CN111905110A - 一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统及应用 - Google Patents

一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鉴定结核杆菌感染与非结核分枝杆菌(NTM)感染的方法及系统。本发明提出一种重组结核杆菌Esat‑6蛋白和CFP‑10蛋白组成的变态反应原和NTM菌体蛋白同体双臂皮肤试验，向待测生物注射重组结核杆菌Esat‑6蛋白和CFP‑10蛋白组成的变态反应原以及NTM菌体蛋白进行皮试反应；根据皮试反应的结果判断所述待测生物的结核杆菌和NTM感染情况。本发明提供的检测结核杆菌感染和非结核分枝杆菌感染的系统既可以联合使用应用于鉴别诊断，也可分别单独用于结核杆菌感染或NTM感染检测。本发明检测结果准确，可重复性高，为不容易找到病原学诊断依据的疾病诊断提供新思路。

Description

一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统 及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统及应用。
背景技术
非结核分枝杆菌(NTM)引起的NTM病呈快速增多趋势，NTM是指除结核分枝杆菌复合体、麻风分枝杆菌外的分枝杆菌。NTM感染引起的NTM病主要以侵犯人体肺脏引发肺部病变(NTM肺病)，还可感染淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等组织器官。
NTM主要存在水源和土壤，因此人群对NTM的暴露和感染普遍存在。目前报道已分离的NTM约190多种，其中大都是条件致病菌；Runyon分类法将NTM分为光产色菌、暗产色菌、慢生长菌和快生长菌四群。菌阴肺结核患者可通过肺部影像学、免疫学和临床进行综合诊断，但是NTM肺病影像学与肺结核非常相似，通过影像学无法鉴别诊断肺结核和NTM肺病。肺结核病细胞免疫学诊断方法有皮试试验(TST)和干扰素释放试验(IGRA)，均采用结核分枝杆菌特异的且大部分NTM菌和卡介苗均缺失的蛋白进行结核分枝杆菌感染诊断。由于目前国内无NTM病免疫学诊断的方法，无法判定菌阴肺结核病患者是否存在NTM合并感染，也无法诊断菌阴的NTM病。NTM对不同抗结核药有不同程度的天然耐药性，因此，菌阴肺结核与NTM肺部治疗方案是不同的。只有依据菌阴肺结核与NTM肺病鉴别诊断，才能对患者采取合理、科学的治疗方案，降低治疗成本和提高治疗效果。
现有的NTM病诊断方法包括临床症状、影像学和微生物学检查。NTM肺病临床症状和影像学均与肺结核相似。NTM病原体检测常用方法有NTM分离培养后根据其培养特性、生化反应和分子生物学检测进行鉴定，这些方法均基于为针对病原体的“有菌”诊断。现有针对NTM菌的诊断方法在临床应用中存在许多问题，首先，涂片抗酸染色镜检敏感度低、无法区分结核杆菌与NTM。其次，NTM肺病诊断标准是至少2次独立的痰标本培养阳性、或1次支气管灌洗液培养阳性。支气管灌洗液培养可代替痰培养，解决了无痰或少痰患者NTM培养的问题，但培养周期长(固体3周、液体10天以上)。最后，NTM分子诊断直接检测临床标本敏感度低，NTM检测下限(1200CFU/ml)低于结核杆菌(16CFU/ml)。因此，现有方法均基于针对病原体的“有菌”诊断，缺少有效的针对病原学检测阴性的菌阴肺结核患者与NTM病的鉴别诊断方法。
非病原学诊断的方法主要为免疫学诊断，传统的结核杆菌与NTM感染鉴别实验采用同体双臂分别注射结核菌素(TB-PPD)与非结核杆菌纯蛋白衍生物如胞内分枝杆菌纯蛋白衍生物PPD-B皮试进行鉴别，依据皮试阳性值大小来评估结核杆菌感染或非结核杆菌感染，但由于TB-PPD含多种蛋白衍生物，与卡介苗、NTM存在抗原交叉，即使TB-PPD阳性也不能排除是卡介苗接种或NTM感染导致阳性，并且皮试阳性值的大小也不再可靠
发明内容
为了解决目前无NTM病免疫学诊断方法和无法鉴别诊断菌阴肺结核与NTM肺病诊技术中存在的瓶颈问题，本发明提供一种重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原和NTM菌体蛋白同体双臂皮肤试验，根据两种皮试试剂呈现的阳性或阴性反应，综合判断结核杆菌感染还是NTM感染，本发明为不容易找到特异抗原的疾病诊断提供新思路。
第一方面，本发明提供一种鉴别结核杆菌感染和非结核分枝杆菌感染的方法，包括：
向待测生物注射重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原以及NTM菌体蛋白进行皮试反应；
根据皮试反应的结果判断所述待测生物的结核杆菌和非结核分枝杆菌感染情况；
进一步地，所述结核杆菌Esat-6蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CFP-10蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述判断的标准为
当所述变态反应原的皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果为阳性时，则判断所述待测生物为非结核分枝杆菌感染；
当所述变态反应原的皮试反应结果为阳性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果也为阳性时，则判断所述待测生物为结核杆菌感染；
当所述变态反应原的皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果为阴性时，则判断所述待测生物未感染结核杆菌和非结核分枝杆菌。
进一步地，所述变态反应原为N个所述重组结核杆菌Esat-6蛋白和M个所述CFP-10蛋白组成的融合蛋白；其中0<N<4，0<M<4，且N和M均为正整数。
所述重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成变态反应原可以有多种组成形式，包括重组结核杆菌Esat-6(简称E)和CFP-10蛋白(简称C)按一定比例配比成鸡尾酒形式，1:1、1:2、1:3、2:1、2:3，或按不同顺序和个数串联的融合蛋白，例如EEC、CEE、ECE、EECC、CCEE等，其效果近似，本发明实施例中使用重组蛋白EEC仅为示例，所述重组蛋白EEC的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述NTM菌体蛋白为快生长NTM菌体蛋白、慢生长NTM菌体蛋白、光产色NTM菌体蛋白和暗生产NTM菌体蛋白中的一种或多种。
优选地，所述NTM菌体蛋白为堪萨斯分枝杆菌菌体蛋白、胞内分枝杆菌菌体蛋白、脓肿分枝杆菌菌体蛋白和龟分枝杆菌菌体蛋白中的一种或多种。
进一步地，所述皮试反应的判断标准为：
在皮下注射24～48小时后，测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径，以纵径与横径的均值作为注射样品的皮试反应直径，所述皮试反应直径≥5mm则定义为阳性反应。
第二方面，本发明提供一种鉴别结核杆菌感染和非结核分枝杆菌感染的系统，包括：
检测模块，向待测生物注射重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原以及NTM菌体蛋白进行皮试反应；
