JP5378350B2 - 結核菌(Mycobacteriumtuberculosis)ポリペプチドおよびその融合物を含む免疫原性組成物 - Google Patents
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Description
本出願に付随する配列表は、紙のコピーの代わりに、テキスト形式で提供され、参照として本明細書に組み込むものとする。配列表を含むテキストファイルの名称は、480239_403PC_SEQUENCE_LISTING.txtである。テキストファイルは515KBであり、これは2007年4月4日に作成されたもので、本明細書の提出と同時に、EFS-Webから電子出願することになっている。
本発明は、概して、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原の抗原および/または免疫原の組合せを含む組成物、ならびに、結核の診断、治療、および予防におけるそれらの使用に関する。
結核は、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)およびその他のマイコバクテリウム種の感染により起こる慢性感染症である。これは、発展途上国における主要疾病であり、世界の先進地域でも問題は増加しており、毎年数百万の新たな症例が発生している。感染は、かなり長い間無症候性の可能性もあるが、最も一般的には、肺の急性炎症として発現し、これによって発熱および乾性咳嗽が生じる。治療しなければ、典型的には、深刻な合併症及び死を引き起こす。
(a)Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)およびRv2608(配列番号26)を含む組合せ;
(b)Rv2608(配列番号26)およびRv3619(配列番号46)を含む組合せ;ならびに
(c)Rv3478(配列番号41)およびRv3619(配列番号46)を含む組合せ
からなる群より選択される。
(a)Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)およびRv2608(配列番号26)を含む組合せ;
(b)Rv2608(配列番号26)およびRv3619(配列番号46)を含む組合せ;ならびに
(c)Rv3478(配列番号41)およびRv3619(配列番号46)を含む組合せ
からなる群より選択される共有結合抗原の組合せを含む。
配列番号1は、Mtb Rv0164の推定アミノ酸配列を表す。
本発明は、マイコバクテリウム抗原を含む、高度に抗原性/免疫原性の組成物に関する。本発明の組成物は、一般に、結核菌群のマイコバクテリウム種の少なくとも2つの異種ポリペプチドを含む。結核菌群のマイコバクテリウム種には、結核症を引き起こすと伝統的に考えられる種、ならびに、AIDS患者のような免疫低下患者に結核および肺疾患を引き起こすマイコバクテリウム環境種および日和見種、例えば、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)、またはマイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、BCG、トリ結核菌(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、マイコバクテリウム・セラータム(Mycobacterium celatum)、マイコバクテリウム・ゲナベンズ(Mycobacterium genavense)、マイコバクテリウム・ヘモフィルム(Mycobacterium haemophilum)、カンサシ菌(Mycobacterium kansasii)、マイコバクテリウム・シミアエ(Mycobacterium simiae)、マイコバクテリウム・ワクカエ(Mycobacterium vaccae)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)、およびマイコバクテリウム・スクロフラセム(Mycobacterium scrofulaceum)(例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine、第1巻、pp.1004-1014および1019-1020を参照)。好ましい実施形態では、本発明に従い予防、治療または診断しようとするマイコバクテリウム種は、結核菌(Mtb)である。マイコバクテリウム種由来の抗原の配列は、容易に入手可能である。例えば、結核菌配列は、Coleら、Nature 393:537(1998)に見いだすことができ、また、Wellcome Trust Sanger InstituteおよびInstitut Pasteurにより維持されているようなウェブサイトでも見いだすことができる。
本発明は、一態様において、本明細書に記載するように、単離されたマイコバクテリウムポリペプチドを提供し、これには、融合ポリペプチド、およびそれを含有する組成物も含まれる。一般に、本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチドであるが、本明細書に開示するアミノ酸配列由来の断片(例えば、抗原性/免疫原性部分)であってもよいし、本明細書に開示する全アミノ酸配列を含んでもよい。本発明のポリペプチド、その抗原性/免疫原性断片、ならびに他の変異体は、従来の組換えおよび/または合成技術を用いて、作製することができる。
本発明はまた、単離されたポリヌクレオチド、特に、本発明の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む組成物も提供する。本明細書で用いる用語「DNA」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは、特定の種の全ゲノムDNAから単離されたDNA分子を意味する。従って、ポリペプチドをコードするDNAセグメントは、1以上のコーディング配列を含み、しかも、該DNAセグメントが由来する種の全ゲノムDNAから実質的に単離された、または該DNAから精製されたDNAセグメントを指す。用語「DNAセグメント」および「ポリヌクレオチド」には、DNAセグメント、およびこのようなセグメントのさらに小さい断片、ならびに、組換えベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなども含まれる。
別の態様では、本発明は、細胞または動物に対して、単独で、または1以上の他の治療法と組み合わせて投与するための、製薬上に許容される、または生理学的に許容される溶液中の、本明細書に開示した1種以上のポリヌクレオチド、ポリペプチドもしくはその他の組成物からなる製剤に関する。このような医薬組成物は、好適な免疫刺激剤/アジュバント系と一緒に製剤化すれば、ワクチンとして使用するのに特に好ましい。本組成物はまた、診断に関する用途にも好適である。
前述したように、上記の組成物、融合ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、患者において結核菌感染を検出および/またはモニターするための診断試薬としても有用である。例えば、本発明の組成物、融合ポリペプチド、およびポリヌクレオチドは、感染の診断、疾患の進行のモニタリング、または治療効果評価のために、結核菌に対する液体性抗体または細胞性免疫を検出するためにin vitroおよびin vivoアッセイで用いることができる。
組換え融合タンパク質ID58のクローニングおよび発現
Mtb Rv1813、Rv3620およびRv0496に由来する融合パートナーを含む融合構築物ID58のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質ID69のクローニングおよび発現
Rv2389、Rv1813、Rv3620およびRv0496に由来する融合パートナーを含む融合構築物ID69のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質ID83のクローニングおよび発現
Rv1813、Rv3620およびRv2608に由来する融合パートナーを含む融合構築物ID83のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質ID94のクローニングおよび発現
Rv2389、Rv1813、Rv3620およびRv2608に由来する融合パートナーを含む融合構築物ID94のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質ID95のクローニングおよび発現
ID95は、Rv2389、Rv3810、Rv1813、Rv3620およびRv0496に由来する融合パートナーを含む融合構築物である。ID58-pET28.aベクターをKpnI/HindIIIで消化し、挿入断片を除去した。事前に作製しておいた36f.1-pET28.aベクターにID58挿入断片を連結した(また、KpnI/HindIIIで消化した)。融合構築物は、配列番号96に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号97に記載の融合タンパク質をコードする。ID95を宿主BL-21plysSに発現させた(1L、2XYT増殖培地、37℃)。細胞ペレットを溶解バッファー(20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF)中に懸濁し、凍結させた。ID95は封入体を形成し、ID83と同様に精製した。
組換え融合タンパク質ID120のクローニングおよび発現
