JPH11503610A - 好酸球で発現される新規なケモカイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、過好酸性症候群を患う患者の血液細胞から作られたｃＤＮＡライブラリーで初めに発見された新規なＣ−Ｃケモカインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列ＥＥＣに関する。本発明には、ＥＥＣをコードするヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子、精製ＥＥＣの産生のための発現ベクター、ＥＥＣと特異的に結合し得る抗体、ＥＥＣをコードするヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはオリゴヌクレオチド、及びＥＥＣをコードする核酸分子及びＥＥＣに特異的に結合し得る抗体に基づくケモカイン活性化に対する診断テスト方法が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 好酸球で発現される新規なケモカイン 技術的背景 本発明は、好酸球において見出された新規なケモカインのヌクレオチド配列及 びアミノ酸配列に関し、また、疾病の診断及び治療におけるこれらの配列の使用 に関する。 背景技術ケモカイン ケモカインは、例えば侵入微生物のような非自己抗原、または非適合組織型の 抗原に免疫系が応答したときに生成され、異常な、炎症性、疾病状態における白 血球遊走に関与するサイトカインのファミリーである。ケモカインは内皮細胞上 の特定の接着分子の発現を媒介し、特定の細胞タイプを活性化する化学誘因物質 因子の勾配を作り出す。更に、ケモカインは特定の細胞タイプの増殖を刺激し、 特定の受容体を保有する細胞の活性化を調節する。これらの作用の何れもが、標 的細胞特異性が高いことを説明している。 このケモカインは小さなポリペプチドで、一般に約７０〜１００アミノ酸（ａ ａ）の長さで、８〜１１ｋＢの分子量を有し、１〜１００ｎＧ／ｍｌの濃度の範 囲で活性である。初めに、このケモカインは炎症組織から単離、精製され、その 対生物作用に関して特徴付けられた。最近では、ケモカインは分子クローニング 技術によって発見され、構造と共に機能分析により特徴づけられている。 ケモカインは、主として成熟分子における初めの２つのシステイン残 基のスペーシングに基づく４つのシステインモチーフを通して近縁関係を有して いる。現在、各種ケモカインは２つのファミリー、即ちＣ−Ｘ−Ｃケモカイン（ α）及びＣ−Ｃケモカイン（β）の何れか一方に割り当てられている。例外は存 在するが、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、好中球及び線維芽細胞を活性化し、Ｃ−Ｃ ケモカインは単球／マクロファージ、好塩基球、好酸球、Ｔ細胞他を含むより多 様な標的細胞のグループに作用する。これらのケモカインの両ファミリーは多種 多様なタイプの細胞により合成され、その概要は“Ｔｈｏｍｓｏｎ Ａ．（１９ ９４）Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｄ Ｅｄ．Ａｃａｄ ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ．”に記載されている。ケモカインのこの２つの グループについては後に再び説明する。 現在、Ｃ−Ｃケモカインの数はＣ−Ｘ−Ｃケモカインより少ないが、これはＮ 末端プロセシングの数が少ないためであるらしい。既知のヒト及び／またはネズ ミＣ−Ｃケモカインには、ＭＩＰ−１α及びβ、Ｉ−３０９、ＲＡＮＴＥＳ、及 びＭＣＰ−１が含まれる。マクロファージ炎症性タンパク質α及びβ（ＭＩＰ− １α及びβ）は、初めに刺激されたマウスのマクロファージ株細胞から精製され 、通常の組織に注入されると炎症反応を誘発した。少なくとも３つの異なる非対 立遺伝子が、ヒトＭＩＰ−Ｃαをコードし、７つのこのような遺伝子がＭＩＰ− １βをコードする。 ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βは６８〜６９アミノ酸からなり、これらのアミ ノ酸の約７０％が、その酸性、成熟分泌型において同一である。これらのタンパ ク質は双方共に、刺激されたＴ細胞、Ｂ細胞、及び単球においてミトゲン抗−Ｃ Ｄ３及び内毒素を通して発現され、また両ポリペプチドはヘバリンに結合する。 両分子は単球を刺激し、ＭＩＰ−１αはＴ細胞のＣＤ８サブセット及び好酸球を 化学誘因し、ＭＩＰ−１βは Ｔ細胞のＣＤ４サブセットを化学誘因する。マウスにおいて、これらのタンパク 質は骨髄造血を刺激することが知られている。 Ｉ−３０９はヒトγ−δＴ細胞株からクローニングされ、マウスからクローニ ングされたＴ細胞活性化遺伝子３（ＴＣＡ３）と４２％のアミノ酸同一性を示し ている。これらの２つのタンパク質の５′フランキング領域の間には、かなりの レベルのヌクレオチド相同性が存在しており、他のケモカインにおいては見られ ない特別なシステイン残基の対を共通に持っている。このような類似性は、Ｉ− ３０９とＴＣＡ３が、配列及び機能が異なる種のホモログであることを示唆して いる。 ＲＡＮＴＥＳは、Ｃ−Ｃケモカインの一種であって、発現されるのはＴ細胞（ Ｂ細胞では発現されない）、血小板、ある種の腫瘍細胞株、及び刺激されたリウ マチ滑膜線維芽細胞においてである。後者においては、ＩＬ（インターロイキン ）１及びＩＬ４、形質転換神経因子及びインターフェロンγにより調節される。 Ｔ細胞からクローニングされたｃＤＮＡは、Ｎ結合型グリコシル化を欠いた基本 的な８ｋＤのタンパク質をコードし、白血球、単球、好塩基球、及び好酸球に影 響を与え得る。ＲＡＮＴＥＳのｍＲＮＡの発現は、Ｔ細胞刺激により実質的に低 減する。 単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）は、７６アミノ酸のタンパク質であって 、様々な媒介物の刺激に応じてほとんど全ての細胞及び組織において発現される ようである。しかし、ＭＣＰ−１の標的は、単球及び好塩基球に限定されており 、そこでＭＣＰ−１は、ＭＣＰ−１受容体、Ｇタンパク質結合カルシウム流動（ flux）を誘発する（Ｃｈａｒｏ Ｉ， ｐｅｒｓｏｎａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｃａ ｔｉｏｎ参照）。他の２つの近縁関係にあるタンパク質、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ− ３は、ヒト骨肉腫細胞株から精製された。ＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３はＭＣＰ− １とそれぞれ６２％及び７３％のアミノ酸配列の同一性を有し、単球に対するそ の 化学誘因物質特異性を共通のものとしている。 １９９５年６月２９日に公開された国際公開番号ＷＯ ９５／１７０９２の明 細書、及びその優先権をなす１９９４年３月８日出願の米国特許出願第０８／２ ０８３３９号明細書には、ＭＩＰ３のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、ＭＩ Ｐ−１αに対して６６％の類似性を有する大動脈内皮細胞において見出されたケ モカインが開示されている。 このケモカイン分子について説明している文献には、“Ｓｃｈａｌｌ ＴＪ （１９９４） Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ： Ｔａｒｇｅｔ ｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｏ ｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ ＭＡ ｐｐ １８０−２７０”；及び“Ｐａｕｌ ＷＥ （１９９３）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄ ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ ｐｐ ８２２−８２６”がある。好酸球 好酸球は高度に活性のゴルジ装置及びリボゾーム装置によって含有する好塩基 性または好酸性顆粒が発生する間に形成される二核性、多核性白血球である。形 質膜は白血球の膜と構造的に区別されるものではないが、免疫グロブリン（Ｉｇ ）、特にＩｇＧ及びＩｇＥの受容体によって特徴付けられている。これらの細胞 は、幹細胞から全生涯に亘って形成され、微生物及び異種タンパクから体を保護 する全身性防衛において重要な役目を果たす。血液１ｍｌ当たりの総数７０００ の白血球に対して、好酸球の数は通常血液１μｌ当たり約１６０個である。好酸 球は通常６日間有効であって、骨髄の中で形成され、それらが炎症または浸潤部 位に動員されるまでは骨髄の中に格納されている。 好酸球は寄生生物の感染において特殊な機能を発揮する。好酸球は、 恐らくそれらのＩｇ受容体を介して寄生生物の幼生に付着し、宿主の活性化Ｔ細 胞及びマスト細胞（Ａｂｕ−Ｇｈａｚａｌｅｈ ＲＩ， Ｋｉｔａ Ｈ， Ｇｌ ｅｉｃｈ ＧＪ （１９９２） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｓｅｒ ５７：１３７−６７ ）によって産生されたインターロイキン−５（ＩＬ−５）、ＩＬ−３、顆粒球／ 単球細胞刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または寄生生物によって産生される他の因 子に応じて脱顆粒を受ける。脱顆粒によって以下のような多くの活性化種が放出 される。それは（１）ペルオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、ホスホリパーゼ 、Ｂグルクロニダーゼ、ＲＮＡ分解酵素、アリルスルファターゼ及びカテプシン のような加水分解酵素、（２）高度に反応性の高いスーパーオキサイド、及び（ ３）許容基礎タンパク質（ＭＢＰ）、アルギニンリッチ強力幼生ポリペプチド、 及び好酸球カチオンタンパク質（Ｃａｐｒｏｎ Ｍ （１９９２） Ｍｅｍ Ｉ ｎｓｔ Ｏｓｗａｌｄｏ Ｃｒｕｚ ８７（Ｓ５）：８３−９）である。好酸球 は、鉤虫、住血吸虫症、トキソカラ症、鞭虫症、フィラリア症、糞線虫症、エキ ノコックス症、胞虫症、及び旋毛虫症等の寄生虫様感染症を患っているヒトにお いて大量に作り出される。 多数の好酸球は、心臓、肺、中枢神経系、静脈洞、及びアレルギー反応が一般 に起こる皮膚のような組織にも集まる。好酸球は好酸性走化性因子、血小板活性 化因子、補体５ａ、またはアレルギー反応の際にマスト細胞及び好塩基球から放 出されるＩＬ−５によって炎症または浸潤部位に化学遊走される。好酸球は、マ スト細胞及び好塩基球によって放出されるヒスタミン及びアナフィラキシー（ロ イコトリエンの混合物）の緩慢反応物質を中和し、マスト細胞の脱顆粒を防止す る好酸球由来阻害剤を酸性し、かつ抗原−抗体複合体を貪食細胞に食べさせるが 、これら全てが過感受性反応をダウンレギュレートする。 好酸球増加症、即ち血液１μｌ当たり５００個以上の好酸球が生ずるのは、一 般にアレルギー、アレルギー性鼻炎、喘息及びアスピリン、サルファ剤及びペニ シリンのような薬物に対する反応を患う患者において一般に観測される。好酸球 増加症は、慢性関節リュウマチ及びホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、及び 肺、胃、膵臓、卵巣、子宮及び肝臓の癌腫のようなガンにも関連する。好酸球増 加症により、過度な脱顆粒による組織の損傷が生じ、これは糖質コルチコイド化 学療法で通常治療される。 好酸球、及びその形態、機能及び疾病への関連は、特にＧｕｙｔｏｎ ＡＣ （１９９１） Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ ｙ， ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ； Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ ＫＪ ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｈａｒｒｉｓｏｎ ′ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ， ｐｐ． １４３７ −１５０４； ａｎｄ Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｄ ｅｔ ａｌ （ １９８８） Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｌｅａ ａｎｄ Ｆｅｂｉｇｅｒ， Ｐｈｉ ｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ．に記載されている。 炎症若しくは疾病組織における以上の診断に関する現在の技術は、主として臨 床的な症状の不足、または人体組織または体液をヒトのホルモン、ポリペプチド または様々な代謝産物の血清学的分析を行うことに依存している。患者は疾病の 発生の初期段階では臨床的な症状を示さないことが多い。更に、血清学的分析で は、レンジが重複するまたは非常に近いところにある侵入性の疾病と遺伝学的症 候群とを常に区別できるわけではない。炎症状態の現在の方法では、様々な副作 用を持つステロイ ドや他の薬物の投与を行っている。炎症状態に関与する新規なケモカインの発見 により、より安全で程度の高い診断、治療的組成物、及び治療方法の基礎が提供 される。 発明の開示 本発明は、Ｍａｙｏクリニックで過好酸性症候群と診断された患者の血液細胞 から作られたｃＤＮＡライブラリにおいて初めに発見されたケモカインに対する 新規なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関する。この新たな遺伝子は好酸球 発現型ケモカイン、またはｅｅｃ（インサイト社クローンＮｏ．２８８２３６） としても知られており、Ｃ−Ｃケモカインファミリーの新規なメンバーであるポ リペプチドＥＥＣをコードする。