JP2000509973A - 前立腺を起源とする新規なｒａｎｔｅｓホモログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なヒトＲＡＮＴＥＳホモログ（ＰＴＥＣ）を同定しコードする、前立腺ｃＤＮＡライブラリーから単離されたポリヌクレオチド（ＰＴＥＣ）を提供する。本発明はＰＴＥＣをコードする核酸配列を含む遺伝子工学的処理された発現ベクター及び宿主細胞を提供する。本発明は又、免疫不全疾患の治療における精製ＰＴＥＣの治療的使用、及びＰＴＥＣの発現が関係する病気又は疾患の治療におけるアンチセンス分子、抗体、アンタゴニスト又はインヒビターの治療的使用を提供する。本発明は又、このポリヌクレオチド又はそのフラグメント、若しくはこのポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む診断用組成物を利用した診断試験方法についても記している。

Description

【発明の詳細な説明】 前立腺を起源とする新規なＲＡＮＴＥＳホモログ技術分野 本発明は前立腺に由来する新規なＲＡＮＴＥＳホモログの核酸及びアミノ酸配 列に関するものであり、又疾患の診断、研究、予防、及び治療におけるこれらの 配列の使用に関するものである。背景技術 ケモカインは、一般に約７０〜１００アミノ酸（ａａ）からなる長さを有し、 分子量８〜１１ｋＤの、１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で活性な小型のポリペプチ ドである。初めに、ケモカインは炎症組織から単離、精製され、その生物活性に 対して特徴付けられた。最近では、ケモカインは分子クローニング技術によって 発見されてきており、機能分析と構造分析の両面から特徴付けられている。現在 ケモカインファミリーに割り当てられている近縁なポリペプチドは、成熟細胞に おける初めの２つのシステイン残基の間隔が一定であり、単球／マクロファージ 、好塩基球、好酸球、Ｔ細胞他を含む多様な標的細胞のグループに作用するもの である。既知のケモカイン及びその機能は、“Thomson A.(1994)The Cytokine H andbook,2d Ｅｄ.Academic Press,ＮＹ.”に記載されている。 現在、Ｃ−Ｃケモカインについて書かれたものは比較的少なく、また、そのＮ 末端プロセシングの数は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインより少ないようである。既知の Ｃ−Ｃケモカインには、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）、マクロファージ炎症 性タンパク質（ＭＩＰ）、Ｉ−３０９、ＴＣＡ３、及びＲＡＮＴＥＳが含まれる 。 単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）は、７６個のアミノ酸からなるタンパク 質であって、様々な媒介物の刺激に応じてほとんど全ての細胞及び組織において 発現されるようである。Ｃｈａｒｏによれば、ＭＣＰ −１の標的は、単球及び好塩基球に限定されており、そこでＭＣＰ−１は、ＭＣ Ｐ−１レセプタ、Ｇタンパク質結合レセプタを介してカルシウム流動（flux）を 誘発する。Shyy Y-Jら（1990;Biochem Biophys Res Commun 169:346-351）は、 ホルボールエステル処理による内皮細胞培地におけるＭＣＰ−１の誘発、及びア テローム発生との関連の可能性について報告している。他の２つの近縁関係にあ るタンパク質（ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３）は、ヒト骨肉腫細胞株から精製された 。ＭＣＰ−２及びＭＣＰ−３は、ＭＣＰ−１とそれぞれ６２％及び７３％のアミ ノ酸配列の同一性を有し、単球に対するその化学誘因物質特異性をＭＣＰ−１と 共通のものとしている。 ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βは、初めに刺激されたマウスのマクロファージ 株細胞から精製され、通常の組織に注入されると炎症反応を誘発した。そして、 少なくとも３つの異なる非対立遺伝子が、ヒトＭＩＰ−１αをコードし、異なる ７つの遺伝子がＭＩＰ−１βをコードする。ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βは６ ８〜６９アミノ酸からなり、これらのアミノ酸の約７０％が、その酸性、成熟分 泌型について同一である。これらのタンパク質は双方共に、刺激されたＴ細胞、 Ｂ細胞、及び単球においてミトゲン、抗−ＣＤ３、及び内毒素に応じて発現され 、また両ポリペプチドはヘバリンを結合する。両分子は単球を刺激し、ＭＩＰ− １αはＴ細胞のＣＤ８サブセット及び好酸球を化学誘因し、ＭＩＰ−１βはＴ細 胞のＣＤ４サブセットを化学誘因する。マウスにおいては、これらのタンパク質 が骨髄造血を刺激することが知られている。 Ｉ−３０９はヒトγ−δＴ細胞株からクローニングされ、マウスからクローニ ングされたＴ細胞活性化遺伝子３（ＴＣＡ３）と４２％のアミノ酸同一性を示し ている。これらの２つのタンパク質の５’フランキング領域の間には、かなりの レベルのヌクレオチド相同性が存在しており、 他のケモカインにおいては見られない特別なシステイン残基の対を共通に持って いる。このような類似性は、Ｉ−３０９とＴＣＡ３とが、時間の経過のうちに配 列及び機能が分かれた種のホモログであることを示唆している。 ＲＡＮＴＥＳはインターロイキン８（ＩＬ−８）及びヒトＭＩＰ−１β（Cove ll ＤＧ et al.(1994)Protein Science 3:2064-72）に構造的類似性を有するＣ −Ｃケモカインである。これはＴリンパ球及びマクロファージにより発現され、 腫瘍株細胞やリュウマチ様滑膜繊維芽細胞において同定された。ヒト及びマウス の６８個のアミノ酸からなる成熟タンパク質が知られており、これらのタンパク 質は８５％の相同性を共有し、且つ交差反応性を有する。このヒト遺伝子は染色 体上の１７ｑ１１−ｑ２１に位置している。 ＲＡＮＴＥＳ発現はＬＰＳを用いて刺激することができ、この発現はインター ロイキン１及び４、トランスフォーミング神経因子、及びインターフェロンγに より調節される。Ｔ細胞からクローン化されたｃＤＮＡは、Ｎ−グリコシル化部 位を欠いており、Ｏグリコシル化部位を有しているか、或いは有していない基本 的な８ｋＤのタンパク質をコードする。 ＲＡＮＴＥＳは、カルシウムイオンＣａ⁺⁺の移動を介して機能を発揮する（Ｃ ａ⁺⁺；Meurer R et al.(1993)Ｊ Exp Med 178:1913-1921）。ヘテロ三量体Ｇタ ンパク質共役受容体が関与しているとき、単球、記憶ヘルパーＴ細胞（Ｂ細胞で はない）、及び好酸球の走化性が発生する。タンパク質チロシンキナーゼが関与 しているとき、チャネル開放のような細胞応答、インターロイキン２受容体発現 、サイトカイン放出、及びＴ細胞増殖が起こる（Bacon ＫＢ et al.(1995)Scien ce 269:1727-29）。ＲＡＮＴＥＳはＩＬ−８及びＭＩＰ−１αとは異なる受容体 を有するが、 これはその通常の受容体からＭＩＰ−１αに置き換えることができる（Callard Ｒ and Ａ Gearing（1994）The Cytokine Facts Book,Academic Press,San Dieg o ＣＡ）。ＲＡＮＴＥＳは又、好中球及びマスト細胞からのヒスタミン放出を開 始させ、又抗原からは独立してＴ細胞を活性化する。イヌに皮内注射して４時間 以内に、ＲＡＮＴＥＳ，ＩＬ−８、及びＭＣＰ−１は、それぞれ、好酸球及びマ クロファージが濃厚な炎症、好中球浸潤、及び単球の血管周囲カッフィング（cu ffing）を発生させる。 ここに開示する新規なＲＡＮＴＥＳホモログの発見により、走化性やこのよう なβケモカインより媒介される他の細胞応答に起因する炎症、アレルギー、及び 喘息への介入の機会が得られる。発明の開示 本発明は前立腺ライブラリーからつくられたｃＤＮＡにおいて同定された新規 なβケモカインに関するものであり、又疾患の研究、診断、予防、及び治療にお けるこの新規なケモカインの核酸及びアミノ酸配列の使用に関するものである。 本発明の新規なケモカインは初めにアミノ酸配列アライメントのコンピュータで 生成されたデータの検索によってインサイト社クローンＮｏ．８３６８２０内で 同定された。ここに開示する核酸配列は記号ｐｔｅｃで表され、配列番号：１と して示されており、ＰＴＥＣで表され、配列番号：２として示されているアミノ 酸配列をコードする。本発明は、ＰＴＥＣとマウスのＲＡＮＴＥＳの間の化学的 及び構造的相同性に、部分的にその基礎を置いている（GenBank ＧＩ 475206;Sh in ＨＳ et al(1994)Mol Cell Biol 14:2914-25）。 ＰＴＥＣは９３個のアミノ酸からなる長さを有し、約２２残基のシグナル配列 、βケモカイン固有のシステイン残基（Ｃ₃₂−Ｃ₃₃、Ｃ₅₆、及びＣ₇₂）を有して おり、等電点は１０．６３である。この成熟タン パク質はマウスのＲＡＮＴＥＳ（Ｓｈｉｎ前述）に対して７０％のアミノ酸相同 性を有し、ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＧＩ 134510;Schall TJ et al (1988)ＪImmunol 141:1018-25）に対して約６８％のアミノ酸相同性を有し、又ＭＩＰ−１α（Ｇ Ｉ 182847;Blum Ｓ et al(1990)ＤＮＡ Cell Biol 9:589-602）に対して約６７ ％のアミノ酸相同性を有する。 この核酸配列、そのオリゴヌクレオチドやフラグメントや部分、若しくはその アンチセンス分子は、体液又はバイオプシー用に採取された組織の診断試験に置 いてｐｔｅｃの発現を検出するために用いることができる。例えば、自己免疫組 織破壊が過剰なレベルに達する前に患者におけるｍＲＮＡの存在を検出したり、 或いは炎症治療中にｐｔｅｃレベルをモニタするために、ｐｔｅｃ配列を用いる ことができる。この核酸配列は又、過敏性免疫応答を患う患者におけるゲノムの 核酸配列の発現を、特に組織破壊を防止すべく減らしたり、無くしたりする場合 に役立つアンチセンス分子を設計するために用いることができる。本発明は又、 発現ベクターにこのポリヌクレオチドを封入することにも部分的に関連しており 、この発現ベクターは宿主細胞や生物体を形質転換するのに用いることができる 。このような遺伝子組換え宿主は、コードされたＰＴＥＣの産生や回収のために 役立つ。 本発明は更に、天然ＰＴＥＣの検出のための診断用キットを提供する。このキ ットは精製ＰＴＥＣをポジティブコントロールとして使用し、抗体を産生したり 、ＰＴＥＣに結合する他のアンタゴニストやインヒビターを同定するためのもの である。抗ＰＴＥＣ抗体は、血液や尿のような体液、又はバイオプシー用に採取 された、ＰＴＥＣを発現する組織の抽出物におけるＰＴＥＣレベルをモニタする のに役立つ。 本発明は更に、白血球増殖を誘導する目的で、免疫無防備状態の患者に対して 精製ＰＴＥＣを投与することもその範囲に含む。同様に、抗体、 アンタゴニスト又はインヒビターを、ＰＴＥＣが、特定の組織又は炎症部位に単 球、マクロファージ、及び好酸球を誘引しないようにするために反応亢進の患者 に投与することもできる。このような投与により免疫応答が緩和され、不当な組 織破壊を引き起こすタンパク分解酵素の過剰な分泌や放出が防止される。 本発明は又、ポリペプチド、抗体、アンタゴニスト、又はインヒビターを含む 医薬品組成物をその範囲に含む。これらの分子は、ウィルス、細菌、心筋又は寄 生虫の感染症；アレルギー又は喘息応答；外傷が関与する機械的損傷；動脈硬化 症、アテローム発生又は膠原血管病；慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性 エリテマトーデス、又は溶血性貧血のような自己免疫疾患；白血病、リンパ腫、 又は癌腫；ＡＩＤＳ、Ｘ染色体性無ガンマグロブリン血症、毛細血管拡張性運動 失調、肝硬変症、嚢胞性繊維症、真性糖尿病、肝炎及び鎌形赤血球貧血、又は白 血球、特に単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞及びＴ細胞の 活性化や過剰な増殖を伴う即時型過敏症の疾患のような病気の予防や治療のため に役立つ。