ID120は、Rv2389、Rv3810、Rv1813、Rv3620およびRv2608に由来する融合パートナーを含む融合構築物である。ID83-pET28.aベクターをKpnI/HindIIIで消化し、挿入断片を除去した。事前に作製しておいた36f.1-pET28.aベクターにID83挿入断片を連結した(また、KpnI/HindIIIで消化した)。融合構築物は、配列番号98に記載のポリヌクレオチド配列を有し、この配列は、配列番号99に記載の融合タンパク質をコードする。ID120を宿主BL-21plysSに発現させた(1L、2XYT増殖培地、37℃)。OD 0.50にて、1 mM IPTGで発現を誘導し、OD 1.41で細胞を回収した。細胞ペレットを溶解バッファー(20mM Tris pH8、100mM NaCl、2mM PMSF)中に懸濁し、凍結させた。ID120は封入体を形成し、ID83と同様に処理した。ID120は、一晩では十分に結合しなかったため、容量を8M尿素で2倍にし、BMEを10 mMまで添加した。室温で2時間、次に4℃で一晩、より低濃度の溶液をNi-NTA樹脂に結合させた。樹脂を洗浄し、前述のように溶出した。この精製物からの画分を20 mM Tris pH 8において透析した。
PPD+ヒトPBMCおよびMTB感染マウスからの脾細胞によるMTB抗原の認識
この実施例により、本発明のMtb抗原が、PPD+健康体ドナーからのヒトPBMC、および結核菌に感染したマウスから単離した脾細胞において記憶再生応答(memory recall response)を誘導することを実証する。
ヒトPBMCのin vitroでの刺激およびサイトカインELISA
PBMCは、アフェレーシスにより取得するか、7PPD-、および15PPD+健康体ドナー由来のヘパリン添加血液から精製した。PBMCを2〜2.5 x 105細胞/ウェルで96ウェル組織培養プレートに3重に塗布し、培地、PHA(10μg/ml)、結核菌(Mtb)溶解物(10μg/ml)、または各組換えタンパク質(50μg/ml)と一緒に72時間培養した。上清を回収し、特異的mAb(eBioscience)を製造者のプロトコルに従って用いた二重サンドイッチELISAによりIFN-γについて分析した。
結核菌に感染したマウスからの脾臓を、感染後の様々な時点で採取し、従来の方法により単一の脾細胞懸濁液を取得した。ELISPOTアッセイを用いて、IFN-γまたはTNF発現脾細胞の相対数を決定した。MultiScreen 96ウェルろ過プレート(Millopore、マサチューセッツ州ベッドフォード)に10μg/mlのラット抗マウスIFN-γ、またはTNF、捕獲Ab(eBioscience)をコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、RPMI 1640および10%FBSを用いて室温で少なくとも1時間遮断してから、再度洗浄した。2 x 105細胞/ウェルで脾細胞を2重に塗布し、特異的rAg(10μg/ml)を用いて37℃で48時間刺激した。次いで、プレートをPBSおよび0.1%Tweenで洗浄し、PBS、0.5%BSA、および0.1% Tween中5μg/mlのビオチンコンジュゲート型ラット抗マウスIFN-γ、またはTNF、二次Ab(eBioscience)と一緒に、4℃で一晩インキュベートした。製造者のプロトコルに従って、Vectastain ABCアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートおよびVectastain AEC基質キット(Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて、フィルターを展開した。脱イオン水でプレートを洗浄することにより反応を停止し、プレートを暗所で乾燥させ、スポットを計数した。
ヒトPPD+ PBMCによるMtb組換えタンパク質の認識
Mtb Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、およびRv1511組換えタンパク質と一緒に、PPD+およびPPD-ドナーからのPBMCを72時間培養した。これら組合せ抗原の生産についての説明は本明細書の他所に記載されている。細胞培養上清中のIFN-γの濃度をさらに分析した。
結核菌H37Rv株での低用量エアロゾル暴露によりマウスを感染させ、感染後の様々な時点で脾臓を採取した。ELISPOTアッセイを用いて、48時間のin vitro培養の間の、Mtb組換えRv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv0054、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv3875、Rv1511およびID83タンパク質に応答する、TNF発現脾細胞の相対数を決定した。
C57BL/6マウスにおけるMtb抗原に対する免疫応答、ならびにMtbのエアロゾルチャレンジに対する防御
この実施例では、本発明のMtb抗原によるマウスの免疫化が、免疫原性であり、エアロゾル結核菌チャレンジに対する防御を提供できることを実証する。
組換え抗原およびアジュバント製剤
上記のように組換えタンパク質を生産した。CpG 1826は、Coley Pharmaceuticals(マサチューセッツ州ウェルズリー)から取得した。
雌のC57BL/6マウスをCharles Riverから取得し、各実験において生齢を合わせた(5〜7週)。25μgのアジュバントCpGと一緒に製剤化した8μgの以下:組換えRv0164(配列番号1)、Rv0496(配列番号6)、Rv2608(配列番号26)、Rv3020(配列番号36)、Rv3478(配列番号41)、Rv3619(配列番号46)、Rv3620(配列番号51)、Rv1738(配列番号11)、Rv1813(配列番号16)、Rv3810(配列番号56)、Rv2389(配列番号21)、Rv2866(配列番号31)、Rv0831(配列番号115)、Rv1288(配列番号127)、Rv1569(配列番号133)、Rv1789(配列番号136)、Rv1818(配列番号139)、Rv1860(配列番号142)、Rv1886(配列番号145)、Rv2220(配列番号154)、Rv2032(配列番号151)、Rv2623(配列番号160)、Rv2875(配列番号163)、Rv3044(配列番号166)、Rv0577(配列番号184)、Rv1626(配列番号187)、Rv0733(配列番号190)、Rv3628(配列番号202)、およびRv1884(配列番号205)タンパク質で3回(3週間置きに)免疫した。生理食塩水、アジュバントのみ、およびBCG対照群のマウスには、それぞれ、3用量のPBS、3用量のアジュバントのみ、または1用量の5 x 104 BCG CFUを受けた。1匹当たり総用量100μlをマウスに皮下注射した。
最後の追加免疫から3週間後、免疫原性試験用の動物からの脾臓を採取し、従来の方法により脾細胞を取得した。サイトカイン分析のために、2.5 x 105細胞/ウェルで96ウェル組織培養プレートに脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A 3μg/ml、PPD(10μg/ml)、Mtb溶解物(10μg/ml)、または各組換えタンパク質(10μg/ml)と一緒に72時間培養した。上清を回収し、特異的mAb(eBioscience)を製造者のプロトコルに従って用いた二重サンドイッチELISAによりIFN-γについて分析した。
MultiScreen 96ウェルろ過プレート(Millopore、マサチューセッツ州ベッドフォード)を10μg/mlのラット抗マウスIFN-γまたはTNF捕獲Ab(eBioscience)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、RPMI 1640および10%FBSを用いて室温で少なくとも1時間遮断し、再度洗浄した。2 x 105細胞/ウェルで脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A(3μg/ml)、PPD(10μg/ml)、または各組換えタンパク質(10μg/ml)を用いて37℃で48時間刺激した。次いで、プレートをPBSおよび0.1%Tween-20で洗浄した後、PBS、0.5%BSA、および0.1%Tween-20中5μg/mlのビオチンコンジュゲート型ラット抗マウスIFN-γまたはTNF二次Ab(eBioscience)と一緒に、2時間インキュベートした。製造者のプロトコルに従って、Vectastain ABCアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートおよびVectastain AEC基質キット(Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて、フィルターを展開した。脱イオン水でプレートを洗浄することにより反応を停止し、プレートを暗所で乾燥させ、自動化ELISPOTリーダー(C.T.L. Serie3A Analyzer、Cellular Technology Ltd、オハイオ州クリーブランド)でスポットを計数した後、Immunospot(登録商標)(CTL Analyzer LLC)で分析した。
