAM檢測用ELISA對BCG的反應性、-■-表示分枝桿菌LAM檢測用ELISA對BCG的反應性。
圖12表示利用二價抗體的分枝桿菌LAM檢測用ELISA的檢測靈敏度(實施例8)。圖中的表是比較基因增幅檢查(NAAT)與分枝桿菌LAM檢測用ELISA的檢測靈敏度。
圖13表示分枝桿菌LAM檢測用ELISA與口腔內細菌的交差反應性測試的結果(實施例9)。圖中,「Na」意指N.asteroids、「Nf」意指N.faroinica、「Sg」意指Streptomyces、「Ca」意指C.albicans、「Ai」意指actinomycete、「Tp」意指T.paurometabolum的菌體。並且表示使用由該等的培養菌體及BCG培養菌體分別萃取出的LAM,進行分枝桿菌
LAM檢測用ELISA的結果。
圖14表示利用二價抗體的LAM檢測ELISA對分枝桿菌臨床分離的反應性(實施例10)。圖中,A表示結核菌臨床分離株38株的測定結果,B表示非結核性分枝桿菌29株(M.avium 23株、M.intracellulare 6株)的測定結果。A及B的圖中,黑柱表示分枝桿菌LAM檢測用ELISA的測定結果,白柱表示結核菌LAM檢測用ELISA的測定結果。在B之非結核性分枝桿菌29株中,1~23號為M.avium 23株、24~29號為M.intracellulare 6株的結果。
圖15表示分枝桿菌LAM檢測用ELISA與結核菌LAM檢測用ELISA的反應性的比率(分枝桿菌LAM檢測用ELISA值/結核菌LAM檢測用ELISA值)。
圖16表示利用二價抗體的分枝桿菌LAM檢測用ELISA(右圖)及結核菌LAM檢測用ELISA(左圖)對臨床痰液檢體的反應性(實施例11)。I表示Smear test(直接抹片檢查)陰性且基因增幅檢查陰性的檢體群,II表示Smear test為scanty且基因增幅檢查陰性的檢體,III表示Smear test陰性且基因增幅檢查陽性的檢體群,IV表示Smear test為scanty且基因增幅檢查陽性的檢體群,V表示Smear test為1+的檢體群,VI表示Smear test為2+的檢體群,VII表示Smear test為3+的檢體群的結果。此外,Smear test為1+以上的檢體全部的基因增幅檢查為陽性。另外,虛線表示暫定的截止值。
圖17表示LAM檢測用ELISA所檢測到的LAM濃度與菌體量的相關關係(實施例11)。I表示Smear test陰性且基因增
幅檢查陰性的檢體群、II表示Smear test陰性且基因增幅檢查陽性的檢體群、III表示Smear test為scanty且基因增幅檢查陽性的檢體群、IV表示Smear test為1+的檢體群、V表示Smear test為2+的檢體群、VI表示Smear test為3+的檢體群的結果。此外,Smear test為1+以上的檢體表示全部的基因增幅檢查為陽性。另外,標線表示各檢體群中的LAM濃度的平均值。
圖18表示分枝桿菌的LAM對於滅菌處理的安定性。白柱表示並未進行滅菌處理的菌體、黑柱表示在100℃下煮沸處理30分鐘後的菌體、灰色柱表示高壓蒸氣滅菌(在高壓滅菌釜中以121℃滅菌15分鐘)處理後的菌體的測定結果(實施例12)。
圖19表示高壓蒸氣滅菌(高壓滅菌釜)處理後的LAM保存安定性。白柱表示對於剛完成高壓蒸氣滅菌處理後的菌體進行測定的結果,黑柱表示高壓蒸氣滅菌處理後在25℃放置7天的菌體的測定結果(實施例12)。
(I)與分枝桿菌LAM專一性地結合的單株抗體
結核菌是屬於分枝桿菌科分枝桿菌屬(Mycobacterium),與其他分枝桿菌屬細菌一起被稱為分枝桿菌的細菌群的一種。但是,在37℃下可增殖但是在28℃下不會增殖這點,以及具有耐熱性的過氧化氫酶這點等,與其他分枝桿菌(非結核性分枝桿菌)有所區別。該結核菌已
知有結核菌(Mycobacterium tuberculosis、人型結核菌)、牛型結核菌(M.bovis、牛型菌、牛菌)、非洲結核菌(M.africans)、鼠型結核菌(M.microti)這4種。其中,人型結核菌(M.tuberculosis)除了作為結核的病原菌對人表現出病原性之外,M.bovis與M.africans偶爾會感染人。M.microti對人不具有病原性。另外,將M.bovis長時間繼代培養而弱毒化的菌為BCG,可利用在預防結核的疫苗(弱毒生菌疫苗)。
本發明為一種抗體,其特徵為:作為對象的單株抗體(以下亦稱為「MoAb」),可區別生物體內所存在的其他菌,專一性地辨識出分枝桿菌。較具體而言為一種抗體,其特徵為:可區別分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖(LAM)與其他細菌的LAM類似抗原,而與分枝桿菌的LAM專一性地結合。此處LAM為以結核菌為首的分枝桿菌屬的細菌(分枝桿菌)中構成細胞壁或細胞膜的一個主要的脂聚糖。LAM通常含有甘露糖基磷脂醯肌醇錨勾(MPI)、包括D-甘露糖核心及D-阿拉伯聚醣區段的糖主幹與帽蓋結構組件,而分子內所含有的糖(例如甘露糖)殘基數目、糖鏈的分枝構造、醯基的數目、及構成醯基的脂肪酸的種類,會隨著菌的種類而有所不同。
具體而言,在本發明之MoAb中含有一種抗體,其係具有含有下述(a)~(c)的重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(d)~(f)的輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的構造。方便上亦將該MoAb稱為
「MoAb1」。
(a)由序列號碼1所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(b)由序列號碼2所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(c)由序列號碼3所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(d)由序列號碼4所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(e)由序列號碼5所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(f)由序列號碼6所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3。
另外,具體而言,在本發明之MoAb中亦含有一種抗體,其係具有含有下述(g)~(i)的重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(j)~(l)的輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的構造。方便上亦將該MoAb稱為「MoAb2」。
(g)由序列號碼31所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(h)由序列號碼32所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(i)由序列號碼33所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、
(j)由序列號碼34所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(k)由序列號碼35所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(l)由序列號碼36所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3。
此外,具體而言,在本發明之MoAb中還含有一種抗體,其係具有含有下述(m)~(o)的重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(p)~(r)的輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的構造。方便上亦將該MoAb稱為「MoAb3」。
(m)由序列號碼47所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(n)由序列號碼48所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(o)由序列號碼49所表示的胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(p)由序列號碼50所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(q)由序列號碼51所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(r)由序列號碼52所表示的胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3。
此處“CDR"是“Complementarity Determining
Reagion"的簡稱,亦被稱為互補性決定區域。CDR是指免疫球蛋白的可變區域所存在的區域,且為與抗體所具有的對於抗原的特異結合有深切關連的區域。其中,“重鏈CDR"意指免疫球蛋白的重鏈的可變區域所存在的CDR,“輕鏈CDR”意指免疫球蛋白的輕鏈可變區域所存在的CDR。
重鏈可變區域係含有上述重鏈CDR1~CDR3的區域,另外,輕鏈可變區域係含有上述輕鏈CDR1~CDR3的區域。該等CDR1~CDR3的配置順序並未受到特別限制,而重鏈可變區域或輕鏈可變區域任一者皆宜為由N側往C側的方向,依照CDR1、CDR2及CDR3的順序連續或隔著其他胺基酸序列而配置。
本發明之MoAb的重鏈可變區域或/及輕鏈可變區域,在上述可變區域中,上述CDR1~CDR3以外的區域可具有稱為架構區(以下簡稱為「FR」)的胺基酸序列作為其他胺基酸序列。該FR的胺基酸序列,可為來自免疫球蛋白的重鏈可變區域或輕鏈可變區域的架構區(FR)的胺基酸序列本身,或可為其突變體,甚至還可在來自FR的胺基酸序列的一部分導入限制酵素辨識部位等,使其一部分改變。
在免疫球蛋白的重鏈可變區域之中,例如分別將重鏈可變區域的N末端與上述CDR1之間的區域定義為「FR1」、CDR1與CDR2之間的區域定義為「FR2」、CDR2與CDR3之間的區域定義為「FR3」、CDR3與重鏈可變區域的C末端之間的區域定義為「FR4」。另外同樣地,在免疫球蛋白的輕鏈可變區域之中,例如分別將輕鏈可變區域的N
末端與上述CDR1之間的區域定義為「FR1」、CDR1與CDR2之間的區域定義為「FR2」、CDR2與CDR3之間的區域定義為「FR3」、「CDR3」與可變區域的C末端之間的區域定義為「FR4」。
這些FR係具有連接子的機能而分別將重要的抗原辨識序列的上述CDR1、CDR2及CDR3連接的區域,且為有助於形成可變區域的立體構造的區域。
本發明之MoAb1的重鏈可變區域宜為具有由序列號碼7所表示的119胺基酸殘基所構成之胺基酸序列,另外,輕鏈可變區域宜為具有由序列號碼8所表示的112胺基酸殘基所構成之胺基酸序列。在表示重鏈可變區域的胺基酸序列的序列號碼7中,N末端至第30個的區域相當於重鏈可變區域的「FR1」、第31至35個胺基酸區域相當於重鏈可變區域的「CDR1」(序列號碼1)、第36至49個胺基酸區域相當於「FR2」、第50至65個胺基酸區域相當於「CDR2」(序列號碼2)、第66至96個胺基酸區域相當於「FR3」、第97至106個胺基酸區域相當於「CDR3」(序列號碼3)及第107至119個胺基酸區域相當於「FR4」。
此外,在表示本發明之MoAb1的輕鏈可變區域的胺基酸序列的序列號碼8中,N末端至第23個的區域相當於輕鏈可變區域的「FR1」、第24至36個胺基酸區域相當於輕鏈可變區域的「CDR1」(序列號碼4)、第37至51個胺基酸區域相當於「FR2」、第52至58個胺基酸區域相當於「CDR2」(序列號碼5)、第59至89個胺基酸區域相當於「FR3」、第90
至102個胺基酸區域相當於「CDR3」(序列號碼6)、及第103至112個胺基酸區域相當於「FR4」。
本發明之MoAb2的重鏈可變區域宜為具有由序列號碼37所表示的130胺基酸殘基所構成之胺基酸序列,另外,輕鏈可變區域宜為具有由序列號碼38所表示的116胺基酸殘基所構成之胺基酸序列。在表示重鏈可變區域的胺基酸序列的序列號碼37中,N末端至第35個的區域相當於重鏈可變區域的「FR1」、第36至40個胺基酸區域相當於重鏈可變區域的「CDR1」(序列號碼31)、第41至54個胺基酸區域相當於「FR2」、第55至74個胺基酸區域相當於「CDR2」(序列號碼32)、第75至106個胺基酸區域相當於「FR3」、第107至119個胺基酸區域相當於「CDR3」(序列號碼33)及第120至130個胺基酸區域相當於「FR4」。
此外,在表示本發明之MoAb2的輕鏈可變區域的胺基酸序列的序列號碼38中,N末端至,第20個的區域相當於輕鏈可變區域的「FR1」、第21至28個胺基酸區域相當於輕鏈可變區域的「CDR1」(序列號碼34)、第29至44個胺基酸區域相當於「FR2」、第45個至第51個胺基酸區域相當於「CDR2」(序列號碼35)、第52至83個胺基酸區域相當於「FR3」、第84至95個胺基酸區域相當於「CDR3」(序列號碼36)、及第96至116個胺基酸區域相當於「FR4」。
本發明之MoAb3的重鏈可變區域宜為具有由序列號碼53所表示的121胺基酸殘基所構成之胺基酸序列,另外,輕鏈可變區域宜為具有由序列號碼54所表示的110胺基
酸殘基所構成之胺基酸序列。在表示重鏈可變區域的胺基酸序列的序列號碼53中,N末端至第30個的區域相當於重鏈可變區域的「FR1」、第31至35個胺基酸區域相當於重鏈可變區域的「CDR1」(序列號碼47)、第36至49個胺基酸區域相當於「FR2」、第50至65個胺基酸區域相當於「CDR2」(序列號碼48)、第66至96個胺基酸區域相當於「FR3」、第97至108個胺基酸區域相當於「CDR3」(序列號碼49)及第109至121個胺基酸區域相當於「FR4」。
此外,在表示本發明之MoAb3的輕鏈可變區域的胺基酸序列的序列號碼54中,N末端至,第23個的區域相當於輕鏈可變區域的「FR1」、第24至34個胺基酸區域相當於輕鏈可變區域的「CDR1」(序列號碼50)、第35至49個胺基酸區域相當於「FR2」、第50至56個胺基酸區域相當於「CDR2」(序列號碼51)、第57至87個胺基酸區域相當於「FR3」、第88至100個胺基酸區域相當於「CDR3」(序列號碼52)、及第101至110個胺基酸區域相當於「FR4」。
這些序列號碼7、37及53所表示的重鏈可變區域的FR1~FR4所對應的胺基酸序列;以及序列號碼8、38及54所表示的輕鏈可變區域的FR1~FR4所對應的胺基酸序列,只要沒有損及本發明之MoAb1及MoAb2的效果,任一者皆可實施突變導入。此處「本發明之MoAb1、MoAb2及MoAb3的效果」,只要沒有特別提及,意指與分枝桿菌LAM的結合性,宜為與分枝桿菌LAM的特異結合性。其中,「本發明之MoAb1的效果」,意指與結核菌LAM的結合性,宜為
與結核菌LAM的特異結合性。該突變導入數皆不受特別限制,而突變導入數可設定為與突變前的胺基酸序列有85%以上的同源,宜為90%以上,較佳為95%以上,特佳為98%以上。此外,此處所謂的突變導入可列舉胺基酸的取代、缺損及插入。另外,在重鏈可變區域的FR1及/或輕重鏈可變區域的FR4亦可導入限制酵素辨識部位。
此外,上述MoAb1及MoAb3所表示之重鏈可變區域FR1~FR4及輕鏈可變區域FR1~FR4任一者皆為來自兔子的胺基酸序列,上述MoAb2所表示之重鏈可變區域FR1~FR4及輕鏈可變區域FR1~FR4任一者皆為來自雞的胺基酸序列,而只要不損及本發明之MoAb的效果,則來自任一動物的架構區皆可。該動物並未受到特別限制,可列舉例如人、兔子、雞、馬、母牛、山羊、綿羊、狗、小鼠、倉鼠、及大鼠等。宜為來自兔子、雞或人的胺基酸序列,較佳為人。此外,來自人的FR1~FR4的胺基酸序列已為周知(Kabat,et al.US Department of Health AND human Services,NIH(1991),USA),而被記載於例如NCBI的網站。