図面の簡単な説明 第１図は、ヒト前立腺に由来する新規なＲＡＮＴＥＳホモログＰＴＥＣの核酸 配列（配列番号：１及び予測アミノ酸配列（配列番号：２）を示した図である。 この核酸及びアミノ酸配列のアライメントは、MacＤＮＡsisソフトウェア（Hita chi Software Engineering社）を用いて作成された。 第２図は、ＰＴＥＣ（配列番号：２）、マウスＲＡＮＴＥＳ（GenBank ＧＩ 4 75206;Shin ＨＳ et al(1994)Mol Cell Biol 14:2914-25）、ヒトＲＡＮＴＥＳ （ＧＩ 134510;Schall ＴＪ et al(1988)Ｊ Immunol 141:1018-25）、及びＭＩ Ｐ-1α（ＧＩ 182847 Blum Ｓ et al(1990)ＤＮＡ Cell Biol 9: 589-602）の間のアミノ酸配列アライメントを示した図である。これらの配列の アライメントは、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのマルチシーケンスアライメント プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Inc,Madison ＷＩ）を用いて作成された。 第３Ａ（１）図、第３Ａ（２）図、第３Ｂ（１）図、及び第３Ｂ（２）図、及 び第３Ｃ（１）図及び第３Ｃ（２）図は、それぞれMacＤＮＡsisソフトウェアを 用いて作成されたＰＴＥＣ、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＩＰ−１αの疎水性（１）及 び等電点（２）プロットを示した図である。発明の実施の形態 本発明は、その核酸配列が前立腺ｃＤＮＡライブラリー（ＰＲＯＳＮＯＴ07） 由来のインサイト社クローンＮｏ．836820内で同定された、新規なヒトＲＡＮＴ ＥＳホモログに関するものであり、また疾病の研究、診断、予防、及び治療にお ける、第１図に示されたポリヌクレオチド（小文字のｐｔｅｃ）及びポリペプチ ド（大文字のＰＴＥＣ）の使用に関するものである。 ＰＴＥＣは９３個のアミノ酸からなる長さを有し、約２２残基のシグナル配列 、βケモカインの固有のシステイン残基(Ｃ₃₂-₃₃、Ｃ₅₆及びＣ₇₂；第２図）を有 する。成熟タンパク質の、シグナル配列の先にある残基は、マウスＲＡＮＴＥＳ （GenBank ＧＩ 475206;Shin ＨＳ et al(1994)Mol Cell Biol 14:2914-25）に 対して約７０％のアミノ酸相同性を有し、その等電点の特性についてはこの分子 と最も類似している。成熟ＰＴＥＣは、残基Ｇ₂₅-Ｄ₂₇、Ｃ₃₂-Ｆ₃₄、Ｙ₃₆、Ｌ₄₁ -Ｐ₄₂、Ｖ₄₆、及びＹ₄₉において成熟マウスＲＡＮＴＥＳと同一のアミノ酸を有 している。ＰＴＥＣは、成熟ヒトＲＡＮＴＥＳ（ＧＩ 134510;Schall ＴＪ et a l（1988）Ｊ Immunol 141:1018-25）に対して約６８％のアミノ酸相同性を有し 、又成熟ＭＩＰ−１α（ＧＩ 182847;Blum Ｓ et al(1990)ＤＮＡ Cell Biol 9: 589-602） に対して約６７％のアミノ酸相同性を有する。ＰＴＥＣとＭＩＰ−１αの疎水性 プロットは互いに平行であるように見えるが、ＰＴＥＣとＭＩＰ−１αの等電点 が、それぞれ１０．６３及び４．６０であることに注意しなければならない（第 ３Ａ（２）図及び第３Ｃ（２）図）。 この核酸配列、そのオリゴヌクレオチドやフラグメントや部分、若しくはその アンチセンス分子は、体液又はバイオプシー用に採取された組織の診断試験に置 いてｐｔｅｃの発現を検出するために用いることができる。例えば、自己免疫組 織破壊が過剰なレベルに達する前に患者におけるｍＲＮＡの存在を検出したり、 或いは炎症治療中にｐｔｅｃレベルをモニタするために、ｐｔｅｃ配列を用いる ことができる。この核酸配列は又、過敏性免疫応答を患う患者におけるゲノムの 核酸配列の発現を、特に組織破壊を防止すべく減らしたり、無くしたりする場合 に役立つアンチセンス分子を設計するために用いることができる。本発明は又、 発現ベクターにこのポリヌクレオチドを封入することにも部分的に関連しており 、この発現ベクターは宿主細胞や生物体を形質転換するのに用いることができる 。このような遺伝子組換え宿主は、コードされたＰＴＥＣの産生や回収のために 役立つ。 本発明は更に、天然ＰＴＥＣの検出のための診断用キットを提供する。このキ ットは精製ＰＴＥＣをポジティブコントロールとして使用し、抗体を産生したり 、ＰＴＥＣに結合する他のアンタゴニストやインヒビターを同定するためのもの である。抗ＰＴＥＣ抗体は、血液や尿のような体液、又はバイオプシー用に採取 された、ＰＴＥＣを発現する組織の抽出物におけるＰＴＥＣレベルをモニタする のに役立つ。 本発明は更に、白血球増殖を誘導する目的で、免疫無防備状態の患者に対して 精製ＰＴＥＣを投与することもその範囲に含む。同様に、抗体、アンタゴニスト 又はインヒビターを、ＰＴＥＣが、特定の組織又は炎症 部位に単球、マクロファージ、及び好酸球を誘引しないようにするために反応亢 進の患者に投与することもできる。このような投与により免疫応答が緩和され、 不当な組織破壊を引き起こすタンパク分解酵素の過剰な分泌や放出が防止される 。 本発明は又、ポリペプチド、抗体、アンタゴニスト、又はインヒビターを含む 医薬品組成物をその範囲に含む。これらの分子は、ウィルス、細菌、心筋又は寄 生虫の感染症；アレルギー又は喘息応答；外傷が関与する機械的損傷；動脈硬化 症、アテローム発生又は膠原血管病；慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性 エリテマトーデス、又は溶血性貧血のような自己免疫疾患；白血病、リンパ腫、 又は癌腫；ＡＩＤＳ，Ｘ染色体性無ガンマグロブリン血症、毛細血管拡張性運動 失調、肝硬変症、嚢胞性繊維症、真性糖尿病、肝炎及び鎌形赤血球貧血、又は白 血球、特に単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞及びＴ細胞の 活性化や過剰な増殖を伴う即時型過敏症の疾患のような病気の予防や治療のため に役立つ。 本明細書において「核酸配列」なる用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチ ドまたはポリヌクレオチド配列、及びそのフラグメントまたは一部分の配列を意 味し、且つ、一本鎖または二本鎖でありセンス鎖かアンチセンス鎖の何れかを表 すゲノムの若しくは合成のＤＮＡかＲＮＡを意味する。同様に、本明細書におけ るアミノ酸配列とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパ ク質配列を意味する。 （Ｐ６Ｄ）本明細書における「ペプチド核酸配列」とは、リジンのようなアミ ノ酸残基やアミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小 分子は抗遺伝子剤とも称され、それらに対する核酸の相補的（鋳型）鎖と結合す ることによって転写物伸長を停止させる（Nielsen ＰＥ et al.(1993)Anticance r Drug Des 8:53-63）。 本明細書において、ＰＴＥＣとは、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、好ま しくはヒトを含む任意の種に由来するＰＴＥＣを意味する。ＰＴＥＣは天然のも のか、天然の、合成の、半合成の、又は組換え体何れかの源に由来するＰＴＥＣ である。ここで、「天然（または自然発生）」とは、天然に見出されるアミノ酸 配列を意味する。 本発明は、ＰＴＥＣ変異体をその範囲に含む。好適なＰＴＥＣ変異体は、該ア ミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列の類似性を有するものであ り、より好ましいＰＴＥＣ変異体は９０％のアミノ酸配列の類似性を有するもの であり、最も好ましいのはＰＴＥＣアミノ酸配列（配列番号：２）と９５％のア ミノ酸配列の類似性を有する変異体である。ＰＴＥＣの「変異体」は、１または ２個以上のアミノ酸「置換」によって異なるアミノ酸配列を有し得る。この変異 体は、例えばロイシンからイソロイシンへの置換のような、構造的または化学的 特性が類似したアミノ酸で置換される「保存的」変化を有し得る。頻度はより少 ないが、変異体は、例えばグリシンからトリプシンへの置換のような、「非保存 的」変化を有し得る。類似した小変異体は、アミノ酸の欠失や挿入、或いはその 双方を含み得る。例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのような従来のコンピュー タプログラム技術を用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに、置換、 挿入、または除去できるアミノ酸の数を決定する方法が周知となっている。 「生物学的に活性」なる用語は、天然ＰＴＥＣの構造的、調節性の、または生 化学的機能を有するＰＴＥＣを意味する。同様に、「免疫学的活性」とは、天然 、組換体、または合成ＰＴＥＣ、またはその任意のオリゴペプチドの、適当な動 物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能力として定 義される。 本明細書において「誘導体」なる用語は、ｐｔｅｃまたはコード化さ れたＰＴＥＣの化学的修飾を意味する。このような修飾の例には、水素からアル キル基、アシル基、またはアミノ基への置換がある。ＰＴＥＣ誘導体は、天然Ｐ ＴＥＣの必要不可欠な生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードしてい る。 本明細書において「精製」なる用語は、その天然の環境から取り除かれ、天然 にはそれが結合して存在する少なくとも１つの他の成分から単離または分離され た核酸配列またはアミノ酸配列を有する分子を意味する。 ＰＴＥＣコーディング配列 ＰＴＥＣの核酸配列及び予測アミノ酸配列を第１図に示す。本発明によれば、 ＰＴＥＣのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＰＴＥＣを発現 する組換え分子を生成することができる。ここに開示する特定の実施例では、ｐ ｔｅｃの配列は、前立腺ｃＤＮＡライブラリー（ＰＲＯＳＮＯＴ07）に由来する インサイト社クローンＮｏ．836820の中から初めに単離された。前記ライブラリ ーについては、１９９６年２月２７日に出願された、Sruartらによる“Polynucl eotides and Polypeptide Derived from Human Prostate”なる名称の米国特許 出願第６０／０１２，６８９号に記載されており、本明細書と一体に参照された い。 ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，Ｓ ｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）のクラノウフラグメント（ＵＳ Biochemical社,Cleve land ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin elmer社，Foster City ＣＡ）、熱 安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Amersham社，Chicago ＩＬ）、或いはGibco ＢＲＬ（ Gaithersburg ＭＤ）Methods社から市販されているＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システ ムのような組換えポリメ ラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素 を使用する。 対象のＤＮＡ鋳型にアニールされたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡ を延長する方法は、一本鎖鋳型及び二本鎖鋳型の両方に対して開発されてきてい る。連鎖終了反応の生成物は電気泳動を用いて分離され、それに組み込まれた標 識された前駆体を介して検出される。最近の機械化さた反応調製、配列決定並び に解析における改善によって、１日当たりの決定できる配列数が増えた。