最後の免疫化から1週間後、マウスから採血し、血清IgG1およびIgG2c抗体力価を決定した。0.1 M重炭酸塩バッファー中の2μg/mlの組換えタンパク質でNunc-Immuno Polysorbプレートを室温で4時間コーティングし、PBS Tween-20 0.05% BSA 1%を用いて4℃で一晩遮断し、PBS Tween-20 0.05%で洗浄した後、1:50希釈、次に5倍連続希釈の血清と共に室温で2時間インキュベートし、洗浄し、PBS Tween-20 0.05% BSA 0.1%中1:2,000の抗IgG1-HRPまたは抗IgG2c-HRPと共に1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、SureBlue TMB基質(KPL Inc.、メリーランド州ゲイザーズバーグ)を用いて展開した。酵素反応を1N H2SO4で停止し、マイクロプレートELISAリーダー(Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール)およびSoftMax Pro5を用いて、650 nmの参照フィルター設定で、30分以内に450 nmでプレートを読み取った。カットオフ0.1のGraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc., カリフォルニア州サンディエゴ)で終点力価を決定した。
アジュバントCpGを混合したMtb抗原のサブセット由来の各組換えタンパク質8 gでマウスを3週間置きに3回皮下経路で免疫した。正の対照マウスは尾の付け根にBCG(5 x 104 CFU)で免疫し(1回)、負の対照マウスは食塩水、またはアジュバントのみを注射した。最後の免疫から30日後、50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ(ウィスコンシン州マディソン)を用いて、結核菌H37Rv株(ATCC 35718;American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス)の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。4週間後、マウスを安楽死させ、PBS/Tween 80(0.05%)中に肺および脾臓ホモジネートを調製した。ニュートリエントMiddlebrook 7H11 Bacto Agar(BD Bioscences、メリーランド州コッキーズビル)上で個々の全器官の段階希釈物を平板培養し、加湿空気および5%CO2下での14日間のインキュベーション後の細菌コロニー形成を計数することにより、細菌数を決定した。データは、回収細菌の平均数±SDのLog10として表し、Log10 CFUの減少=ワクチン接種群のLog10 CFU−生理食塩水処置群のLog10 CFUである。
CpGをアジュバントとして添加した組換えMtb抗原に対する免疫応答
25μgのアジュバントCpGと一緒に製剤化した以下:組換えMtb Rv0164、Rv0455、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv0831、Rv1818、Rv1886、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv0577、Rv1626、Rv3628、およびRv1884タンパク質でC57BL/6マウスを3週間置きに3回免疫した。最後の免疫から1週間および3週間後、抗原特異的抗体、および記憶Tリンパ球の存在をそれぞれ評価した。
CpGをアジュバントとして含む、以下:Mtb組換えタンパク質Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1813、Rv1569、Rv1789、Rv1860、Rv1886、Rv2220、Rv2875、Rv3044、Rv0577、Rv1626、およびRv0733でワクチン接種したマウスの肺および脾臓における生存桿菌の数(平均Log10 CFUとして表す)を、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvによるエアロゾルチャレンジから4週間後に決定した。様々な組換えタンパク質で免疫したマウスの肺における平均Log10 CFUをプラセボ(生理食塩水)、またはTBに対する現在唯一のワクチンであるBCGを投与したマウスから得た平均Log10 CFUと比較した。生理食塩水群とワクチン接種群における平均Log10 CFUの差をLog10 CFUの減少として表す。
C57BL/6マウスにおけるMtb抗原の混合物に対する免疫応答、ならびにMtbによるエアロゾルチャレンジに対する防御
この実施例では、本発明のMtb抗原の混合物によるマウスの免疫化が免疫原性であり、エアロゾル結核菌チャレンジに対する防御を提供できることを実証する。
組換え抗原およびアジュバント製剤
前記のように組換えタンパク質を作製した。CpG1826はColey Pharmaceuticals(マサチューセッツ州ウェルズリー)から入手した。
雌のC57BL/6マウスをCharles Riverから取得し、各実験において生齢を合わせた(5〜7週)。25μgのアジュバントCpGと一緒に製剤化した6または8μgの組換えRv2608、Rv3620、およびRv1813タンパク質で3回(3週間置きに)マウスを免疫した。アジュバントのみ、およびBCG対照群のマウスには、それぞれ、3用量のアジュバントのみ、または1用量の5 x 104 BCG CFUを投与した。1匹当たり総用量100μlをマウスに皮下経路で注射した。
最後の追加免疫から3週間後、免疫原性試験用に指定された動物からの脾臓を採取し、従来の方法により脾細胞を取得した。サイトカイン分析のために、2.5 x 105細胞/ウェルで96ウェル組織培養プレートに脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A 3μg/ml、PPD(10μg/ml)、Mtb溶解物(10μg/ml)、または各組換えタンパク質(10μg/ml)と一緒に72時間培養した。上清を回収し、特異的mAb(eBioscience)を用いた二重サンドイッチELISA及び製造者のプロトコルによりIFN-γについて分析した。
MultiScreen 96ウェルろ過プレート(Millopore、マサチューセッツ州ベッドフォード)を10μg/mlのラット抗マウスIFN-γまたはTNF捕獲Ab(eBioscience)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、RPMI 1640および10%FBSを用いて室温で少なくとも1時間遮断し、再度洗浄した。2 x 105細胞/ウェルで脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A(3μg/ml)、PPD(10μg/ml)、または各組換えタンパク質(10μg/ml)を用いて37℃で48時間刺激した。次いで、プレートをPBSおよび0.1%Tween-20で洗浄し、PBS、0.5%BSA、および0.1% Tween-20中5μg/mlのビオチンコンジュゲート型ラット抗マウスIFN-γまたはTNF二次Ab(eBioscience)と一緒に、2時間インキュベートした。製造者のプロトコルに従って、Vectastain ABCアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートおよびVectastain AEC基質キット(Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて、フィルターを展開した。脱イオン水でプレートを洗浄することにより反応を停止し、プレートを暗所で乾燥させ、自動化ELISPOTリーダー(C.T.L. Serie3A Analyzer、Cellular Technology Ltd、オハイオ州クリーブランド)でスポットを計数し、Immunospot(登録商標)(CTL Analyzer LLC)で分析した。
最後の免疫から1週間後、マウスから採血し、血清IgG1およびIgG2c抗体力価を決定した。0.1 M重炭酸塩バッファー中の2μg/mlの組換えタンパク質でNunc-Immuno Polysorbプレートを室温で4時間コーティングし、PBS Tween-20 0.05% BSA 1%を用いて4℃で一晩遮断し、PBS Tween-20 0.05%で洗浄し、1:50希釈、次に5倍段階希釈の血清と共に室温で2時間インキュベートし、洗浄し、PBS Tween-20 0.05% BSA 0.1%中1:2,000の抗IgG1-HRPまたは抗IgG2c-HRPと共に1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、SureBlue TMB基質(KPL Inc.、メリーランド州ゲイザーズバーグ)を用いて展開した。酵素反応を1N H2SO4で停止し、マイクロプレートELISAリーダー(Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール)およびSoftMax Pro5を用いて、650 nmの参照フィルター設定で、30分以内に450 nmでプレートを読み取った。カットオフ0.1のGraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc., カリフォルニア州サンディエゴ)で終点力価を決定した。