本發明之MoAb係具有包含上述構成的重鏈可變區域與輕鏈可變區域透過連接子接合而成的構造。此處的「連接子」只要不損及本發明之MoAb的效果,則並未受到特別限制,可列舉通常為由胺基酸數為8~30左右的胺基酸序列,宜為具有8~20左右的胺基酸序列,較佳為8~15左右的胺基酸序列所構成之連接子序列的胜肽。合適的連接子序列並未受到限制,而可列舉例如GS連接子序列
[(Gly-Gly-Gly-Ser:序列號碼9)n或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser:序列號碼10)n[n為重覆次數]等。理想的情況是使用具有重覆該GS連接子序列1~3次(n為1~3的整數)的序列的胜肽作為連接子。在後述實施例中,使用具有重覆上述GS連接子序列3次的序列(GGGGSGGGGSGGGGS:序列號碼11)的胜肽(實施例1)、及具有序列(GGGGSGGDGSGGGGS:序列號碼40)的胜肽(實施例6)作為連接子。
本發明之MoAb1的合適形態可列舉由序列號碼12所表示的胺基酸序列所構成之單鏈抗體。另外,MoAb2的合適形態可列舉由序列號碼39所表示的胺基酸序列所構成之單鏈抗體。此外,MoAb3的合適形態可列舉由序列號碼30所表示的胺基酸序列所構成之單鏈抗體。
在該本發明之單株抗體中含有一種抗體,其特徵為:可區別出非結核性分枝桿菌,而專一性地辨識出結核菌。較具體而言為一種抗體,其特徵為:區別出結核菌的脂阿拉伯甘露糖(LAM)與非結核性分枝桿菌的LAM,而與結核菌的LAM專一性地結合。該單株抗體可列舉前述MoAb1。此處,本發明之MoAb所能夠區別出非結核性分枝桿菌而專一性地辨識出來的結核菌,宜為人型結核菌(M.tuberculosis)及牛型結核菌(M.bovis),較佳為人型結核菌(M.tuberculosis)。
在以競爭法來比較對結核菌LAM的反應的情況,與結核菌LAM相比需要10倍以上的非結核性分枝桿菌LAM時,可對於結核菌LAM具有特異結合性。再者,本發
明之MoAb,在使用於固定化抗體與檢測抗體將LAM夾住以進行檢測的情況,非結核性分枝桿菌LAM相對於結核菌LAM的反應性降低至1/100以下時,可判斷為對於結核菌LAM較具有適合的結合專一性。
抗體的親和性可使用以往的技術測定例如125I標記IgG或其斷片的飽和結合等溫線、或如Analyzing Data with GraphPad Prizm(1999),GraphPad Software Onc.,San Diego,CA的Motilsky所記載般,可藉由使用非線性迴歸分析,利用未標記IgG進行125IgG的相同取代而輕易地測定。其他還可藉由當業界所周知的方法進行測定,而該方法可例示Scatchard et.al,Ann.NY Acd.Sci.,51,660(1949)所記載的方法。
本發明之MoAb並未受到限制,而可依照使用結核菌作為抗原的噬菌體展示法(G.Smith,Science,228,1315(1985))來製造。此處結核菌可列舉前述結核菌(Mycobacterium tuberculosis、人型結核菌)、牛型結核菌(M.bovis、牛型菌、牛菌)、非洲結核菌、及鼠型結核菌。宜為結核菌(Mycobacterium tuberculosis、人型結核菌)、牛型結核菌(M.bovis、牛型菌、牛菌)、非洲結核菌,較佳為牛型結核菌。如前述般,將牛型結核菌(M.bovis)長時間繼代培養而弱毒化的菌為BCG。
將以該BCG作為抗原,使用噬菌體展示來製造本發明之MoAb之方法記載於實施例。如前述般,本發明之MoAb其特徵為:可區別出口腔內細菌等的其他細菌,專一
性地辨識分枝桿菌,較具體而言,區別出其他細菌的LAM類似抗原,與分枝桿菌LAM專一性地結合;宜為區別出非結核性分枝桿菌,專一性地辨識結核菌,較具體而言,區別出非結核性分枝桿菌LAM,與結核菌LAM專一性地結合,而該MoAb可藉由以BCG作為免疫原來製作。
此外,BCG意指如前述般由牛型結核菌(M.bovis)所製作出的弱毒株,雖然具有抗原性,但是對人的毒性消失或減弱而成的細菌,然而不僅如此,在本發明中還包括由該細菌所製作出的BCG疫苗,而稱為「BCG」。
此外,本發明之單株抗體亦包括在上述所說明的單鏈抗體的多價抗體。多價抗體包括二價抗體、三價抗體、及四價抗體,而宜為二價抗體。這些多價抗體可依照既定方法來製造(非專利文獻7:K.Zuberbuhler,Protein Engineering,Design & Selection,22,169(2009)),具體而言,例如在二價抗體的情況,可藉由使單鏈抗體的重鏈與輕鏈的基因與各個定常區域的基因接合,選殖至可使其在哺乳動物細胞表現出的載體後,轉殖至哺乳動物細胞並且進行培養而製造。
(II)用以製造與分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地結合的單株抗體的非人動物的免疫方法、及該單株抗體的製造方法
此外,本發明關於用以製造與分枝桿菌的LAM專一性地結合的MoAb的非人動物的免疫方法、及利用該免疫方法的上述MoAb之製造方法。較佳為關於用以製造與結核菌的
LAM專一性地結合的MoAb的非人動物的免疫方法、及利用該免疫方法的上述MoAb之製造方法。
(II-1)免疫方法
分枝桿菌LAM的基本構造幾乎相同,只有在帶甘露糖帽的構造觀察到微小差異。在製作對該分枝桿菌LAM的抗體的情況,一般而言使用H37Rv等的人型結核菌標準株作為免疫原,使非人動物免疫。藉此可製作出廣泛與分枝桿菌的LAM反應的抗體。
相對於此,若使用由牛型結核菌(M.bovis)所製作出的弱毒株,或由其所製作出的疫苗,亦即使用BCG作為免疫原,使非人動物免疫,則可得到可區別出非結核性分枝桿菌的LAM,與結核菌的LAM甚至人型結核菌的LAM專一性地結合且專一性高的抗體。本發明的合適形態提供一種使用BCG作為免疫原(免疫抗原)使非人動物免疫之方法,以作為用來製造與人結核菌的LAM專一性地結合的MoAb的免疫法。
此處,非人動物只要是人以外的動物即可,可列舉例如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔子、猴子、狗、山羊、綿羊、豬、馬、母牛等的哺乳動物、或雞、鴨、火雞及鵪鶉等的鳥類。宜為小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、及兔子等的哺乳動物(小動物),較佳為兔子。
用以製造與結核菌的LAM專一性地結合的MoAb的本發明之免疫方法,其特徵為:使用BCG作為免疫原(免疫抗原)使非人動物免疫,免疫手段並未受到特別限
制,可適當地選擇周知的方法來使用。
可列舉例如將BCG因應必要加上佐劑,藉由皮下、靜脈內、或腹腔內注射等進行投予的方法。宜為皮下投予。此處佐劑並不受限制,而可例示例如弗氏完全佐劑、及弗氏不完全佐劑。此外,BCG的投予宜為在初次投予(初次免疫)之後,以2週左右的間隔投予2~5次左右。
以這樣的方式免疫的非人動物的脾臟細胞,可有效地作為用以製造對於結核菌的LAM甚至人型結核菌的LAM專一性高的抗體的細胞。該脾臟係在BCG初次免疫至十數日~數個月後,由免疫非人動物取出,可使用於製造及取得對於結核菌的LAM甚至人型結核菌的LAM專一性高的抗體。
具體而言,例如將免疫非人動物的脾臟摘出,由脾臟調製出細胞(抗體產生細胞),依照聚乙二醇法或電氣刺激等的既定方法,使其與骨髓瘤細胞融合,使用HAT選擇培養基進行培養,以取得融合瘤,接下來,藉由使用極限稀釋法等的既定方法,從融合瘤之中篩選出產生與結核菌的LAM結合的抗體的融合瘤,藉此可取得產生對於結核菌的LAM專一性高的MoAb的融合瘤。將以這種方式選殖的融合瘤依照既定方法進行培養,藉此可調製出所希望的對於結核菌的LAM甚至人型結核菌的LAM專一性高的MoAb。
調製出無論結核菌及非結核性分枝桿菌的種類而廣泛與分枝桿菌的LAM選擇性地結合的MoAb之方法,可列舉使用對於上述所得到的結核菌的LAM甚至人型結核菌
的LAM專一性高的抗體與LAM的複合體來選擇抗體之方法。此情況下,免疫手段並未受到特別限制,可適當地選擇周知的方法來使用。此外,此處的「複合體」,是指與結核菌的LAM專一性高的抗體與LAM形成抗原抗體複合體,藉由ELISA進行解析,可確認該複合體的產生。
(II-2)與分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地結合的MoAb之製造方法
與分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地結合的MoAb,可藉由利用以上述免疫方法免疫的非人動物(免疫非人動物)來製造。
該方法的其中一個可列舉如前述般,將免疫非人動物的脾臟摘出,由所摘出的脾臟調製出細胞(抗體產生細胞),依照聚乙二醇法或電氣刺激等的既定方法,使其與骨髓瘤細胞融合,由所得到的融合瘤之中,取得產生與分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地結合的MoAb之融合瘤,然後培養該融合瘤之方法。以這種方式可調製出對於分枝桿菌、結核菌的LAM、甚至於人型結核菌的LAM專一性高的MoAb。此處,融合瘤的培養是在小鼠或兔子等的非人動物的腹腔內進行,或者可使用培養皿等而在體外進行。前者的方法,亦即在非人動物的腹腔內培養融合瘤的情況,在培養後,採取該非人動物的腹水,由該腹水分離純化出所希望得到的MoAb。後者的方法,亦即在體外培養融合瘤的情況,由培養後所得到的培養液分離純化出所希望得到的MoAb。關於單株抗體的純化方法,在抗體的亞型為IgG的
情況,可列舉例如使用利用蛋白質A的親合層析的方法。
此外,與分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地結合的MoAb,亦可藉由使用近年來開發的噬菌體展示法(非專利文獻6:Winter等,Annu.Rev.Immunol.,12:433,1994)來製造。具體而言,將藉由上述方法免疫的免疫非人動物的脾臟摘出,由所摘出的脾臟製作出Total RNA或mRNA,以該RNA作為模板調製出cDNA,而製作出編碼抗體可變區域的單鏈抗體(scFV:single chain fragment of variable region)的基因。此處抗體可變區域只要是含有重鏈可變區域(VH區域)與輕鏈可變區域(LH區域)兩區域即可,在此前提之下,在VH區域與LH區域之間亦可含有任意的胜肽連接子。該胜肽連接子可列舉例如(I)所記載般,具有由8~30左右的胺基酸序列所構成之連接子序列的胜肽,該連接子序列可例示GS連接子序列。
然後,將該基因選殖至噬菌粒載體,移入大腸菌之後,使噬菌體感染,可使scFV抗體表現在噬菌體被膜上(scFV噬菌體展示庫的調製)。
關於非人動物的免疫方法,在使用BCG作為免疫原(免疫抗原)的情況,對於如上述方式表現出scFV抗體的ScFV噬菌體展示庫使用BCG作為免疫抗原實施生物淘洗,接下來,使用將結核菌的LAM甚至人結核菌的LAM固相化的抗原盤實施生物淘洗,藉此可取得或製作出與結核菌的LAM甚至人結核菌的LAM專一性地結合的單株抗體(scFV抗體)。
另外,關於選擇對於分枝桿菌的LAM的專一性高的MoAb(單鏈抗體)之方法,由表現出scFV抗體的scFV噬菌體展示庫,使LAM被捕捉在將抗LAM抗體固相化的擔體,使用所形成的抗體抗原複合體來實施生物淘洗,藉此可製作出無論結核菌及非結核性分枝桿菌的類型,能夠廣泛與分枝桿菌的LAM選擇性地結合的單鏈抗體(scFV抗體)。
此外,此處Total RNA或mRNA的調製、cDNA的調製、噬菌粒的次選殖或移入大腸菌、噬菌體的感染、與分枝桿菌的LAM、結核菌的LAM,甚至於人結核菌的LAM專一性地結合的單株抗體(scFV抗體)的篩選方法(生物淘洗),可使用周知的方法進行,具體而言,可參考後述實施例的記載來實施。
(III)分枝桿菌甚至結核菌的檢測方法、及使用其之分枝桿菌(特別是結核菌)檢測工具
上述本發明之MoAb可使用於分枝桿菌甚至結核菌的檢測。換言之,藉由使用本發明之MoAb,可診斷.檢查受試者是否具有分枝桿菌甚至結核菌,亦即受試者是否感染分枝桿菌甚至結核菌。
本發明之分枝桿菌,尤其是結核菌的檢測(診斷、檢查),可藉由進行下述(1)及(2)之步驟來實施。
(1)使本發明之MoAb與受試者的生物體試樣(受測試樣)接觸之步驟、及(2)以本發明之MoAb與分枝桿菌LAM,特別是結核菌
LAM的結合反應作為指標,測定受測試樣中所存在的結核菌之步驟。
在步驟(1),與本發明之MoAb接觸的受試者的生物體試樣(受測試樣),只要是分枝桿菌甚至結核菌可能存在的生物體試樣即可,可列舉例如痰液、唾液、血液(血清、血漿)、肺洗淨液、胃液、尿、糞便、皮膚、胰液等。宜為痰液、唾液、及血液,較佳為痰液、及唾液。
此處作為測定對象的受試者為宜為人,而其他還能夠以馬、母牛、山羊、綿羊、狗、雞、小鼠、倉鼠、及大鼠等的動物作為對象。
使本發明之MoAb與生物體試樣接觸的條件,只要是不損及本發明之MoAb與分枝桿菌LAM甚至結核菌LAM的結合反應的條件,則並未受到特別限制,可採用通常免疫反應的條件。可列舉一般而言在45℃以下,宜為約4~40℃,較佳為25~40℃左右的溫度條件下,使本發明之MoAb與可含有分枝桿菌甚至結核菌的生物體試樣共存,放置或保溫約0.5~40小時,宜為1~20小時左右之方法。另外,結合反應所使用的溶劑及其pH只要不會對該反應造成不良影響,則並未受到特別限制,亦可依照常法或以其為準,使用緩衝液(例如檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、tris鹽緩衝液、醋酸緩衝液等)使pH成為約5~9左右。
(1)之步驟,可藉由使本發明之MoAb固定化(固相化)的狀態(與固態擔體結合的狀態)來進行。該固定化包括本發明之MoAb以可脫附的狀態結合於固態擔體的情況以
及以不可脫附的狀態結合的情況這兩者。
用以使MoAb固定化所使用的固態擔體,可利用在此技術領域之中所慣用的各種擔體,廣泛可例示例如由玻璃、纖維素粉末、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚苯乙烯、濾紙、羧甲基纖維素、硝基纖維素、離子交換樹脂、聚葡萄糖、塑膠薄膜、塑膠管、耐綸、玻璃珠、絹、聚胺-甲基乙烯基醚-馬來酸共聚合物、胺基酸共聚合物、乙烯-馬來酸共聚合物等的各種素材所構成之棒、珠、盤(包括微量盤)、試管等。
固定化方法並無特別限制,可因應各種固體擔體,採用物理的結合及化學的結合之任一者。可例示例如共價鍵法的重氮法、胜肽法(酸醯胺衍生物法、羧基氯化物樹脂法、碳二醯亞胺樹脂法、馬來酸酐衍生物法、異氰酸酯衍生物法、溴化氰活性化多糖體法、纖維素碳酸酯衍生物法、使用縮合試劑之方法等)、烷基化法、利用交聯試劑的擔體結合法(例如使用戊二醛、六亞甲基異氰酸酯等作為交聯試劑)、利用Ugi反應的擔體結合法等的化學反應;或使用如離子交換樹脂般的擔體的離子結合法;使用玻璃珠等的多孔性玻璃作為擔體的物理吸附法等。
在步驟(2)之中,本發明之MoAb能夠在以任意的標記物質標記的狀態來使用。此處標記物質可例示西洋山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶等的酵素;螢光素異氰酸酯、玫瑰紅等的螢光物質;32P或125I等的放射性物質;以膠體金或白色膠體等的金屬膠體、紅色或青色等的顏料著色
的聚苯乙烯乳膠等的合成乳膠及天然橡膠乳膠等的乳膠等的發色物質(呈色物質);化學發光物質等。利用這些標記物質的MoAb的標記,可因應各種標記物質,並依照既定方法來進行。
步驟(2)是檢測.測定本發明之MoAb與分枝桿菌甚至結核菌LAM的結合反應所得到的免疫複合體(抗原抗體結合物)之步驟。此處免疫複合體(抗原抗體結合物)之檢測.測定方法以及其條件並未受到特別限制,可採用與通常使用於免疫測定方法的相同或以其為準的方法及條件。具體而言,因應MoAb的標記所使用的標記物質的種類,可利用例如放射性同位元素免疫測定方法(RIA法)、ELISA法、螢光抗體法、溶菌斑法、墨點法、凝集法、歐氏擴散法(Ouchterlony)等一般免疫化學測定方法所使用的各種方法(參照例如「融合瘤法與單株抗體」、R&D Planning股份有限公司發行、第30-53頁、昭和57年3月5日發行等)。從靈敏度或簡便性這點看來,宜依據ELISA法來實施,而較佳為三明治法。
例如可依據固相化三明治法,對於作為測定對象的受測試樣中的分枝桿菌甚至結核菌,以例如如以下方式進行測定。