好適に はこの処理は、Hamilton Micro Lab2200（Hamilton社,Reno ＮＶ）、Peltier Th ermal Cycler(PTC200;ＭＪ Reserch社,Watertown ＭＡ)並びにApplied Biosyste ms（Perkin Elmer）、及びCatalyst800及び377及び373ＤＮＡシーケンサのよう な装置を用いて自動化される。 特定のｃＤＮＡライブラリの品質は、ｃＤＮＡのパイロットスケール分析を実 行することにより、さらにはクローン含有ベクター、λ或いはＥ．ｃｏｌｉ Ｄ ＮＡ、ミトコンドリア或いは反復ＤＮＡ、並びに公的データベースに厳密に一致 、或いは相同的に一致するクローンのパーセンテージを検査することにより決定 される。 ポリヌクレオチド配列の延長 ポリヌクレオチド配列ｐｔｅｃは、部分的なヌクレオチド配列と、プロモータ 及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には周知の様々な 方法とを用いて延長することができる。Gobinda等（1993;ＰＣＲ Methods Appli c 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために汎用プライマ ーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ） を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対して特異的な プライマー及 びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅される。増幅された配列は、 その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異的 プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣＲの各回の生成物は、適 切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される 。 逆ＰＣＲ法は、既知領域に基づく分岐プライマーを用いて配列を増幅、または 延長するために用いることができる（Triglia等（1988）Nucleic Acids Res 16: 8186）。プライマーは、Ｏｌｉｇｏ４．０（National Biosciences社，Plymouth ＭＮ）或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２２−３０ヌク レオチドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８−７２℃の温度で標的 配列にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知 領域における適切なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内 ライゲーションにより環状にされ、ＰＣＲ鋳型として使用される。 キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom Ｍ等（1991）ＰＣＲ Methods Applic 1:111 -19）は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接す るＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅をするための方法である。またキャプチャＰ ＣＲでは、多数の制限酵素の消化及びライゲーションによってＰＣＲ前にＤＮＡ 分子の未知の部分に、工学的処理をなされた二本鎖配列を配置する必要がある。 Parker ＪＤ等（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60）は、歩行ＰＣＲ、すな わち未知の配列の検索ができる標的遺伝子歩行のための方法を教示している。Ｐ ｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（登録商標）、Clontech社（Palo Alto ＣＡ）から 入手できる新しいキットでは、ＰＣＲ、入れ子状（nested）プライマー並びにプ ロモータファインダライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩行させる。この 過程は、ライブラリーをス クリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有用 である。 別のＰＣＲ方法としては、Guebler等による１９９５年６月７日出願の米国特 許第０８／４８７，１１２号「Improved Method for Obtaining Full Length ｃ ＤＮＡ Sequences」に開示されたものがあり、この明細書を本明細書と一体に参 照されたい。この方法では、ＸＬ−ＰＣＲ（登録商標）（Perkin elmer社,Foste r City ＣＡ）を用いて、ヌクレオチド配列を増幅、並びにまた延長する。 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選 択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムに初回 刺激を与えられた（primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流領域を含む より多くの配列を含むという点で好適である。ランダムに初回刺激を与えられた ライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しない場 合、特に有用ある。ゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の５’を延長す るために有用である。 サイズがどのくらいかを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌ クレオチド配列を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。 迅速な配列決定のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社 （Fullerton ＣＡ）並びに他の企業から入手できる。キャピラリー電気泳動法で は、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる 蛍光色素（各ヌクレオチドに対して１つ）を使用し、ＣＣＤカメラによる放射線 の波長の検出を行う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer 社製のGenotyper（登録商標）及びSequence Navigator（登録商標））を用いて 電気信号に変換され、サンプルのロードからコンピュータ解析及 び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。キャピラリー電気泳 動法は特定のサンプルの限定された量の中に存在するＤＮＡの小片の配列決定に 特に適している。この方法により３０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐ を再現可能な形で配列決定できたことが報告されている（Ruiz-Martinez ＭＣ等 （1993）Anal Chem 65:2851.8）。 ヌクレオチド配列の発現 本発明に従って、ＰＴＥＣ、そのポリペプチドのフラグメント、融合タンパク 質或いはその機能的等価物をコードするｐｔｅｃポリヌクレオチド配列を、適切 な宿主細胞内でのＰＴＥＣの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために 用いることができる。遺伝子コードの固有の縮重のために、概ね同一か或いは機 能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＰＴＥＣのクローン 化や発現のために用いることができる。当業者には理解できるように、非自然発 生コドンを有するＰＴＥＣコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であ り得る。特定の原核宿主或いは真核宿主において好適なコドン（Murray Ｅ等（1 989）;Nucleic Acids Res 17:）を、例えば、ＰＴＥＣ発現率を増大させたり、 或いは自然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような望ましい特 性を有する組換えＲＮＡ転写産物を生成したりするように選択することができる 。 また本発明の範囲に含まれるものとして、中程度から最高度の厳密性の条件の 下で、第１図のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配 列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmel（1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol 152,Academic Pres s,San Diego ＣＡ）により教示され、ここで引用して組み込んでいるように、核 酸結合複合体の融点（Ｔ ｍ）に基づいており、以下に説明するように、定義された「厳密性」を与える。 「最高度の厳密性」は典型的に約Ｔｍ５℃（プローブのＴｍより５℃下）で発 生し、「高度の厳密性」はＴｍの約５〜１０℃下で発生し、「中程度の現密性」 はＴｍの約１０〜２０℃下で発生し、「低度の現密性」はＴｍの約２０〜２５℃ 下で発生する。当業者には理解できるように、最高度に厳密なハイブリダイゼー ションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、すなわち検出するために用いる ことができるが、一方中程度（或いは低度）に厳密なハイブリダイゼーションは 類似の、すなわち近縁なポリヌクレオチド配列を同定、つまり検出するために用 いられる。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は「核酸の鎖が塩基対合 を介して相補鎖と結合する過程」（Coombe Ｊ(1994)Dictionary of Biotechnolo gy,Stockton Press社,New York）を含む概念である。従って定義により、ハイブ リダイゼーションは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実行されるような 増幅のプロセスを含むものである。このＰＣＲ技術についてはDieffenbach ＣＷ and ＧＳ Dveksler（1995,ＰＣＲ Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring H arbor Press社,New york）の論文に記載されており、本明細書と一体に参照され たい。 本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミ ノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定 義される。 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、天然ｐｔｅｃに比べて、結果 的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の加わるようなヌクレオ チド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。 本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ 酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによっ て生ずる変化を指す。 本発明において用いられ得る改変ｐｔｅｃ核酸配列は、異なるヌクレオチド残 基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的に等価のＰＴ ＥＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなる。そのタンパク質も、サ イレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に機 能的に等価なＰＴＥＣとなる。慎重なアミノ酸置換は、ＰＴＥＣの生物学的活性 が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びに また両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミ ノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸には リジン及びアルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ帯電しない極性頭基を有する アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパ ラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが 含まれる。 本発明の範囲に含まれるものとして、ｐｔｅｃのアレルがある。ここで用いる 「アレル」或いは「アレル配列」とは、ｐｔｅｃの別の形態である。アレルは突 然変異、すなわち核酸配列の変化に起因し、一般に改変ｍＲＮＡ或いはポリペプ チドを生成し、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変更される 場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態がないもの 、１つあるもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生じる変異は一般に 、アミノ酸の欠失、付加並びに置換に起因する。このタイプの変化はそれぞれ単 独で、或いは他の遺伝子の組み合わせで、与えられた配列内一回またはそれ以上 の回数生じ得る。 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが遺伝子生成物のクローニング、 プロセッシング並びにまた発現を変化させる変更を含む、様々 な目的のＰＴＥＣコード配列を変更のために遺伝子工学的処理をなされ得る。例 えば、変異は、当業者には周知の技術、例えば特定部位突然変異誘発を用いて導 入され、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変 化等をもたらすことができる。 本発明の別の実施例では、天然ｐｔｅｃ、変更ｐｔｅｃ或いは組換えｐｔｅｃ が、異種の配列に結合され、融合タンパク質をコードする配列となる。例えば、 ＰＴＥＣ活性のインヒビターを選び出すべくペプチドライブラリをスクリーニン グするために、市販の抗体により認識される異種のペプチドを発現するキメラＰ ＴＥＣタンパク質をコード化することが役立つことがある。融合タンパク質はＰ ＴＥＣ配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部位を包含するように設 計することもでき、これによってＰＴＥＣを切断して、異種の部分から分けて精 製することが可能となる。 本発明の別の実施例では、ｐｔｅｃのコード化配列は、当業者によく知られた 化学的方法を用いて、（Caruthers等（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-22 3、Crea,Horn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers（1980）Tet rahedron Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照） 全体的に、或いは部分的に合成することができる。別法では、ＰＴＥＣアミノ酸 配列を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体を 生成することができる。例えばペプチドを固相技術で合成して、樹脂から切り離 し、さらに分離高速液体クロマトグラフィにより精製することができる（例えば Creighton（1983）Proteins Structure And Molecular Principles,ＷＨ Freema n and Co,New York参照）。合成されたペプチドの構成は、アミノ酸解析或いは 配列決定処理により確認することができる（例えばthe Edman degradation proc edure;Creighton,上述）。 加えて、ＰＴＥＣのアミノ酸配列或いはその任意の部分を、その直接の合成の際 に変更したり、他のタンパク質或いはその任意の部分から得られた配列と化学的 方法を用いて結合したり、またはこの両方の処理を行って、変異体ポリペプチド を生成することができる。 発現系 生物学的に活性のＰＴＥＣを発現するために、ＰＴＥＣをコード化したヌクレ オチド配列、或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入された コード化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。 ＰＴＥＣコード化配列及び適切な転写や翻訳の制御要素を含む発現ベクターを 構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in vitro 組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え即ち遺伝子組換え技術が含 まれる。このような技術は、Maniatis等（1989）Molecular Cloning,Ａ Laborat ory Manual，Cold Spring Harbor Press,Planview ＮＹ及びAusubel ＦＭ等Curr ent Protocol in Molecular Biology,John Wilky ＆Sons,New John Wilky ＆So ns,New Yorkに記載されている。 種々の発現ベクター／宿主系が、ＰＴＥＣコード化配列を保持し発現するため に利用される。このようなものには、限定はされないが、組換えバクテリオファ ージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換したバクテリア 、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベクター（例えばバ キュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリ フラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）をトラン スフェクトした、或いはバクテリア発現ベクター（例えばＴｉ，或いはｐＢＲ３ ２２プラス ミド）で形質転換した植物細胞系、或いは動物細胞系を含む。 これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は 様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサ、プロモータ及び３’非翻訳領域で あり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作用 する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを含 む、任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、バクテ リア系においてクローニングする際には、Bluescript（商標）phagemid（Strata gene社,LaJolla ＣＡ）のｈｙｂｒｉｄ ｌａｃＺプロモータ及びｐｔｒｐ−ｌ ａｃ ｈｙｂｒｉｄ並びに同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイ ルスポリヘドリンプロモータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム （例えば熱ショック，ＲＵＢＩＳＣＯ及びストレージタンパク質遺伝子）に由来 する、或いは植物ウイルス（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダ配列）に 由来するプロモータ或いはエンハンサはベクターにクローン化され得る。哺乳動 物細胞では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモータが最適で ある。ｐｔｅｃの多数の複製を含む株細胞を生成する必要がある場合には、ＳＶ 40或いはＥＢＶに基づくベクターを、適切な選択マーカーと共に用いる。 細菌系では、ＰＴＥＣに対する所期の使用に応じて多数の発現ベクターが選択 され得る。例えば抗体を誘発するために大量のＰＴＥＣが必要とされる場合は、 容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を可能とするベクターが望ま れる。そのようなベクターには、限定はしないが、Ｅ.coliクローニング及び発 現ベクターBluescript（商標）(このベクターにおいて、ｐｔｅｃコード化配列 が、アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を 用いてフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッドタンパク質が生成 される)や、 ｐＩＮベクター（Van Heeke＆Schuster（1989）Ｊ Biol Chem 264:5503-5509） 等が含まれる。またｐＧＥＸベクター（Promage社、MadisonＷＩ）もグルタチオ ンＳ−トランスファーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として異種ポリペプ チドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性で あり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタチオンの存在 下における溶出により溶解した細胞から容易に精製できる。その系において生成 されたタンパク質はヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位 を含むように設計され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意にＧＳＴ部分 から放出され得る。 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因 子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成的或いは誘導性プロモータ を含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出） 及びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。 植物発現ベクターを用いる場合には、ＰＴＥＣコード化配列の発現は、多数の 任意のプロモータにより推進される。例えばＣａＭＶの35Ｓ及び19Ｓプロモータ （Brisson等（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルス性プロモータは、 単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu等（1987）ＥＭＢＯ Ｊ 6:307.311）からのオ メガーリーダー配列と共に用いられる。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯ（Coruzzi等 （1984）ＥＭＢＯ Ｊ 3:1671-1680）、Broglie等（1984）Science 224:838-843 ）の小サブユニット、或いは熱ショックプロモータ（WinterＪ及びSinibaldi Ｒ Ｍ（1991）Results Probl Cell Differ 17:85-105）のような植物プロモータが 用いられる。これらの構成は直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介トランスフェ クションにより植物細胞内に導入される。