结果分析模块，所述结果分析模块和所述检测模块相连，用于根据皮试反应的结果判断所述待测生物的结核杆菌和非结核分枝杆菌感染情况；
所述结果分析模块的判断标准如下：
当所述变态反应原的皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果为阳性时，则判断所述待测生物为非结核分枝杆菌感染；
当所述变态反应原的皮试反应结果为阳性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果也为阳性时，则判断所述待测生物为结核杆菌感染；
当所述变态反应原的皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果为阴性时，则判断所述待测生物未感染结核杆菌和非结核分枝杆菌。
NTM种类多，寻找NTM的特异抗原非常困难。本发明通过对结核杆菌与NTM具有共同抗原(简称共同抗原，NTM菌体蛋白简称NTM蛋白)以及结核杆菌具有而BCG和大部分NTM缺乏的抗原(简称结核特异抗原，本发明是重组结核杆菌Esat-6和CFP-10蛋白组成的变态反应原)的同体双臂皮肤试验建立菌阴肺结核与NTM肺病鉴别诊断的免疫学方法。
本发明中NTM菌体蛋白制备方法如下：
液体培养1-6周(快生长菌种1-2周，慢生长菌种4-6周)NTM菌经纱布粗滤除菌，G3漏斗加滤纸抽滤，滤液依次经硫酸铵和三氯醋酸沉淀多次、每次离心收集沉淀的复溶液离心收集的上清再沉淀，具体为滤液经终浓度80％硫酸铵沉淀1次、4％三氯醋酸沉淀4次，最后沉淀用pH8.4的PBS复溶；复溶液10000转/分、离心5min，留取上清，上清采用中空纤维柱超滤浓缩并置换为pH7.2的PBS缓冲液。
进一步地，所述重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成变态反应原包括依次连接的2个EAST6蛋白和1个CFP10蛋白，氨基酸序列具体如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述NTM菌体蛋白为快生长NTM菌体蛋白、慢生长NTM菌体蛋白、光产色NTM菌体蛋白和暗生产NTM菌体蛋白中的一种或多种；
优选为堪萨斯分枝杆菌菌体蛋白、胞内分枝杆菌菌体蛋白、脓肿分枝杆菌菌体蛋白和龟分枝杆菌菌体蛋白中的一种或多种。
进一步地，在所述结果分析模块中，所述皮试反应的判定标准为：
在皮下注射24～48小时后，测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径，以纵径与横径的均值作为注射样品的皮试反应直径，所述皮试反应直径≥5mm则定义为阳性反应。
当皮下注射24小时时的检测效果最好，若时间太长，容易出现皮试反应减弱，当时间太短，则会使皮试反应还未到达最佳反应状态
本发明进一步提供重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原和NTM菌体蛋白的组合物在制备用于鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的检测试剂盒中的应用，所述变态反应原为N个所述重组结核杆菌Esat-6蛋白和M个所述CFP-10蛋白组成的融合蛋白；其中0<N<4，0<M<4，且N和M均为正整数。
进一步地，编码所述变态反应原的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统及应用，具有如下有益效果：
本发明通过重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成变态反应原和NTM菌体蛋白同体双臂皮肤试验鉴别结核杆菌感染或NTM感染，通过皮试反应的阳性与否可以快速、直接地鉴别出结核杆菌感染或NTM感染。本发明检测结果准确，可重复性高，为不容易找到特异抗原的疾病诊断提供新思路。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种检测结核杆菌感染和/或NTM感染的系统的结构示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如图1所示，本发明提供一种用于鉴别结核杆菌感染和NTM感染的系统1000，包括检测模块100和结果分析模块200。检测模块100用于分别向待测生物注射重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成变态反应原以及NTM菌体蛋白进行皮试反应；结果分析模块200和检测模块100相连，用于根据皮试反应的结果判断待测生物的结核杆菌和NTM感染情况；结果分析模块200的判断标准如下：当所述重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成变态反应原皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白皮试反应结果为阳性时，则判断所述待测生物NTM感染；当重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成变态反应原皮试反应结果为阳性、NTM菌体蛋白皮试反应结果为阳性或阴性时，则判断待测生物结核杆菌感染，同时不能排除少数NTM菌种感染(包括苏加分枝和堪萨斯分枝杆菌感染)或结核杆菌与NTM混合感染；当所述重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成变态反应原皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白皮试反应结果为阴性时，则判断所述待测生物未感染结核杆菌和NTM。
发明人通过大量实验研究发现，利用本发明的系统可以有效对待测生物的结核杆菌感染和NTM感染情况进行检测，既可以单独对两者中任一进行检测，也可以将两者区分开。同时，本发明的系统结构简单易操作，结果准确，可重复性高。
在上述实施例的基础上，可以有多种组成形式，包括重组结核杆菌Esat-6和CFP-10蛋白按一定比例配比，1:1、1:2、1:3、2:1、2:3，或按不同顺序和个数串联的融合蛋白例如EEC、CEE、ECE、EECC、CCEE等，其效果近似。
在上述实施例的基础上，NTM菌体蛋白为快生长NTM菌体蛋白、慢生长NTM菌体蛋白、光产色NTM菌体蛋白和暗生产NTM菌体蛋白中的一种或多种；
在上述实施例的基础上，NTM菌体蛋白为堪萨斯分枝杆菌菌体蛋白、胞内分枝杆菌菌体蛋白、脓肿分枝杆菌菌体蛋白和龟分枝杆菌菌体蛋白中的一种或多种。
在上述实施例的基础上，在结果分析模块100中，皮试反应的判定标准为：
在皮下注射24～48小时后，测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径，以纵径与横径的均值作为注射样品的皮试反应直径，若皮试反应直径≥5mm则定义为阳性反应。
下面将结合具体实施例对本发明的方案进行解释，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明的具体技术或条件，均可参考本领域内文献所描述的技术或条件，或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均可以市售购得。
实施例1豚鼠致敏用NTM菌和结核分枝杆菌H37Ra制备