本発明は、好酸球増加症のような、異常、炎症 性または疾病状態における白血球遊走に関連する疾病状態の研究、診断及び治療 にＥＥＣのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を利用することにも関連する。好 酸球増加症は、血液１μｌ当たりの好酸球の数の劇的な増加として定義される。 この症状は以下のような状態で観測される。即ち、慢性関節リュウマチ、好酸性 筋膜炎、アレルギー性脈管炎、結節性動脈周囲炎、及び肉芽腫症のような膠原血 管病、ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄性白血病、及び肺、胃、膵臓、 卵巣または子宮のガン、鉤虫、住血吸虫症、トキソカラ症、鞭虫、フィラリア症 、糞線症、エキノコックス症、胞虫症、及び旋毛虫症のような寄生虫性感染症、 レフラー症候群、レフラー心内膜炎、好酸性白血病、好酸性筋肉症、及び突発性 の過好酸性症候群及びアレルギーや喘息を患っている状態である。 本発明は、部分的には、ＥＥＣが、Ｃ−Ｃケモカインファミリーの他のメンバ ーと共有するアミノ酸相同性に、また一部分には好酸性ｃＤＮ ＡライブラリにおけるＥＥＣに対するヌクレオチド配列の存在にその基礎を置い ている。ＥＥＣに対するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、ＭＩＰ３に対す るヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に類似性を有しており、このことは１９９ ５年６月２９日に公開された国際公開番号ＷＯ９５／１７０９２の明細書、及び それに対する優先権である、１９９４年３月８日に出願された米国特許出願第０ ８／２０８，３３９号明細書に記載されている。 従って、本発明は異常な、炎症性若しくは疾病状態における白血球遊走に関与 する、新規なＣ−Ｃケモカイン、ＥＥＣの発見にその基礎を置いている。ＥＥＣ とそれをコードするヌクレオチド配列及びオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ ＰＮＡ）、そのフラグメント、部分またはアンチセンス分子は、炎症性または疾 病状態に関連するＥＥＣの早期の正確な検出及び／または定量に対する診断方法 の基礎を提供する。例えば、ここに開示するＥＥＣをコードするｅｅｃヌクレオ チド配列またはそのフラグメントを、組織診された細胞または組織または体液の ハイブラダイゼーションアッセイに用いて、炎症を有するまたは炎症を有してい る危険のある個人の異常を診断することができる。 生物学的治療におけるＥＥＣをコードするヌクレオチド配列の異常レベルは、 核酸欠失または突然変異のような染色体異常を反映しうる。従って、ＥＥＣをコ ードするヌクレオチド配列は、ＥＥＣをコードする遺伝子における欠失、突然変 異または染色体の転移のような染色体異常を診断的に検出するのに使用されうる クローブの基礎を提供する。ｅｅｃ遺伝子の発現は、このような疾病によって変 化することがあり、またはＥＥＣをコードする遺伝子の領域において染色体異常 が存在しうる。 本発明はまた、ケモカインの活性をブロックすることが望ましい炎症のような 状態において、ＥＥＣの活性、即ち白血球遊走をブロックする のに使用されうるｅｅｃアンチセンス分子またはＥＥＣアンタゴニストを提供す る。これとは別に、白血球遊走を増加することが望ましい、急性または慢性の感 染症のような、白血球遊走を強化することが望ましい状態において、ＥＥＣの活 性を亢進するために、ｅｅｃセンス分子またはＥＥＣアゴニストを用いることが できる。 本発明はまた、インビトロまたはインバイボでのヌクレオチド配列及びアミノ 酸配列の作成のためのｅｅｃヌクレオチド配列を含む生物工学的に処理された宿 主細胞及び発現ベクターに関する。 更に、本発明は、疾病状態におけるＥＥＣタンパク質レベルを定量し診断的に 検出するのに使用されうるＥＥＣポリペプチドの阻害剤またはアンタゴニストの スクリーニングを行うため、及び抗ＥＥＣ抗体を作り出すために、ＥＥＣポリペ プチドまたはフラグメントまたは変異体を使用することにも関連している。 本発明はまた、例えば、炎症の治療においてケモカインの活性を低下させるこ とが必要な状態において、ＥＥＣアンチセンス核酸またはＥＥＣタンパク質の阻 害剤またはアンタゴニストを効果的な量だけ含む医薬品組成物にも関連する。本 発明はまた、例えば感染症において白血球遊走を亢進することが必要な治療条件 において使用するための、ＥＥＣ活性を亢進しうるＥＥＣのアゴニストまたは他 の分子を効果的な量だけ含む医薬品組成物にも関連する。 本発明は、更に、ポジティブコントロールとして使用されうる精製ＥＥＣ、及 び抗ＥＥＣ抗体を含む細胞及び組織におけるＥＥＣの検出のための診断アッセイ 及びキットを提供する。このような抗体は、溶液ベース、膜ベース、または組織 ベース技術において使用され、タンパク質の発現またはその欠失したものまたは 変異体の発現に関連する疾病状態または条件を検出することができる。 図面の簡単な説明 第１図は、好酸球発現型ケモカインのヌクレオチド配列ｅｅｃ、及び予測アミ ノ酸配列ＥＥＣを示した図である。 第２図は、ＭＩＰ−１ａ（配列番号：３）、ＭＩＰ−１ｂ（配列番号：４）、 ＭＣＰ−１（配列番号：５）、ＭＣＰ−２（配列番号：６）、ＭＣＰ−３（配列 番号：７）、ＲＡＮＴＥＳ（配列番号：８）、及び通常の配列（配列番号：９） を含む、Ｃ−ＣヒトケモカインファミリーとＥＥＣとのアミノ酸アライメントを 示した図である。第２図及び第５図に示すアライメントは、ＤＮＡＳＴＡＲソフ トウェアのマルチシーケンスアライメントプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて形成された。 第３図は、予測アミノ酸配列及び組成に基づくＥＥＣ疎水性分析を示した図で ある。 第４図は、ヒトＣ−Ｃケモカインの近縁関係樹形図である。系統樹は、ＰＡＭ ２５０残基表と共にクラスタル（Clustal）法を用いるＤＮＡＳＴＡＲソフトウ ェア系統樹プログラムにより作成された。 第５図は、ＭＩＰ−３及びＥＥＣのアミノ酸アライメントを示した図である。 発明の実施の形態 本発明は新規なＣ−Ｃケモカイン受容体ＥＥＣ、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃで超 好酸性症候群と診断された患者の血液細胞に由来するｃＤＮＡライブラリの配列 から初めに発見されたヌクレオチド配列に関連する。 本発明は、異常な、炎症または疾病状態における白血球遊走に関与する疾病状態 の研究、診断及び治療において、ここに開示されたヌクレオチド配列及びアミノ 酸配列を使用することにも関連する。上記の炎症または疾病状態の例には、慢性 関節リュウマチ、好酸性筋膜炎、アレルギー性脈管炎、結節性動脈周囲炎、及び 肉芽腫症のような膠原血管病、ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、慢性骨髄性白血 病、及び肺、胃、膵臓、卵巣または子宮のガン、鉤虫、住血吸虫症、トキソカラ 症、鞭虫、フィラリア症、糞線症、エキノコックス症、胞虫症、及び旋毛虫症の ような寄生虫性感染症、レフラー症候群、レフラー心内膜炎、好酸性白血病、好 酸性筋肉症、及び突発性の過好酸性症候群及びアレルギーや喘息がある。本発明 はまた、ＥＥＣ活性を調節する物質及び化合物を評価しスクリーニングするため に、ＥＥＣ、及びそれを発現する生物工学的処理をなされた宿主細胞を使用する ことにも関連する。 本発明は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃで過好酸性症候群と診断された４８歳の男 性患者から成分献血された末梢血液細胞から作られたｃＤＮＡライブラリにおけ る９５７６個の使用可能な配列のランダムサンプルにおいてＥＥＣをコードする ヌクレオチド配列が存在することに部分的基礎を置いている。細胞集団は、ライ ト着色により７７％以上の好酸球であると決定された。本発明は更に、第２図に 示すように、既知のＣ−ＣケモカインとＥＥＣが共有するアミノ酸相同性に基づ いている。 従って、本発明は感染症及び炎症を含む多くの疾病において見られる白血球遊 走に関与する、新規なＣ−ＣケモカインＥＥＣの同定に基礎を置いている。 本明細書において、“核酸配列”なる用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオ チドまたはポリヌクレオチド配列、及びそのフラグメントまたは部分を意味する か、あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖の何れで あれ、二本鎖または一本鎖のゲノムのまたは合成の核酸源から得られるＤＮＡま たはＲＮＡを意味する。本明細書において、“アミノ酸配列”は、ペプチドまた はタンパク質配列、若しくはその部分を意味する。本明細書において、“ｅｅｃ ”は、核酸配列を意味し、“ＥＥＣ”は、タンパク質配列を意味する。本明細書 において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、分子が、対応するオリゴヌクレオチドよ りも高いアフィニティ及び特異性を持って等補的なＤＮＡまたはＲＮＡとハイブ リッド形成可能にせしめる、ヌクレオベースを備えた中性“ペプチド様”バック ボーンを有する情報分子のクラスを意味する（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ １−８００−８９９−５８５８）。 本明細書において、ＥＥＣは、自然発生形態あるいは変異体形態の、ウシ、ヒ ツジ、ネズミ、ブタ、ウマ、及び好ましくはヒトまたは他の哺乳類種に由来する ＥＥＣであって、天然のもの、合成のもの、半合成のもの、または組み換え体の ものが包含される。 本明細書において、“自然発生”なる用語は、天然に見いだされるアミノ酸配 列を有するＥＥＣを意味し、“生物学的活性”なる用語は、免疫活性を含む、自 然発生ＥＥＣの構造的、調節または生化学的機能を有するＥＥＣを意味する。自 然発生ＥＥＣは、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質 化、及びアシル化を含む（これらに限定されない）翻訳後修飾されたポリペプチ ドに由来するＥＥＣを含む。本明細書において、“免疫学的活性”は、天然、組 み換え、または合成ＥＥＣまたはその任意のオリゴペプチドが、適切な動物また は細胞において特異的免疫反応を誘発し、特異的抗体に結合する能力として定義 される。 本明細書において、“誘導”なる用語は、ＥＥＣの化学的修飾を意味する。こ のような修飾の例としては、アルキル基、アシル基、またはア ミノ基による水素の置換がある。ＥＥＣポリペプチド誘導体は、自然発生ＥＥＣ の生物学的特性を必ず維持している。ＥＥ誘導体は、ユビキチン化、ラベリング （例えば放射性核種や、様々な酵素修飾による標識付け）、ペジレーション（ポ リエチレングリコールによる誘導体化）のような化学的修飾、若しくは例えばオ ルギチンのような通常はヒトタンパク質において自然発生しないアミノ酸の化学 合成による挿入、置換によって得られた自然発生ＥＥＣに由来するＥＥＣポリペ プチドを意味する。 本明細書において、“精製”なる用語は、その天然の環境から取り出され、そ れらが通常結合している少なくとも１つの他の物質から単離または分離された核 酸またはアミノ酸配列の分子を意味する。 本明細書において、“組換え変異体ＥＥＣ”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を 用いて生成されるアミノ酸の挿入、除去、及び／または置換により自然発生ＥＥ Ｃとは異なるものとなった任意のポリペプチドを意味する。興味の対象となる活 性、細胞接着性、走化性を損なわずに置換、付加、あるいは除去され得るアミノ 酸残基を決定するためには、特定のＥＥＣの配列と相同体のサイトカインの配列 とを比較し、相同性の高い領域でのアミノ酸配列の変化の数を最小にすればよい 。 アミノ酸の“置換”では、例えばロイシンからイソロイシンまたはバリンへの 置換、アスピレートからグルタメートへの置換、スレオニンからセリンへの置換 、即ち保存的アミノ酸置換のような１個のアミノ酸が構造的及び／または化学的 特性がそれに類似した他の１個のアミノ酸で置換されるのが好ましい。アミノ酸 の“挿入”または“除去”は、通常１〜５個のアミノ酸の範囲で行われる。組換 えＤＮＡ技術を用いてＥＥＣのアミノ酸の挿入、除去、または置換を体系的に行 い、得られた組換え変異体の活性を検定することにより、許容される変異体が実 験的に決定され得る。 必要ならば、“シグナル配列またはリーダー配列”を細胞膜を通してポリペプ チドに向けることができる。このような配列は、本発明のポリペプチド上に自然 に存在するか、あるいは組換えＤＮＡ技術により異種タンパク質源から得られる 。 本明細書において、ＥＥＣ“フラグメント（断片）”、“部分”、または“セ グメント”なる用語は、生物学的及び／または免疫学的活性を示すに十分な長さ を有するアミノ酸の伸展（ストレッチ）を意味する。好適実施例では、このＥＥ Ｃ断片は少なくとも約５個のアミノ酸、少なくとも約７個のアミノ酸、または少 なくとも約８〜１３個のアミノ酸を含み、別の実施例では約１７個またはそれ以 上のアミノ酸を含む。 本明細書において、“オリゴヌクレオチド”またはポリヌクレオチド“フラグ メント”、“部分”、または“セグメント”なる用語は、同一の、若しくは近縁 関係にある核酸を同定、若しくは増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）法や、当業者には周知の様々なハイブリッド形成法におけるプライマーとして 使用するのに十分な長さを有するＥＥＣをコードする核酸の任意のストレッチを 意味する。 本発明には、ＥＥＣをコードする組換え核酸分子で形質転換された宿主細胞、 ベクター、及び天然または組換えポリペプチド源から得られた精製ＥＥＣポリペ プチドが含まれる。ＥＥＣポリペプチドを単離するための様々な方法は、当業者 の周知となっている。