アジュバントCpGを混合したMtb抗原のサブセット由来の各組換えタンパク質6または8μgでマウスを3週間置きに3回皮下注射により免疫した。正の対照マウスは尾の付け根にBCG(5 x 104 CFU)で免疫し(1回)、負の対照マウスはアジュバントのみを注射した。最後の免疫から30日後、50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ(ウィスコンシン州マディソン)を用いて、結核菌H37Rv株(ATCC 35718;American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス)の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。4週間後、マウスを安楽死させ、PBS/Tween 80(0.05%)中に肺および脾臓ホモジネートを調製した。ニュートリエントMiddlebrook 7H11 Bacto Agar(BD Bioscences、メリーランド州コッキーズビル)上で個々の全器官の連続希釈物を平板培養し、加湿空気および5%CO2下での14日間のインキュベーション後、細菌コロニー形成を計数することにより、細菌数を決定した。データは、回収細菌の平均数±SDのLog10として表し、Log10 CFU減少=ワクチン接種群のLog10 CFU−生理食塩水処置群のLog10 CFUである。
CpGをアジュバントとして添加した組換えMtb抗原の混合物に対する免疫応答
25μgのアジュバントCpGと一緒に製剤化した各組換えMtb Rv2608、Rv3620、Rv1813タンパク質を個別に(8μg)、または混合物(各6μg)として用いて、C57BL/6マウスを3週間置きに3回免疫した。最後の免疫から1週間、3週間後、抗原特異的抗体の存在、ならびに記憶Tリンパ球をそれぞれ評価した。
アジュバントとしてCpGを添加したMtb組換えタンパク質Rv2608、Rv3620、およびRv1813を個別に(8μg)、または混合物(各々6μg)としてワクチン接種したマウスの肺において、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvによるエアロゾルチャレンジから4週間後に、生存桿菌の数(平均Log 10 CFUとして表す)を決定した。様々な組換えタンパク質で免疫したマウスの肺における平均Log 10 CFUを、アジュバントのみまたはBCG(現在TBに対する唯一のワクチン)を投与したマウスにおいて得られた平均Log 10 CFUと比較した。アジュバント群とワクチン接種群における平均Log10 CFUの差をCFUのLog 10減少として表す。
C57BL/6マウスにおけるID83およびID93融合タンパク質に対する免疫応答、ならびにMtbのエアロゾルチャレンジに対する防御
この実施例では、本発明の融合タンパク質による免疫が免疫原性であり、エアロゾル結核菌チャレンジに対する防御を提供できることを実証する。
融合タンパク質およびアジュバント製剤
前記のように組換えタンパク質を作製した。CpG1826はColey Pharmaceuticals(マサチューセッツ州ウェルズリー)から入手した。グルコピラノシルリピドA(GLA)はAvanti(アラバマ州アラバスター)から、またガルジキモド(GDQ)はInvivogen(カリフォルニア州サンディエゴ)から取得した。標準的技術により、安定な水中油型エマルジョン(-SE)を調製した。
雌のC57BL/6マウスをCharles Riverから取得し、各実験において生齢を合わせた(5〜7週)。20μgのアジュバントGLA-SEと一緒に製剤化した8μgのID83およびID93融合タンパク質で、または20〜25μgのアジュバントGLA-SE、GDQ-SE、CpG-SE、GLA/GDQ-SE、GLA/CpG-SE、CpG/GDQ-SEと一緒に製剤化した8μgのID83融合タンパク質で3回(3週間置きに)マウスを免疫した。生理食塩水、アジュバント単独、およびBCG対照群のマウスには、それぞれ、3用量のPBS、3用量のアジュバント単独、または1用量の5 x 104 BCG CFUを受けた。1匹当たり総用量100μlをマウスに皮下経路で注射した。
最後の追加免疫から3週間後、免疫原性試験用の動物からの脾臓を採取し、従来の方法により脾細胞を取得した。サイトカイン分析のために、2.5 x 105細胞/ウェルで96ウェル組織培養プレートに脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A 3μg/ml、PPD(10μg/ml)、Mtb溶解物(10μg/ml)、または各融合タンパク質(10μg/ml)と一緒に72時間培養した。上清を回収し、特異的mAb(eBioscience)を用い、製造者のプロトコルに従って、二重サンドイッチELISAによりIFN-γについて分析した。
最後の免疫から1週間後、マウスから採血し、血清IgG1およびIgG2c抗体力価を決定した。0.1 M重炭酸塩バッファー中の2μg/mlの組換えタンパク質でNunc-Immuno Polysorbプレートを室温で4時間コーティングし、PBS Tween-20 0.05% BSA 1%を用いて4℃で一晩遮断し、PBS Tween-20 0.05%で洗浄し、1:50希釈、次に5倍段階希釈の血清と共に室温で2時間インキュベートし、洗浄し、PBS Tween-20 0.05% BSA 0.1%中1:2,000の抗IgG1-HRPまたは抗IgG2c-HRPと共に1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、SureBlue TMB基質(KPL Inc.、メリーランド州ゲイザーズバーグ)を用いて展開した。酵素反応を1N H2SO4で停止し、マイクロプレートELISAリーダー(Molecular Devices、カリフォルニア州サニーベール)およびSoftMax Pro5を用いて、650 nmの参照フィルター設定で、30分以内に450 nmでプレートを読み取った。カットオフ0.1のGraphPad Prism 4(GraphPad Software Inc., カリフォルニア州サンディエゴ)で終点力価を決定した。
前記アジュバント中で製剤化した8μgの融合タンパク質で、マウスを3週間置きに3回皮下注射で免疫した。正の対照マウスには尾の付け根にBCG(5 x 104 CFU)で免疫し(1回)、負の対照マウスには生理食塩水、またはアジュバントのみを注射した。最後の免疫から30日後、50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ(ウィスコンシン州マディソン)を用いて、結核菌H37Rv株(ATCC 35718;American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス)の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。4週間後、マウスを安楽死させ、PBS/Tween 80(0.05%)中に肺および脾臓ホモジネートを調製した。ニュートリエントMiddlebrook 7H11 Bacto Agar(BD Bioscences、メリーランド州コッキーズビル)上で個々の全器官の段階希釈物を平板培養し、加湿空気および5%CO2下、37℃で14日間のインキュベーション後、細菌コロニー形成を計数することにより、細菌数を決定した。データは、回収細菌の平均数±SDのLog10として表し、Log10 CFUの減少CFU=ワクチン接種群のLog10 CFU−生理食塩水処置群のLog10 CFUである。
GLA-SEをアジュバントとして添加したID83およびID93に対する免疫応答
20μgのアジュバントGLA-SEと一緒に製剤化したID83またはID93融合タンパク質で、C57BL/6マウスを3週間置きに3回免疫した。最後の免疫から1週間、および3週間後、抗原特異的抗体、ぷおび記憶Tリンパ球の存在をそれぞれ評価した。
20〜25μgのアジュバントGLA-SE、GDQ-SE、CpG-SE、GLA/GDQ-SE、GLA/CpG-SE、CpG/GDQ-SEと一緒に製剤化したID83融合タンパク質で、C57BL/6マウスを3週間置きに3回免疫した。最後の免疫から1週間および3週間後、抗原特異的抗体、および記憶Tリンパ球の存在をそれぞれ評価した。
GLA-SEをアジュバントとして添加したID83またはID93融合タンパク質をワクチン接種したマウスの肺において、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvのエアロゾルチャレンジから4週間後に、生存桿菌の数(平均Log 10 CFUとして表す)を決定した。
20〜25μgのアジュバントGLA-SE、CpG-SE、またはGLA/CpG-SEと一緒に製剤化したID83融合タンパク質をワクチン接種したマウスの肺において、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvを用いたエアロゾルチャレンジから4週間後に、生存桿菌の数(平均Log 10 CFUとして表す)を決定した。
20/25μgのアジュバントGLA/CpG-SEと一緒に製剤化したID83融合タンパク質をワクチン接種したモルモットの生存を、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvを用いたエアロゾルチャレンジから200日間追跡した。
C57BL/6マウスにおけるAD5-ID83に対する免疫応答、ならびにエアロゾル結核菌チャレンジに対する防御
この実施例は、本発明のID83融合タンパク質を発現すべく操作されたアデノウイルスベクターによるマウスの免疫が、C57BL/6マウスにおいて免疫原性であることを実証するものである。
ウイルス構築および精製