首先,在將與作為測定對象的分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地進行抗原抗體反應的抗體固定化(包括以可脫附的狀態固定化、及以可脫附的狀態固定化)而成的固相化抗體加入可含有作為測定對象的分枝桿菌甚至結核
菌的受測試樣的生物體試樣(例如痰液、唾液或血液等),其使進行抗原抗體反應。接下來,藉由例如洗淨而除去未結合的物質,加入與作為測定對象的分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地發生抗原抗體反應的抗體,使其與上述所產生的抗原抗體結合物中的測定對象菌進行反應,藉由反應來檢測所產生的抗原抗體結合物(「抗體-分枝桿菌-抗體」的複合物甚至「抗體-結核菌-抗體」的複合物)的存在(定性測定)、或測定其量(定量測定)。在該方法之中,在本發明的情況,與分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地進行抗原抗體反應的抗體,是採用本發明之MoAb甚至MoAb1。
上述抗原抗體結合物(「抗體-分枝桿菌-抗體」的複合物甚至「抗體-結核菌-抗體」的複合物)的測定,可藉由使用前述以任意的標記物質標記的抗體(標記化抗體),作為與分枝桿菌甚至結核菌的LAM進行抗原抗體反應的任一抗體(本發明之MoAb甚至MoAb1)而簡便地進行。更簡便地可例示利用經過膠體金等的著色乳膠粒子等標記的抗體的免疫層析法。這些測定手段中的各種手段的選擇或該等的改變等,皆已被業界人士知悉,在本發明中可採用這些手段的任一者[參照「臨床檢查法提要」、金原出版、1995年等]。
該方法可藉由使用例如具有下述構造的分枝桿菌檢測工具甚至結核菌檢測工具(亦簡稱為「檢測工具」)來實施。該檢測工具是用來判定人或動物之體液(包括痰液、唾液及尿)中的分枝桿菌甚至結核菌的存在,亦即有無
感染分枝桿菌甚至結核菌的道具,並具備由可藉由毛細現象運送受測試樣的材料所構成的吸液片。
該吸液片係具備:(i)吸收採取受測試樣之試樣採取部、(ii)擔持與受測試樣的分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地反應之標記-抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb)之標記抗體部、(iii)具備下述所表示之測試結果顯示部之判定部、(a)將與分枝桿菌甚至結核菌的LAM專一性地反應之未標記-抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb)加以固定的測試結果顯示部、及(iv)將移動至上述試樣採取部、標記抗體部及判定部的受測試樣的殘液加以吸收之液體吸收部。
此外,上述(iii)判定部除了具備(a)測試結果顯示部之外,與其距離一段間隔還可具備下述所表示之控制組顯示部:(b)將與標記-抗分枝桿菌LAM抗體(本發明之MoAb)甚至標記-抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb1)進行反應的未標記-抗分枝桿菌LAM抗體(本發明之MoAb)甚至未標記-抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb1)加以固定之控制組顯示部。
只要使用該檢測工具,即可藉由(a)測試結果顯示部發色的有無,來判定受測試樣中分枝桿菌甚至結核菌的存在。
本發明之檢測工具係具備由可藉由毛細管作用
或層析作用(在本發明中,將該等總稱為「毛細現象」)運送受測試樣的材料所構成之吸液片。該吸液片可設定為薄片狀細片(以下稱為「薄片狀細片」),該薄片狀細片可藉由一枚薄片或者將多枚薄片重疊或連結而形成。或者,吸液片可設計成細長的柱狀細片等,製成可吸收液體的及藉由毛細現象進行運送的各種的形態。此外,本發明之檢測工具亦可進一步具備支持上述吸液片的支持體。
用以構成此吸液片的材料,只要是具有溶劑(水、血清、尿、其他生物體試樣)、受測成分(結核菌等的分枝桿菌)、及含有受測成分的複合體(例如經過標記的抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb1)與結核菌的複合體[標記抗體-結核菌]、或該複合體與未標記-抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb1)的複合體[標記抗體-結核菌-抗體])可滲透的多孔構造或毛細管構造,在將含有受測成分的受測試樣施加(採取、滴入、添加)於(1)試樣採取部的情況,儘管途中含有上述抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb1)或複合體(標記抗體-結核菌),受測試樣也能夠在多孔構造或毛細管構造內移動(展開)的材料即可,並不受特別限制。可列舉例如前述固體擔體。該等之中,較佳者為有機多孔質體。此外,有機多孔質體的例子,可列舉纖維素等的天然纖維、纖維素醋酸酯等的半合成纖維或硝基纖維素等的纖維素衍生物、聚乙烯、聚丙烯、耐綸、聚酯等的合成纖維等所形成的纖維集合體、多孔質聚丙烯、多孔質聚苯乙烯、多孔質聚甲基丙烯酸甲酯、多孔質耐綸、多孔質聚碸、多孔質氟樹脂、
導入親水性基的聚偏氟乙烯等的多孔質合成樹脂等。宜為纖維素等的天然纖維、或纖維素醋酸酯等的半合成纖維或硝基纖維素等的纖維素衍生物。
吸液片的大小並未受到特別限制。合適的大小為寬(短邊長)在2~20mm左右的範圍,宜為在4~10mm左右的範圍,長(長邊長)為20~200mm的範圍,宜為在30~150mm的範圍。
以下參照圖式同時對本發明之實施形態所關連之檢測工具作說明。
圖1(A)及(B)表示本發明之檢測工具的一個形態。該圖1(A)及(B)為由橫向觀察本發明之檢測工具之圖。在該檢測工具之中,吸液片係具備:採取(或添加)受測試樣的試樣採取部(1)、標記抗體部(2)、及具備測試結果顯示部(a)之判定部(3);以及將移動至這些試樣採取部、標記抗體部、及判定部的受測試樣的殘液加以吸收的液體吸收部(4)。另外,圖1(B)表示於上述判定部(3)之中,除了測試結果顯示部(a)之外還具備控制組顯示部(b)之檢測工具。
在圖1所表示的例子中,吸液片係由多個薄片所形成的薄片狀細片,而薄片狀細片亦可由以相同材料構成的一枚薄片所構成,或可為以相同或相異的材質構成的多枚薄片整體形成一個薄片。此外,薄片可全體由多枚薄片所構成,或可部分地具有由多枚薄片所形成的部分。
在圖1所表示的例子中,在支持體10上接著有薄片狀細片。此薄片狀細片,由長邊方向的一端至另一端依
序具備形成試樣採取部(1)的薄片21、形成標記抗體部(2)的薄片22、形成判定部(3)的薄片23、形成液體吸收部(4)的薄片24。另外,亦可如圖2所示般,以薄片21的端部與薄片22的端部重疊的方式構成,或以薄片22的端部與薄片23的端部重疊的方式構成,甚至以薄片23的端部與薄片24的端部重疊的方式構成。藉由採用該構成,可使液體的移動更順利。
試樣採取部(1),係吸收採取作為測定對象的受測試樣的部分(受測試樣供給部)。受測試樣可列舉本發明的測定對象的受試者的生物體試樣。
該試樣採取部(1)如圖1及圖2所例示般,可位於薄片狀細片的端部(始端部)。
標記抗體部(2)如前述般,係以與試樣採取部(1)的終端部接觸(圖1)或一部分與該試樣採取部(1)重疊的狀態所形成(圖2)。該標記抗體部(2),係以可脫離的狀態含有與受測試樣所含有的分枝桿菌LAM甚至結核菌LAM專一性地反應並且結合的抗體。具體而言,本發明之檢測工具,是在構成標記抗體部(2)的薄片22,以可脫離的狀態含有藉由與分枝桿菌LAM甚至結核菌LAM進行抗原抗體反應而專一性地結合的抗分枝桿菌LAM抗體(本發明之MoAb)甚至抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb1)。此處本發明之MoAb可在以前述任意標記物質標記的狀態下使用,亦即以標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)的形式來使用,另外,MoAb1能夠以標記-抗結核菌LAM抗體(標記-
本發明之MoAb1)的形式來使用。
標記抗體部(2),宜為由薄片狀細片所可採用的材料之中,具備以可脫離的狀態含有標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1),從試樣採取部(1)移動過來的受測試樣中的受測成分(分枝桿菌甚至結核菌)進行反應所形成的抗原-抗體複合體(分枝桿菌LAM與標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)的複合體甚至結核菌LAM與標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)的複合體)會隨著受測試樣往判定部(3)移動而往圖1中的箭號P所表示的方向移動的性質,且具有親水性及吸水性的材料所構成。
此外,在標記抗體部(2)中,以可脫離的狀態擔持標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)之方法並不受限制,而可例示使含有標記-本發明之MoAb甚至標記-本發明之MoAb1的溶液浸滲或附著於標記抗體部(2)之方法。另外,在標記抗體部(2),為了不漏掉受測試樣中所含有的受測成分(分枝桿菌甚至結核菌)而使其結合,宜為在該標記抗體部(2)過量地擔持上述標記-本發明之MoAb甚至標記-本發明之MoAb1。
判定部(3)係含有將由上述試樣採取部(1)通過標記抗體部(2)移動過來的受測試樣進一步運送至液體吸收部(4)的部分,且在該運送區域上捕捉運送的受測試樣中所含
有的特定成分(分枝桿菌LAM與標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)的複合體甚至是結核菌LAM與標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)的複合體),顯示其捕捉結果的部分[測試結果顯示部(a)]。基於此測試結果顯示部(a)所顯示的結果,可判定受測試樣的分枝桿菌甚至結核菌的存在的有無,因此將含有該顯示部(a)的區域稱為「判定部(3)」。
本發明之檢測工具在該判定部(3)之中,除了具備測試結果顯示部(a)之外,還可具備控制組顯示部(b)。此外,該測試結果顯示部(a)及控制組顯示部(b)係距離一段間隔依序配置。
在測試結果顯示部(a)中,過量地固定了與分枝桿菌LAM專一性地反應的未標記的抗體[未標記-抗分枝桿菌LAM抗體]甚至與結核菌LAM專一性地反應的未標記的抗體[未標記-抗結核菌LAM抗體]。因此,藉由上述標記抗體部(2)的抗原抗體反應,與標記-本發明之MoAb結合的分枝桿菌甚至與標記-本發明之MoAb1結合的結核菌,係以與標記-本發明之MoAb甚至標記-本發明之MoAb1的複合體的狀態被捕捉在此測試結果顯示部(a),並以因應其捕捉量的強度呈現出標記物質造成的發色。
此外,此處,構成未標記-抗分枝桿菌LAM抗體的抗分枝桿菌LAM抗體,同樣地可採用與分枝桿菌的LAM專一性地結合的本發明之MoAb(本發明之MoAb)。另外,此處,構成未標記-抗結核菌LAM抗體的抗結核菌LAM抗體
同樣地可採用與結核菌的LAM專一性地結合的本發明之MoAb1(本發明之MoAb1)。
在控制組顯示部(b)中,係以既定量固定了與上述標記抗體部(2)所含有的標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)反應的未標記-抗體(第二抗體)。該控制組顯示部(b),可往受測試樣的移動方向(圖1中p的方向)與測試結果顯示部(a)距離一段間隔,依照測試結果顯示部(a)及控制組顯示部(b)的順序配置。在控制組顯示部(b)中,過量地固定了與由先前的薄片移動過來的受測試樣中所含有的標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)反應的未標記-抗體(第二抗體)。
因此,在該控制組顯示部(b)中,可捕捉由標記抗體部(2)脫離而釋放至受測試樣中的標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1),以對應於固定於控制組顯示部(b)的上述第二抗體含量的強度呈現出標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)、抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)的標記物質造成的發色。
此處,未標記-抗體(第二抗體)只要能夠與標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)結合即可。該未標記-抗體(第二抗體)並不受限制,而可使用例如分枝桿菌的LAM
binding protein、陰離子性粒子等。
在使用本發明之檢測工具測定結核菌時,是以判定部(3)中的測試結果顯示部(a)有無發色作為指標來進行。此時,亦可因應必要藉由判定部(3)中的控制組顯示部(b)有無發色來判斷。即使在測試結果顯示部(a)沒有觀察到發色,在上述控制組顯示部(b)觀察到發色的情況下,測定可正常進行,可判斷測定結果為陰性。但是,在上述控制組顯示部(b)沒有觀察到發色的情況,表示測定並未正常進行,無法基於測試結果顯示部(a)的結果判斷為陰性。
判定部(3),宜為由薄片狀細片所可採用的材料之中具備可藉由毛細現象使含有各種成分的受測試樣移動至液體吸收部(4),可將上述未標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)可安定地固定化在測試結果顯示部(a),另外,可將上述未標記-抗體(第二抗體)安定地固定化在控制組顯示部(b)的性質且具有親水性及吸水性的材料所構成。
液體吸收部(4),是將由上述試樣採取部(1)通過標記抗體部(2)及判定部(3)(測試結果顯示部(a)、或測試結果顯示部(a)與控制組顯示部(b))往箭號P的方向移動過來的受測試樣的殘液加以吸收的部分。因此,液體吸收部(4),宜為由薄片狀細片所可採用的材料之中親水性及吸收性優異的材料所構成,而較適合的情況希望是具備不會使所吸收的液體脫離的性質的材料或具有彈性的材料所構成。該材料具體而言,可列舉濾紙或親水性纖維之不織布等,亦
可使用濾紙與不織布的積層體。
本發明之檢測工具基本上由具備上述構成的薄片狀細片所構成,而除了上述薄片狀細片之外,亦可進一步具備支持體10。該支持體10只要具備可保持上述薄片狀細片的材質及形態,則不受特別限制。例如可為層合於薄片狀細片的背面(下層面)而使用的薄片狀支持體,或可為收納薄片狀細片的殼體形態之支持體。
薄片狀支持體,可列舉例如各種塑膠製的薄片(塑膠薄片)、硬質紙、鋁製等的金屬(包括合金)製薄片,例如將異質或同質的多張紙黏合(貼合)的複層紙、將塑膠薄片與紙黏合(貼合)而成者、將紙與金屬製薄片黏合(貼合)而成者、將塑膠薄片、紙與金屬製薄片黏合(貼合)而成者、在紙上施加防水用等的塗層而成者等。宜為具有防水機能者。
殼體形態的支持體係以由聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、丙烯酸聚合物等不透濕性的材料所構成為佳,而如果是紙製品,只要經過撥水加工即可使用。在殼體上,希望為至少對應於收納於內部的上述薄片狀細片的試樣採取部(1)形成「採液窗」、對應於判定部(3)的測試結果顯示部(a)形成「判定表示窗」、及對應於控制組顯示部(b)形成「控制表示窗」。此外,「判定表示窗」與「控制表示窗」可分別形成,而亦可以一個窗口的方式形成。
具備前述薄片狀細片的本發明之檢測工具,在使用時,首先使受測試樣浸滲至試樣採取部(1)。如此一來,被試樣採取部(1)吸收的受測試樣會藉由毛細現象滲透至薄