致敏用NTM标准株和H37Ra菌株：胞内分枝杆菌(CMCC 95002)，苏加分枝杆菌(CMCC95019)，瘰疬分枝杆菌(CMCC 95017)，猿分枝杆菌(CMCC 95015)，堪萨斯分枝杆菌(CMCC95013)，海分枝杆菌(CMCC 95014)，鸟分枝杆菌(CMCC 95001)，龟分枝杆菌(CMCC 95020)，脓肿分枝杆菌(CMCC 95021)，戈登分枝杆菌(CMCC 95018)，偶发分枝杆菌(CMCC 95022)和H37Ra从中国药品生物制品检定所购买得到。
致敏菌株制备：用灭菌生理盐水将罗氏培养基上培养的NTM培养菌苔分别用灭菌棉签洗脱，洗脱菌液用6000r/min离心30min，称重，用生理盐水混匀制成50mg/ml的菌液，121℃高压20min，无菌分装，-20℃保存备用。
NTM-PPD的制备方法如下：
液体培养1-6周(快生长菌种1-2周，慢生长菌种4-6周)NTM菌经纱布粗滤除菌，G3漏斗加滤纸抽滤，滤液依次经硫酸铵和三氯醋酸沉淀多次、每次离心收集沉淀的复溶液离心上清再沉淀，具体为滤液经终浓度80％硫酸铵沉淀1次、4％三氯醋酸沉淀4次，最后沉淀用pH8.4的PBS复溶；复溶液10000转/分、离心5min，留取上清，上清采用中空纤维柱超滤浓缩并置换为pH7.2的PBS缓冲液。
实施例2海分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活海分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活海分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活海分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
若无特别声明，表中混合PPD为混合海-PPD、胞内-PPD、猿-PPD和堪萨斯-PPD这几种NTM菌体蛋白。
下述实施3-实施例12中混合PPD与本实施例中的相同。
表1显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与海分枝杆菌致敏豚鼠基本无交叉反应。
表1海分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000081
Figure BDA0002603597130000091
表格中比值具体为各皮试反应直径累计值与PPD标准品比值，以下实施例中均相同。
实施例3胞内分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活胞内分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活胞内分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活胞内分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表2显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与胞内分枝杆菌致敏豚鼠基本无交叉反应。
表2胞内分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000092
Figure BDA0002603597130000101
实施例4苏加分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活苏加分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活苏加分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活苏加分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表3显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与苏加分枝杆菌致敏豚鼠存在交叉反应。
表3苏加分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000102
Figure BDA0002603597130000111
实施例5瘰疬分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活瘰疬分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活瘰疬分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活瘰疬分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表4显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与瘰疬分枝杆菌致敏豚鼠基本无交叉反应。
表4瘰疬分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000112
实施例6猿分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活猿分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活猿分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活猿分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表5显示：皮试反应24小时观察较好，PPD标准品、EC标准品和EEC与海分枝杆菌致敏豚鼠基本无交叉反应。
表5猿分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000121
实施例7堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活堪萨斯分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活堪萨斯分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活堪萨斯分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表6显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠存在交叉反应。
表6堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000131
实施例8鸟分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活鸟分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活鸟分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活鸟分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表7显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与鸟分枝杆菌致敏豚鼠存在交叉反应。