AdEasy(商標)XL AdenoviralVector System(Stratagene #240010)を用いて、Ad5-ID83を構築した。手短には、PCRを用いて、プラスミドDNAからID83を増幅し、HinDIIIおよびEcoRVで消化し、pShuttle-CMVに連結して、ID83-pShuttleCMVを作製した。PmeIで消化することにより、ID83-pShuttleCMVを線状にし、大腸菌BJ5183-AD-1エレクトロコンピテントセル(Stratagene #200157)にエレクトロポレートした(2.4kV、186Ω、0.2cm ギャップキュベット)。PacIで消化することにより、組換えAd5-ID83プラスミドを同定した。Polyfect試薬(Invitrogen #301107)を用いて、60mmプレート中で、AD-239細胞にPacIで消化したAd5-ID83プラスミド(4μg)をトランスフェクトした。4日後、3mL媒地中に細胞を回収し、3サイクルの凍結/解凍により細胞を溶解させた。溶解物上清を、CsCl勾配遠心分離による精製用のウイルスを増幅するために用いた。
雌のC57BL/6マウスをCharles Riverから取得し、各実験において生齢を合わせた(5〜7週)。5 x 108 Ad5-ID83ウイルス粒子で2回(3週間置きに)マウスを免疫した。生理食塩水、およびBCG対照群のマウスには、PBS、または1用量の5 x 104 BCG CFUをそれぞれ投与した。1匹当たり総用量100μlをマウスに筋内経路で注射した。
MultiScreen 96ウェルろ過プレート(Millopore、マサチューセッツ州ベッドフォード)を10μg/mlのラット抗マウスIFN-γまたはTNF捕獲Ab(eBioscience)でコーティングしてから、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで洗浄し、RPMI 1640および10%FBSを用いて室温で少なくとも1時間遮断し、再度洗浄した。2 x 105細胞/ウェルで脾細胞を二重に塗布し、培地、Con A(3μg/ml)、PPD(10μg/ml)、または各組換えタンパク質(10μg/ml)を用いて37℃で48時間刺激した。次いで、プレートをPBSおよび0.1%Tween-20で洗浄し、PBS、0.5%BSA、および0.1% Tween-20中5μg/mlのビオチンコンジュゲート型ラット抗マウスIFN-γまたはTNF二次Ab(eBioscience)と一緒に、2時間インキュベートした。製造者のプロトコルに従って、Vectastain ABCアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートおよびVectastain AEC基質キット(Vector Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて、フィルターを展開した。脱イオン水でプレートを洗浄することにより反応を停止し、プレートを暗所で乾燥させ、自動化ELISPOTリーダー(C.T.L. Serie3A Analyzer、Cellular Technology Ltd、オハイオ州クリーブランド)でスポットを計数した後、Immunospot(登録商標)(CTL Analyzer LLC)で分析した。
前記アジュバント中で製剤化した8μgの融合タンパク質でマウスを3週間置きに3回皮下注射で免疫した。正の対照マウスは尾の付け根にBCG(5 x 104 CFU)で免疫し(1回)、負の対照マウスには生理食塩水、またはアジュバントのみを注射した。最後の免疫から30日後、50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ(ウィスコンシン州マディソン)を用いて、結核菌H37Rv株(ATCC 35718;American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス)の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。4週間後、マウスを安楽死させ、PBS/Tween 80(0.05%)中に肺および脾臓ホモジネートを調製した。ニュートリエントMiddlebrook 7H11 Bacto Agar(BD Bioscences、メリーランド州コッキーズビル)上で個々の全器官の段階希釈物を平板培養し、加湿空気および5%CO2下、37℃で14日間のインキュベーション後、細菌コロニー形成を計数することにより、細菌数を決定した。データは、回収細菌の平均数±SDのLog10として表し、Log10 CFUの減少=ワクチン接種群のLog10 CFU−生理食塩水処置群のLog10 CFUである。
Ad5-ID83に対する免疫応答
C57BL/6マウスをAd5-ID83で3週間置きに2回免疫した。
5 x 108個のAd5-ID83ウイルス粒子をワクチン接種したマウスの肺において、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvを用いたエアロゾルチャレンジから4週間後に、生存桿菌の数(平均Log 10 CFUとして表す)を決定した。
アジュバントGLA-SEを含むMtb Rv1813、Rv2608、およびRv3620組換えタンパク質による免疫療法
この実施例では、標準的抗生物質療法と併用した本発明の組換えタンパク質の混合物によるマウスの免疫化により、結核菌感染マウスの寿命を延長できることを実証する。
組換えタンパク質およびアジュバント製剤
前記のように組換えタンパク質を作製した。グルコピラノシルリピドA(GLA)はAvanti(アラバマ州アラバスター)から取得した。安定な水中油型エマルション(-SE)を調製した。
雌のSWR/JマウスをJackson Laboratoriesから取得し、各実験において生齢を合わせた(5〜7週)。50〜100の細菌を肺に送達するように調整したUW-Madisonエアロゾル暴露チャンバ(ウィスコンシン州マディソン)を用いて、結核菌H37Rv株(ATCC 35718;American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス)の低用量エアロゾル暴露により、マウスをチャレンジした。感染から225日間、マウスの生存をモニターした。
結核菌によるエアロゾルチャレンジから2週間後、標準的抗生物質療法を開始した。飲用水に50 mg/lのリファンピンと85 mg/lのイソニアジドを添加して、これらをマウスに60日間与えた。いくつかのマウスにはさらに免疫療法を施し、感染から76日、97日、および118日後、20μgのアジュバントGLA-SEと一緒に製剤化したRv1813、Rv2608、およびRv3620組換えタンパク質各々6μgでこれらのマウスを免疫した。1匹当たり総量100μlをマウスに皮下経路で注射した。マウスの生存を225日間モニターした。
結核菌感染マウスにおける、抗生物質と、GLA-SE含有Rv1813、Rv2608、およびRv3620免疫療法との併用によりもたらされる防御
リファンピン+イソイアジド抗生物質の標準的レジメン(Rx)、またはRxと、20μgのアジュバントGLA-SEと一緒に製剤化したRv1813、Rv2608、およびRv3620組換えタンパク質による免疫(免疫療法)との併用療法、を用いて治療したMtb感染マウスの生存を、約50 CFUの毒性結核菌H37Rvによるエアロゾルチャレンジから225日間追跡した。
結核の血清学的診断
この実施例では、結核菌感染の血清学的診断のための感度および特異性が増大した結核菌抗原および抗原融合物を同定する。
組換え融合タンパク質ID93のクローニングおよび発現
Rv3619、Rv1813、Rv3620およびRv2608由来の融合パートナーを含む融合構築物ID93のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質ID91のクローニングおよび発現
Rv3619、Rv2389、Rv3478およびRv1886由来の融合パートナーを含む融合構築物ID91のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質ID71のクローニングおよび発現
Rv3619、Rv2389、Rv3478(N180)およびRv1886由来の融合パートナーを含む融合構築物ID71のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質ID114のクローニングおよび発現
Rv1813、Rv3620、Rv2608およびRv1886由来の融合パートナーを含む融合構築物ID114のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質ID125のクローニングおよび発現
Rv3619、Rv1813、Rv3620、Rv2608およびRv1886由来の融合パートナーを含む融合構築物ID125のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質DID85のクローニングおよび発現
Rv2032、Rv2875、およびRv0831由来の融合パートナーを含む融合構築物DID85のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質DID92のクローニングおよび発現
Rv3044、Rv1009、およびRv0614由来の融合パートナーを含む融合構築物DID92のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質DID108のクローニングおよび発現
Rv3872、Rv3873、Rv3875およびRv3881由来の融合パートナーを含む融合構築物DID108のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
組換え融合タンパク質DID93のクローニングおよび発現