片狀細片中,首先會到達以可脫離的方式擔持有標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)的標記抗體部(2)。此處,受測試樣中的受測成分(結核菌)藉由與上述標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)進行抗原抗體反應而專一性地結合。接下來,受測試樣會和「分枝桿菌與標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)的複合體」(「結核菌與標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)的複合體」)與「並未與結核菌結合的剩餘標記-結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)」(「並未與結核菌結合的剩餘標記-結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)」)一起到達判定部(3)的測試結果顯示部(a)。在測試結果顯示部(a)中,安定地固定了與分枝桿菌專一性地結合的未標記-抗分枝桿菌LAM抗體(本發明之MoAb)甚至與結核菌專一性地結合的未標記-抗結核菌LAM抗體(本發明之MoAb1),因此,受測試樣中的「與分枝桿菌專一性地結合的標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)」甚至「與結核菌專一性地結合的標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)」被捕捉而集中在此處。其結果,測試結果顯示部(a)會藉由所捕捉到的標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至所捕捉到的標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)的標記物質,以受測試樣中所含有的分枝桿菌甚至結核菌的量所對應的強度發色。藉此可檢測受測試樣中的分枝桿菌甚至
結核菌的有無或量的比例。
接下來,受測試樣會和「並未與分枝桿菌結合的剩餘標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)」甚至「並未與結核菌結合的剩餘標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)」一起到達判定部(3)的控制組顯示部(b)。在控制組顯示部(b)中,以一定量且安定地固定了與標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)結合的第二抗體[未標記-抗體]甚至與標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)結合的第二抗體[未標記-抗體],因此,受測試樣中的上述剩餘標記-抗分枝桿菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb)甚至標記-抗結核菌LAM抗體(標記-本發明之MoAb1)被捕捉而集中在此處。其結果,控制組顯示部(b)會以固定化於控制組顯示部(b)的第二抗體的量(或與第二抗體結合的標記-抗體的量)所對應的強度發色。
除了該等之外,本發明之檢測工具在不脫離本發明的範圍,可為各種變化的形態。在上述本發明之檢測工具中,另外還可附加針對該檢測工具的使用方法或判定方法作說明的規格說明書,本發明提供一種判定套組,其係使該檢測工具與規格說明書成為組合。
(IV)結核診斷劑或診斷用套組
前述分枝桿菌檢測方法及分枝桿菌檢測工具,是用來檢測受試者的生物體試樣中的分枝桿菌的存在。特別是在單株抗體採用本發明之MoAb1的情況,上述分枝桿菌之合適者可例示結核菌。亦即,前述分枝桿菌檢測方法及分枝
桿菌檢測工具可使用於診斷受試者有無感染分枝桿菌,特別是結核菌。
所以,前述本發明之MoAb甚至MoAb1為有效的結核診斷劑,本發明提供一種結核診斷劑,其係含有該本發明之MoAb甚至MoAb1。該本發明之MoAb能夠以可脫附或不可脫附的方式固定化於任意固態擔體,另外,還能夠以任意的標記物質來標記。
此外,在實施上述本發明之分枝桿菌甚至結核菌的檢測方法時,可藉由利用含有本發明之MoAb甚至MoAb1作為結核菌檢測試劑的結核診斷用套組而簡便地實施。所以,本發明提供一種結核診斷用套組,其係用以實施前述結核檢測方法。該結核診斷用套組,係利用抗原抗體反應來檢測受測試樣中所存在的結核菌的試劑套組。該套組只要含有本發明之MoAb甚至MoAb1即可,亦可含有前述結核菌檢測工具、與本發明之MoAb甚至MoAb1發生反應的第二抗體、或抗體檢測試劑等。另外,為了方便於實施測定,在該診斷用套組中亦可進一步含有適當的反應液、稀釋液、洗淨液、反應停止液、標記活性測定試劑等。
(V)分枝桿菌LAM(特別是結核菌LAM)之測定方法、分枝桿菌LAM(特別是結核菌LAM)檢測劑或檢測用套組
本發明之MoAb為專一性地辨識分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖(LAM)並且結合的抗體。因此,前述本發明之分枝桿菌檢測方法,亦可應用於分枝桿菌LAM的測定。
具體而言,本發明之分枝桿菌LAM的測定方法
可藉由進行下述步驟來實施。
(1)使本發明之MoAb與可含有分枝桿菌的受測試樣接觸之步驟、及(2)以本發明之MoAb與分枝桿菌的LAM的結合反應作為指標,測定受測試樣中所存在的分枝桿菌LAM之步驟。
(1)及(2)這些步驟分別對應於前述「(II)分枝桿菌的檢測方法」所說明的步驟(1)及(2),此處亦可援用上述(II)的記載。另外,該分枝桿菌LAM的測定亦可同樣地使用前述「(II)分枝桿菌的檢測方法」所說明的分枝桿菌檢測工具來實施(此外,此情況亦可改稱為「分枝桿菌LAM檢測工具」)。
此外,上述本發明之MoAb之中,MoAb1為專一性地辨識結核菌的脂阿拉伯甘露糖(LAM)並且結合的抗體,因此上述本發明之分枝桿菌檢測方法,可作為結核菌檢測方法而應用於結核菌LAM的測定。
此處,分枝桿菌LAM甚至結核菌LAM的測定,包括用以檢測分枝桿菌LAM甚至結核菌LAM的定性測定、及用以測定分枝桿菌LAM甚至結核菌LAM的量的定量測定。定量測定並未受到限制,而可例示例如由本發明之MoAb與既定量的分枝桿菌LAM甚至結核菌LAM的反應預先製作出檢量線,由該檢量線,計算出受測試樣中所含有的未知量的分枝桿菌LAM甚至結核菌LAM的量之方法。
在該測定之中,本發明之MoAb為有效的分枝桿菌LAM檢測用試劑,本發明提供一種分枝桿菌LAM檢測
劑,其係含有該本發明之MoAb作為分枝桿菌LAM檢測用試劑。其中,本發明之MoAb1為有效的結核菌LAM檢測用試劑,本發明提供一種結核菌LAM檢測劑,其係含有該本發明之MoAb1作為結核菌LAM檢測用試劑。這些本發明之MoAb能夠以可脫附或不可脫附的方式固定化於任意的固態擔體,另外,還能夠以任意的標記物質來標記。
在實施上述本發明之分枝桿菌LAM測定方法時,可藉由利用含有本發明之MoAb作為分枝桿菌LAM檢測試劑的分枝桿菌LAM檢測用套組而簡便地實施。另外,在實施上述本發明之結核菌LAM測定方法時,可藉由利用含有本發明之MoAb之中的MoAb1作為結核菌LAM檢測試劑的結核菌LAM檢測用套組而簡便地實施。
所以,本發明提供一種用以實施前述分枝桿菌LAM測定方法的分枝桿菌LAM檢測用套組,特別是一種用以實施結核菌LAM測定方法的結核菌LAM檢測用套組。該分枝桿菌LAM檢測用套組,特別是結核菌LAM檢測用套組,係利用抗原抗體反應檢測受測試樣中所存在的分枝桿菌甚至結核菌的LAM的試劑套組。該分枝桿菌LAM檢測用套組只要含有本發明之MoAb即可,另外,結核菌LAM檢測用套組只要含有本發明之MoAb1即可,亦可含有前述分枝桿菌LAM檢測工具(或結核菌LAM檢測工具)、與本發明之MoAb(或MoAb1)反應的第二抗體、或抗體檢測試劑等。另外,為了方便於實施測定,在該診斷用套組中亦可進一步含有適當的反應液、稀釋液、洗淨液、反應停止液、標記
活性測定試劑等。
(VI)對滅菌檢體的測定方法
(III)所述的本發明之分枝桿菌或結核菌檢測方法,可應用作為生物災害的測定方法。具體而言,本發明之生物災害的測定方法,可藉由進行下述步驟來實施。
(1)將檢體試樣高熱煮沸滅菌,宜為高壓蒸氣滅菌。
(2)使本發明之MoAb甚至MoAb1分別與滅菌處理後的受測試樣接觸之步驟、(3)以上述本發明之MoAb甚至MoAb1與結核菌LAM的結合反應作為指標,測定受測試樣中的結核菌LAM之步驟;及(4)在受測試樣中檢測到結核菌LAM的情況,判斷為感染受測試樣為結核菌之步驟。
(VII)判定抗結核藥的結核治療效果之方法
(III)所述的本發明之分枝桿菌甚至結核菌檢測方法,亦可應用於抗結核藥的結核治療效果之判定。
具體而言,本發明之抗結核藥的結核治療效果的判定方法可藉由進行下述步驟來實施。
(1)使本發明之MoAb甚至MoAb1分別與抗結核藥投予前後的受測試樣接觸之步驟;(2)以上述本發明之MoAb甚至MoAb1與結核菌LAM的結合反應作為指標,測定抗結核藥投予前後的受測試樣中的結核菌LAM之步驟;及
(3)在抗結核藥投予前的受測試樣檢測到結核菌LAM,且在抗結核藥投予後的受測試樣並未檢測到結核菌LAM的情況,判斷為抗結核藥具有結核治療效果之步驟。
步驟(1)及(2)分別對應於前述「(III)分枝桿菌,特別是結核菌的檢測方法」所說明的步驟(1)及(2),除了受測試樣是以罹患結核的(感染結核菌)結核患者的受測試樣,且以抗結核藥投予前(結核治療前)的受測試樣及抗結核藥投予後(結核治療後)的受測試樣作為對象以外,可同樣地實施上述(III)所記載之方法。另外,(2)所進行的結核菌LAM的測定,亦可同樣地使用前述「(III)分枝桿菌,尤其是結核菌的檢測方法」所說明的結核菌檢測工具來實施(此外,此情況亦可改稱為「結核菌LAM檢測工具」)。
此處抗結核藥,可列舉以往所周知的利福平、異菸酸酊(異菸鹼醯肼)、吡嗪醯胺、鏈黴素或其鹽、乙胺丁醇或其鹽,而不僅是這些抗結核藥,還包括對於結核菌具有殺菌作用(抗結核作用)的核准或非核准藥。
上述步驟(2)的結果,在抗結核藥投予前的受測試樣中檢測到結核菌LAM,換言之即為檢測到結核菌,且在抗結核藥投予後的受測試樣中並未檢測到結核菌LAM(結核菌)的情況,可判斷該抗結核藥對於對象的結核患者具有結核治療效果以及抗結核藥的有效性。
另一方面,上述步驟(2)的結果,在抗結核藥投予前的受測試樣中檢測到結核菌LAM,換言之即為檢測到結核菌,且在抗結核藥投予後的受測試樣中也檢測到結核
菌LAM(結核菌)的情況,進一步可比較在抗結核藥投予前後所檢測到的結核菌的量。此處,在抗結核藥投予前後觀察到結核菌量的降低的情況,提示了該抗結核藥對於作為對象的結核患者可能具有結核治療效果,因此可提供醫療從業人員繼續使用該抗結核藥進行治療的選擇。相對於此,在抗結核藥投予前後並未觀察到結核菌量的降低的情況,認為該抗結核藥對於作為對象的結核患者沒有結核治療效果,因此可提供醫療從業人員中止使用該抗結核藥,改變成其他治療的選擇。
在該方法之中,本發明之MoAb甚至MoAb1,為有效的抗結核藥的結核治療效果判定試劑,本發明提供一種結核治療效果判定劑,其係含有該本發明之MoAb甚至MoAb1作為結核治療效果判定試劑。該本發明之MoAb甚至MoAb1,亦能夠以可脫附或不可脫附的方式固定化在任意的固態擔體,另外還能夠以任意的標記物質來標記。
此外,在實施上述本發明之判定方法時,可藉由利用含有本發明之MoAb甚至MoAb1作為抗結核藥的結核治療效果判定試劑的結核治療效果判定用套組而簡便地實施。所以,本發明提供一種結核治療效果判定用套組,其係用以實施前述抗結核藥的結核治療效果判定方法。該結核治療效果判定用套組,係利用抗原抗體反應檢測治療前後的受測試樣中所存在的結核菌的LAM,用以判定抗結核劑對結核患者產生的治療效果的試劑套組。該套組只要含有本發明之MoAb甚至MoAb1即可,亦可含有前述結核菌
LAM檢測工具、與本發明之MoAb反應的第二抗體、或抗體檢測試劑等。另外,為了方便於實施測定,在該診斷用套組中亦可進一步含有適當的反應液、稀釋液、洗淨液、反應停止液、標記活性測定試劑等。
一般對於活動性結核的治療,是藉由在6個月投予4種以上的治療藥來進行。在懷疑有結核感染的情況,首先,利用齊爾-尼爾生染色或螢光染色進行抹片檢查。在痰液檢體1ml中,如果有10,000個以上的菌,則為抹片陽性。痰液抹片陽性的患者為感染源,臨床上、或公共衛生上需要特別重視。因此,抹片陽性患者必須在結核病房住院治療。轉換為通勤治療的一個指標,是連續3天抹片檢查結果為陰性。利用本發明的結核菌LAM檢測法,可對痰液、唾液、血液等的生物體試樣中的LAM濃度進行定量。所以,藉由測定痰液、唾液、血液等的生物體試樣中的LAM,可監測治療藥劑有效性,且亦可應用於排菌狀態的陰性化判斷。
以下藉實施例對本發明的構成及其效果作說明。但是,本發明完全不受該實施例之記載所限制。
1.材料的調製
(1-1)寡聚化LAM的製作、及免疫抗原的調製
對於人型結核菌的M.tuberculosis的LAM(來自青山B株、Nacalai Tesque)3mg,以50mM的醋酸緩衝液(pH4.5)進
行透析,將濃度調整成1mg/mL,然後添加200mM的過碘酸水溶液150μL,在遮光下於4℃攪拌7分鐘。攪拌後添加乙二醇35μL,以小型管柱PD-10(GE公司製)進行膠體過濾(0.1M碳酸氫鈉、pH8.3),以1mL進行分液收集。藉由酚-硫酸法來檢測收集物樣品中的糖,對於檢測到糖的收集物以純水進行透析,然後進行冷凍乾燥。
使冷凍乾燥後的寡聚化LAM 3mg以0.5mL的純水溶解。於其中添加溶於乙腈的100mg/mL的1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟硼酸12μL,攪拌約1分鐘,然後添加0.2M的三乙胺12μL,攪拌2分鐘。接下來,於其中添加以0.5M的碳酸氫鈉緩衝液(pH8.5)溶解的0.6M的己二酸二醯肼0.53mL,在4℃下攪拌10小時,然後以純水透析約1小時。
在透析後的溶液中添加鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)300μg、200mM磷酸緩衝液(pH5.0)30μL、100mM的N-羥基琥珀醯亞胺鈉45μL,然後進一步添加1M的二氯乙烯65μL,在4℃下攪拌3小時以上。最後,以磷酸緩衝液進行透析,製成免疫抗原用的寡聚化LAM-KLH。此外,將該寡聚化LAM-KLH與佐劑(Completea或Incomplete Freund's adjuvant,DIFCO公司製)以1:1(寡聚化LAM-KLH:佐劑[重量比])的比例混合,而製成免疫源。
(1-2)BCG疫苗、及免疫抗原的調製
BCG疫苗採用日本BCG製造股份有限公司製的冷凍乾燥BCG疫苗(認證碼20300AMZ00767000)。在該冷凍乾燥BCG疫苗100mg(濕重量)中加入生理食鹽水1ml並混合,將
混合物使用於免疫。
(1-3)H37Ra死菌體、及免疫抗原的調製
H37Ra死菌體採用DIFCO公司製的M.TUBERCULOSIS H37Ra(冷凍乾燥品)。在該冷凍乾燥H37Ra死菌體100mg(乾重)中加入生理食鹽水1m1並且混合,將混合物使用於免疫。
(1-4)scFv斷片製作用引子的製作
將單鏈抗體(scFv)的製作所使用的引子的名稱、鹽基序列、及用途揭示於表1。合成出作為VH區域增幅用引子的正股引子4種與反股引子1種、作為VL區域增幅用引子的正股引子4種與反股引子4種、作為連結重鏈可變區域斷片與輕鏈可變區域斷片的連接子(GS連接子)增幅用引子的正股引子1種與反股引子1種、及用以增幅限制酵素(Sfi-I,Not-I)辨識區域的引子2種。此外,序列表的序列號碼13~29所記載的胺基酸序列依序對應於該表1中由上至下所記載的引子的胺基酸序列。
[表1]
(1-5)scFv噬菌體庫的製作
分別使用BCG疫苗或HR37Ra死菌體作為免疫抗原,使兔子免疫(參照上述(1-2)及(1-3)以及參考例1(2))。在免疫結束後,將兔子的脾臟摘出,在RPMI(無血清)培養基中,使組織溶解,並萃取出Total RNA,由所得到的Total RNA合成出cDNA。此外,Total RNA的萃取是使用RNA萃取套組(QIAGEN公司)並依照操作手冊來進行。另外,由Total RNA合成cDNA,是使用cDNA合成套組(Invitrogen公司)並依照操作手冊來進行。
以所合成出的cDNA作為模板,使用上述表1所記載之特異的引子進行增幅VH基因斷片及VL基因斷片。具體而言,VH基因斷片是使用RabVH-F1與RabVH-R、RabVH-F2與RabVH-R、RabVH-F3與RabVH-R、及RabVH-F4與RabVH-R這4種引子組進行增幅。VL基因斷片是使用RabVκ-F1與RabVκ-R1、RabVκ-F1與RabVκ-R2、RabVκ-F1與RabVκ-R3、RabVκ-F2與RabVκ-R1、RabVκ-F2與