そのような技術を再検討する場合 には、Hobbs Ｓ及びMurry ＬＥ、McGraw Yearbook of Science and Technology （1992）McGraw Hill ＮＹ,pp191-196及びWeissbach and Weissbach（1988）Met hods for Plant MolecularBiology,Academic Press ＮＹ,pp421-463を参照され たい。 ｐｔｅｃを発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。そ のような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰ Ｖ）がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusi a の幼虫において外来遺伝子を発現する。ｐｔｅｃコード化配列は、ポリヘドリ ン遺伝子にような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプ ロモータの制御下に置かれる。ｐｔｅｃの挿入が成功した場合には、ポリヘドリ ン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスを生成す る。変異体ウイルスはそれからS.frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫への 感染させるために用いられ、その中でＰＴＥＣが発現される（Smith等（1983） Ｊ Virol 46:584、Engelhard ＥＫ等（1994）Proc Nat Acad Sci 91:3224-7）。 哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現 ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＰＴＥＣコード化配列は 、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体 内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須Ｅ1或いはＥ3領域における挿入によ り、結果的に感染した宿主細胞におけるＰＴＥＣを発現することができる生存可 能なウイルスになる（Logan及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659 ）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エンハンサを 哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるために用いることができる。 また、挿入されるｐｔｅｃ配列の有効な翻訳のためには、特定の開始 信号も必要である。これらの信号には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接の配列が含ま れる。ＰＴＥＣ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入 される場合には、追加の翻訳制御信号は不要である。しかしながらコード化配列 、或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻 訳制御信号が与えられなければならない。さらに、開始コドンは正確なリーディ ングフレーム内部にある必要があり、全インサートの転写を確実に行わなければ ならない。外来転写素子及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由 来するものであり得る。発現の効果は、その細胞系に適切なエンハンサを含める ことにより強められる（Scharf等（1994）Results Probl Cell Differ 20:125-6 2、Bitter等（1987）Methods Enzymol 153:516-544）。 さらに宿主細胞株は、望ましい形に、挿入された配列を変更したり、発現した タンパク質のプロセシングを行う能力を求めて選択される。このようなポリペプ チドの修飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、 リン酸化、脂質化（リピデーション）並びにアシル化を含む。またタンパク質の プレプロ形態を切り離す翻訳後プロセッシングは、正確な挿入、折り畳み、並び にまた機能を正しく発揮するために重要である。ＣＨＯ，ＨｅＬａ，ＭＤＣＫ， 293，ＷＩ38等のような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定 の細胞機構及び特徴的な機構を有しており、導入される外来タンパク質の修飾や プロセシングを確実に実行するべく選択される。 長期的で高収率の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定した発現 が望ましい。例えばＰＴＥＣを安定的に発現する株細胞は、ウイルス由来の複製 物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを 用いて形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地に切り替え られる前に、濃縮培地内で１〜２日 間成長させられる。選択マーカーは選択物への耐性を与え、導入された配列をＤ ＮＡ内に安定的に結合する細胞を同定できるようにする。安定的に形質転換され た細胞の耐性凝集塊はその細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖することが できる。 形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができ る。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler 等（1977）Cell 11:223）及びアデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ （Lowy等（1980）Cell 22:817）遺伝子を含み、それぞれtk^-及びaprt^-細胞にお いて用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基 礎として用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性 を与え（Wigler等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、ｎｐｔはアミノグリコシッ ド剤、ネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え（Colberre-Garapin等（ 1981）Ｊ Mol Biol 150:1）、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（chlorsu lfuron）、フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotrici n acetyltransferase）に対する耐性を与える（上記Murry）。さらに選択可能な 遺伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できる ようにするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を 利用できるようにするｈｉｓＤが記載されている(Hartman及びMulligan(1988)Pr oc Nalt Acad Sci 85:8047）。最近になって、形質転換体を同定するためばかり ではなく、特定ベクター系が要因となる一過性の或いは安定なタンパク質発現の 量を定量するために広く用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及び ルシフェリンのような標識を用いる、可視標識が非常によく用いられるようにな った(Rhodes ＣＡ等(1995)Methods Mol Biol 55:121-131)。 本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定 標識遺伝子発現の存在／不在は、対象の遺伝子も存在することを示唆するが、 その存在及び発現は確認されるべきである。例えばもしｐｔｅｃが標識遺伝子配 列内に挿入されるなら、ｐｔｅｃを含む組換え細胞が標識遺伝子の機能の存在に より同定できる。別法では標識遺伝子は、単一プロモータの制御下でｐｔｅｃ配 列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じての標識遺伝子の発現 は、通常さらにｐｔｅｃの発現をも示す。 この他、ｐｔｅｃのコード化配列を含み、さらにＰＴＥＣを発現する宿主細胞 が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定はし ないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び、核 酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片ベース技 術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。 ｐｔｅｃポリヌクレオチド配列の存在は、ｐｔｅｃのプローブ、一部、或いは フラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーシ ョン或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは 、ｐｔｅｃ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用し、ｐｔｅ ｃのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。本明細書において「オリ ゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いはアンプリマー（am plimer）として用いることができる、少なくとも１０ヌクレオチド、多い場合に は６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２ ５ヌクレオチドの核酸配列を指す。 ＭＣＰ−４タンパク質の発現による生成物の評定は、生物学的には走 化性またはＣａ＋＋動員アッセイにより、免疫学的にはウェスタンブロット法や 、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）等により行うことができる。 Falk ＷＲ等(1980,Ｊ Immunol Methods 33:239)は、初めて４８穴マイクロケ モタキシスチャンバを用いた走化性の活性の評定について記した。このアッセイ では、発現されたケモカインを、ポリカーボネイトフィルタの一方の側の培地に 入れ、特定の細胞の集団をフィルタの他方の側の同じ培地に懸濁する。十分なイ ンキュベーション時間をおくと、ケモカインの濃度勾配に応じて細胞がフィルタ を通過する。次いで、各ウェルからフィルタを回収し、フィルタのケモカイン側 に付着した細胞の型を調べ定量する。 このようなアッセイにおいて用いられる細胞の集団には、静脈穿刺によって得 られた血液細胞又は密度勾配円心分離法か、不必要な集団の表面分子に対して特 異的な抗体を用いるネガティブ選択法か、或いはその両方を用いて得られる好中 球、末梢血液の単核細胞、単球、及びリンパ球の高濃度の集団が含まれる。例え ば、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団をインキュベートし、ＣＤ４＋結合細胞を分離するこ とにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞が高濃度のＴ細胞集団が得られる。 ＰＴＥＣの非走化性の活性をアッセイするためには、試験においてＣａf⁺⁺の 動員を測定し、その測定結果と標準の測定値とを比較する。