例えばこのようなポリペプチドの精製のために、本発明の 提供する抗体を用いたイムノアフィニティクロマトグラフィーを利用することが できる。タンパク質精製のための他の様々な方法は、例えば、“Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｒ Ｍ （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏ ｌ １８２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”及び“ Ｓｃｏｐｅｓ Ｒ （１９８２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ． Ｓｐｒｉｎ ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹＣ”に記載されており、これらの文献を本明細書 と共に参照されたい。 本明細書において、“組換え”なる用語は、組換えＤＮＡ技術を用いて調製さ れるＥＥＣをコードするポリヌクレオチドを意味する。ＥＥＣをコードするＤＮ Ａも対立形質の変異体または組換え変異体、及びその突然変異体を含み得る。 本明細書において、“プローブ”または“核酸プローブ”または“オリゴヌク レオチドプローブ”なる用語は、所望の標的配列とハイブリッド形成し得るｅｅ ｃの部分、フラグメント、またはセグメントを意味する。分子生物学における従 来の技術を用いることにより、ＥＥＣをコードするｃＤＮＡまたは内生核酸を検 出し、増幅し、または定量するのにこのプローブが使用され得る。プローブの長 さは様々であり、好ましくは、約１０から最大約数１００ヌクレオチドの長さを 有するものである。当業者には理解されようが、ハイブリッド形成条件及びプロ ーブの設計は、使用目的に応じて変化する。例えば、ＰＣＲでの使用を目的とし たプローブは、長さが１５〜６０ヌクレオチドであり、縮重プローブのプールの 一部分であり得る。即ちＰＣＲ用プローブは、ヌクレオチドのミスマッチに対す る許容性を有するが、未知の配列に対する結合に適用するオリゴヌクレオチドで ある得るのに対して、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダ イゼーション用のプローブは、長さが数１００ヌクレオチドの、１つの特定のヌ クレオチド配列である得る。核酸プローブは、約６ｋｂより少ない塩基対数の、 通常は約１ｋｂ未満の配列の部分からなり得る。本発明のオリゴヌクレオチド及 び核酸プローブは、細胞または組織内にＥＥＣをコードする核酸が存在するか否 かを判定するため、または“Ｗａｌｓｈ ＰＳ ｅｔ ａｌ（１９９２） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ． １：２４１−２５０”に記載のように染 色体ＤＮＡから類似した核酸配列を分離するのに使用され得る。 従って、ｅｅｃを特異的に検出するためのプローブで好適なものは、配列番号 ：１の配列の非保存ヌクレオチド領域から得られるポリヌクレオチドまたはオリ ゴヌクレオチドフラグメントであり得る。本明細書において、“非保存的ヌクレ オチド領域”なる用語は、配列番号：１に一義的に存在し、かつＣ−Ｃケモカイ ンのファミリーにおける保存される領域を含まないヌクレオチド領域を意味する 。プローブは一本鎖または二本鎖で、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成及びＥＬ ＩＳＡ（固相酵素免疫検定法）のような技術を含む膜ベースのハイブリダイゼー ション、溶液、細胞、組織において特異性を有し得る。ここに開示する実施例で は、ＥＥＣをコードするヌクレオチド配列の検出のためのヌクレオチドプローブ は、配列番号：２のアミノ酸残基位置２２〜６３のアミノ酸残基をコードするヌ クレオチド配列に由来する。 本発明の核酸プローブは、自然発生核酸、組換え一本鎖または二本鎖核酸から 誘導されるか、若しくは化学的に合成され得る。プローブの標識化は、ニックト ランスレーション法、クレノウフィルイン反応法、ＰＣＲ法、または当分野にお いて周知の他の方法を用いて行われ得る。本発明のプローブを調製し、標識する 方法は、“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊｅｔ ａｌ （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”または“Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ ｙ ＆ Ｓｏｎｓ”に詳しく述べられており、これらの文献を本明細書と共に参 照されたい。 別の形態として、本発明のポリペプチドをコードする組換え変異体は、当業者 に周知の技術を用いて、遺伝暗号の“重複性”を利用することにより合成、また は同定され得る。様々な切断部位を作り出すサイレント変化のような、様々なコ ドン置換を導入することで、プラスミドやウィルスベクターへのクローニング、 または特定の原核細胞系または真核細胞系における発現を最適化することができ る。また、突然変異を導入することによって、ポリペプチドの特性を変え、リガ ンド結合親和力、鎖間親和力、またはポリペプチド変性またはターンオーバー速 度を変えることもできる。発明の詳細な説明 ＥＥＣをコードする配列 ヒトｅｅｃのヌクレオチド配列（配列番号：１）は第１図に示されている。Ｅ ＥＣのコード領域は、過好酸性症候群と診断された患者の血液細胞から作られた ｃＤＮＡライブラリ（インサイト社ｃＤＮＡライブラリＥＯＳＩＨＥＴ０２）内 で同定された。ここでは約９５７６個の使用可能な配列において７回見いだされ た。ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６： ２９０−３００； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４ １０）で、ＥＯＳＩＨＥＴ０２ライブラリのｃＤＮＡとＧｅｎＢａｎｋの霊長類 データベースとを比較して、サイトカインエフェクタ（ＧＩＧ３４７５０）に対 するヒト４６４．２メッセンジャーＲＮＡと完全に一致しないものとしてインサ イト社クローンＮｏ． ２８８２３６を同定した。ＥＥＣをコードするヌクレオ チド配列は、子宮組織から作られたｃＤＮＡライブラリ（インサイト社ＵＴＲＳ ＮＯＴ０１）の約２５５ ３の配列においても１回見いだされた。 ＥＥＣは好酸球において発現されることから、核酸（ｅｅｃ）、ポリペプチド （ＥＥＣ）及びＥＥＣに対する抗体は、好酸球の数及び機能に影響を与える炎症 または疾病が生じた場合のケモカイン産生に基づく診断アッセイにおいて有用で ある。ＥＥＣの過剰な発現はまた、単球、マクロファージ、好酸球、Ｔ細胞及び ／またはケモカインに反応する他の細胞を活性化して、最良のプロテアーゼの産 生及び組織損傷または破壊をもたらしうる他の細胞の産生をもたらしうる。従っ て、ＥＥＣの過剰発現に対する診断テストにより、好酸球増加症、即ちウィルス 、バクテリア、カビ、または寄生虫感染、外傷による機械的な障害、アレルギー や喘息のような遺伝病、白血病やリンパ腫のような浸潤病、または好酸球の数の 変化を伴う他の生理学的及び病理学的問題によって生ずる異常状態の診断及び適 切な治療を促進しうる。 ＤＮＡ配列決定の方法は従来より周知であり、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノー フラグメントＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉ ｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ ＣＮ）、耐熱性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅ ｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ ＩＬ）のような酵素を用いるか、若しくはＥＬ ＯＮＧＡＳＥ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ ＭＤ）のような校正エキソヌクレアーゼの組合せを用いる。目的のＤ ＮＡ鋳型にアニーリングされたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡを延展 する方法は、一本鎖鋳型用の方法と二本鎖鋳型用の方法の双方が開発された。チ ェーンターミネーション反応の生成物は、電気泳動法を用いて分離され、それら に一体に組み込まれた標識された前駆物質を介して検出された。一体化された反 応調整、配列決定、及び分析の最近の進歩に より、一日当たりに決定されうる配列数が伸びた。好ましくは、このプロセスは 、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒ ｅｎｏ ＮＶ）、Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２０ ０； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ Ｃ ａｔａｌｙｓｔ ８００、３７７及び３７３ＤＮＡシーケンサ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ ＣＮ）のような機械により自動化される。 ＥＥＣをコードするポリヌクレオチドが見いだされる特定のｃＤＮＡライブラ リの品質は、ｃＤＮＡのパイロットスケール分析を実行し、クローン含有ベクタ ー、ラムダまたはＥ． ｃｏｌｉＤＮＡ、ミトコンドリアまたは反復ＤＮＡ、及 び法的データベースに対する正確な一致または相同性一致を有するクローンをチ ェックすることにより決定されうる。 ＥＥＣをコードするヌクレオチド配列（またはその相補的配列）は、分子生物 学の分野における当業者には周知の技術において数多くの用途を有する。これら の技術には、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲ用オリゴマ ーの構築における使用、染色体及び遺伝子マッピングにおける使用、ＥＥＣの組 換え体生成における使用、及びアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの、またはこれ らの化学的類似体等の生成における使用が含まれる。ここに開示するＥＥＣをコ ードするヌクレオチドの使用方法は、周知の技術の一例であり、当業者に周知の 何らかの技術にその使用を限定しようとするものではない。更に、未だ開発され ていない分子生物学的技術であっても、それが例えばトリプレット遺伝暗号及び 特異的な塩基対相互作用のような既知のポリヌクレオチド配列の特性に基づく技 術である限り、ここに開示するヌクレオチド配列を使用することができる。 遺伝暗号の縮重（degeneracy）の結果、そのヌクレオチド配列がＥＥ Ｃをコードするもので限り、既知のヌクレオチド配列及び自然発生遺伝子のヌク レオチド配列に対する相同性を有する最小限のヌクレオチド配列を有するヌクレ オチド配列を含む、様々なＥＥＣをコードするヌクレオチド配列が産生され得る 、ということは当業者には理解されよう。本発明は、より具体的には可能なコド ン選択に基づいて組合せを選択することにより生成され得る全ての可能なヌクレ オチド配列を、その範囲に含んでいる。これらの組合せは、自然発生ＥＥＣのヌ クレオチド配列に対して適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基づ いて作られる。また、このような全ての変異体は、具体的にここで開示されたも のと考えられたい。 ＥＥＣ及び／またはＥＥＣ変異体をコードするヌクレオチド配列は、厳格な条 件の下で自然発生ＥＥＣ遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なも のであるのが好ましいが、実質的に異なるコドン使用頻度をプロセシングするＥ ＥＣまたはＥＥＣ誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益で あり得る。コドンの選択は、特定の原核細胞または真核細胞の発現宿主における ペプチドの発現速度を高めるように選択することができ、このときこの発現速度 は、その宿主における特定のコドンの使用頻度に基づいて決まる。本発明のＥＥ Ｃ及び／またはＥＥＣ誘導体をコードするヌクレオチド配列を、このコードされ たアミノ酸配列を変えることなく実質的に変化させる他の理由は、より望ましい 特性、例えば自然発生ヌクレオチド配列から産生されたものより長い半減期を有 するＲＮＡ転写物を作り出すためである。 ＥＥＣをコードするヌクレオチド配列は、完全に確立された組換えＤＮＡ技術 （“Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｄ Ｅｄ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ”参照）により様々な他のヌクレオチド配列と結合してもよい。ｅｅｃに 結合するのに有用なヌクレオチド配列には、例えば従来より周知のプラスミド、 コスミド、λファージ誘導体、ファージミド等のクローニングベクターの組合せ が含まれる。興味の対象であるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プ ローブ産生ベクターシークエンシングベクター等が含まれる。一般に、興味の対 象となるベクターは、少なくとも１つの生物において複製起点機能を発揮する便 利な制限エンドヌクレアーゼ検知サイト、及び宿主細胞用として選択可能なマー カーを含み得る。 本発明の別の実施例では、ＥＥＣをコードする自然発生ヌクレオチド配列とハ イブリッド形成可能なｅｅｃ特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが提供 される。ＥＥＣをコードする配列の検知のためのこのようなプローブは、配列番 号：１の非保存領域から得られるヌクレオチドフラグメントを含むのが好ましい 。