RabVκ-R2、RabVκ-F2與RabVκ-R3、RabVκ-F3與RabVκ-R1、RabVκ-F3與RabVκ-R2、RabVκ-F3與RabVκ-R3、RabVλ-F與RabVλ-R這10種引子組進行增幅。所得到的基因增幅產物係藉由1.5%洋菜膠體電泳來進行分離,藉由膠體來萃取純化目標分子量的基因增幅產物。
使用GS連接子(GGGGSGGGGSGGGGS:序列號碼11)將純化的VH基因增幅產物及VL基因增幅產物接合。將VH基因增幅產物的3'末端具有同源序列的RS1與VH基因混合,進行PCR5個循環,藉此使GS連接子附加在VH基因增幅產物的3'末端。同樣地,將VL基因增幅產物的5'末端具有同源序列的RS2與VL基因混合,進行PCR5個循環,藉此使GS連接子附加在VL基因增幅產物的5'末端。將附加GS連接子的VH基因增幅產物與VL基因混合,進行PCR10個循環,藉此製作出VH基因與VL基因透過GS連接子接合而成的scFv基因(VH基因/GS連接子/VL基因)。以這種方式製作出的scFv基因為模板,使用附加限制酵素序列的引子(參照表1中的「RS-Sfi」及「RS-Not」)以PCR增幅30個循環,最後使用限制酵素Sfi-I及Not-I來切斷。
接下來,將以限制酵素處理後的scFv基因插入抗體展示用噬菌粒載體pCANTAB5E(GE公司製)的Sfi-I及Not-I部位,藉由電穿孔法將大腸菌JM109株轉殖。然後,以LB-Amp/Glu洋菜培養基(含有150μg/mL青黴素、1%葡萄糖、1.5%洋菜的LB培養基)在37℃下培養一晚,將所產生的菌落全部回收。
以LB培養基將該轉殖大腸菌調製成波長600nm的吸光度(OD600)=0.2,然後與助手噬菌體M13K07(Invitrogen公司製)(1012cfu)混合,在37℃下靜置培養30分鐘,進一步以1L的LB-Amp/Kan液態培養基(含有150μg/mL青黴素、100μg/mL康黴素的LB培養基)在37℃下培養一晚,藉此製作出scFv噬菌體展示庫。
最後,將此scFv噬菌體展示庫以PEG/NaCl溶液濃縮,以PBS調製成約1x1012cfu/mL的濃度,並使用於生物淘洗。
(1-6)可溶性scFv(單鏈抗體)的製作
可溶性scFv是利用大腸菌表現載體pET22b(+)(Novagen公司製)來製作。對於目標的scFv基因藉由正股引子與反股引子進行增幅,藉此使Not I的限制酵素序列附加在5'末端、使Nco I的限制酵素序列附加在3'末端。
將以Not I及Nco I處理後的scFv基因插入大腸菌表現載體pET22b(+)之後,轉殖至宿主大腸菌Rosseta(Novagen公司)。將轉殖的大腸菌以LB-Amp/Glu洋菜培養基在37℃下培養一晚,將菌落以2mL的LB-Amp液態培養基在25℃下培養8小時。將培養液2ml添加至200ml的LB-Amp液態培養基,藉由在30℃下培養16小時,使可溶性scFv(單鏈抗體)分泌至培養上清液中。
由培養上清液純化出可溶性scFv,是藉由使用填充有Ni Sepharose的管柱(Ni管柱)(GE公司製)的親合純化來進行。在培養上清液中加入3倍量的100mM磷酸緩衝液,並
添加至Ni管柱,藉此使其與可溶性scFv結合。以含有10mM咪唑的100mM磷酸緩衝液將管柱洗淨後,以含有500mM咪唑的100mM磷酸緩衝液使可溶性scFv溶離。
接下來,藉由將溶離液以磷酸緩衝液透析一晚而將咪唑除去,取得可溶性scFv(單鏈抗體)。
(1-7)抗體的生物素標記
上述所調製出的單鏈抗體(scFv)、及多株抗體(PoAb)的生物素標記是使用PIERCE公司的Sulfo-NHS-LC-Biotin標記套組,依照推薦使用的套組操作步驟來進行。
2.測定方法
(2-1)血中抗體價的測定(ELISA)
由以各抗原進行免疫後的兔子及小鼠所採取到的血清,其血中抗體價的確認,是藉由下述ELISA來進行。
分別以PBS調製純化的人型結核菌M.tuberculosis的LAM(來自青山B株,Nacalai Tesque)、或純化的非結核性分枝桿菌M.avium的LAM(來自血清型B株,Nacalai Tesque),使濃度成為100μl/ml。將各LAM溶液以100μL/孔的比例添加至96孔微量盤的各孔中,在4℃下反應一晚後,在含有1%脫脂牛乳的磷酸緩衝液中進行阻斷,製作出抗原盤。
一次反應係藉由將以反應緩衝液(含有1%BSA[牛胎兒蛋白素]、1%脫脂牛乳、0.14M NaCl、0.1%Tween 20且pH 7.8的tris緩衝液)稀釋的兔子血清或小鼠血清100μL添加至上述抗原盤的各孔中,使其在25℃下反
應1小時來進行。然後洗淨3次以除去未反應的抗體。二次反應係藉由在上述一次反應液中添加以反應緩衝液稀釋5,000倍的HRP標記抗兔子IgG(EPITOMICS公司製)或HRP標記抗小鼠IgG(Zymed公司製)100μL,使其在25℃下反應1小時來進行。然後洗淨3次以除去未反應的抗體。
發色反應是藉由在上述二次反應物中添加100μL的TMB[3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine]溶液,在室溫下放置10分鐘來進行。發色後,添加100μL的1N硫酸溶液使反應停止。檢測是藉由測定波長450-650nm的吸光度(OD450-600nm)來進行。
(2-2)生物淘洗
生物淘洗是藉由第1至4步驟所構成的4個步驟來進行。
第1至3步驟是將與免疫抗原(BCG疫苗或H37Ra死菌體)結合的噬菌體殖株加以濃縮。將以反應緩衝液(含有1%BSA、1%脫脂牛乳、0.14M NaCl、0.1%Tween20且pH7.8的tris緩衝液)調製成1x1011cfu/500μL的scFv噬菌體展示庫(參照「1.材料的調製」的(1-5))與BCG疫苗或H37Ra死菌體1mg混合,在25℃下反應2小時。反應後,藉由離心分離(10,000rpm 10分鐘)集菌,並除去上清液。在集菌後的菌體中添加PBS並混合,然後再度藉由離心分離集菌,並且進行洗淨。洗淨操作進行5次。以500μL的溶離液(以1M甘胺酸溶液將含有0.1%BSA的0.1N HCl溶液調整成pH2.2)使結合在菌體的噬菌體溶離後,加入500μL的中和液(1M tris緩衝液pH9.1)使其中和。將中和的噬菌體庫感染大腸菌JM109
株,然後以LB-Amp/Glu洋菜培養基在37℃下培養一晚,並回收菌落。將以LB培養基調製成OD 600nm=0.2的轉殖大腸菌與助手噬菌體M13K07(Invitrogen公司製)(1012cfu)在37℃下靜置培養30分鐘,然後加入100mL的LB-Amp/Kan液態培養基,在37℃下培養一晚。將噬菌體培養液以PEG/NaCl溶液濃縮,並以磷酸緩衝液調製成約1x1012cfu/mL的濃度。利用菌體進行3次生物淘洗。
第4步驟,是使用將M.tuberculosis的純化LAM或M.avium的純化LAM固相化的抗原盤(純化LAM固相化微量滴定盤)進行生物淘洗。具體而言,將第3步驟所得到的結合在菌體的噬菌體庫添加至純化LAM固相化微量滴定盤,在25℃下反應2小時,然後以反應緩衝液洗淨10次以除去未反應的噬菌體。以100μL的溶離液使結合於LAM的噬菌體溶離,然後加入100μL的中和液(1M tris緩衝液pH9.1)使其中和。將中和的噬菌體庫感染大腸菌JM109株,然後以LB-Amp/Glu洋菜培養基在37℃下培養一晚。
參考例1 對LAM的抗血清的製作
(1)為了製作出對LAM的多株抗體(PoAb),以寡聚化LAM使兔子免疫。寡聚化LAM,具體而言是採用以上述「1.材料的調製」的(1-1)所記載之方法作為免疫抗原所製作出的寡聚化LAM-KLH。將該寡聚化LAM-KLH與佐劑(弗氏不完全佐劑)以1:1(寡聚化LAM-KLH:佐劑[重量比])的比例混合,將該混合物100μg投予至兔子的皮下(2隻:Rab-1及2),然後,以14天為間隔進行4次免疫。在第5次的免疫結
束後進行採血,依照上述「2.測定方法」的(2-1)所記載之ELISA法,測定對於人型結核菌(M.tuberculosis)的LAM及非結核性分枝桿菌(M.Avium)的LAM的血中抗體價。
以將M.tuberculosis的LAM固相化的抗原盤進行評估的結果,進行皮下免疫的2隻兔子(Rab-1及2),以稀釋384,000倍的血清確認了抗體價充分上昇。這些兔子(Rab-1及2)的抗血清對於將M.Avium的LAM固相化的抗原盤亦同樣地呈現結合反應,確認了兔子(Rab-1及2)的抗血清對M.tuberculosis與M.Avium這兩種LAM表現出同等的反應性。亦即,以寡聚化LAM(寡聚化LAM-KLH)作為免疫抗原所調製出的兔子的抗血清(多株抗體),會與分枝桿菌的LAM全體發生反應,而並未觀察到對結核菌LAM的專一性。
(2)接下來,分別使用BCG疫苗及H37Ra死菌體作為免疫抗原,與上述同樣地,以14天為間隔對兔子進行4次皮下免疫。具體而言,將分別含有上述「1.材料的調製」的(1-2)或(1-3)所記載之方法所調製出的BCG疫苗或H37Ra死菌體100mg的生理食鹽水1ml,每次免疫以全量對兔子實施皮下免疫。
對於2次免疫後的兔子的血中抗體價,與上述同樣地藉由「2.測定方法」的(2-1)所記載之ELISA法作測定。具體而言,分別由以BCG疫苗及H37Ra死菌體實施免疫的兔子製作出血清,並使用分別將純化的M.tuberculosis的LAM及M.avium的LAM固相化的抗原盤評估其抗體價。將使用BCG疫苗作為免疫抗原的情況的結果表示於圖3(A),
將使用H37Ra死菌體的情況的結果表示於圖3(B)。各圖中,「-■-」表示對M.tuberculosis的LAM的反應性、「-●-」表示對M.avium的LAM的反應性。
如圖3所示般,確認了BCG疫苗及H37Ra死菌體對於LAM的抗體價,任一者皆依存於濃度地顯著上昇。另外,對於M.tuberculosis與M.avium的任一種LAM皆表現出同等的反應性。
如以上所述般,在分別以寡聚化LAM、BCG疫苗及H37Ra死菌體作為免疫抗原的情況,這些抗原所對應的抗血清(多株抗體)任一者皆與分枝桿菌的LAM全體發生反應,並未觀察到對結核菌LAM的專一性。
實施例1 對LAM的單鏈抗體(scFv)的製作
(1)對LAM的scFv的製作
在參考例1之中,由以分別寡聚化LAM、BCG疫苗或HR37Ra死菌體進行免疫後的兔子取得脾臟細胞,由該細胞分離出單鏈抗體scFv。
具體而言,依照「1.材料的調製」的(1-5)所記載之方法,由各兔子的脾臟調製出Total RNA,然後以合成出的cDNA作為模板,使用表1所記載之各種引子實施PCR,藉此調製出VH基因增幅產物及VL基因增幅產物。
接下來使VH基因與VL基因透過GS連接子(GGGGSGGGGSGGGGS:序列號碼11)接合,製作出scFv基因(VH基因/GS連接子/VL基因),然後依照「1.材料的調製」的(1-5)所記載之方法,製作出scFv噬菌體展示庫。各
庫的滴度約為106cfu,因此可推測為具有106個多樣性的庫。
對於由以BCG疫苗免疫的兔子的脾臟細胞所製作出的scFv噬菌體展示庫,使用BCG疫苗作為抗原進行生物淘洗(參照「2.測定方法」的(2-2))3次,然後在第4次使用將M.tuburculosis的LAM固相化的微量盤進行生物淘洗。
同樣地,對於由以HR37Ra死菌體免疫的兔子的脾臟細胞所製作出的scFv噬菌體展示庫,以H37Ra死菌體作為抗原進行生物淘洗3次,然後在第4次藉由將M.tuburculosis的LAM固相化的微量盤進行生物淘洗。
由最後所得到的各淘洗庫隨機選擇200株,篩選出LAM反應性殖株。其結果,由各庫分別可得到約10株左右的LAM反應性殖株。
解析鹽基序列的結果,確認了由各庫所得到的殖株的鹽基序列大致一致。
藉由以上的操作,由以BCG疫苗免疫的兔子的脾臟細胞的scFv噬菌體展示庫及以HR37Ra死菌體免疫的兔子的脾臟細胞的scFv噬菌體展示庫,成功地分離出各1株的scFv(單鏈抗體)。
將由以HR37Ra死菌體免疫的兔子的脾臟細胞製作出的單鏈抗體scFv(Myco-scFv)之胺基酸序列(序列號碼30)及BCG疫苗、由免疫的兔子的脾臟細胞製作出的單鏈抗體scFv(TB-scFv)的胺基酸序列(序列號碼12)、重鏈可變區域的CDR1、CDR2、及CDR3區域;GS連接子;及輕鏈可變區域的CDR1、CDR2、及CDR3區域的位置一併表示於圖
4。
(2)scFv的LAM反應性
分別針對由以BCG疫苗免疫的兔子的脾臟細胞調製出的scFv噬菌體展示庫所得到的單鏈抗體scFv(TB-scFv)、及由以HR37Ra死菌體免疫的兔子的脾臟細胞調製出的scFv噬菌體展示庫所得到的單鏈抗體scFv(Myco-scFv),評估對LAM的反應性。
具體而言,首先依照「1.材料的調製」的(1-6)所記載之方法使各單鏈抗體scFv(TB-scFv、Myco-scFv)可溶化,調製出可溶性scFv。接下來依照同章節的(1-7)所記載的方法,對該等實施生物素標記,對於分別將純化的M.tuberculosis及M.avium的LAM固相化的抗原盤(純化LAM固相化微量滴定盤)的反應性,藉由「2.測定方法」的(2-1)所記載之ELISA法進行測定評估。
分別將單鏈抗體TB-scFv與M.tuberculosis的LAM(-■-)及M.avium的LAM(-●-)的反應性表示於圖5。如圖5所示般,以1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、及7.8125ng/ml的濃度,藉由將LAM固相化的抗原盤,使TB-scFv與M.tuberculosis的LAM及M.avium的LAM進行反應的結果,確認了在M.tuberculosis的LAM(-■-)的情況,TB-scFv濃度為250ng/ml時,OD值(450nm)超過3,反應達最大值,相對於此,在M.avium的LAM(-●-)的情況,即使TB-scFv濃度為1000ng/ml,OD值(450nm)為2左右,反
應並未達最大值。另一方面,雖未揭示結果,而Myco-scFv對於M.tuberculosist與M.avium兩者的LAM表現出大致同等的反應性。
由以上的結果,確認了以BCG疫苗作為免疫原所調製出的單鏈抗體TB-scFv,係對於人型結核菌M.tuberculosis的LAM,具有比非結核性分枝桿菌M.avium的LAM更強的反應性的特異抗體。
實施例2 LAM檢測ELISA的建立
將參考例1及實施例1所製作出的3種抗體(寡聚化LAM免疫的兔子多株抗體(以下稱為「Myco-Poly」)(參考例1)、H37Ra死菌體免疫的兔子單株抗體(Myco-svFv)及BCG疫苗免疫的兔子單株抗體(TB-scFv)(以上的實施例1))的特徵整理於表2。
以這些各抗體的反應專一性為基礎,將各抗體加以組合,建立出分枝桿菌LAM檢測用與結核菌LAM檢測用這2種ELISA。
(1)分枝桿菌LAM檢測用ELISA的製作
分枝桿菌LAM檢測用ELISA的建立,是將Myco-Poly固相化於盤中作為捕捉用抗體,另外,對Myco-scFv實施生物素標記而使用作為檢測用抗體。
以磷酸緩衝液將Myco-poly調製成10μg/ml的濃度。以100μL/孔的比例添加至96孔微量盤中,在4℃下反應一晚後,在含有1%脫脂牛乳的磷酸緩衝液中進行阻斷,藉此製作出抗體盤。
一次反應係將以反應緩衝液(含有1%BSA、1%脫脂牛乳、0.14M NaCl、0.1%Tween 20且pH 7.8的tris緩衝液)稀釋的可含有分枝桿菌的受測試樣100μL逐一添加至上述抗體盤的各孔中,在25℃下反應1小時後,進行洗淨3次。二次反應係將以反應緩衝液稀釋5,000倍的生物素標記-抗Myco-scFv100μL逐一添加至上述抗體盤的各孔中,在25℃下反應1小時後,洗淨3次以除去未反應的抗體。三次反應係添加以反應緩衝液10,000倍稀釋的抗生物素蛋白標記HRP(MILLIPORE公司製)100μL,在25℃下反應1小時後,洗淨3次以除去未反應的抗生物素蛋白標記HRP。
發色反應係藉由將100μL的TMB溶液添加至各孔,在室溫下放置10分鐘來進行,發色後,添加100μL的1N硫酸溶液以使反應停止。發色強度的檢測係藉由測定波長450-650nm的吸光度來進行。
(2)結核菌LAM檢測用ELISA的製作
結核菌LAM檢測ELISA,是藉由捕捉用抗體及檢測用抗體皆採用TB-scFv來建立。除了捕捉用抗體及檢測用抗體