シグナル伝達経路の 一部としてのＣａ⁺⁺の動員に対するアッセイには、その放射特性がＣａ⁺⁺結合に より変化する抵抗プローブと共に単球を前負荷することが必要である。細胞が活 性化刺激に曝されたとき、蛍光光度計における細胞の観察によってＣａ⁺⁺流動が 決定される。Ｃａ⁺⁺動員の特定についてはGrynkievicz Ｇ et al（1985）Ｊ Bio l Chem 260:3440,and McColl Ｓ et al(1993)Ｊ Immunol 150:4550-4555によ り説明されており、本明細書と一体に参照されたい。単球活性の別の測定法は、 リンパ球における接着分子発現についてのアッセイである(Jiang Ｙ et al（199 2）Ｊ Immunol 148:2423-8;Taub Ｄ et al(1993)Science 260:355-358)。 タンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれか を用いて、ＰＴＥＣポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロト コルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合免 疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表示式細胞 分取器法（ＦＡＣＳ）を含む。ＰＴＥＣポリペプチド上で２つの非干渉なエピト ープに対して応答するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イ ムノアッセイ（two-site,monoclonal-based immunoassay）は好適ではあるが、 競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、Ha mptonＲ等(1990,Serologivcal Methods,a Laboratory Manual,ＡＰＳ Press,St Paul ＭＮ）及びMaddox ＤＥ等（1983,Ｉ Exp Med 158:1211）等に記載されてい る。 さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸検査法において用いることができる。ｐｔｅｃに関連する配列を検出するた めの標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための 手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標識 されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法では、ｐｔｅｃ配列、 或いはその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニ ングされる。そのようなベクターは当分野では周知であり、市販されており、Ｔ ７，Ｔ３或いはＳＰ６並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリ メラーゼの付加により、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用い ることができる。 Pharmacia Biotech社（Piscataway ＮＪ）、Promega社（MadisonＷＩ）並びに ＵＳ Biochemical社（Cleveland ＯＨ）のようないくつかの企業がこれらの手順 に対する商用のキット及びプロトコルを提供する。適切なリポーター分子、すな わち標識には、放射性核種、酵素、蛍光性、化学ルミネセンス或いは色素性因子 及び基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含まれ る。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７ 号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５ 号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号並びに第４，３３６，２ ４１号がある。また、組換え免疫グロブリンが米国特許第４，８１６，５６７号 に示されており、本明細書とともに参照されたい。 ＰＴＥＣの精製 ＰＴＥＣヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地からコード 化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養される。組換え細胞 により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクターに応じて、 細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。ｐｔｅｃを含む発現 ベクターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通してのＰＴＥＣを分泌を誘導す るシグナル配列を含むように設計される。他の組換え構成物では、ｐｔｅｃを、 可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレ オチド配列に結合することができる(Kroll ＤＪ等(1993)ＤＮＡ Cell Biol 12:4 41-53、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照されたい)。 またＰＴＥＣは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２以 上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質 として発現される。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが 、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのよ うな金属キレートペプチド（PorathＪ(1992)Protain Expr Purif 3:263-281）、 固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにＦ ＬＡＧＳ延長／アフィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immune x社、Seattle ＷＡ）が含まれる。精製ドメイン及びＰＴＥＣ間の第ＸＡ因子或 いはエンテロキナーゼ（Invitrogen,San Diego ＣＡ）のような切断可能なリン カー配列を含めるのは精製を容易にするのに役立つ。 ＰＴＥＣの使用 ＰＴＥＣ配列の診断及び治療的な使用の原理は、核酸及びアミノ酸配列、それ らのＰＴＥＣ、ＲＡＮＴＥＳ及びＭＩＰ−１α（第２図、第３Ａ（１）図及び（ ２）図、第３Ｂ（１）図及び（２）図、第３Ｃ（１）図及び（２）図）に対する 相同性、及び、ＰＲＯＳＮ０Ｔ07ｃＤＮＡライブラリーにおけるｐｔｅｃ転写物 の存在に基づいている。 核酸配列（配列番号：１）、その相補配列、フラグメントまたはオリゴマー、 及び抗ＰＴＥＣ抗体を診断用組成物として用いて、ｐｔｅｃの発現のための生物 学的サンプルの抽出物や体液をアッセイすることができる。精製ポリヌクレオチ ド及びポリペプチドを、それらの各核酸またはタンパク質を基礎とするアッセイ におけるポジティブコントロールとして用いて、特定の病気や疾患の予備診断の 際に、或いは治療の過程において、ｐｔｅｃの確認及び定量を行うことができる 。 核酸配列、その相補配列、フラグメントまたはオリゴマー、及び抗ＰＴＥＣ抗 体は、ｐｔｅｃの発現が関係する疾病の評価において役立つ。白血球、特に、単 球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞 及びＴ細胞の活性化または過剰増殖は、ウィルス、細菌、心筋又は寄生虫の感染 症；アレルギー又は喘息応答；外傷が関与する機械的損傷；動脈硬化症、アテロ ーム発生又は膠原血管病；慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマト ーデス、又は溶血性貧血のような自己免疫疾患；白血病、リンパ腫、又は癌腫の ような病気や疾病と関連を有する。例えば、年齢６９歳の男性から採取された前 立腺組織におけるｐｔｅｃの発現は、天然タンパク質の発現や分泌が、腺癌、良 性の前立腺肥大、及び関連する感染症の何れかまたは全部と関連していることを 示唆している。 ＲＡＮＴＥＳホモログとしてのＰＴＥＣは、アレルギー、喘息、鼻炎、じんま 疹、及び皮膚炎のような、ＩｇＥと細胞表面受容体との相互作用によって発生す る即時型過敏症の疾病と密接な関連を有しているようである。（扁桃腺、アデノ イド、鼻ポリープ、または皮膚における）好塩基球及びマスト細胞上での受容体 摂動が細胞内カルシウムイオンの動員を活性化し、分泌顆粒の放出、生理活性脂 質メディエータ及び血小板活性化因子の形成を起こさせる。この用途の組換えヌ クレオチド及びタンパク質は、即時型過敏性応答におけるＰＴＥＣの活性を調節 する能力を与える。 精製組換えタンパク質は、特にＴリンパ球増殖を刺激すべく免疫無防備状態の 患者に投与することができる。免疫不全疾患には、限定はしないが、ＡＩＤＳ、 Ｘ染色体性無ガンマグロブリン血症、毛細血管拡張性運動失調、肝硬変症、嚢胞 性繊維症、真性糖尿病、肝炎及び鎌形赤血球貧血が含まれる。 精製核酸配列、アンチセンス分子、ＰＮＡ、精製タンパク質、抗体、アンタゴ ニスト、またはインヒビターは全て、医薬品組成物として用いることができる。 これらの分子の治療目的でのデリバリーは、医薬品組 成物の項で更に説明する。最も適切な治療は、患者や、特定の診断、及び患者の 治療にあたり病状を監視している外科医によって決まる。 ＰＴＥＣの抗体 ＰＴＥＣに対する抗体の生成のために、当分野においてよく知られる手順が用 いられる。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノク ローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現 ライブラリにより生成されるフラグメントが含まれる。中和抗体、すなわちＰＴ ＥＣポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、特に診断及び治療に好適である 。 抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は 、免疫学的特性を保持するＰＴＥＣポリペプチド或いはその任意の部分、フラグ メント或いはオリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。宿主 種に応じて、種々のアジュバントが免疫学的応答を促進するために用いられる。 そのようなアジュバントには、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸 化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活 性物質アジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュ バント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペット ヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。 ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウムパルヴム（Coryneba cterium parvum）は潜在的に有用なヒトアジュバントである。 ＰＴＥＣに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞による抗体分子 の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これらは、限定はしないが 、Koehler及びMilstein（1975,Nature 256:495-497） に当初掲載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kosb or等（1983）Immunol Today 4:72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026 -2030）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cote等（1985）Monoclonal Antibodi es and Cancer Therapy,Alan Ｒ Liss Inc,pp77-96）を含む。 