近縁関係にあるケモカインをコードする配列の検出のためのこのようなプロー ブは、Ｃ−Ｃをコードする配列のヌクレオチドの少なくとも５０％を含むのが好 ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：１のヌクレオ チド配列、または自然発生ｅｅｃのプロモータ、エンハンサー要素、及びイント ロンを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプ ローブは、様々なリポーターグループにより標識され得るが、このリポーターグ ループには、³²Ｐまたは³⁵Ｓのような放射性核種、若しくはアルカリホスファタ ーゼのような酵素標識が含まれ、これらはアビジン／ビオチン結合系を介してプ ローブに結合する。この他当業者に周知の技術を用いてプローブを標識すること ができる。 米国特許第４，９６５，１８８号、第４，６８３，１９５号、及び第４，８０ ０，１９５号明細書に記載されているようなＰＣＲ法の実施に おいて、ＥＥＣをコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドの別 の使用方法がある。このようなＰＣＲにおいて使用されるプローブは、組換えに より得られたものであるか、化学的に合成されたものであるか、若しくは両者の 混合であり得、また、診断的な使用に供される分散したヌクレオチドまたは近縁 関係にあるゲノム配列の同定に用いられる可能な変性配列のプールを含み得る。 ｅｅｃに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを産生するための他 の方法には、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクターへの、ＥＥＣ及びＥＥＣ 誘導体をコードする核酸配列のクローニングが含まれる。このようなベクターは 従来より周知であり、または市販されており、例えばＴ７またはＳＰ６ ＲＮＡ ポリメラーゼのような適当なＲＮＡポリメラーゼ及び適当な放射性の標識をなさ れたヌクレオチドを添加することによりｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合 成するのに使用することができる。 現在完全に化学合成によりＥＥＣ及びＥＥＣ誘導体をコードするＤＮＡ配列、 またはその部分を産生することが可能であり、合成の後、従来より周知の試薬、 ベクター、及び細胞を用いて様々な市販のＤＮＡベクターに挿入することができ る。更に化学合成を用いて、ｅｅｃポリヌクレオチド配列若しくはその部分に突 然変異を起こさせることも可能である。 このヌクレオチド配列を用いて、ＥＥＣの発現レベルの異常に関連する炎症及 び疾病の検出のためのアッセイを構築することができる。このヌクレオチド配列 は、従来より周知の方法で標識した上で、ハイブリッド形成条件の下で患者の体 液または組織の試料に添加することができる。インキュベーション時間の経過後 、ヌクレオチドが酵素で標識されていた場合には、所望に応じて染料（または他 の展開剤を必要とする標識） を含有する適合性の液体で試料が洗浄される。この適合性の液体を洗い流した後 、染料を定量し、標準値と比較する。染料の量が著しく多い場合には、このヌク レオチド配列は試料とハイブリッド形成したことになる。ｅｅｃが異常なレベル で存在している場合には、このアッセイにより炎症及び／または疾病の存在が確 認されたことになる。 ｅｅｃのヌクレオチド配列を用いて、その遺伝子のマッピングのためのハイブ リダイゼーションプローブを構築することができる。ここに開示するヌクレオチ ド配列の染色体及び染色体の特定の領域へのマッピングを、周知の遺伝子及び／ または染色体マッピング技術を用いて行うこともできる。このような技術には、 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対するリンケ ージ分析、既知の染色体に対して特異的なライブラリまたはフローソートされた 染色体調合物を用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が含まれる。染 色体延展（chromosome spread）の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション 技術については、他の文献、即ち“Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ （１９８８） Ｈ ｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹＣ”に記載さ れている。 染色体調合物の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及び他の物理的染 色体マッピング技術は、追加的な遺伝子地図データと関連付けられ得る。遺伝子 地図データの例としては、“Ｏ’Ｂｒｉｅｎ （１９９０） Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｐｓ： Ｌｏｃｕｓ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｂｏｏｋ ５； Ｈｕｍａｎ Ｍａｐｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ”がある。物理的染色体地図上でのｅｅ ｃをコードする遺伝子の位置と特定の疾病（若しくは特定の疾病に対する素因） との間の 相関関係は、この遺伝病に関連するＤＮＡの領域の範囲を特定するための助けと なる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者の遺伝子配列と、キャリアま たは遺伝病の保因者の遺伝子配列との相違を検出することができる。ＥＥＣの発現 ＥＥＣをコードするヌクレオチド配列を用いて、周知の組換えＤＮＡ技術を利 用して精製ＥＥＣを作り出すことができる。遺伝子を単離した後、その遺伝子を 発現させる方法を記載した文献は数多くあるが、その例としては、“Ｇｏｅｄｄ ｅｌ （１９９０） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． Ｖｏｌ １８５， Ａ ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ”がある。ＥＥＣは、原核 細胞または真核細胞の何れかの様々な宿主細胞内において発現され得る。宿主細 胞は、ｅｅｃヌクレオチド配列が内生である種と同一の種、あるいは異なる種の 何れからでも得ることができる。組換えＤＮＡ技術によってＥＥＣを産生するこ との利点には、精製用として高濃度に濃縮されたタンパク質源が得られること、 及び精製のための簡単な手順が利用できるようになることがある。ｅｅｃの発現 は、ｃＤＮＡを適当な発現ベクターにサブクローニングし、このベクターを適切 な発現宿主に感染させることによりなされ得る。実施例７に記載されているよう に、ＥＥＣの発現及び精製のための好適な発現ベクターは、ＥＥＣを含む融合タ ンパク質の発現用として使用でき、かつ６個のヒスチジン残基、次いでチオレド キシン及びエンテロキナーゼ切断サイトをコードする核酸を含むものである。ヒ スチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ ー“Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３ ：２６３：２８１”に記載）上での精製を促進し、一方エンテロキナーゼ切断サ イトは、融合タンパク質からのケモカインの精製のための手段となる。組織ライ ブラリーの作成のために従来より用いられてきたクローニングベクターによって も、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｅｅｃ配列を発現させられる。 ｃＤＮＡクローン挿入断片は、必ずランダムプロセスにより産生されることか ら、含まれたｃＤＮＡが適切な翻訳のための正しい読み枠に存在する可能性は３ つに１つである。ｃＤＮＡが適切な読み枠に存在しない場合には、ｉｎ ｖｉｔ ｒｏ突然変異を含む周知の方法による適切な数の塩基の除去または挿入や、エキ ソヌクレアーゼＩＩＩまたは大豆ヌクレアーゼを用いた消化、若しくはオリゴヌ クレオチドリンカーの混入により、正しい読み枠に存在するものを得ることがで きる。 ｅｅｃのｃＤＮＡは、特定の宿主におけるタンパク質源の発現のために有用で あることが知られているベクターにシャトルされ得る。クローニングサイトと共 に、目標ｃＤＮＡ（２５塩基）の両端における伸展部分とハイブリッドを形成す るのに十分なＤＮＡのセグメントを含むオリゴヌクレオチドアンプリマーは、標 準的な方法で化学的に合成され得る。次いで、これらのプライマーを用いて、Ｐ ＣＲ法により所望の遺伝子セグメントを増幅することができる。得られた新たな 遺伝子セグンメントは、標準的な条件の下で適当な制限酵素で切断し、ゲル電気 泳動法により単離することができる。別の形態として、適当な制限酵素を用いて ヌクレオチド配列を切断し、欠失した遺伝子セグメントに化学的に合成されたオ リゴヌクレオチドを埋め込むことにより、類似の遺伝子セグメントを産生するこ とができる。更に、複数の遺伝子から得られた配列をコードするセグメントを相 互に結合し、適当なベタターにクローニングして、組換え配列の発現を最適化す ることができる。 このようなキメラ分子用の適切な発現宿主には、チャイニーズハムスターの卵 巣及びヒト２９３細胞のような哺乳類の細胞、Ｓｆ９細胞のような昆虫の細胞、 サッカロミセスセルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のような酵母菌細胞、 及びＥ．ｃｏｌｉのような細菌が含まれるが、これらに限定されるものではない 。このような細胞系のそれぞれに対して有用な各発現ベクターも、細菌内での増 殖を可能にする複製起点、及びβ−ラクタマーゼ抗抗生物質遺伝子のような細菌 内での選択を可能にする選択可能なマーカーを含み得る。更に、このベクターは 、感染された真核宿主細胞群における選択を可能にする、ネオマイシンホスホト ランスフェラーゼ遺伝子のような第２の選択可能なマーカーを有し得る。真核細 胞の発現宿主において使用するためのベクターは、３′ポリアデニル化配列のよ うなＲＮＡプロセシング要素を、それが興味の対象であるｃＤＮＡに含まれてい ない場合には必要とすることがある。 更に、ベクターは遺伝子発現を増加させるプロモータまたはエンハンサーを含 み得る。このようなプロモータは宿主特異的であって、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０、ま たはＣＨＯ細胞用のメタロチオネインプロモータや、細菌宿主用のｔｒｐ、ｌａ ｃ、ｔａｃ、またはＴ７プロモータや、酵母菌用のα因子、アルコール酸化酵素 、またはＰＧＨプロモータが含まれる。ＲＳＶエンハンサーのような転写エンハ ンサーは、哺乳類の宿主細胞において使用され得る。ひとたび標準的な培養法に より均一な組換え細胞の培養物が得られると、組換え体により産生されたＥＥＣ が大量に条件培地から得られ、当技術分野において周知のクロマトグラフィー法 により分析できることになる。 ＥＥＣをコードするＤＮＡによって形質転換された細胞は、ＥＥＣの発現及び 細胞培地からのタンパク質の回収に適切な条件の下で培養され得る。組換え細胞 により産生されたＥＥＣは、使用される特定の遺伝子 構造に応じて、分泌されるか、あるいは細胞内に保持され得る。一般に、組換え タンパク質は、分泌される形態で準備しておくのがより便利である。精製のステ ップは、使用される産生プロセスの性質及び産生される特定のＥＥＣの性質に基 づいて決まる。 ＥＥＣは、タンパク質精製を容易にするべく添加された１または２以上の追加 のポリペプチドを有するキメラタンパク質として発現され得る。このような精製 促進ドメイン（分子内領域）には、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジ ン−トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド固定化免疫グロ ブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸展／ア フィニティ精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗ Ａ）において利用されるドメイン等があるが、これらに限定されるものではない 。切断可能なリンカー配列（例えばＸＡ因子またはエンテロキナーゼ）が精製ド メインと、ｅｅｃ配列との間に含まれていると、ＥＥＣの発現を促進するのに役 立つ。 組換え体による産生に加えて、固相技術を用いた直接のペプチド合成によりＥ ＥＣフラグメントを産生することもできる。（“Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ （１９６９） Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ； Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ Ｒ （１９６３）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ８５：２１４９ −２１５４”参照）。ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成は、手作業、あるいは機 械により自動的に行うことができる。自動的な合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造業者の指示に従って 用いることにより行うことができる。ＥＥＣの様々なフラグ メントを個別に化学合成し、化学的な方法により結合することによってＥＥＣの 全体を産生することもできる。ＥＥＣ 抗体 抗体の誘発において使用するためのＥＥＣは、生物学的活性を有している必要 はないが、免疫活性を有していなければならない。