採用TB-scFv以外,以與上述(1)同樣的方式製作出結核菌LAM檢測ELISA。
(3)各LAM檢測用ELISA的評估
對(1)及(2)所分別製作出分枝桿菌LAM檢測ELISA及結核菌LAM檢測ELISA對LAM的反應性,使用人型結核菌(M.tuberculosis)的純化LAM及分枝桿菌(M.avium)的純化LAM進行評估。
將結果表示於圖6。圖中,●表示分枝桿菌LAM檢測ELISA對M.tuberculosis LAM的反應性、■表示分枝桿菌LAM檢測ELISA對M.avium的反應性、○表示結核菌LAM檢測ELISA對M.tuberculosis LAM的反應性、□表示結核菌LAM檢測ELISA對M.avium LAM的反應性。
由圖6可知,分枝桿菌LAM檢測用ELISA可對於M.tuberculosis之LAM(-■-)及M.avium的LAM(-●-)同等地進行檢測。另一方面,確認了結核菌LAM檢測用ELISA在結核菌(M.tuberculosis)的LAM的情況,100ng/ml時,OD值(450nm)為3以上,反應大致達最大值,相對於此,在分枝桿菌(M.avium)的LAM的情況,即使濃度為100ng/ml,也幾乎沒有表現出反應性。
實施例3 分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA對分枝桿菌及結核菌的LAM的抗體反應性的評估(使用分枝桿菌臨床分離株)
使用實施例2所建立的分枝桿菌LAM檢測用ELISA與結核菌LAM檢測用ELISA,並使用圖7所表示的各種分枝桿
菌臨床分離株,評估對分枝桿菌及結核菌的LAM的抗體反應性。
具體而言,分枝桿菌臨床分離株採用M.tuberculosis 38株(參照圖7的A表及B表)的培養液、及MAC症病原菌的M.avium 23株與M.intracellulare6株(參照圖7的C表及D表)的培養液。將各分枝桿菌臨床分離株以液態培養基(含有10%ADC Enrichment:BD公司製的7H9 Broth:BD公司製),在37℃下培養至匯集(confluent),將培養液以-80℃冷凍保存。
使冷凍保存的培養液融化之後,與等量的Y-PER(蛋白萃取試劑:Thermo公司製)混合,然後在95℃下進行加熱處理10分鐘。藉由離心分離(10,000rpm、10分鐘)集菌,然後回收上清液。在所回收的上清液中加入4倍量的反應緩衝液(含有1%脫脂牛乳、0.5%BSA、0.05%Tween 20、及0.1%XL-II的磷酸緩衝液),將100μl供給至實施例2所建立的分枝桿菌LAM檢測用ELISA與結核菌LAM檢測用ELISA,測定對LAM的抗體反應性。
ELISA的測定結果,是藉由與使用作為標準品的純化M.tuberculosis的LAM的抗體反應性作比較來求值。將結果表示於圖7。
如圖7所表示般,分枝桿菌LAM檢測用ELISA(參照圖7各表中的「myco」所記載之列)對於M.tuberculosis 38株、M.avium 23株、M.intracellulare 6株全部皆表現出反應性。另一方面,結核菌LAM檢測用ELISA(參照圖7各表中
的「TB」所記載之列)對於M.tuberculosis以38株中的34株的高比例表現出反應性,而對於M.avium 23株及M.intracellulare 6株完全未表現出反應性。
如此一來,判明了實施例2所製作出的分枝桿菌LAM檢測用ELISA係與分枝桿菌的LAM的反應性優異,可廣泛檢測分枝桿菌的LAM。相對於此,實施例2所製作出的結核菌LAM檢測用ELISA在株間的反應性會有所差異,與分枝桿菌LAM檢測用ELISA相比,反應較具有專一性。亦即,實施例2所製作出的結核菌LAM檢測用ELISA可專一性地檢測結核菌的LAM,靈敏度為90%,特異度為100%,呈現良好的結果。
由以上的結果看來,確認了依據實施例2所製作出的分枝桿菌LAM檢測用ELISA(捕捉抗體:Myco-Poly、檢測用抗體:Myco-scFv),可廣泛檢測分枝桿菌的LAM,另外,依據實施例2所製作出的結核菌LAM檢測用ELISA(捕捉抗體:TB-scFv、檢測用抗體:TB-scFv),能夠區別出非結核性分枝桿菌的LAM,而專一性地檢測出結核菌的LAM。
實施例4 LAM檢測用免疫層析法的建立
使用以ELISA進行評估的抗體的組合,來進行分枝桿菌LAM檢測用與結核菌LAM檢測用的免疫層析測試的建立。
(1)分枝桿菌LAM檢測用免疫層析法
分枝桿菌LAM檢測用免疫層析測試的建立,是將Myco-Poly固相化於硝基纖維素膜作為捕捉用抗體,另外,對於
Myco-scFv實施膠體金標記,使用作為檢測用抗體。
在硝基纖維素膜(Millipore公司製;毛細管流時間240)上以3.0mg/mL(磷酸緩衝液)的濃度塗佈Myco-Poly(捕捉用抗體),在50℃下乾燥20小時。將在硝基纖維素基板貼附吸收墊而成的免疫層析試片貼上疊層密封件,並且切成寬度4mm,而製成測試1次用的試片。
Myco-scFv的膠體金標記,是使用粒徑為40nm的膠體金。在膠體金(OD=1)中以2.0μg/mL的濃度添加Myco-scFv,使其在室溫下反應20分鐘。抗體結合時的緩衝液,是使用2mM TES[N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid](pH7.5)。在進行膠體金標記之後,以2mM Borax[Sodium Tetraborate Decahydrate]、1.5%BSA(pH9.0)、300rpm,在室溫下反應5分鐘,藉此進行阻斷。在阻斷操作之後,以4620×g、20分鐘,在4℃下進行離心分離,將上清液除去。使所得到的沉積物懸浮於膠體金標記抗體稀釋溶液(10mM Borax、5%Sucrose、1%BSA(pH9.0))之後,以0.1μm的過濾器進行過濾。
測定方法是以萃取液(72mM磷酸二氫鈉二水合物、4.5%蛋白素(來自牛血清)、0.9%酪蛋白、0.09%Triton X-305、0.1%疊氮化鈉、10.0%Y-PER、氫氧化鈉適量、鹽酸適量、pH7.0)將可含有分枝桿菌的受測試樣稀釋之後,適量添加膠體金標記抗體溶液,於其中插入上述所製作出的試片,將受測試樣展開。在展開開始之後7分鐘,將試片移位,以含有界面活性劑(0.1%Tween 20)的磷酸緩衝液進行
洗淨操作8分鐘,然後以目視判定陽性.陰性。
(2)結核菌LAM檢測用免疫層析法
結核菌LAM檢測用免疫層析,是藉由捕捉用抗體及檢測用抗體皆採用TB-scFv來建立。其他建立方法及測定方法,係以與上述(1)之分枝桿菌LAM檢測用免疫層析測試的建立方法及測定方法同樣的方式進行。
(3)各LAM檢測用免疫層析法的評估
使用純化的M.tuberculosis的LAM及M.avium的LAM,評估(1)及(2)所分別製作出的分枝桿菌LAM檢測用免疫層析及結核菌LAM檢測用免疫層析對LAM的反應性。
將結果表示於圖8。
以分枝桿菌LAM檢測用及結核菌LAM檢測用的免疫層析法測定M.tuberculosis的LAM的結果,在任一測試中皆能夠以目視確認條紋(myco:分枝桿菌LAM檢測用、TB:結核菌LAM檢測用)(圖A及B)。同樣地,對於M.avium的LAM以兩種檢測系統測定的結果,分枝桿菌LAM檢測用免疫層析測試(myco)如圖C及D所示般,能夠以目視確認與測定M.tuberculosis的LAM的情況同等的條紋。另一方面,在結核菌LAM檢測用免疫層析法(TB)的情況,即使在1000ng/ml的高濃度也並未檢測到條紋(圖D)。
以上的結果顯示,以BCG疫苗作為免疫原所調製出的單鏈抗體TB-scFv,即使是免疫層析測試,也能夠專一性地檢測人型結核菌(M.tuberculosis)的LAM。
如以上的實施例1~4所示般,這次分離出與結核
菌的LAM專一性地反應的單鏈抗體(scFv(TB-scFv)),藉由使用該TB-scFv來測定LAM,成功地確立可專一性地檢測結核菌的LAM的測定系統。使用TB-scFv的測定系統,可應用於ELISA或免疫層析測試,認為能夠簡便、迅速地診斷結核感染症。
3.材料的調製
(3-1)BCG疫苗、及免疫抗原的調製
BCG疫苗採用日本BCG製造股份有限公司製的冷凍乾燥BCG疫苗(認證碼20300AMZ00767000)。在該冷凍乾燥BCG疫苗100mg(濕重量)中加入生理食鹽水1ml,將混合物使用於免疫。
(3-2)雞scFv噬菌體庫的製作
使用BCG疫苗作為免疫抗原使雞免疫(參照上述(3-1)及實施例6)。免疫結束後,將雞的脾臟摘出,在RPMI(無血清)培養基中使組織溶解,萃取出Total RNA。Total RNA的萃取是使用RNA萃取套組(QIAGEN公司),依照操作手冊來進行。另外,由Total RNA合成出cDNA,是使用cDNA合成套組(Invitrogen公司)並依照操作手冊來進行。
以所合成出的cDNA作為模板,使用表3所記載的引子,使VH基因斷片及VL基因斷片增幅。具體而言,VH基因斷片是藉由Sfi1-CκVH F與GSL-CκVH R之引子組來增幅,VL基因斷片是藉由GSL-CκVL F與Not1-CκVL R之引子組來增幅。
所得到的基因增幅產物係藉由1.5%洋菜膠體電泳進行分離,由膠體萃取純化出目標分子量的基因增幅產物。
將純化的VH基因產物及VL基因產物藉由GS連接子(序列號碼40)接合。將VH基因產物的3'末端具有同源序列的CκVL-GSL-VH R(序列號碼46)與VH基因混合,進行PCR5個循環,藉此使GS連接子附加在VH基因的3'末端。同樣地,將VL基因產物的5'末端具有同源序列的CκVH-GSL-VL F(序列號碼45)與VL基因混合,進行PCR5個循環,藉此使GS連接子附加在VL基因的5'末端。將附加GS連接子的VH基因與VL基因混合,進行PCR10個循環,藉此製作出將VH基因/GS連接子基因/VL基因接合的scFv基因(雞scFv基因)。最後,使用限制酵素Sfi I及Not I來切斷。
接下來,將以限制酵素處理後的scFv基因插入抗體展示用噬菌粒載體pCANTAB5E之Sfi-I及Not-I部位,藉由電穿孔法轉殖至大腸菌JM109株之後,以LB-Amp/Glu洋菜培養基(含有150μg/mL青黴素、1%葡萄糖、1.5%洋菜的LB培養基)在37℃下培養一晚,將所產生的菌落全部回收。
將該轉殖大腸菌以LB培養基調製成波長600nm
之吸光度(OD600nm)為0.2之後,與助手噬菌體M13K07(1012cfu)混合,在37℃下靜置培養30分鐘之後,進一步以1L的LB-Amp/Kan液態培養基(含有150μg/mL青黴素、100μg/mL康黴素的LB培養基),在37℃下培養一晚,藉此製作出雞的scFv噬菌體展示庫。
最後,將此scFv噬菌體展示庫以PEG/NaCl溶液濃縮,並以PBS調製成約1x1012cfu/mL的濃度,並使用於生物淘洗。
(3-3)使用雞scFv庫的抗原生物淘洗
抗原生物淘洗是藉由第1至4步驟所構成的4個步驟來進行。
第1至3步驟是進行與免疫抗原(BCG疫苗)結合的噬菌體殖株的濃縮。將以反應緩衝液(含有1%BSA、1%脫脂牛乳、0.14M Nacl、0.1%Tween 20且pH 7.8的tris緩衝液)調製成1x1011cfu/500μL的雞scFv噬菌體展示庫(參照「3.材料的調製」的(3-2))與BCG疫苗1mg混合,在25℃下反應2小時。反應後,藉由離心分離(10,000rpm 10分鐘)集菌,並除去上清液。在集菌後的菌體中添加PBS並混合,然後再度藉由離心分離集菌,並且進行洗淨。洗淨操作進行5次。以500μL的溶離液(將含有0.1%BSA的0.1N HCl溶液以1M甘胺酸溶液調整成pH2.2)使結合在菌體的噬菌體溶離後,加入500μL的中和液(1M tris緩衝液pH9.1)使其中和。將中和的噬菌體庫感染大腸菌JM109株,然後以LB-Amp/Glu洋菜培養基在37℃下培養一晚,並回收菌落。將以LB培養基調製
成OD 600nm=0.2的轉殖大腸菌與助手噬菌體M13K07(1012cfu)在37℃下靜置培養30分鐘,然後加入100mL的LB-Amp/Kan液態培養基,在37℃下培養一晚。將噬菌體培養液以PEG/NaCl溶液濃縮,並以磷酸緩衝液調製成約1x1012cfu/mL的濃度。利用菌體進行3次生物淘洗。
第4步驟是使TB-scFv固相化的盤與M.tuberculosis的純化LAM反應,使用TB-scFV與LAM的複合體進行生物淘洗。在將TB-scFv以5μg/ml濃度固相化的微量盤中添加M.tuberculosis的純化LAM10μg,使其在25℃下反應1小時。在洗淨後,添加第3步驟所得到的結合在菌體的噬菌體庫,使其在25℃下反應2小時,接下來,以反應緩衝液洗淨10次以除去未反應的噬菌體。以100μL的溶離液使結合於TB-scFv與LAM的複合體的噬菌體溶離,然後加入100μL的中和液(1M tris緩衝液pH 9.1)使其中和。將中和的噬菌體庫感染大腸菌JM109株,然後以LB-Amp/Glu洋菜培養基在37℃下培養一晚。
(3-4)與LAM結合的雞scFv殖株的選擇
與LAM結合的scFv,是藉由噬菌體ELISA法選擇與LAM專一性地反應的噬菌體殖株來進行。在使用上述(3-3)所說明的雞scFv庫的抗原生物淘洗的第4步驟得到噬菌體庫,培養為單一菌落,將所得到的單一菌落以50μL的LB-Amp培養基在37℃下培養8小時。以50μL的助手噬菌體M13K07(1012cfu/mL)液使其感染之後,加入400μL的LB-Amp/Kan液態培養基,在37℃下培養一晚,製作出單一
噬菌體殖株的培養液。
噬菌體ELISA係藉由,在將TB-scFv以5μg/ml濃度固相化的微量盤中添加M.tuberculosis的純化LAM10μg,使其在25℃下反應1小時,形成TB-scFv與LAM的複合體,並篩選與該複合體反應的殖株來進行。一次反應係藉由將90μL的反應緩衝液(含有1%BSA、1%脫脂牛乳、0.05%Tween 20的磷酸緩衝液)與10μL的scFv噬菌體展示培養液添加至LAM固相化盤,在25℃下反應1小時來進行,然後洗淨3次以除去未反應的噬菌體。二次反應係藉由在上述一次反應液中添加以與上述相同的反應緩衝液稀釋5,000倍的HRP標記抗M13噬菌體p8蛋白質抗體100μL,使其在25℃下反應1小時來進行。然後洗淨3次以除去未反應的抗體。發色反應係藉由在二次反應液中添加100μL的TMB溶液,使其在室溫下反應10分鐘來進行,發色之後,以100μL的1N硫酸溶液使反應停止。檢測是藉由測定波長450-650nm的吸光度(OD 450-650nm)來進行。
藉由將與LAM具有反應性的殖株PCR,使scFv基因增幅,藉由直接定序法來決定基因序列。
(3-5)利用二價抗體的ELISA的評估所使用的檢體
利用二價抗體的分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA的評估,是使用分枝桿菌臨床分離株(M.tuberculosis 38株、M.aviurn 23株、M.intracellulare 6株)以及BCG、口腔內細菌6種(N.asteroids、N.farcinica、S.globisporus、C albicans、A.israelii、T.paurometabolum)、
及痰液檢體(54例)來進行。由培養菌體及痰液檢體萃取LAM,全部以相同條件進行。在樣品中添加NaOH使最終濃度成為0.4M,混合之後煮沸30分鐘。煮沸後添加磷酸緩衝液使其中和。
4.測定方法
(4-1)二價抗體的製作
將單鏈抗體scFv改變為二價抗體,可藉由一般的手段來進行。將VH區域基因及VL區域基因,由Myc0-scFv(序列號碼30)、TB-scFv(序列號碼12)、及G3-scFv(序列號碼39)分別選殖至具有兔定常區域的哺乳動物細胞表現載體(商品名;pFUSEss-CHIg-rG*03及pFUSE2ss-CLIg-rk1,InvivoGen公司製),而製作出VH表現載體及VL表現載體。將VH表現載體與VL表現載體混合,並導入CHO細胞。培養該載體導入細胞4天之後,回收培養上清液,使用Protein A(Biorad公司製),分別由培養上清液分離純化出二價抗體(2價Myco-scFv、2價TB-scFv、及2價G3-scFv)。
(4-2)二價抗體的生物素標記
二價抗體的生物素標記,是使用PIERCE公司的Sulfo-NHS-LC-Biotin標記套組並依照套組所附屬的操作手冊的記載來進行。生物素標記化抗體係使用於ELISA測定系統的建立。