表7鸟分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000141
实施例9龟分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活龟分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活龟分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活龟分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表8显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与鸟分枝杆菌致敏豚鼠无交叉反应。
表8龟分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000151
实施例10脓肿分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活脓肿分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活脓肿分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活脓肿分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表9显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品与脓肿分枝杆菌致敏豚鼠无交叉反应，EEC与脓肿分枝杆菌致敏豚鼠基本无交叉反应。
表9脓肿分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000161
实施例11戈登分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活戈登分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活戈登分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活戈登分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表10显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与戈登分枝杆菌致敏豚鼠无交叉反应。
表10戈登分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000171
实施例12偶发分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活偶发分枝杆菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活偶发分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活偶发分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合PPD以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表11显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与偶发分枝杆菌致敏豚鼠基本无交叉反应。
表11偶发分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000181
实施例13 4种混合分枝杆菌致敏豚鼠的皮试试验
5只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的灭活4种混合分枝杆菌(鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌)，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活4种混合分枝杆菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml灭活5种混合分枝杆菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC、NTM-PPD、混合-PPD(包括鸟-PPD、胞内-PPD、龟-PPD和脓肿-PPD的混合物)以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表12显示：皮试反应24小时观察较好，EC标准品和EEC与混合分枝杆菌致敏豚鼠存在交叉反应。
表12 4种混合分枝杆菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000191
实施例14结核分枝杆菌致活菌致敏豚鼠的皮试试验
4只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的结核分枝杆菌H37Ra活菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml结核分枝杆菌H37Ra活菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml结核分枝杆菌H37Ra活菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的EEC以及TB-PPD和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表13显示：皮试反应24小时和48小时观察均可，EC标准品和EEC与H37Ra活菌致敏豚鼠皮试呈阳性反应。
表13结核分枝杆菌H37Ra活菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000201
实施例15结核分枝杆菌致活菌致敏豚鼠的皮试试验
4只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的结核分枝杆菌H37Ra活菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml结核分枝杆菌H37Ra活菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml结核分枝杆菌H37Ra活菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的NTM-PPD(包括：海分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌，猿分枝杆菌，戈登分枝杆菌，瘰疬分枝杆，苏加分枝杆菌)、以及PPD标准品和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表14显示：结核活菌致敏的豚鼠与猿、戈登、瘰疬、苏加-PPD呈部分交叉反应。
表14结核分枝杆菌H37Ra活菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000202
Figure BDA0002603597130000211