ＥＥＣ特異的抗体の誘発にお いて使用するためのペプチドは、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個 のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。このペプチドは、タンパク質の一部分 を模しており、ＥＥＣのような自然発生分子の全アミノ酸配列を含んでいてもよ い。ＥＥＣのアミノ酸配列の短いストレッチは、ヒザラガイヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）や抗体産生に使用されるキメラ分子のような他のタンパク質のストレッチと 融合され得る。 ＥＥＣに対して特異的な抗体は、適当な動物にＥＥＣ配列を接種することによ り産生され得る。抗体が、自然発生または組換えタンパク質の少なくとも一部分 に対して産生され、そのタンパク質の全体または一部分に結合するならば、その 抗体はＥＥＣに対して特異的であると言える。抗体の誘発は、動物への注射によ り生ずる免疫反応の刺激作用によるもののみならず、合成抗体、または組換え免 疫グロブリンライブラリ（“Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ （１９８９） ＰＮ ＡＳ ８６：３８３３−３８３７またはＨｕｓｅ ｅｔ ａｌ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１２７５−１２８１”参照）またはリンパ球集団のｉ ｎ ｖｉｔｒｏ刺激作用によっても起こる。現在の技術（“Ｗｉｎｔｅｒ ａｎ ｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９ ”）では、抗体形成の原理に基づき、高度に特異的に結合する多数の試薬を提供 することができる。このような技術は、ＥＥＣに特異的に結合し得る分子の産生 に容易く適用することができる。 ＥＥＣに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を調製するための 方法は、様々なものが当業者の知るところであろう。その方法の１つは、逆相Ｈ ＰＬＣ分離から変性ＥＥＣを得て、これを用いて当業者に周知の技術でマウスま たはウサギを免疫化する方法である。マウスの免疫化には変性ＥＥＣ約１００μ ｇで十分であり、ウサギの免疫化には最大１ｍｇを用いることができる。マウス ハイブリドーマを同定するために、変性タンパク質を放射性要素で標識し、これ を用いて潜在性ネズミＢ細胞ハイブリドーマをスクリーニングして、抗体を産生 するものを分離することができる。この方法では、必要なタンパタ質の量はわず かであり、数１０００のクローンを標識しスクリーニングするためには２０ｍｇ で十分である。 別の方法では、ＥＥＣのアミノ酸配列はｃＤＮＡ配列から推論されるように、 その分析により免疫抗原性の高い領域が決定される。これらの領域を含むポリペ プチドを合成し、適切な免疫化プロトコルで使用して抗体を産生する。適切なエ ピトープを選択するための分析方法は、“Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ （１９８９， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ） ”に記載されている。免疫化のための最適なアミノ酸配列は、通常、そのタンパ ク質が自然のコンフォーメーションをなしているときに外部環境にさらされやす いポリペプチドのＣ末端、Ｎ末端、及びその間に介在する親水性領域に存在する 。 典型的には、約１５残基の長さを有する選択されたポリペプチドは、ｆｍｏｃ 化学を用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎ ｔｈｅｓｉｚｅｒ ｍｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成され、Ｍ−マレイミドベ ンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ ステル（ＭＢＳ；上述のＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ参照）と反応させる ことによりヒザラガイヘモシアニンまたはキーホールリンペットヘモシアニン（ ＫＬＨ；Ｓｉｇｍａ）と結合される。必要ならば、ＫＬＨに結合できるようにペ プチドのＮ末端にシステインを挿入してもよく、動物は、フロイント完全アジュ バントによりペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫化される。得られた抗血清は、ペプ チドをプラスチックに結合し、１％のＢＳＡでブロックし、抗血清と反応させ、 その後洗浄し、（放射性または蛍光性の）標識をなされたアフィニティ精製され た特異的ヒツジ抗ウサギＩｇＧと反応させることにより、抗ペプチド活性をテス トすることができる。 ハイブリドーマも標準的な技術を用いて調製される。興味の対象となるハイブ リドーマは、標識化ＥＥＣでスクリーニングし、所望の特異性を有するモノクロ ーナル抗体を産生するそれらの融合体を同定することにより検出される。例えば 、典型的なプロトコルでは、プレート（ＦＡＳＴ， Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉ ｎｓｏｎ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）の穴が、アフィニティ精製された特 異的ウサギ抗マウス（または適当な抗種Ｉｇ）抗体約１０ｍｇ／ｍｌでコーティ ングされる。コーティングされた穴は１％のＢＳＡでブロックされ、洗浄されて 、ハイブリドーマの上清液にさらされる。インキュベーションの後、この穴は約 １ｍｇ／ｍｌの濃度の標識化ＥＥＣにさらされる。抗体を産生するクローンは、 上述のような条件の下で検出可能な量の標識化ＥＥＣと結合する。このようなク ローンは、増殖された上で、限界希釈（１細胞／３穴）で２サイクルのクローニ ングをなされる。クローニングされたハイブリドーマは、プリスタン処置を受け たマウスに注射され、マウスの復水が作り出される。モノクローナル抗体は、プ ロテインＡを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、マウスの復水から 精製される。少 なくとも１０⁸Ｍ^-1、好ましくは１０⁹〜１０¹⁰以上の親和力を有するモノクロー ナル抗体は、典型的には、“Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ”または“Ｇ ｏｄｉｎｇ （１９８６） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， ２ｄ Ｅｄ． Ａｃａｄ ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ”に記載の標準的な手順に より作られる。これらの文献を本明細書と共に参照されたい。ＥＥＣのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の使用 本発明の別の実施例では、好酸球増加症や好酸球数の増加を伴う炎症または疾 病を治療するために、ＥＥＣ特異的抗体、阻害剤、受容体、またはこれらの類似 体を生理活性剤として使用する。上記の疾病の例には、好酸球増加症、即ちウィ ルス、バクテリア、カビ、または寄生虫感染、外傷による機械的な障害、アレル ギーや喘息のような遺伝病、白血病やリンパ腫のような浸潤病、または好酸球の 数の変化を伴う他の生理学的及び病理学的問題によって変化を伴う他の生理学的 及び病理学的問題が含まれるが、これらに限定されるものではない。 ＥＥＣの正しい完全なｃＤＮＡ配列を知ることにより、遺伝子機能の調査での アンチセンス技術に、これを適用することが可能になる。ＥＥＣをコードするポ リヌクレオチド配列のアンチセンス鎖を含むゲノムのまたはｃＤＮＡのフラグメ ントをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いて、特定のタンパク質の発 現を阻害することができる。このような技術は周知であり、ヌクレオチド配列の 様々な部位に付くプローブをデザインすることができる。細胞または実験動物の 全体をこのようなアンチセンス配列で処理することより、興味の対象である遺伝 子の機能 を効果的に遮断することができる。多くの場合、細胞レベル、組織レベル、若し くは生物体全体のレベルでの挙動（例えば死亡率、分化した機能の消失、形態の 変化等）を観察することにより、その遺伝子の機能を確認することができる。 開放された読み枠の転写を妨害するように構築された配列を用いることに加え て、イントロン領域、プロモータ／エンハンサー要素、またはトランス作用調節 遺伝子に対するアンチセンス配列をデザインすることにより、遺伝子発現を修飾 することかできる。同様に、“三重らせん体（トリプルヘリックス）”塩基対と して知られるＨｏｇｅｂｏｏｍ塩基対を用いて阻害を達成することができる。 ＥＥＣの抗体、阻害剤、アンチセンス分子、受容体、若しくは類似体（過剰な ケモカイン産生の治療薬、以下略して“ＴＥＣ”と称する）は、治療的に投与さ れたときそれぞれ異なる効果を与え得る。このＴＥＣは、無毒性で、不活性で薬 化学的に適格な水性担体媒質でありそのｐＨは約５〜８、より好適には６〜８の である。但し、このｐＨ値は、照合される抗体、阻害剤、受容体、または類似体 の特性や治療される病状に応じて変わってくる。ＴＥＣの特性には、分子の可溶 性、半減期、及び抗原性／免疫抗原性が含まれ、効果的な担体を決定するのに役 立ち得る。天然ヒトタンパク質はＴＥＣとして好適であるが、薬物スクリーニン グによって得られた有機分子も特定の状態の下では同様に効果的であり得る。 ＴＥＣは、局所塗布用クリームまたはゲル、粘膜透過性スプレーまたはエーロ ゾル、皮膚透過性パッチまたは包帯、注射可能な静脈内または洗浄調合物及び経 口投与液若しくは錠剤を含む周知の投与経路によって与えられ得るが、投与の仕 方は以上挙げたものに限定されない。特定の配合、正確な投与量、及び投与経路 は、病院所属医師により決定され、それぞれの状況に応じて変わってくる。 このような決定は、治療を受ける条件、投与されるＴＥＣ、及び特定のＴＥＣ の薬動力学的プロフィールのような様々な変量を考慮してなされる。考慮され得 る他の因子には、病状、患者の年齢、体重、性別、食事、投与の回数、薬物の組 合せ、反応感受性及び治療に対する耐性／反応が含まれる。長時間作用するＴＥ Ｃ調剤の投与の頻度は、特定のＴＥＣの半減期及び消失速度に応じて、３日から ４日に１回、１週間に１回、または２週間に１回であり得る。 通常の投与量は、投与経路に応じて０．１〜１００，０００μｇ、最大１ｇの 間で変化し得る。ＴＥＣの特定の投与量に関しての説明は以下の文献、即ち米国 特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、または第５，２２５， ２１２号明細書に記載されている。ＴＥＣの種類に応じて効果的な配合も変わり 、また好酸球を標的にする投与と、他の器官または組織を標的にする場合では、 投与方法も異なってくることが予測される。 単球、マクロファージ、好塩基球、好酸球または他の白血球を活性化する好酸 球の状態または疾病は永久損傷を促進させるが、これはＴＥＣで治療されうる。 好酸球増加症は、上述のようなテストにより特異的に診断されうるが、このよう なテストは、ウィルス、バクテリア、カビまたは寄生虫の感染の疑いがある場合 、外傷による機械的損傷の疑いがある場合、アレルギー、喘息、及び慢性関節リ ュウマチのような遺伝病の疑いがある場合、上述の癌腫、白血病、及びリンパ腫 のような癌の疑いがある場合、または好酸球数の変化を伴う生理学的または病理 学的問題が生じている疑いがある場合に行われるべきである。 上述の全ての文献及び特許明細書は、本明細書と一体として参照されたい。表 記の発明は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。実際、分 子生物学または関連分野の当業者にとって明らかな本 発明の実行のための上述の事項の様々な変更は、請求の範囲に記載の本発明の範 囲を逸脱しないものであることが企図されている。 以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するもの ではない。 産業的応用性 １．ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡライブラリの構築 ｅｅｃ配列は、ヒト好酸球ライブラリの配列において同定された。このライブ ラリのために使用された好酸球は、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅ ｒ ＭＮ）において過好酸性症候群と診断された５６歳の白人男性の患者から成 分献血により得られた。この細胞はリン酸緩衝液食塩水で２度洗浄され、グアニ ジウムイソシアネートを含む緩衝液の中に即座に溶解された。この溶液は、Ｃｓ Ｃｌクッションで遠心分離され、エタノール沈殿をなされて、３７℃で１５分間 処理された水及びＤナーゼに再懸濁された。ＲＮＡは、フェノールクロロホルム で抽出され、エタノール沈殿処理された。ポリアデニル化メッセージは、Ｑｉａ ｇｅｎ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ） を用いて単離され、ｃＤＮＡライブラリはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（１１０１１ Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ， Ｌａ Ｊｉｌｌａ ＣＡ ９２０３７）により構築された。 第１鎖ｃＤＮＡ合成は、ＸｈｏＩ制限サイトを含むオリゴｄ（Ｔ）プライマ／ リンカーを用いて達成された。