(4-3)利用二價抗體的分枝桿菌LAM檢測用ELISA的建立
利用二價抗體的分枝桿菌LAM檢測用ELISA,是使用2
價TB-scFv、2價G3-scFv、及2價Myco-scFv(參照「二價抗體的製作」的(4-1))來建立。
將2價TB-scFv與2價G3-scFv等量混合,以磷酸緩衝液將濃度調整成5μg/ml。以100μL/孔的比例將其添加至96孔微量盤中,在4℃下反應一晚之後,在含有1%脫脂牛乳的磷酸緩衝液中進行阻斷,藉此製作出使上述二價抗體固相化的抗體盤。
一次反應係藉由將以反應緩衝液(含有1%BSA、1%脫脂牛乳、0.14M Nacl、0.1%Tween 20且pH7.8的tris緩衝液)稀釋的樣品100μL添加至上述抗體盤的孔中,使其在25℃下反應1小時30分鐘來進行,然後洗淨3次。二次反應係藉由將以與上述相同的反應緩衝液稀釋5,000倍的生物素標記2價Myco-scFv100μL添加至上述一次反應液中,使其在25℃下反應1小時30分鐘來進行,然後洗淨3次以除去未反應的抗體。三次反應係藉由在上述二次反應物中添加以與上述相同的反應緩衝液10,000倍稀釋的抗生物素蛋白標記HRP100μL,使其在25℃下反應1小時30分鐘來進行,然後洗淨3次以除去未反應的抗生物素蛋白標記HRP。發色反應是藉由在三次反應物中添加100μL的TMB溶液,使其在室溫下反應10分鐘來進行。發色後,以100μL的1N硫酸溶液使反應停止。檢測是藉由測定波長450-650nm的吸光度(OD 450-650nm)來進行。
(4-4)利用二價抗體的結核菌LAM檢測用ELISA的建立
利用二價抗體的結核菌LAM檢測用ELISA,捕捉用抗體是採用2價TB-scFv,檢測抗體是採用生物素標記的2價Myco-scFv。除了使用2價TB-scFv作為捕捉用抗體,使用生物素標記2價Myco-scFv作為檢測抗體以外,以與上述(4-3)所記載之分枝桿菌LAM檢測用ELISA同樣的方式,建立結核菌LAM檢測用ELISA。
實施例5 雞的免疫、及雞抗血清對LAM的抗體價評估
雞的免疫是藉由將「3.試樣的調製」(3-1)所記載之方法所調製出的BCG疫苗(100mg濕重量/1ml生理食鹽水)全量以皮下免疫的方式來進行。以14天的間隔進行4次的免疫之後,藉由ELISA評估雞的血中抗體價。
將純化的人型結核菌M.tuberculosis的LAM(來自青山B株,Nacalai Tesque)、或純化的M.avium的LAM(來自血清型B株,Nacalai Tesque)以PBS調整成100μl/ml的濃度。將其以以100μL/孔的比例添加至96孔微量盤中,在4℃下反應一晚後,在含有1%脫脂牛乳的磷酸緩衝液中進行阻斷,藉此製作出抗原盤。
一次反應係藉由將以反應緩衝液(含有1%BSA、1%脫脂牛乳、0.14M Nacl、0.1%Tween 20且pH 7.8的tris緩衝液)稀釋的雞血清100μL逐一添加至上述抗原盤的各孔中,使其在25℃下反應1小時來進行,然後洗淨3次以除去未反應的抗體。二次反應係藉由在上述一次反應液中添加以與上述相同的反應緩衝液稀釋5,000倍的HRP標記抗雞
IgY100μL,使其在25℃下反應1小時來進行,然後洗淨3次以除去未反應的抗體。發色反應係藉由添加100μL的TMB溶液,使其在室溫下反應10分鐘來進行,發色後,添加100μL的1N硫酸溶液使反應停止。檢測是藉由測定波長450-650nm的吸光度(OD450-650nm)來進行。
將結果表示於圖9。圖中,「-■-」表示對雞抗血清的純化M.tuberculosis LAM的反應性、「-●-」表示對雞抗血清的純化M.avium LAM的反應性。如圖9所示般,藉由以BCG疫苗使雞免疫,確認了對LAM的抗體價充分上昇。另外,對結核菌的LAM及分枝桿菌的LAM的任一者皆表現出同等的反應性。
實施例6 對LAM的雞scFv(單鏈抗體)的製作
(1)對LAM的雞scFv(單鏈抗體)的製作
由以BCG疫苗免疫的雞的脾臟細胞分離出單鏈抗體scFv。具體而言,依照「3.材料的調製」的(3-2)所記載的方法,由雞的脾臟調製出Total RNA,以由其所合成出的cDNA作為模板,使用表3所記載之各種引子,實施PCR,藉此調製出VH基因增幅產物及VL基因增幅產物。接下來,製作出VH基因與VL基因透過GS連接子(序列號碼40)接合而成的雞單鏈抗體(VH基因/GS連接子/VL基因),由其製作出scFv噬菌體展示庫。各庫的滴度約為106cfu,因此可推測為具有106個多樣性的庫。
使用所製作出的scFv噬菌體展示庫,利用BCG疫苗進行3次生物淘洗。第4次的淘洗,是為了分離出可辨識
與TB-scFv相異的抗原決定區的單鏈抗體scFv,並使用了將TB-scFv固相化的微量盤與M.tuburculosis的LAM(來自青山B株)反應所形成的複合體。使將TB-scFv固相化的微量盤與M.tuburculosis的LAM溶液反應,在洗淨3次後,添加BCG淘洗噬菌體庫,在25℃下反應2小時。反應後,洗淨3次使LAM結合噬菌體溶離。最後,由各淘洗庫隨機選擇200株,使用TB-scFv與LAM的複合體來篩選LAM反應性殖株。由各庫分別可得到約10株左右的LAM反應性殖株。由解析鹽基序列的結果,確認了由各庫所得到的殖株的序列幾乎一致。
由以上可知,由以BCG疫苗免疫的雞之脾臟所調製出的scFv噬菌體展示庫成功地分離出1株的單鏈抗體scFv(G3-scFv)。將由雞脾臟庫分離出的單鏈抗體G3-scFv的胺基酸序列(序列號碼39)、重鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3區域、GS連接子;以及輕鏈可變區域的CDR1、CDR2及CDR3區域的位置一併表示於圖10。
(2)雞scFv(單鏈抗體)的LAM反應性
對於上述所製作出的G3-scFv的反應性,使用將純化M.tuberculosis的LAM及M.avium的LAM固相化的盤來進行評估。具體而言,依照「1.材料的調製」的(1-6)所記載之方法使G3-scFv可溶化,調製出可溶化G3-scFv。接下來依照同章節的(1-7)所記載之方法,進行生物素標記,對於分別將純化的M.tuberculosis的LAM及M.avium的LAM固相化的抗原盤(純化LAM固相化微量滴定盤)的反應性,藉由
ELISA法進行測定、評估。
其結果,G3-scFv對於結核菌的LAM及分枝桿菌的LAM的任一者皆表現出同等的反應性。由此結果看來,認為雞的單鏈抗體G3-scFv,係對於包括結核菌LAM在內的分枝桿菌LAM全體具有反應性的抗體。
實施例7 利用二價抗體的LAM檢測用ELISA的建立
考慮到實用化,依照「二價抗體製作」的(4-1)所記載之方法,將實施例1及6所製作出的3種單鏈抗體scFv(Myco-svFv、TB-scFv、G3-scFv)改變成二價抗體,以該二價抗體的反應專一性為基礎,建立出分枝桿菌LAM檢測用與結核菌LAM檢測用這2種ELISA。具體而言,分枝桿菌LAM檢測用ELISA,是將2價TB-scFv與2價G3-scFv混合並且固相化於盤作為捕捉用抗體,並對2價Myco-scFv實施生物素標記而使用作為檢測用抗體。結核菌LAM檢測用ELISA,是將2價TB-scFv固相化於盤作為捕捉用抗體,並對2價Myco-scFv實施生物素標記而使用作為檢測用抗體。細節如「4.測定方法」的(4-3)及(4-4)所記載。
所建立出的分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA的評估,是藉由測定由BCG培養菌體萃取的LAM來進行(圖11)。其結果,如圖11所示般,藉由分枝桿菌LAM檢測用ELISA(-■-)及結核菌LAM檢測用ELISA(-●-),任一者皆能夠以同等的靈敏度檢測BCG的LAM。
實施例8 利用二價抗體的LAM檢測ELISA之檢測靈敏度評估
為了評估利用二價抗體的ELISA的靈敏度,將BCG培養菌體由106cfu/ml稀釋至61cfu/ml,由此稀釋液的一部分萃取出基因,進行基因增幅檢查(NAAT),由一部分萃取出LAM,進行分枝桿菌LAM檢測用ELISA。
將分枝桿菌LAM檢測用ELISA的結果表示於圖12。如圖12中的表所表示般,基因增幅檢查(NAAT)的檢測靈敏度約為500cfu/ml,相對於此,分枝桿菌LAM檢測用ELISA的檢測靈敏度約為250cfu/ml。目標為用來進行基因增幅檢查的重覆序列,其重覆數會依照菌株而有所差異,因此檢測靈敏度會依照菌株而出現差異。由於BCG的重覆序列少,因此基因檢查的靈敏度低,一般而言認為在重覆序列多的菌株的情況,檢測靈敏度為100cfu/ml。
由以上的結果,証明了利用二價抗體的本發明之分枝桿菌LAM檢測用ELISA為非常高靈敏度的免疫測定方法,具有高於基因增幅檢查或同等的檢測靈敏度。
實施例9 利用二價抗體的LAM檢測ELISA的交差反應性測試
口腔內細菌之中,存在具有與LAM的構成成分類似構造的膜抗原的種類。在檢測痰液檢體中的分枝桿菌的LAM或結核菌的LAM的情況,與該等口腔內細菌的交差反應性會成為嚴重問題,在確立使用痰液的分枝桿菌及結核菌的檢測免疫測定方法時會成為一項障礙。
此處,為了確認LAM檢測ELISA與口腔內細菌的交差反應性,分別將N.asteroids(簡稱「Na」)、N.farcinica(簡稱「Nf」)、S.globisporus(簡稱「Sg」)、C albicans(簡稱「Ca」)、A.israelii(簡稱「Ai」)、及T.paurometabolum(簡稱「Tp」)液態培養,調整成106cfu/ml及108cfu/ml(僅Ca為107cfu/ml),然後以與BCG培養菌體同樣的方式萃取LAM,以LAM檢測用ELISA進行測定。圖13表示分枝桿菌LAM檢測用ELISA的結果。
由圖13可知,控制組所使用的BCG的反應性,在105cfu/ml濃度達最大值,相對於此,各口腔內細菌即使在108cfu/ml的高濃度菌體量,也完全未表現出反應性。結核菌LAM檢測用ELISA亦顯示出完全同樣的結果。
以上的結果,証明了吾人所取得的單鏈抗體scFv(Myco-svFv、TB-scFv、G3-scFv),對於分枝桿菌及結核菌的LAM具有高親和性,藉由將該等組合使用作為二價抗體,能夠以與基因增幅檢查同等的高靈敏度檢測分枝桿菌(含有結核菌),且與口腔內細菌完全不具有交差反應性,而為選擇性且專一性非常高的抗體及測定方法。
實施例10 以臨床分離株對於利用二價抗體的LAM檢測用ELISA進行評估
對於利用二價抗體的分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA,使用分枝桿菌臨床分離株進行評估。
臨床分離株採用M.tuberculosis 38株、及MAC症
的病原菌的M.avium 23株與M.intracellulare 6株,由該等的培養菌體萃取出LAM,進行利用二價抗體的分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA。將結果表示於圖14。
圖14的A表示對於結核菌臨床分離株(M.tuberculosis)38株實施分枝桿菌LAM檢測用ELISA(黑柱)及結核菌LAM檢測用ELISA(白柱)的結果。B表示對於非結核性分枝桿菌29株(M.avium 23株與M.intracellulare6株)實施分枝桿菌LAM檢測用ELISA(黑柱)及結核菌LAM檢測用ELISA(白柱)的結果。
分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA對於M.tuberculosis 38株、M.avium 23株、M.intracellulare6株全部皆表現出反應性。但是,分枝桿菌LAM檢測用ELISA會與結核菌及非結核性分枝桿菌同等地反應,相對於此,結核菌LAM檢測用ELISA,對於非結核性分枝桿菌表現出低反應性。
為了只以LAM檢測用ELISA的結果來鑑別結核菌與非結核性分枝桿菌的種類,計算出分枝桿菌LAM檢測用ELISA值與結核菌LAM檢測用ELISA值之比(分枝桿菌LAM檢測用ELISA值/結核菌LAM檢測用ELISA值)(圖15)。其結果,在結核菌方面,兩測定值的比超過3倍的情形在38株中只有1株。另外,在非結核性分枝桿菌方面,29株中有23株出現3倍以上的比。
以上的結果顯示,LAM用檢測用ELISA可幾乎不
受株間差異的影響而檢測LAM。此外,藉由計算出兩測定系統的比(分枝桿菌LAM檢測用ELISA值/結核菌LAM檢測用ELISA值),能夠以靈敏度97%,專一性80%的良好成績來鑑別(識別)結核菌與非結核性分枝桿菌,由此証明了本發明之方法為「可檢測全部的分枝桿菌,並且可識別結核菌與非結核性分枝桿菌」的LAM檢測用ELISA,而為世界上首先出現的免疫測定系統。
實施例11 以臨床痰液檢體對於利用二價抗體的LAM檢測ELISA進行評估
為了評估實施例7所建立出的利用二價抗體的LAM檢測用ELISA的性能,使用54例的臨床痰液檢體來進行評估。評估係進行直接抹片檢查(Smear)及基因增幅檢查(NAAT)兩者。將直接抹片檢查及基因增幅檢查的結果整理於表4。
直接抹片檢查為陽性例(3+、2+、1+、Scanty)有43例,基因增幅檢查為陽性例(+)有45例。該等之中,兩檢查為陽性的情況有42例,兩檢查為陰性的情況有8例,此
外,僅基因增幅檢查為陽性的情況有3例。
由臨床痰液檢體萃取出LAM,將藉由分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA所分別測得的結果表示於表5及圖16。在表5中,一併表示了分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA的檢測率。
如表5所示般,分枝桿菌LAM檢測用ELISA及結核菌LAM檢測用ELISA的結果幾乎相同。在以抹片檢查確認為1+以上的菌體量的群體之中,ELISA的反應性在大部分的檢體達最大值。關於菌體量少的Scanty,在50%的檢體之中ELISA的反應性達最大值。再者,在只有基因增幅檢查判定為陽性而菌體量非常少的3例之中,全部顯示出高於以基因增幅檢查判斷為陰性的檢體的值。在分枝桿菌LAM檢測用ELISA的情況,可由以基因增幅檢查判斷為陽性的全部的檢體檢測到LAM,然而由以基因增幅檢查判斷為陰性的檢體,每一例皆無法檢測到LAM。亦即,分枝桿菌LAM檢測用ELISA的靈敏度及專一性,在與基因增幅檢查相比的情況為100%一致。在結核菌LAM檢測用ELISA之中,只有基因增幅檢查為陽性且以Smear test判定為scanty的1例與基因增幅檢查不一致,其他則全部與基因增幅檢查一致。另外,不一致的1例也只是稍微低於截止值。
以上的結果顯示,本發明的LAM檢測用ELISA為能夠以與基因增幅檢查同等的靈敏度及專一性來篩選分枝桿菌感染症患者的檢查。
接下來,為了確認LAM檢測用ELISA值與菌量相關,而進行稀釋測定。
將來自痰液檢體的萃取溶液稀釋5倍、25倍、及125倍,以純化LAM作為標準品,同時進行測定,計算出LAM濃度。將結果表示於圖17。
基於基因增幅檢查及抹片檢查(Smear test),依照菌量將檢體分群(I:基因增幅檢查及抹片檢查皆陰性、II:基因增幅檢查陽性及抹片檢查陰性、III:基因增幅檢查陽性及抹片檢查scanty、IV:抹片檢查1+、V:抹片檢查2+、VI:抹片檢查3+),並與LAM濃度(pg/ml)作比較。其結果,如圖17所示般,隨著菌量少的群至菌量多的群(I→VI)的變化,LAM濃度的平均值亦上昇,菌量與LAM濃度表現出正相關。以上的結果顯示可藉由定量LAM濃度來預測菌量。
這些結果顯示,本發明之方法係具有與基因增幅檢查同等的靈敏度及專一性,進一步証明了能夠應用於可決定菌量的檢查、結核的治療監測等。
實施例12 LAM的安定性評估
在運送痰液檢體的情況,因為感染性的問題,必須在嚴格管理之下進行運送。此情況下,成本會變高,甚至可利用的地區會受限。在採取痰液檢體後進行滅菌的情況下,可進行通常的運送。為了將分枝桿菌完全滅菌,必須
進行30分鐘以上的煮沸或加壓蒸氣滅菌(高壓滅菌釜等)處理。在進行這種處理的情況,可預測LAM的構造會發生變化。吾人針對上述所建立出的LAM檢測ELISA是否對於嚴苛的滅菌處理具有耐性,是否可正確檢測LAM進行檢討。