Rv1099、Rv0655、およびRv0054由来の融合パートナーを含む融合構築物DID93のクローニングのために、以下のプライマーを用いた:
以下に、実施形態を示す。
実施形態
(1)免疫刺激剤、ならびに、2種以上の結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原、またはその免疫原性断片の組合せを含む組成物であって、その際、上記抗原は、以下:Rv0164(配列番号1)、Rv0496(配列番号6)、Rv2608(配列番号26)、Rv3020(配列番号36)、Rv3478(配列番号41)、Rv3619(配列番号46)、Rv3620(配列番号51)、Rv1738(配列番号11)、Rv1813(配列番号16)、Rv3810(配列番号56)、Rv2389(配列番号21)、Rv2866(配列番号31)、Rv3876(配列番号61)、Rv0054(配列番号100)、Rv0410(配列番号106)、Rv0655(配列番号112)、Rv0831(配列番号115)、Rv1009(配列番号118)、Rv1099(配列番号121)、Rv1240(配列番号124)、Rv1288(配列番号127)、Rv1410(配列番号130)、Rv1569(配列番号133)、Rv1789(配列番号136)、Rv1818(配列番号139)、Rv1860(配列番号142)、Rv1886(配列番号145)、Rv1908(配列番号148)、Rv2220(配列番号154)、Rv2032(配列番号151)、Rv2623(配列番号160)、Rv2875(配列番号163)、Rv3044(配列番号166)、Rv3310(配列番号169)、Rv3881(配列番号178)、Rv0577(配列番号184)、Rv1626(配列番号187)、Rv0733(配列番号190)、Rv2520(配列番号193)、Rv1253(配列番号196)、Rv1980(配列番号199)、Rv3628(配列番号202)、Rv1884(配列番号205)、Rv3872(配列番号208)、Rv3873(配列番号211)、Rv1511(配列番号214)、およびRv3875(配列番号292)、ならびに上記配列のいずれかと少なくとも90%の同一性を有する抗原、からなる群より選択される、上記組成物。
(2)前記2種以上の抗原の組合せが、以下:
(a)Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)およびRv2608(配列番号26)を含む組合せ;
(b)Rv2608(配列番号26)およびRv3619(配列番号46)を含む組合せ;ならびに
(c)Rv3478(配列番号41)およびRv3619(配列番号46)を含む組合せ
からなる群より選択される、(1)に記載の組成物。
(3)Rv2608(配列番号26)、Rv1813(配列番号16)およびRv3620(配列番号51)を含む前記組合せが、以下:Rv1886(配列番号145)、Rv2389(配列番号21)、Rv3478(配列番号41)、Rv2875(配列番号163)、Rv2220(配列番号154)、Rv0733(配列番号190)、Rv0577(配列番号184)、Rv3044(配列番号166)、Rv1626(配列番号187)、Rv3619(配列番号46)およびRv3020(配列番号36)からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、(2)(a)に記載の組成物。
(4)前記組合せが、Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)、Rv2608(配列番号26)およびRv2389(配列番号21)を含む、(3)に記載の組成物。
(5)前記組合せが、Rv2608(配列番号26)、Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)およびRv3619(配列番号46)を含む、(3)に記載の組成物。
(6)Rv2608(配列番号26)およびRv3619(配列番号46)を含む前記組合せが、以下:Rv1886(配列番号145)、Rv2389(配列番号21)、Rv1813(配列番号16)、Rv2875(配列番号163)、Rv2220(配列番号154)、Rv0733(配列番号190)、Rv0577(配列番号184)、Rv3044(配列番号166)、Rv1626(配列番号187)、Rv3620(配列番号51)、Rv3478(配列番号41)およびRv3020(配列番号36)からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、(2)(b)に記載の組成物。
(7)Rv3478(配列番号41)およびRv3619(配列番号46)を含む前記組合せが、以下:Rv1886(配列番号145)、Rv2389(配列番号21)、Rv1813(配列番号16)、Rv2875(配列番号163)、Rv2220(配列番号154)、Rv0733(配列番号190)、Rv0577(配列番号184)、Rv3044(配列番号166)、Rv1626(配列番号187)、Rv3620(配列番号51)、Rv2608(配列番号26)およびRv3020(配列番号36)からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、(2)(c)に記載の組成物。
(8)2種以上の抗原、その免疫原性断片は、融合ポリペプチドの形態で共有結合している、(1)に記載の組成物。
(9)前記融合ポリペプチドが、以下:ID83(配列番号91)、ID94(配列番号95)、ID93(配列番号226)、ID91(配列番号236)、ID71(配列番号245)、ID114(配列番号251)、ID125(配列番号257)、またはこれらと少なくとも90%の同一性を有する配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、(8)に記載の組成物。
(10)前記免疫刺激剤が、以下:GLA、AS-2、ENHANZYN(商標)、MPL(商標)、3D-MPL(商標)、IFA、QS21、CWS、TDM、AGP、CpG含有オリゴヌクレオチド、トール様受容体アゴニスト、LeIF、サポニン、サポニン模擬物、ならびに生体および合成のリピドA、イミキモド、ガルジキモド(gardiquimod)、レシキモド、polyI:C、フラジェリン、またはこれらの組合せからなる群より選択される、(1)に記載の組成物。
(11)2種以上の共有結合した結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原、またはその免疫原性断片の組合せを含む、単離された融合ポリペプチドであって、その際、上記抗原は、以下:Rv0164(配列番号1)、Rv0496(配列番号6)、Rv2608(配列番号26)、Rv3020(配列番号36)、Rv3478(配列番号41)、Rv3619(配列番号46)、Rv3620(配列番号51)、Rv1738(配列番号11)、Rv1813(配列番号16)、Rv3810(配列番号56)、Rv2389(配列番号21)、Rv2866(配列番号31)、Rv3876(配列番号61)、Rv0054(配列番号100)、Rv0410(配列番号106)、Rv0655(配列番号112)、Rv0831(配列番号115)、Rv1009(配列番号118)、Rv1099(配列番号121)、Rv1240(配列番号124)、Rv1288(配列番号127)、Rv1410(配列番号130)、Rv1569(配列番号133)、Rv1789(配列番号136)、Rv1818(配列番号139)、Rv1860(配列番号142)、Rv1886(配列番号145)、Rv1908(配列番号148)、Rv2220(配列番号154)、Rv2032(配列番号151)、Rv2623(配列番号160)、Rv2875(配列番号163)、Rv3044(配列番号166)、Rv3310(配列番号169)、Rv3881(配列番号178)、Rv0577(配列番号184)、Rv1626(配列番号187)、Rv0733(配列番号190)、Rv2520(配列番号193)、Rv1253(配列番号196)、Rv1980(配列番号199)、Rv3628(配列番号202)、Rv1884(配列番号205)、Rv3872(配列番号208)、Rv3873(配列番号211)、Rv1511(配列番号214)、およびRv3875(配列番号292)、ならびに上記配列のいずれかと少なくとも90%の同一性を有する抗原、からなる群より選択される、上記単離された融合ポリペプチド。
(12)前記2種以上の抗原の組合せが、以下:
(a)Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)およびRv2608(配列番号26)を含む組合せ;
(b)Rv2608(配列番号26)およびRv3619(配列番号46)を含む組合せ;ならびに
(c)Rv3478(配列番号41)およびRv3619(配列番号46)を含む組合せ
からなる群より選択される、(11)に記載の単離された融合ポリペプチド。
(13)Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)およびRv2608(配列番号26)を含む前記組合せが、以下:Rv1886(配列番号145)、Rv2389(配列番号21)、Rv1813(配列番号16)、Rv2875(配列番号163)、Rv2220(配列番号154)、Rv0733(配列番号190)、Rv0577(配列番号184)、Rv3044(配列番号166)、Rv1626(配列番号187)、Rv3619(配列番号46)、Rv3478(配列番号41)およびRv3020(配列番号36)からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、(12)(a)に記載の単離された融合ポリペプチド。