第２鎖合成は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、 Ｅ． ｃｏｌｉリガーゼ、及びＲナーゼＨの組合せを用いて行われ、次いでＥｃｏＲＩ アダプタがｃＤＮＡの平滑末端に付けられた。ＥｃｏＲＩを付けられた二鎖のｃ ＤＮＡは、次いでＸｈｏＩ制限酵素で 消化され、フェノールクロロホルムで抽出され、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ４００で サイズにより分割された。適当なサイズのＤＮＡは、次いで脱リン酸ラムダＺａ ｐ（商標）アーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に付けられて、Ｇｉｇａｐａｃｋ抽 出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージングされた。ｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ファージミドＤＮＡは、好酸球ライブラリか らまとめて切除され、個々のプラスミドＤＮＡはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔ ｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されてい るミニプレップキットを用いて作られた（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）。 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ファージミドＤＮＡは、好酸 球ライブラリーからまとめて切り出され、個々のファージミドＤＮＡは、Ｍｉｎ ｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ． Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）を使用して作られた 。 このキットは９６穴の形態で、９６０精製のために十分な試薬を供給する。推 奨プロトコルを採用したが、以下の点を変更した。第１に、９６穴のそれぞれが 、２５ｍｇ／ｌのカルベニシンと０．４％のグリセリンを含む滅菌液体培地（Ｌ ＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）． Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）１ｍｌで満たされる。細菌が穴の中に挿入され、２４時間培養され、か つ溶解緩衝液の６０μｌに溶解される。このブロックは２９００ｒｐｍで５分間 遠心分離され、次いでこのブロックの内容（contents）が第１フィルタプレート に加えられる。所望に応じて加えられるステップであるＴＲＩＳ緩衝液にイソプ ロパノールを添加するステップは、定例的には実行されない。プロトコルにある 最終ステップの後、試料は保存のためＢｅｃｋｍａｎ９６穴ブロックに送られる 。 ｃＤＮＡライブラリの品質は、１９２ｃＤＮＡのパイロットスケール分析を行 い、ベクターのみを含有するクローン、ミトコンドリアまたは反復ＤＮＡ配列を 含むクローン、及びラムダまたはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡに由来するクローンのパー センテージをチェックすることによって決定された。公的データベースとの正確 な一致または相同的な一致の数は、一義的な配列の数、即ちあらゆるデータベー スとの一致が見られないものの数も記録された。 ２．ｃＤＮＡクローンの単離 個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、ｉｎ ｖｉｖｏ切除プロセス により得られた。このプロセスでは、宿主Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＸＬ１−ＢＬＵＥ（ 登録商標）ＭＲＦ）が、ｆ１ヘルパーファージと共感染された。ラムダファージ 及びｆ１ヘルパーファージの双方から誘導されたタンパク質は、ラムダ標的ＤＮ Ａ上の定められた配列から新たなＤＮＡ合成を開始し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ （登録商標）プラスミド及びｃＤＮＡ挿入断片の全てのＤＮＡ配列を含む小型の １本鎖環状ファージミドＤＮＡ分子を作り出す。このファージミドＤＮＡは、細 胞から放出され、精製されて、次いで新鮮な細菌性宿主細胞（ＳＯＬＲ）に再感 染するのに使用されて、重鎖のファージミドＤＮＡが産生された。ファージミド がβ−ラクタマーゼに対する遺伝子を保有していることから、新たに形質転換さ れた細菌がアンピシリンを含む培地上で選択された。 ファージミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ社（９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ ９１３１１）のＱＩＡＷＥＬＬ−８ファスミド 精製システムを用いて精製された。この技術は、細菌細胞を溶解し、高度に精製 されたファージミドＤＮＡを単離するための高速で信頼性が高く高スループット の方法である。精製樹脂から溶離されたこのＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定及び他の 分析走査に適したものであ る。 ヒト好酸球ライブラリーのランダム分離により得られたｃＤＮＡ挿入断片は、 部分的に配列決定された。このｃＤＮＡは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏ Ｌ ａｂ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）、及び４台のＰｅｌｔ ｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒｓ（ＰＴＣ２００ ｆｒｏｍ ＭＪ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ｏｒ ３７３ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙ ｓｔｅｍｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、Ｓａｎｇｅｒ Ｆ 及び ＡＲ Ｃｏｕｌｓｏｎの論文（１９７５； Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ９４ ：４４１ｆ）に記載の方法により配列決定され、ＤＮＡの読み枠が決定された。 ３．ｃＤＮＡクローン及び演繹されたタンパク質の相同性検索 各ｃＤＮＡはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の検索アルゴリズム を、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０配列分析システムに組み込んで用いて、Ｇｅ ｎＢａｎｋの配列と比較を行った。このアルゴリズムにおいては、Ｐａｔｔｅｒ ｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ（ＴＲＷ社製， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ ＣＡ）を用いて、相同領域の決定を行った。配列比較をどのよ うに行うかを定める３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセ ット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組合せを用いて、問 題の配列に対して相同性を有する領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索 し、適当な配列に対して初期値と共に点数が付けられた。続いて、これらの相同 領域を、ドットマトリクス相同性プロット法を用いて検定し、偶然の一致と真の 相同領域とを区別した。相同性検索の結果を表示するのにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅ ｒｍａｎアラインメントを用いた。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）６７０配列 分析システムを用いてＤＮＡ配列の相同性の検査と似た方法で確認された。Ｐａ ｔｔｅｒｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｎｇｕａｇｅ及びパラメータウ ィンドウを用いて、相同性領域を含むタンパク質配列のデータベースを検索し、 相同領域は初期値と共にスコアを付けられて表示された。ドットマトリクス相同 性プロット法により検定を行い、有意な相同性領域を偶然の一致から区別した。 ＢＬＡＳＴ（ベーシック局部的一致検索ツール）（“Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００； Ａｌｔｓｃ ｈｕｌ， ＳＦ ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５： ４０３−１０”参照）を用いて、局部的な配列の一致を検索した。ＢＬＡＳＴは ヌクレオチド及びアミノ酸配列双方の一致をチェックして、配列の類似性を決定 する。一致の局部的な性質のために、ＢＬＡＳＴは正確な一致を求めたり、ある いは相同性を同定するのに特に有用である。ＢＬＡＳＴは、ギャップを含まない 一致を求めるのに有用なのである。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本ユニット は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｐａｉｒ（ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは、任意の、長さが等しく互いの一致部分が局部的に最大で、一致スコ アがユーザがセットしたカットオフスコアまたは閾値スコアに達するかそれを超 えるような２つの配列フラグメントからなる。ＢＬＡＳＴを用いる方法により、 問題の配列とデータベース配列とのＨＳＰを捜し、発見された一致の統計的な有 意性を評価し、ユーザが選択した有意性の閾値を満たす一致のみを知ることがで きる。パラメータＥはデータベース配列との一致で報告されるものを選択するた めの統計的有意性の閾値を設定する。Ｅは、データベース検索全体の前後関係の 中でのＨ ＳＰ（若しくはＨＳＰの組）の偶然の一致の期待される頻度上限と解釈される。 Ｅを満たすデータベース配列はプラグラムの出力において報告される。 好酸球で発現されるケモカインＥＥＣの全コード領域のヌクレオチド配列及び アミノ酸配列は、第１図に示されている。 ４．遺伝子の同定及び完全長配列決定 ヒト好酸球ライブラリーのクローンの中からランダムにピックアップし配列決 定すると、既知のＣ−Ｃケモカイン分子に相同性を有するが、明らかに異なって いるｅｅｃ配列が見つけられた。ｅｅｃの完全なヌクレオチド配列は翻訳され、 枠内の翻訳は第１図に示す。この配列の予測される全ての可能な３つの翻訳物を スイスプロット及びＰＩＲのようなタンパク質データベースから検索したが、ｅ ｅｃの可能な翻訳と完全に一致するものは見つけられなかった。第２図に示すの は、ＥＥＣアミノ酸配列と他のＣ−Ｃケモカイン分子の配列との比較である。恒 久性Ｃ−Ｃモチーフを含むこれらの分子のうち実質的に相同な領域は白抜きで示 されている。系統樹分析（第４図）は、ｅｅｃと他の良く特徴付けられたヒトＣ −Ｃケモカインとがどのように近縁関係にあるかを示している。これらの分子の 最も近縁なものは、図面の右手側に集まっている。 ５．アンチセンス分析 ＥＥＣ配列、またはその一部分は、内生ＥＥＣのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ発現を阻害するのに用いられる。約２０塩基対からなるアンチセンス オリゴヌクレオチドを使用することについては詳細に説明したが、より大きいｃ ＤＮＡフラグメントについても同一の手順を用いる。ＥＥＣコード配列に基づく オリゴヌクレオチドは、内生ＥＥＣの発現を阻害するのに用いられる。オリゴ４ ．０を用いて、相補的オリゴヌクレオチドを保存的５’配列からデザインし、こ れを用いてプロモ ータが上流の非翻訳領域に結合するのを防止することにより、転写を阻害するか 、またはリボソームがｍＲＮＡに結合するのを防止することによりＥＥＣ転写物 の翻訳を阻害する。 ６．ＥＥＣの発現 ＥＥＣをコードするヌクレオチド配列が、Ｔ７プロモーター、それに続く開始 メチオニンコロン（ＡＴＧ）、それに続く６つのヒスチジンコドン、それに続く （チオレドキシンをコードする）Ｅ．ｃｏｌｉのＴｒｘＡ遺伝子、それに続くエ ンテロキナーゼ切断可能部位をコードする配列、及びＥＥＣをコードするヌクレ オチド配列を有する発現ベクター内にクローニングされた。シグナル配列の切断 に関しての経験的研究によれば、完全長タンパク質のＮ末端に位置する予測疎水 性領域のＣ末端、またはその近傍で切断は起こる。ＥＥＣの疎水性のプロファイ ルは第３図に示されており、このプロファイルに基づけば、配列番号：２の残基 ２１（アラニン）は成熟ＥＥＣの発現のためのＮ末端アミノ酸残基であるようだ 。Ｃ−Ｃケモカインの特徴的なＣ−Ｃ残基からＮ末端残基５０のアミノ酸残基の 存在は、新規な活性を発揮するＥＥＣへのＮ末端の延長を反映しうる。 ６個のヒスチジンコドンを含む上述の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転 換させ、宿主細胞培地をＩＰＴＧで誘発し、発現されたタンパク質は、変性ＳＤ Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動法を受けた。発現ベクターからの核酸は、上 述のＳａｍｂｒｏｏｋのミニプレッププロシージャを用いて部分的に精製され、 スーパーコイルしたＤＮＡを産生した約１００ｎｇのＤＮＡを用いて宿主細菌細 胞Ｗ３１１０／ＤＥ３を形質転換させた。