分別由對於BCG培養菌體實施高壓滅菌釜處理(121℃、20分鐘)後的菌體(高壓滅菌釜處理菌),在100℃下煮沸處理30分鐘後的菌體(煮沸處理菌)、及未處理菌萃取出LAM,以分枝桿菌LAM檢測用ELISA進行測定。將結果表示於圖18。若比較未處理菌(白柱)與煮沸處理菌(黑柱)及高壓滅菌釜處理菌(灰色柱),則任一者皆為完全相同的值,即使是受到如煮沸或高壓滅菌釜般的嚴苛處理的菌體,也顯示與未處理菌同樣地可測定LAM。
進一步使用最嚴苛處理的高壓滅菌釜處理(121℃,20分鐘)的菌體,進行保存安定性的評估。將高壓滅菌釜處理後的BCG菌體在25℃下放置7天,然後對於萃取出的LAM實施分枝桿菌LAM檢測用ELISA。將其結果(黑柱)與對於由剛完成高壓滅菌釜處理後的BCG菌體萃取出的LAM實施分枝桿菌LAM檢測用ELISA的結果(白柱)表示於圖19。由圖19可知兩者幾乎沒有差異,即使是高壓滅菌釜處理後放置7天的菌體,亦可得到與剛完成處理後的菌體同等的結果,顯示至少在滅菌處理後1週仍可進行測定。
由以上的結果,可確認本測定系統亦能夠以實施如加壓蒸氣滅菌(高壓滅菌釜)般的嚴苛的處理的菌體作為對象來進行測定,且處理後至少1週依然可安定地測定。
所以,即使在並未整建特別的檢體運送系統的地區,亦可藉由郵送等一般的運送系統來發送檢體,時間上也有1週左右的緩期,因此認為檢體運送的遲延並不會成為問題。
序列號碼9及10表示GS連接子序列的單位胺基酸序列,序列號碼11及40表示本發明所使用的連接子序列之胺基酸序列。序列號碼13~16表示抗體重鏈可變區域的正股引子的胺基酸序列;序列號碼17表示抗體重鏈可變區域的反股引子的胺基酸序列;序列號碼18~20及24表示抗體輕鏈可變區域的正股引子的胺基酸序列;序列號碼21~23及25表示抗體輕鏈可變區域的反股引子的胺基酸序列:序列號碼26表示GS連接子的正股引子的胺基酸序列;序列號碼27表示GS連接子的反股引子的胺基酸序列:序列號碼28表示限制酵素(Sfi-I)位置的引子的胺基酸序列:序列號碼29表示限制酵素(Not-I)位置的引子的胺基酸序列(參照表1)。
此外,序列號碼41表示抗體重鏈可變區域的正股引子的胺基酸序列;序列號碼42表示抗體重鏈可變區域的反股引子的胺基酸序列;序列號碼43表示抗體輕鏈可變區域的正股引子的胺基酸序列;序列號碼44表示抗體輕鏈可變區域的反股引子的胺基酸序列;序列號碼45表示GS連接子的正股引子的胺基酸序列;序列號碼46表示GS連接子的反股引子的胺基酸序列(參照表3)。
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<223> VH region sense primer with Sfi I site
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<223> VH區域反股引子
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<223> 具有Not I位點之VL區域反股引子
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> GS連接子反股引子
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Claims (27)
- 一種單株抗體,其係下述(A)~(C)中任一者,並且對於分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖具有結合性:(A)含有下述(a)~(c)之重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(d)~(f)之輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的單株抗體:(a)由序列號碼1所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(b)由序列號碼2所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(c)由序列號碼3所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(d)由序列號碼4所示胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(e)由序列號碼5所示胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(f)由序列號碼6所示胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3;(B)含有下述(g)~(i)之重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(j)~(l)之輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的單株抗體:(g)由序列號碼31所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、 (h)由序列號碼32所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(i)由序列號碼33所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(j)由序列號碼34所示胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(k)由序列號碼35所示胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(l)由序列號碼36所示胺基酸序列所構成的輕鏈CDR3;(C)含有下述(m)~(o)之重鏈CDR1~CDR3的重鏈可變區域與含有下述(p)~(r)之輕鏈CDR1~CDR3的輕鏈可變區域透過連接子接合而成的單株抗體:(m)由序列號碼47所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR1、(n)由序列號碼48所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR2、(o)由序列號碼49所示胺基酸序列所構成的重鏈CDR3、(p)由序列號碼50所示胺基酸序列所構成的輕鏈CDR1、(q)由序列號碼51所示胺基酸序列所構成的輕鏈CDR2、(r)由序列號碼52所表示的胺基酸序列所構成的輕 鏈CDR3。
- 如申請專利範圍第1項之單株抗體,其中上述(A)之單株抗體係由序列號碼12所示胺基酸序列所構成。
- 如申請專利範圍第1項之單株抗體,其中上述(B)之單株抗體係由序列號碼39所示胺基酸序列所構成。
- 如申請專利範圍第1項之單株抗體,其中上述(C)之單株抗體係由序列號碼30所示胺基酸序列所構成。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之單株抗體,其係一價或二價之抗體。
- 一種分枝桿菌的檢測方法,其係包括下述步驟:(1)使如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體與受試者的生物體試樣接觸之步驟;及(2)以上述單株抗體與分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖的結合反應作為指標,測定受測試樣中所存在的分枝桿菌之步驟。
- 如申請專利範圍第6項之分枝桿菌的檢測方法,其係專一性地檢測分枝桿菌中之結核菌的方法,且單株抗體採用如申請專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單株抗體。
- 一種分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖檢測劑,含有如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體。
- 一種分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖檢測用套組,含有如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體作為分枝桿菌的脂阿拉伯甘露糖檢測用試劑。
- 一種結核診斷劑,含有如申請專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單株抗體。
- 一種結核診斷用套組,含有如申請專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單株抗體作為結核菌檢測試劑。
- 一種測定受測試樣中的分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖之方法,包括下述步驟:(1)使如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體與可能含有分枝桿菌的受測試樣接觸之步驟;及(2)以上述單株抗體與分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖的結合反應作為指標,測定受測試樣中所存在的分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖之步驟。
- 如申請專利範圍第12項之測定方法,其中上述測定方法為下述方法:分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖的定性方法,其具有檢測分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖之步驟以作為步驟(2);或分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖的定量方法,具有對分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖進行定量之步驟以作為步驟(2)。
- 如申請專利範圍第12或13項之方法,其係單一性地測定分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖中之結核菌脂阿拉伯甘露糖的方法,且單株抗體採用如申請專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單株抗體。
- 一種判定抗結核藥的結核治療效果之方法,包括下述步驟:(1)使如申請專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單 株抗體分別與抗結核藥投予前後的受測試樣接觸之步驟;(2)以上述單株抗體與結核菌之脂阿拉伯甘露糖的結合反應作為指標,測定抗結核藥投予前後的受測試樣中的結核菌脂阿拉伯甘露糖之步驟;及(3)抗結核藥投予前的受測試樣檢測到結核菌脂阿拉伯甘露糖,且抗結核藥投予後的受測試樣並未檢測到結核菌脂阿拉伯甘露糖的情況,判定為抗結核藥具有結核治療效果之步驟。
- 一種判定抗結核藥的結核治療效果之方法,包括下述步驟:(1)使如申請專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單株抗體分別與抗結核藥投予前後的受測試樣接觸之步驟;(2)以上述單株抗體與結核菌之脂阿拉伯甘露糖的結合反應作為指標,對於抗結核藥投予前後的受測試樣中的結核菌脂阿拉伯甘露糖進行定量之步驟;及(3)比較抗結核藥投予後的受測試樣中的結核菌脂阿拉伯甘露糖量(投予後測定值)與抗結核藥投予前的受測試樣中的結核菌脂阿拉伯甘露糖量(投予前測定值),在投予後測定值低於投予前測定值的情況,判定為抗結核藥具有結核治療效果,其他情況則判定為抗結核藥不具結核治療效果之步驟。
- 一種抗結核藥的結核治療效果判定用套組,含有如申請 專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單株抗體。
- 一種分枝桿菌檢測工具,具備一由可利用毛細現象運送受測試樣的材料所構成的吸液片,其特徵在於該吸液片具備:(1)吸收並採取受測試樣之試樣採取部;(2)標記抗體部,其擔持有對分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性反應且經標記而成的如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體;(3)具備下述測試結果顯示部的判定部:(a)固定有如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體的測試結果顯示部,該單株抗體係對分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性反應且非經標記者;(4)將已移動至上述試樣採取部、標記抗體部及判定部的受測試樣殘液予以吸收的液體吸收部。
- 如申請專利範圍第17項之分枝桿菌檢測工具,其中上述(3)判定部係在與(a)測試結果顯示部有一段間隔處進一步具備下述控制組顯示部:(b)固定有未標記抗體的控制組顯示部,該未標記抗體會與經標記而成之如申請專利範圍第1至5項中任一項之單株抗體發生反應。
- 如申請專利範圍第18或19項之分枝桿菌檢測工具,其含有如申請專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單株抗體作為單株抗體並且用以檢測分枝桿菌中的結核菌。
- 一種非人動物的免疫方法,係用以製造會對結核菌的脂 阿拉伯甘露糖作專一性結合之單株抗體者,包含下述步驟:對非人動物投予BCG作為免疫源,藉此誘導出對於BCG之體液性免疫反應。
- 一種對人類結核菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性結合之單株抗體的製造方法,包括下述步驟:對非人動物投予BCG作為免疫源,藉此誘導出對於BCG的體液性免疫反應,而產生會結合到人類結核菌之脂阿拉伯甘露糖的抗體;及由該非人動物採取會產生該抗體的細胞。
- 一種會對人類結核菌之脂阿拉伯甘露糖作單一性結合之單株抗體的製造方法,包含下述步驟:對非人動物投予BCG作為免疫源,藉此誘導出對於BCG的體液性免疫反應;由該非人動物調製出mRNA,該mRNA係對應於會與人類結核菌之脂阿拉伯甘露糖結合的抗體;以該mRNA作為模板調製出cDNA之步驟;及藉由使用該cDNA的噬菌體展示法,採取與結核菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性結合的單株抗體。
- 如申請專利範圍第21或22項之製造方法,其中對人類結核菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性結合的單株抗體係如申請專利範圍第1至5項中任一項之(A)之單株抗體。
- 一種對分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性結合之單株抗體的製造方法,包含下述步驟:對非人動物投予如申請專利範圍第1項之抗體與脂 阿拉伯甘露糖的複合體作為免疫源,藉此誘導出對於該複合體的體液性免疫反應,而產生會與分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖結合的抗體;及由該非人動物採取產生該抗體的細胞。
- 一種對分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性結合之單株抗體的製造方法,具有下述步驟:對非人動物投予如申請專利範圍第1項之抗體與脂阿拉伯甘露糖的複合體作為免疫源,藉此誘導出對於該複合體的體液性免疫反應;由該非人動物調製出mRNA,該mRNA係對應於會與結核菌之脂阿拉伯甘露糖結合的抗體;以該mRNA作為模板調製出cDNA;及藉由使用該cDNA的噬菌體展示法,採取會與分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性結合的單株抗體。
- 如申請專利範圍第25或26項之製造方法,其中會與分枝桿菌之脂阿拉伯甘露糖作專一性結合的單株抗體係如申請專利範圍第1項之單株抗體。
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