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ 抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのた めに開発された技術が用いられる（Morrison等（1984）Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855）、Neuberger等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等（1985）Natu re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載された技術（米国 特許第４，９４６，７７８号）が、ＰＴＥＣ特異的一本鎖抗体を生成するために 適用される。 また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo生成を誘導することにより、或い はOrlandi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter Ｇ及びMi lstein Ｃ（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え免疫グロ ブリンライブラリー或いは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングす ることによっても生成することができる。 ＰＴＥＣに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができ る。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、抗体分子のペプシン 消化により生成することができるＦ（ａｂ’）₂フラグメント及びＦ（ａｂ’）₂ フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａ ｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦ ａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブ ラリーが構築さ れる（Huse ＷＤ等（1989）Science 256:1275-1281）。 ＰＴＥＣ特異的抗体は、ＰＴＥＣポリペプチドの発現が関連する状態及び疾患 の診断のために有用である。確立された特異性を有するポリクローナル抗体或い はモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定 量測定法のための種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。そのような イムノアッセイでは、一般に、ＰＴＥＣとその特異的抗体との間の複合体の形成 、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＰＴＥＣタンパク質上の２つの非 干渉性エピトープに対して応答するモノクローナル抗体を利用する二部位モノク ローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイも用いられる。 これらの検査法はMaddox ＤＥ等（1983,Ｊ Exp Med 158:1211）に記載されてい る。 ＰＴＥＣ特異的抗体を用いる診断アッセイ 特定の抗ＰＴＥＣ抗体は、ＰＴＥＣの発現の誘発により特徴付けられる病気、 疾患の診断や、ＰＴＥＣで治療された患者のモニタのためのアッセイに役立つ。 ＰＴＥＣに対する診断アッセイは、ヒトの体液、細胞、組織或いはそのような組 織の切片または抽出物において、ＰＴＥＣを検出するための抗体或いは標識を利 用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾がある、なしに拘わ らず用いることができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或 いは非共有結合かのいずれかでそれらをリポーター分子と結合することにより標 識される。非常に多くのリポーター分子が周知となっており、そのいくつかにつ いては前に説明した。 それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー ナル抗体を用いて、ＰＴＥＣポリペプチドを測定するための 種々のプロトコルが当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法 （ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）並びに蛍光表示式細胞分取器 法（ＦＡＣＳ）がある。ＰＴＥＣポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに 対して応答するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノア ッセイは好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイ は、他にもあるが、Maddox ＤＥ等（1983,Ｉ Exp Med 158:1211）に記載されて いる。 診断の基礎を提供するために、ＰＴＥＣ発現についての通常値、すなわち標準 値が確立されなければならない。これは複合体形成のために適切な条件下で、ヒ ト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或いは細胞抽出 物と、ＰＴＥＣに対する抗体とを結合することにより得ることができるが、これ は当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形成量は、一連のポジテ ィブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定量され、抗体の既知の 量が既知の濃度の精製ＰＴＥＣと結合される。その後正常サンプルから得られた 標準値を、ＰＴＥＣが関係する障害或いは疾患により潜在的に影響を受けた被験 者からのサンプルから得られた値と比較する。標準値と被験値との偏差によって 疾病状態の存在を確認できる。 薬物スクリーニング ＰＴＥＣ、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチド は、種々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニン グのために用いることができる。そのような試験において用いられるフラグメン トは、溶液中で遊離しているか、固体支持体へ付着したものか、細胞表面へ付着 したものか、或いは細胞内への定着したものであり得る。ＰＴＥＣと試験される 薬剤との間の触媒活性、す なわち結合複合体形成の低下が測定される。 薬物スクリーニングのための別の方法は、ＰＴＥＣポリペプチドへの安定的な 結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを提供するものであ り、“Determination of Amino Acid Sequence Antigenicity”なる名称の１９ ８４年９月１３日公告の欧州特許出願第８４／０３５６４号（Geysen）に詳細に 記載されており、本明細書に一体に引用されている。概要としては、多数の別々 の小ペプチド試験用化合物をプラスチックピン或いはいくつかの他の表面のよう な、固体基質上で合成する。ポリペプチド試験化合物をＰＴＥＣフラグメントと 反応させ、洗浄する。次いで結合ＰＴＥＣを当分野で周知の方法により検出する 。また精製ＰＴＥＣを前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、 プレート上に直接コーティングすることもできる。別法では、ペプチドを捕捉し 、固形支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いる。 また本発明は、ＰＴＥＣに結合し得る中和抗体特性が、ＰＴＥＣとの結合につ いて特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図 している。このようにして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基をＰＴ ＥＣと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。 ＰＴＥＣコード化ポリヌクレオチドの使用 ｐｔｅｃポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並びにまた治療目的で用い られる。診断目的の場合、本発明のｐｔｅｃは、ＰＴＥＣ活性が関係する状態や 疾病における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる。診断試験は 、ｐｔｅｃの通常の発現と過剰発現とを区別したり、治療的介入時のｐｔｅｃレ ベルの調節をモニタするのに役立つ。 本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分 子、及びＰＮＡが含まれる。 本発明の別の側面は、ＰＴＥＣまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を 含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いは ＰＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわ ち非常に高い保存領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオチ ド）に由来するのか、或いは低度に保存的な領域（例えば特に３’領域における システイン残基の間の領域）に由来するのかということや、ハイブリダイゼーシ ョン或いは増幅の（高度の、中程度の或いは低度の）厳密性によって、そのプロ ーブが天然ｐｔｅｃのみを同定するものであるか、アレル配列または近縁な配列 も同定するものであるかが決まってくる。 診断 ＰＴＥＣコード化ポリヌクレオチド配列を、ＰＴＥＣの発現が関与する病気、 疾病の診断や、治療のモニタ用として使用することができる。例えば、ＰＴＥＣ をコードするポリヌクレオチド配列を、ｐｔｅｃ発現を検出するための、バイオ プシー用に採取された組織や体液のハイブリダイゼーションアッセイ或いはＰＣ Ｒアッセイにおいて用いることができる。そのような定性的及び定量的方法の形 態は、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他 の膜用技術、ＰＣＲ技術、浸漬法、ピン或いはチップ技術及びＥＬＩＳＡ技術を 含む。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており、実際に市販されてい る多くの診断キットの基礎となっている。 このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するために修正され、 動物実験、臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタする際 に用いることができる。疾患を診断するための基礎を与えるために、ｐｔｅｃ発 現に対する正常な或いは標準的なプロフィールが確立されなければならない。こ れは、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出 物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、ｐｔｅｃ或いはそ の一部と結合することにより達成される。