Ｗ３１１０／ＤＥ３は、ＡＰＣＣのＷ ３１１０及びＮｏｖａｇｅｎ社製のラムダＤＥ３溶原化キットを用いて構築され た。ＤＥ３溶原は、その親Ｗ３１１０より形質転換受容性が低いことが多く、効 率的な形質転換のためのスーパーコイルしたＤＮＡの使用に適合する。各ケモカ イン形質転換から１つの形質転換体が選択され、アンピシリンを含むＬ−ブロス の培地５ｍｌが接種された。各５ｍｌの培地は、浸透した上。摂氏３７℃で一晩 （１２〜１５時間）増殖させた。一晩おいた後、その一晩おいた培地の１ｍｌを 、５００ｍｌのフラスコ内にアンピシリンを含むＬ−ブロスの１００ｍｌの培地 に接種し、浸透した上で３７℃で増殖させ、培地のＯＤ６００が０．４〜０．６ に達するまで放置した。接種された細胞が、ＯＤ６００の値が０．６を越えるま で増殖した場合には、定常期に入り、誘発レベルは低くなる。 接種の時に、５ｍｌの試料を取り出し、氷上に設置して、全誘発（若しくは０ 時間）試料として用いた。この細胞培地がＯＤ６００の値で０．６に達したとき 、１００ｍＭ ＩＰＴＧ原液の４０μｌを添加して最終的な濃度が０．４ｍＭに なるようにした。この培地は、浸透した上摂氏３７℃で３時間増殖させた。１時 間から最大６時間の間隔で培地の５ｍｌの分割量を取り、変性ＳＤＳポリアクリ ルアミドゲル電気泳動法で分析することにより、発現誘発の分析を行った。この 融合タンパク質は、細胞の溶液分画に蓄積するように見えた。 本発明のケモカインの場合、誘発が最大となるのは２時間経過したときであっ た。４時間以上増殖させると、培地での溶解が生じ、タンパク質分解により所望 のタンパク質の全体としての収量は低減した。０時間、１時間及び２時間経過し たときに細胞培地の５ｍｌの分割量を取り、摂氏４℃で５分間３００ＲＰＭで遠 心分離した。その上澄みを吸引し、細胞の溶解を助けるべくピペットに凍結融解 処理を施した。このピペットは摂氏４℃でＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ′ＨＣＬ ｐＨ８．０１ｍＭＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に再懸濁したその量はＴＥ（ｕｌ）＝ （ＯＤ６００）（２５０）で計算される量であった。各試料には同量の２×Ｓ ＤＳ試料加重バッファ（Ｎｏｖｅｘ）を添加した。この試料を５分間煮沸し、各 レーンにつき１０μｌの各試料をロードした。 Ｈ６−ＴｒｘＥＥＣを含む融合タンパク質の期待される分子量は１９，２３３ ダルトンである。１４％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で発現されたＥＥＣ は、明らかに分子量約２０ｋＤａを示した。６個のヒスチジンコドンを欠く第２ の融合タンパク質が構築され、発現された。このタンパク質に期待される分子量 は、１８４１０ダルトンです。ＥＥＣタンパク質は、細胞溶解物の不溶性分画に 優勢なようである。 ７．組換えＥＣの単離 ＥＥＣはキメラタンパク質として発現され、６個のヒスチジンとそれに続くＥ ．ｃｏｌｉのチオレドキシン（ＴｒｘＡ）遺伝子を有し、ＴｒｘＡタンパク質と 目的のケモカインとの間にエンテロキナーゼ切断可能部位を有する。これはクロ ーニングプロセスを促進するために添加されたものである。ヒスチジンはタンパ ク質の精製を促進するために添加されたものである。ヒスチジンが存在すること により、ＩＭＩＡＣ クロマトグラフィー上での精製（Ｐｏｒａｔｈ（上述）） が可能になる。 ８．ＥＣ特異的抗体を用いた診断テスト 特定のＥＥＣ抗体は、前病状態の診断や、ＥＥＣの量または分布の差によって 特徴付けられる慢性または急性の疾病に対する診断において有用である。ＥＥＣ はヒト好酸球ライブラリーにおいて初めに発見され、白血球遊走や好酸球に関与 する異常や病状の診断に使用できる。 ＥＥＣに対する診断テストにおいては、抗体及びヒトの体液、組織及びそのよ うな組織からの抽出物においてＥＥＣを検出するための標識を利用する。本発明 のポリペプチド及び抗体は、修飾した上で使用されることもあれば、修飾せずに 使用されることもある。ポリペプチド及び抗体は、検出可能なシグナルを与える 物質と共有結合または非共有結合で それらに結合させることにより標識される。標識及び接合技術は様々なものが知 られており、化学文献あるいは特許明細書の双方において広く記載されている。 適当な標識には、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学ルミ ネセンス剤、磁性粒子等がある。このような標識を使用した特許には、例えば米 国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，３５２号、第３，９３９，３５ ０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４ ９号、第４，３６，２４１号等がある。また、組換え免疫グロブリンの産生につ いては、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されており、本明細書と 共に参照されたい。 可溶性または膜結合型ＥＥＣを測定するための、該タンパク質に対して特異的 なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる様々なプロト コールが周知となっている。その例を挙げると、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳ Ａ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分析分類法（ＦＡＣＳ ）等がある。好適なのは、ＥＣ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクロ ーナル抗体を利用した２つの部位のモノクローナルベースの免疫検定法であるが 、競合的結合検定法を用いてもよい。これらの検定法は“Ｍａｄｄｏｘ， ＤＥ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １５８：１２１１”他の文献に 記載されている。 ９．特異的抗体を用いた未変性ＥＥＣの精製 未変性ＥＥＣまたは組み換えＥＥＣは、ＥＥＣ特異的抗体を用いたイムノアフ ィニティクロマトグラフィーにより精製される。イムノアフィニティカラムは、 抗ＥＥＣ抗体と活性化クロマトグラフィー樹脂を共有結合させることにより構築 される。 ポリクローナル免疫グロブリンは、免疫血清から硫酸アンモニウム沈 殿または固定化プロテインＡ上でのクロマトグラフィーにより免疫血清から調製 される（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｉｓ ｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ活 性化セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）のようなクロマトグラフィー樹脂に共有結 合で付けられる。抗体は樹脂に結合され、樹脂はブロックされて、誘導体樹脂が 製造者の指示に従って洗浄される。 このようなイムノアフィニティカラムは、可溶型のＥＥＣを含む細胞から分画 を調製することによって行われるＥＥＣの精製において使用される。この調製で は、細胞全体または界面活性剤の添加または他の周知の方法により遠心分離法を 用いて得られた細胞成分分画を可溶化することによって調製が誘導される。別の 形態として、シグナル配列を含む可溶ＥＥＣは、細胞が増殖される培地に使用に 供される量だけ分泌される。 可溶ＥＥＣを含む調製物は、イムノアフィニティカラムを通されて、このカラ ムは、ＥＥＣの優先吸収が可能な（例えば界面活性剤が高イオン強度緩衝液の中 に存在しているような）条件の下で洗浄される。次いで、このカラムは抗体とケ モカインとの結合を分裂させるような条件（例えばｐＨが２から３の緩衝液、ま たは高濃度の尿素またはチオシアネートイオンのようなカオトロープ）の下で溶 離され、このＥＥＣが収集される。 １０．ＥＣ誘発走化性または細胞活性化の判定 ＥＥＣの走化性の活性は、４８穴マイクロケモタキシスチャンバ（Ｆａｌｋ ＷＲ ｅｔ ａｌ （１９８０） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３３ ：２３９）で測定される。各穴はフィルタによって２つの区画に分割されており 、このフィルタは化学的勾配に応じて細胞が 通過できるフィルタである。発現されたケモカインを含むＲＭＰＩ１６４０（Ｓ ｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）のような細胞培養培地は、通常はポリカー ボネート製のフィルタの一方の側に入れられ、同じ媒質内で懸濁された細胞がフ ィルタの反対側の区画に入れられる。十分なインキュベーション時間が経過する と、フィルタ前後の濃度勾配に応じて細胞がフィルタを通過する。フィルタは各 穴から取り出され、ケモカインに対向するフィルタの側に付着した細胞が分類さ れ定量される。 特異的細胞集団上でのケモタキシスアッセイを実行することにより、化学誘因 物質の特異性が決定される。初めに、静脈穿刺によって得られた血液細胞が密度 勾配遠心分離法により分画され特定のＥＣの走化性の活性が好中球、末梢血単球 細胞、単球及びリンパ球の濃度の高い集団の上でテストされる。所望に応じて、 このような濃縮細胞集団は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋濃縮Ｔ細胞集団に対するＣＤ ８＋及びＣＤ４＋特異的抗体を用いてそれぞれ更に分画される。 別のアッセイにより、活性化Ｔ細胞上のＥＣの走化性の効果が解明される。こ こでは、未分画のＴ細胞または分画されたＴ細胞サブセットが、ＣＤ−３抗体で コーティングされた組織培養容器内で６〜８時間培養される。このＣＤ３活性化 の後、ＥＣの走化性の活性が後に述べるようにテストされる。濃縮細胞集団を得 るための他の様々な方法が従来より周知である。 ケモカインの中には、好中球及び単球の非走化性細胞活性化作用を生み出すも のがある。これは、アクチン重合のような好中球活性化作用、呼吸バースト作用 の増加、アズール親和性顆粒の脱顆粒、及びシグナル伝達経路の一部としてのＣ ａ²⁺動員のような標準的な測定基準を介してテストされる。Ｃａ²⁺の動員に対す る検定法は、好中球にＣａ²⁺の結合によって放射特性が変化する蛍光プローブを 前負荷する方法である。細 胞が活性化刺激にさらされると、Ｃａ⁺²の流動は、蛍光光度計による細胞の観測 により知ることができる。Ｃａ²⁺動員の測定については、“Ｇｒｙｎｋｉｅｖｉ ｃｚ Ｇ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６０：３ ４４０， ａｎｄ ＭｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ Ｉｍ ｍｕｎｏｌ １５０：４５５０−４５５５”に記載されており、本明細書と共に 参照されたい。 脱顆粒及び呼吸バースト反応は、単球（“Ｚａｃｈａｒｉａｅ ＣＯＣ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７１：２１７７−８２”参照 ）でも測定される。更に単球活性の測定は、接着分子発現及びサイトカインの産 生の調節（“Ｊｉａｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ ｌ １４８：２４２３−８”参照）を利用しても行うことができる。接着分子の 発現は、リンパ球活性化に応じても変化する（“Ｔａｕｂ Ｄ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ３５５−３５８”参照）。 １１．薬物スクリーニング 本発明のＥＥＣ及びその生物学的に活性なフラグメントは、様々な薬物スクリ ーニング技術における化合物のスクリーニングにおいて有用である。このような テストにおいて用いられるケモカインポリペプチドまたはフラグメントは、溶液 の中に遊離しているものか、固体の支持体に付着しているものか細胞の表面に支 持されているか、あるいは細胞内に存在するものの何れかである。薬物スクリー ニングの一方法では、ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現する組換え核 酸で安定に形質転換される真核細胞または原核細胞の宿主細胞を利用する。この ような細胞は、生存型であれ固定型であれ標準的な結合実験に使用される。これ を用いて例えば、ＥＥＣと試験される薬剤との複合体の形成を測定したり、ある いはＥＥＣと試験される薬剤によって生じた単球等の標的細胞 との複合体の減少を検査することができる。 従って、本発明は炎症及び疾病を発症し得る任意の薬剤または薬物のスクリー ニング方法を提供するものである。これらの方法は、ＥＥＣポリペプチド若しく はそのフラグメントをこのような薬剤に接触させる過程と、（ｉ）ＥＣポリペプ チド若しくはフラグメントと薬剤との間の複合体の存在、若しくは（ｉｉ）ＥＥ Ｃポリペプチド若しくはそのフラグメントと細胞との複合体の存在を、周知の方 法により検定する過程とを含む。このような競合的結合検定法においては、ＥＥ Ｃポリペプチドまたはそのフラグメントは、当業者に周知の方法により標識され る。適当なインキュベーションの後、遊離したＥＥＣポリペプチドまたはフラグ メントが、結合した形態で存在するものから分離される。そして遊離した標識ま たは複合体を形成していない標識の量が、特定の薬剤がＥＥＣに結合する能力、 またはＥＥＣ／薬剤複合体に干渉する能力の尺度となる。本発明の別の実施例は 、請求項８に記載のポリペプチドへの特異的結合親和性（アフィニティ）で複数 の化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）複数の化合物を準備する供給 する過程と、ｂ）好酸球脾臓発現型ケモカイン（ＥＥＣ）と、複数の化合物のそ れぞれを、適切な条件の下で結合できるだけの十分な時間をかけて結合する過程 と、ｃ）ＥＥＣと複数の化合物のそれぞれとの結合を検出して、ＥＥＣに特異的 に結合する化合物を同定する過程とを有する。 