实施例16结核分枝杆菌致活菌致敏豚鼠的皮试试验
4只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的结核分枝杆菌H37Ra活菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml结核分枝杆菌H37Ra活菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml结核分枝杆菌H37Ra活菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的NTM-PPD(包括：鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，溃疡分枝杆菌，龟分枝杆菌，脓肿分枝杆菌，偶发分枝杆菌，耻垢分枝杆菌)、以及PPD标准品和EC标准品。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径5mm定义为阳性反应。本实施例为2018年12月实验。
结核分枝杆菌H37Ra活菌致敏豚鼠皮试，胞内-PPD与溃疡-PPD皮试反应稍弱于PPD标准品。
表15结核分枝杆菌H37Ra活菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000212
Figure BDA0002603597130000221
实施例17结核分枝杆菌致活菌致敏豚鼠的皮试试验
4只健康未做过任何试验的SPF级白色豚鼠，体重300g-500g。取出冻存的结核分枝杆菌H37Ra活菌，室温自然溶解，每只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml结核分枝杆菌H37Ra活菌；间隔1周后，于豚鼠另一只豚鼠后腿腹股沟皮下注射0.2ml结核分枝杆菌H37Ra活菌，末次免疫后3-4周皮试。将豚鼠脊柱双侧去毛，于皮内注射0.2ml的混合PPD(包括4种NTM-PPD，分别是堪萨斯-PPD，胞内-PPD，戈登-PPD菌，脓肿-PPD)、以及PPD标准品和EC标准品，其中混合NTM-PPD浓度为四种总浓度，每种NTM-PPD浓度为总浓度的四分之一。双盲法于24和48小时分别测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径(mm)，纵径与横径均值作为该点注射样品的皮试反应直径，皮试反应直径≥5mm定义为阳性反应。
表16结果显示：高浓度混合-NTM皮试反应与PPD标准品相当，中、低浓度混合-NTM皮试反应不如PPD标准品。
表16结核分枝杆菌H37Ra活菌致敏豚鼠皮试试验结果
Figure BDA0002603597130000222
Figure BDA0002603597130000231
根据以上实施例1-17及表1-表16中的结果可以得出如下结论：
1、除猿分枝杆菌致敏的豚鼠外，混合NTM-PPD(1μg/ml)对于各类NTM和H37Ra致敏的豚鼠的皮试反应均呈100％阳性反应；
2、EEC蛋白对于H37Ra、苏加分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌致敏的豚鼠的皮试反应呈阳性。
3、EEC和混合NTM-PPD联合诊断，两者皮试若呈阴性反应，未感染结核杆菌和NTM；EEC皮试阴性，混合NTM-PPD阳性，感染NTM；当两者呈阳性反应，则判断所述待测生物结核杆菌感染，不排除少数几种NTM感染(包括苏加分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌感染)和结核杆菌与NTM菌混合感染。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京恩元华生物科技有限公司
<120> 一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法、系统及应用
<130> KHP191116099.7
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu
20 25 30
Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Ser Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr
50 55 60
Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala
65 70 75 80
Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
100 105 110
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
130 135 140
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
145 150 155 160
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
165 170 175
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala Met
180 185 190
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly Asn
195 200 205
Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val Glu
210 215 220
Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly Thr
225 230 235 240
Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln
245 250 255
Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val
260 265 270
Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser Gln
275 280 285
Met Gly Phe
290
<210> 2
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggcaccg aacagcagtg gaacttcgca ggcattgaag cggcggcttc tgcaatccag 60
ggtaacgtta cctctattca ttctctgtta gatgaaggta aacagagcct gaccaaactg 120
gctgctgcat ggggtggtag cggtagtgaa gcgtatcagg gtgttcagca aaaatgggac 180
gcaactgcaa ctgaactgaa caatgcactt cagaacctgg ctcgtaccat ctctgaagca 240
ggccaggcta tggcgagcac cgaaggtaat gtgactggta tgttcgcaat gactgaacaa 300