(14)前記組合せが、Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)、Rv2608(配列番号26)およびRv2389(配列番号21)を含む、(13)に記載の単離された融合ポリペプチド。
(15)前記組合せが、Rv2608(配列番号26)、Rv1813(配列番号16)、Rv3620(配列番号51)およびRv3619(配列番号46)を含む、(13)に記載の単離された融合ポリペプチド。
(16)Rv2608(配列番号26)およびRv3619(配列番号46)を含む前記組合せが、以下:Rv1886(配列番号145)、Rv2389(配列番号21)、Rv1813(配列番号16)、Rv2875(配列番号163)、Rv2220(配列番号154)、Rv0733(配列番号190)、Rv0577(配列番号184)、Rv3044(配列番号166)、Rv1626(配列番号187)、Rv3620(配列番号51)、Rv3478(配列番号41)およびRv3020(配列番号36)からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、(12)(b)に記載の単離された融合ポリペプチド。
(17)Rv3478(配列番号41)およびRv3619(配列番号46)を含む前記組合せが、以下:Rv1886(配列番号145)、Rv2389(配列番号21)、Rv1813(配列番号16)、Rv2875(配列番号163)、Rv2220(配列番号154)、Rv0733(配列番号190)、Rv0577(配列番号184)、Rv3044(配列番号166)、Rv1626(配列番号187)、Rv3620(配列番号51)、Rv2608(配列番号26)およびRv3020(配列番号36)からなる群より選択される1種以上の抗原をさらに含む、(12)(c)に記載の単離された融合ポリペプチド。
(18)(11)〜(17)のいずれか1に記載の融合ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
(19)(1)〜(10)のいずれか1に記載の有効量の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、防御免疫応答を刺激する方法。
(20)生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための方法であって、
(a)生体サンプルを以下:Rv0054(配列番号100)、Rv0164(配列番号103)、Rv0410(配列番号106)、Rv0496(配列番号109)、Rv0655(配列番号112)、Rv0831(配列番号115)、Rv1009(配列番号118)、Rv1099(配列番号118)、Rv1240(配列番号124)、Rv1288(配列番号127)、Rv1410(配列番号130)、Rv1569(配列番号133)、Rv1789(配列番号136)、Rv1818(配列番号139)、Rv1860(配列番号142)、Rv1886(配列番号145)、Rv1908(配列番号148)、Rv2220(配列番号154)、Rv2032(配列番号151)、Rv2608(配列番号157)、Rv2623(配列番号160)、Rv2875(配列番号163)、Rv3044(配列番号166)、Rv3310(配列番号169)、Rv3619(配列番号172)、Rv3810(配列番号175)、Rv3881(配列番号178)、Rv0577(配列番号184)、Rv1626(配列番号187)、Rv0733(配列番号190)、Rv2520(配列番号193)、Rv1253(配列番号196)、Rv1980(配列番号199)、Rv3628(配列番号202)、Rv1884(配列番号205)、Rv3872(配列番号208)、Rv3873(配列番号211)、Rv1511(配列番号214)、およびRv3875(配列番号292)、またはその免疫原性部分、またはその融合ポリペプチド、からなる群より選択される2種以上の抗原の組合せと接触させるステップと;
(b)生体サンプルにおいて、前記組合せに結合する抗体および/またはT細胞の存在を検出するステップ
を含む、上記方法。
(21)生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための診断キットであって、
(a)以下:Rv0164(配列番号1)、Rv0496(配列番号6)、Rv2608(配列番号26)、Rv3020(配列番号36)、Rv3478(配列番号41)、Rv3619(配列番号46)、Rv3620(配列番号51)、Rv1738(配列番号11)、Rv1813(配列番号16)、Rv3810(配列番号56)、Rv2389(配列番号21)、Rv2866(配列番号31)、Rv3876(配列番号61)、Rv0054(配列番号100)、Rv0410(配列番号106)、Rv0655(配列番号112)、Rv0831(配列番号115)、Rv1009(配列番号118)、Rv1099(配列番号121)、Rv1240(配列番号124)、Rv1288(配列番号127)、Rv1410(配列番号130)、Rv1569(配列番号133)、Rv1789(配列番号136)、Rv1818(配列番号139)、Rv1860(配列番号142)、Rv1886(配列番号145)、Rv1908(配列番号148)、Rv2220(配列番号154)、Rv2032(配列番号151)、Rv2623(配列番号160)、Rv2875(配列番号163)、Rv3044(配列番号166)、Rv3310(配列番号169)、Rv3881(配列番号178)、Rv0577(配列番号184)、Rv1626(配列番号187)、Rv0733(配列番号190)、Rv2520(配列番号193)、Rv1253(配列番号196)、Rv1980(配列番号199)、Rv3628(配列番号202)、Rv1884(配列番号205)、Rv3872(配列番号208)、Rv3873(配列番号211)、Rv1511(配列番号214)、およびRv3875(配列番号292)、またはその免疫原性部分、もしくはその融合ポリペプチドからなる群より選択される2種以上の抗原の組合せと;
(b)検出試薬と
を含む、上記診断キット。
(22)生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための方法であって、
(a)生体サンプルを以下:DID85(配列番号265)、DID92(配列番号273)、DID108(配列番号283)、およびDID93(配列番号291)からなる群より選択される融合ポリペプチドと接触させるステップと;
(b)生体サンプルにおいて、前記融合ポリペプチドに結合する抗体および/またはT細胞の存在を検出するステップ
を含む、上記方法。
(23)生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための診断キットであって、
(a)以下:DID85(配列番号265)、DID92(配列番号273)、DID108(配列番号283)、およびDID93(配列番号291)からなる群より選択される融合ポリペプチドと;
(b)検出試薬と
を含む、上記診断キット。
Claims (28)
- 免疫刺激剤、並びに、2種以上の結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原の組合せを含む組成物であって、その際、上記抗原は、Rv2608(配列番号26)、Rv3620(配列番号51)及びRv1813(配列番号16)から成る群より選択されるか、又は配列番号26の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原、配列番号51の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原及び配列番号16の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原から成る群より選択される、上記組成物。
- 前記組合せが、Rv2608(配列番号26)、Rv3620(配列番号51)及びRv1813(配列番号16)を含むか、又は配列番号26の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原、配列番号51の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原及び配列番号16の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記組合せが、結核菌抗原Rv3619(配列番号46)又は配列番号46の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原をさらに含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記組合せが、結核菌抗原Rv2389(配列番号21)又は配列番号21の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原をさらに含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記2種以上の抗原は、融合ポリペプチドの形態で共有結合している、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 免疫刺激剤、並びに、配列番号91(ID83)、配列番号95(ID94)、配列番号226(ID93);又は配列番号91、配列番号95若しくは配列番号226の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含む組成物。