薬物スクリーニングのための他の技術としては、本発明のＥＣポリペプチド、 若しくはそのフラグメントに対する適切な結合親和性を有する複合体を高スルー プットでスクリーニングすることができるものがあり、その詳細はＧｅｙｓｅｎ による欧州特許出願第８４／０３５６４号明細書（公開１９８４年９月１３日） に記載されており、本明細書と共にこれを参照されたい。この方法を簡単に述べ ると、たくさんの異なる小さ なペプチドのテスト化合物が、固体基板、例えばプラスチックピンまたは他のも のの表面上で合成される。ペプチドテスト化合物は、ＥＣポリペプチドと反応さ せられて、洗浄される。結合されたＥＥＣポリペプチドは次いで周知の方法によ り検出される。精製ＥＥＣは上述の薬物スクリーニング技術において使用するた めのプレート上に直接コーティングされ得る。更に、非中和性抗体を用いてペプ チドを捕捉し、それを固体支持体の上に固定化することができる。 ケモカインポリペプチド、若しくはそのフラグメントへの結合について、テス ト化合物とＥＥＣに特異的に結合し得る中和性抗体とが競合する競合的薬物スク リーニングアッセイの利用も本発明の企図するところである。このようにして、 この抗体を用いて、１または２以上の抗原決定基がＥＥＣと共通な任意のペプチ ドの存在を検出することができる。 １２．合理的薬物デザイン 合理的薬物デザインの目標は、興味の対象である生物学的に活性のポリペプチ ドの構造的類自体や、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、若しくは阻害剤の ような、それらのポリペプチドが相互作用する小さな分子の構造的な類似体を作 り出すことである。ここに例として挙げたものは何れも、ポリペプチドのより活 性または安定な形態のものであるか、またはｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの機 能を強化するか、または阻害する薬剤を形成するのに用いることができる（“Ｈ ｏｄｇｓｏｎ Ｊ （１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１９− ２１”参照）。 １つの方法においては、目的のタンパク質、またはタンパク質−阻害剤複合体 の三次元的構造を、Ｘ線結晶解析、コンピュータによるモデル化、若しくは最も 典型的には２つの方法の組合せにより決定する。構造を解明し、分子の活性部位 を決定するためにポリペプチドの形状及び電 荷が確認されなければならない。ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相 同タンパク質の構造に基づいたモデリングにより得ることが可能である。何れの 場合においても、構造情報を用いて、ケモカイン上の分子の類似体をデザインし たり、あるいは効果的な阻害剤を同定している。合理的薬物デザインの有用な例 としては、Ｂｒａｘｔｏｎ Ｓ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ＪＡ （１９９２ Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：７７９６−７８０１）により示された改良ＥＣ活 性または安定性を有する分子、またはＡｔｈａｕｄａ ＳＢ ｅｔ ａｌ （１ ９９３ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １１３：７４２−７４６）によって示された自然 発生ＥＣの阻害剤、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する分子があり 、ここでは上述の両文献を参照されたい。 機能的アッセイにより選択された標的特異的抗体を上述のように単離し、次い でその結晶構造を解明することも可能である。この方法では、原則として、続け て行われる薬物デザインにおける基礎となり得るファーマコア（pharmacore）が 生み出される。機能的な、薬理学的に活性の抗体に対する抗イディオタイブの抗 体（抗ｉｄ）を精製することにより、タンパク質の結晶を精製することにより、 タンパク質の結晶解析をバイパスすることが可能である。鏡像の鏡像のように、 抗ｉｄの結合部位は、もとの受容体の類似体であることが期待される。次いで、 抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に産生されたペプチドのバンクからペプ チドを同定し単離することができる。単離されたペプチドは、ファーマコアとし て役立つ。 本発明により、Ｘ線結晶解析のような分析的研究を行うのに使用できる十分な ＥＣポリペプチドが作られ得る。更に、ここに開示したＥＥＣアミノ酸配列の知 識を、Ｘ線結晶解析の代わりまたはそれと共に用いられるコンピュータによるモ デリング技術に応用することができる。 １３．ＥＥＣ受容体の同定 精製ＥＥＣを用いて、特異的細胞表面受容体及び他の結合分子を特徴付け、精 製することができる。走化性若しくは他の特異的反応により特定のＥＥＣに反応 する細胞は、そのＥＥＣに対する受容体を発現することが多い。様々な当業者に 周知の方法によりＥＥＣに放射性標識が組み込まれる。好適実施例では、ＥＥＣ の一次アミノ基を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（“Ｂｏｌｔｏｎ， ＡＥ ａ ｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ， ＷＭ （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １３３：５ ２９”参照）で標識する。これを用いて、他のケモカインを、生物学的活性を損 なうことなく標識することができる（“Ｈｅｂｅｒｔ ＣＡ ｅｔ ａｌ （１ ９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６： １８９８９； ＭｃＣｏｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ （１９９３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５０：４５５０−４５ ５５”参照）。受容体保有細胞は、標識化ＥＥＣと共にインキュベートされる。 次いで、この細胞は洗浄されて非結合ＥＥＣが除去され、次いで受容体結合ＥＥ Ｃが定量される。異なる濃度のＥＥＣを用いて得られたデータから、受容体の数 及び親和性を表す数値を計算することができる。 標識化ＥＥＣはその特異的受容体の精製のための試薬として有用である。アフ ィニティ精製の一実施例においては、このＥＣがクロマトグラフィカラムに共有 結合で結合される。受容体保有細胞が抽出され、その抽出物がカラムに通される 。受容体はそのリガンドとの生物学的に親和性のためにカラムに結合する。受容 体はカラムから回収され、Ｎ末端タンパク質配列決定を受ける。このアミノ酸配 列は、次いでその受容体遺伝子のクローニングのための変性オリゴヌクレオチド プローブのデザインに使用される。 別の実施例においては、発現クローニング、ｍＲＮＡが受容体保有細 胞から得られ、ｃＤＮＡ発現ライブラリが形成される。このライブラリは、細胞 の集団へトランスフェクションがなされて、受容体を発現するこれらの細胞集団 は蛍光標識化ＥＣを用いて選択される。この受容体は、高度に標識された細胞か ら組換えＤＮＡを回収し配列決定することにより識別される。 別の方法では、受容体保有細胞の表面に対する抗体、好ましくはモノクローナ ル抗体が産生される。このモノクローナル抗体は、標識化ＥＣの結合を阻害する ものを識別するためにスクリーニングされる。これらのモノクローナル抗体は、 次いでアフィニティ精製または受容体の発現クローニングのために用いられる。 可溶性受容体、若しくは他の可溶性結合分子の同定も類似した方法で行われる 。標識化ＥＥＣをその特異的な炎症の生じている、若しくは患部の組織から取り 出した適切な材料と共にインキュベートする。インキュベーションの後、精製Ｅ ＥＣのサイズより大きいＥＥＣ複合体を、例えば、サイズ除外クロマトグラフィ または密度勾配遠心分離法のようなサイジング技術を用いて同定し、従来より周 知の方法で精製する。可溶性受容体または結合タンパク質はＮ末端配列決定を受 けて、その可溶性タンパク質が既知である場合にはデータベースによる同定、そ の可溶性タンパク質が未知である場合にはクローニングのために十分な情報が得 られる。 上述の明細書の記載の中で引用された全ての文献及び特許明細書は、本明細書 と一体に組み込まれる。上述の本明細書の内容は、当業者が本発明を実行するの に十分なものであると考えられる。実際、以下の請求の範囲に記載の本発明の範 囲内で、当業者は上述の実施例を様々に変更を加えて実行することができるであ ろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 スチュアート、スーザン・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州94037・ モンタラ・バーチストリート 1256 (72)発明者 ブラクストン、スコット・マイケル アメリカ合衆国カリフォルニア州94402・ サンマテオ・ヨークタウンロード 1786 (72)発明者 ローズ、エリック・ティー アメリカ合衆国カリフォルニア州94566・ プレザントン・ボニタアベニュー 612 (72)発明者 コックス、ベンジャミン・グリーム アメリカ合衆国カリフォルニア州94306・ パロアルト・ウィルキウェイ 4292−ディ ー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：２に示す酸配列またはその相補的配列を有するポリペプチドをコ ードする核酸を含む精製ポリヌクレオチド。 ２．前記核酸配列が、配列番号：１の配列であることを特徴とする請求項１に記 載のポリヌクレオチド。 ３．請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。 ４．請求項３に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。 ５．請求項２に記載のポリヌクレオチドの非保存フラグメントを含む核酸プロー ブ。 ６．２２乃至６３番目のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含むこと を特徴とする請求項５に記載の核酸プローブ。 ７．請求項２のポリヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的なポリヌク レオチド配列を含むアンチセンス分子。 ８．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であっ て、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項４に記載の宿主細胞 を培養する過程と、 ｂ）前記宿主細胞培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特 徴とする配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法。 ９．配列番号：２のアミノ酸配列を含む精製された好酸球で発現されるケモカイ ン。 １０．Ｎ末端アミノ酸残基として配列番号：２の２１番目の残基であるアラニン を有することを特徴とする精製された好酸球で発現されるケモ カイン（ＥＥＣ）。 １１．請求項９に記載の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。 １２．請求項６に記載の核酸プローブを含む好酸球、脾臓で発現されるケモカイ ンをコードする核酸配列を検出するための診断用組成物。 １３．生物学的試料において、ＥＥＣをコードする核酸配列を検出するための診 断テスト方法であって、 ａ）配列番号：１の核酸配列と相補的核酸配列との核酸ハイブリダイゼーショ ン複合体を前記試料内で形成するのに適切な条件の下で、配列番号：１の核酸配 列、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドと前記生物学的試料とを結 合する過程と、 ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程と、 ｃ）前記ハイブリダイゼーション複合体の量と標準値とを比較する過程とを有 することを特徴とし、 前記ハイブリダイゼーション複合体の異常レベルの存在が炎症に関連する状態 と正の相関を有することを特徴とする診断テスト方法。 １４．生物学的試料において、好酸球、脾臓で発現されるケモカインをコードす るヌクレオチド配列を検出するための診断テスト方法であって、 ａ）核酸増幅に適切な条件の下で、前記生物学的試料とＰＣＲプライマーとを 結合する過程であって、前記プライマーが配列番号：１のヌクレオチド配列の非 保存領域のフラグメントを含む、該過程と、 ｂ）増幅されたヌクレオチド配列を検出する過程と、 ｃ）前記生物学的試料における増幅されたヌクレオチド配列の量と標準値とを 比較することにより、前記ヌクレオチド配列の量が前記標準値から偏移している か否か、及び前記ヌクレオチド配列の異常レベルの存在がＥＥＣの異常発現に関 連する状態と生の相関を有しているか否かを判定する過程とを有することを特徴 とする診断テスト方法。 １５．請求項８のポリペプチドまたはその一部分に対する特異的結合親和性によ り複数の化合物をスクリーニングする方法であって、 ａ）複数の化合物を準備する過程と、 ｂ）適切な条件の下で結合しうるだけの十分な時間をかけて前記複数の化合物 のそれぞれと好酸球、脾臓で発現されるケモカイン（ＥＥＣ）とを結合する過程 と、 ｃ）前記ＥＥＣが前記複数の化合物のそれぞれに結合したことを検出し、前記 ＥＥＣに特異的に結合する化合物を同定する過程とを有することを特徴とするス クリーニング方法。