cagtggaatt ttgcgggtat cgaagcagct gcatctgcaa ttcagggtaa cgtgacctct 360
atccactctc tgctcgatga aggtaaacag tctttaacta aactggccgc agcatggggt 420
ggttctggtt ctgaagcata ccagggtgtg cagcagaaat gggatgctac tgctaccgaa 480
ttaaacaacg cgttacaaaa cctggcgcgt actatttctg aagcaggtca ggctatggct 540
tctactgaag gtaacgtaac gggtatgttc gcgatggctg aaatgaaaac tgatgcggct 600
accctggctc aagaagctgg taactttgaa cgtattagcg gtgacctgaa aactcagatt 660
gatcaagttg aatctaccgc tggttctctg caaggtcagt ggcgtggtgc tgctggtacc 720
gctgctcagg ctgcagttgt tcgctttcaa gaagcggcga acaaacagaa acaggaactg 780
gatgaaatca gcaccaacat ccgtcaggct ggtgtgcagt atagccgtgc tgatgaagaa 840
cagcagcagg cactgtcttc tcagatgggt ttctaa 904
<210> 3
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly
20 25 30
Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu
50 55 60
Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly
65 70 75 80
Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala
85 90 95
<210> 4
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val
20 25 30
Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys
50 55 60
Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly
65 70 75 80
Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser
85 90 95
Gln Met Gly Phe
100

Claims (10)

1.一种鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的方法，其特征在于，包括：
向待测生物注射重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原以及NTM菌体蛋白进行同体双臂皮试；
根据皮试反应的结果判断所述待测生物的结核杆菌和非结核分枝杆菌感染情况。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述判断的标准为：
当所述变态反应原的皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果为阳性时，则判断所述待测生物为非结核分枝杆菌感染；
当所述变态反应原的皮试反应结果为阳性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果也为阳性时，则判断所述待测生物为结核杆菌感染；
当所述变态反应原的皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果为阴性时，则判断所述待测生物未感染结核杆菌和非结核分枝杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述变态反应原为N个所述重组结核杆菌Esat-6蛋白和M个所述CFP-10蛋白组成的融合蛋白；其中0<N<4，0<M<4，且N和M均为正整数。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述变态反应原的氨基酸序列具体如SEQID NO.1所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述NTM菌体蛋白为快生长NTM菌体蛋白、慢生长NTM菌体蛋白、光产色NTM菌体蛋白和暗生产NTM菌体蛋白中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述NTM菌体蛋白为堪萨斯分枝杆菌菌体蛋白、胞内分枝杆菌菌体蛋白、脓肿分枝杆菌菌体蛋白、龟分枝杆菌菌体蛋白、鸟分枝杆菌菌体蛋白、苏加分枝杆菌菌体蛋白、瘰疬分枝杆菌菌体蛋白、海分枝杆菌菌体蛋白、猿猴分枝杆菌菌体蛋白、戈登分枝杆菌菌体蛋白和偶发分枝杆菌菌体蛋白中的一种或多种。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述皮试反应的判定标准为：
在皮下注射24～48小时后，测量注射部位红肿和/或硬结的纵径与横径，以纵径与横径的均值作为注射样品的皮试反应直径，所述皮试反应直径≥5mm则定义为阳性反应。
8.一种鉴别结核杆菌感染和非结核分枝杆菌感染的系统，其特征在于，包括：
检测模块，所述检测模块用于分别向待测生物注射重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原以及NTM菌体蛋白进行皮试反应；
结果分析模块，所述结果分析模块和所述检测模块相连，用于根据皮试反应的结果判断所述待测生物的结核杆菌和非结核分枝杆菌感染情况；
所述结果分析模块的判断标准如下：
当所述变态反应原的皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果为阳性时，则判断所述待测生物为非结核分枝杆菌感染；
当所述变态反应原的皮试反应结果为阳性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果也为阳性时，则判断所述待测生物为结核杆菌感染；
当所述变态反应原的皮试反应结果为阴性，所述NTM菌体蛋白的皮试反应结果为阴性时，则判断所述待测生物未感染结核杆菌和非结核分枝杆菌。
9.重组结核杆菌Esat-6蛋白和CFP-10蛋白组成的变态反应原和NTM菌体蛋白的组合物在制备用于鉴别结核杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的检测试剂盒中的应用，所述变态反应原为N个所述重组结核杆菌Esat-6蛋白和M个所述CFP-10蛋白组成的融合蛋白；其中0<N<4，0<M<4，且N和M均为正整数。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，编码所述变态反应原的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
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