- 前記免疫刺激剤が、以下:GLA、AS-2、モノホスホリルリピドA、3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA、IFA、QS21、CWS、TDM、AGP、CpG含有オリゴヌクレオチド、トール様受容体アゴニスト、LeIF、サポニン、サポニン模擬物、並びに生体及び合成のリピドA、イミキモド、ガルジキモド(gardiquimod)、レシキモド、polyI:C、フラジェリン、又はこれらの組合せから成る群より選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 2種以上の共有結合した結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原の組合せを含む、単離された融合ポリペプチドであって、その際、上記抗原は、Rv2608(配列番号26)、Rv3620(配列番号51)及びRv1813(配列番号16)から成る群より選択されるか、又は配列番号26の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原、配列番号51の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原及び配列番号16の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原から成る群より選択される、上記単離された融合ポリペプチド。
- 前記組合せが、Rv2608(配列番号26)、Rv3620(配列番号51)及びRv1813(配列番号16)を含むか、又は配列番号26の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原、配列番号51の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原及び配列番号16の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原を含む、請求項8に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記組合せが、結核菌抗原Rv3619(配列番号46)又は配列番号46の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原をさらに含む、請求項9に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 前記組合せが、結核菌抗原Rv2389(配列番号21)又は配列番号21の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原をさらに含む、請求項9に記載の単離された融合ポリペプチド。
- 配列番号91(ID83)、配列番号95(ID94)、配列番号226(ID93);又は配列番号91、配列番号95若しくは配列番号226の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む単離された融合ポリペプチド。
- 請求項8〜12のいずれか1項に記載の融合ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドによりコードされる融合ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養すること、及び該宿主細胞により生産された該融合ポリペプチドを回収することを含む、融合ポリペプチドの生産方法。
- 防御免疫応答の刺激を必要とする被験体において防御免疫応答を刺激するための医薬の製造における請求項1〜7のいずれか1項に記載の有効量の組成物の使用。
- 被験体がヒトである、請求項15に記載の使用。
- 生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための方法であって、
(a)生体サンプルを、Rv2608(配列番号26)、Rv3620(配列番号51)及びRv1813(配列番号16)から成る群より選択されるか、又は配列番号26の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原、配列番号51の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原及び配列番号16の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原から成る群より選択される2種以上の抗原の組合せと接触させるステップと;
(b)生体サンプルにおいて、前記組合せに結合する抗体及び/又はT細胞の存在を検出するステップ
を含む、上記方法。 - 前記組合せが、Rv2608(配列番号26)、Rv3620(配列番号51)及びRv1813(配列番号16)を含むか、又は配列番号26の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原、配列番号51の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原及び配列番号16の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記組合せが、結核菌抗原Rv3619(配列番号46)又は配列番号46の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 前記組合せが、結核菌抗原Rv2389(配列番号21)又は配列番号21の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原をさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 前記2種以上の抗原は、融合ポリペプチドの形態で共有結合している、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための方法であって、
(a)生体サンプルを、配列番号91(ID83)、配列番号95(ID94)、配列番号226(ID93);又は配列番号91、配列番号95若しくは配列番号226の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドと接触させるステップと;
(b)生体サンプルにおいて、前記融合ポリペプチドに結合する抗体及び/又はT細胞の存在を検出するステップ
を含む、上記方法。 - 生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための診断キットであって、
(a)Rv2608(配列番号26)、Rv3620(配列番号51)及びRv1813(配列番号16)から成る群より選択されるか、又は配列番号26の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原、配列番号51の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原及び配列番号16の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原から成る群より選択される2種以上の抗原の組合せと;
(b)検出試薬と
を含む、上記診断キット。 - 前記組合せが、Rv2608(配列番号26)、Rv3620(配列番号51)及びRv1813(配列番号16)を含むか、又は配列番号26の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原、配列番号51の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原及び配列番号16の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原を含む、請求項23に記載のキット。
- 前記組合せが、結核菌抗原Rv3619(配列番号46)又は配列番号46の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原をさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 前記組合せが、結核菌抗原Rv2389(配列番号21)又は配列番号21の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列を有する抗原をさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 前記2種以上の抗原は、融合ポリペプチドの形態で共有結合している、請求項23〜26のいずれか1項に記載のキット。
- 生体サンプルにおける結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を検出するための診断キットであって、
(a)配列番号91(ID83)、配列番号95(ID94)、配列番号226(ID93);又は配列番号91、配列番号95若しくは配列番号226の配列に対して少なくとも90%の同一性を有する配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドと;
(b)検出試薬と
を含む、上記診断キット。
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