標準的なハイブリダイゼーションの定 量は、正常被験者に対して得られる値と、既知の精製ｐｔｅｃ量が用いられる同 一の実験におけるポジティブコントロール希釈系列で得られる値とを比較するこ とにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、ｐｔｅ ｃ発現に関連する障害或いは疾患により潜在的に影響を受けている被験者からの サンプルから得られる値と比較される。標準値と被験者値との偏差から疾患状態 の存在が確認される。 疾患が確認された場合は、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファイル 或いは数値が生成される。最終的にアッセイは、その数値が正常、すなわち標準 パターンに進むか、或いは戻るかを評価するために規則的に繰り返される。治療 プロファイルは治療の有効性を示すために用いられ、数日間或いは数ヶ月の期間 に渡って継続される。 米国特許第４，６８３，１９５、４，８００，１９５並びに４，９６５，１８ ８号に記載のあるようなＰＣＲ法により、ｐｔｅｃ配列に基づくオリゴヌクレオ チドのための追加の使用法が提供される。このようなオリゴマーは一般には化学 的に合成されるが、酵素を用いて発生させたり、或いは組換えソースから生成す ることもできる。一般にオリゴマーは、通常特定の遺伝子或いは状態を同定する ために最適な条件下で用いられる２つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５ ’→３’）のヌクレオチド及びアンチセンス方向（３’←５’）のヌクレオチド からなる。同一の２つのオリゴマー、入れ子状のオリゴマーの組、或いはオリゴ マ ーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や定量のためのよ り低い厳密性の条件下であっても用いることができる。 さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel ing）(Melby ＰＣ等1993 Ｊ Immunol Methods 159:235-44)或いはビオチン標識 （Duplaa Ｃ等1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの利用、制御核酸の同 時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して書かれた標準的 なグラフ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ＥＬＩＳＡ形式のア ッセイを実行することにより迅速に行うことができ、対象のオリゴマーが様々な 希釈溶液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅速に定量すること ができる。例えば、リウマチ様滑膜から取出された体液におけるｐｔｅｃの量の 増加は、活性化リンパ液の存在と組織破壊の進行を示している。このタイプの確 定的診断により、健康の専門家が患者を治療したり病状の悪化を防ぐことが可能 となる。同様に、別のアッセイを用いて、治療中の患者の病状の進行モニタする ことができる。 治療 ここに開示するポリヌクレオチドは、様々な過敏症や免疫病の治療に役立ち得 る。アンチセンス分子（アンチｐｔｅｃ）を癌が疑われる細胞に導入することに よって、ＰＴＥＣ発現を低下させたり停止させる遺伝子治療が可能となる。この ような例では、アンチセンス分子を有する細胞が、アミノ酸配列の翻訳を抑止す る。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来 する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の 器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当 業者によく知られた方法は、ＰＴＥＣを発現 する組換えベクターを構築するために用いることができる。例えばManiatis等（ 上記）及びAusubel等（上記）に記載された技術を参照されたい。 完全長ｃＤＮＡ配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチド により、研究者は遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian Ｈ及びＨＦ Lodish 19 93 Mol Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguchi等（1991）An nu Rev Biochem 60:631-652）の調査用のツールとしてｐｔｅｃを用いることが できる。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、センス或いはア ンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメントを、コーディン グ領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。 ｐｔｅｃ断片を高レベルで発現する発現ベクターを細胞または組織にトランス フェクトすることにより、ＰＴＥＣをコードする遺伝子の機能を停止させること ができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアンチセンス配列と ともに細胞から溢れ出し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合ですら、このよう なベクターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解されるまで、ＲＮ Ａ分子を転写し続ける。このような過渡的発現は、非複製ベクター（Mettler Ｉ ，personal communication）でも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター 系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。 上述のように、ｐｔｅｃの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイ ントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計するこ とにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリーダ配列 の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。またア ンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することにより 、ｍＲＮＡの翻訳を阻止す るように設計される。同様に、抑制は、「三重らせん」塩基対合としても知られ る、Ｈｏｇｅｂｏｏｍ塩基対合方法論を用いて達成することができる。三重らせ ん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するた めに十分に開放する機能を抑制する。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は 、Gee ＪＥら（Huber ＢＥ and ＢＩ Carr(1994) Molecular and Immunologi c Approaches ，Futura Publishing Co,Mt Kisco ＮＹ）により再検討されてい る。 リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で ある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特 異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる切断（ endonucleolytic cleavage）がなされる。 任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、 配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対する標的分 子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝 子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、 そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価される 。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相 補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性を試験すること により行われる。 本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための 当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス ホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学的合成オリゴヌクレオ チドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＰＴＥＣをコードするＤＮＡ 配列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮ Ａ配列は、Ｔ７或いはＳＰ ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクターに組み 込まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するア ンチセンスｃＤＮＡ構成物が、株細胞、細胞或いは組織内に導入される。 ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’ 末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステ ラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メ チルを使用することを含む。このコンセプトは、ＰＮＡの産生において固有のも のであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グア ニン、シチジン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修 飾形態とともに、イノシン、クエオシン（queosine）、及びワイブトシン（Wybu tosine）のような非伝統的な塩基を含めることによって、これら全ての分子に拡 張することができる。 細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方 法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対して も適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞に ベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同じ患者に戻す方 法が、ここで引用により開示されている米国特許第5,399,493号及び第5,437,994 号に記載されている。 更に、ここに開示するｐｔｅｃのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定は しないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特 性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術であれば、まだ開 発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。 近縁なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピング ｐｔｅｃの核酸配列は、天然ゲノム配列のマッピングのためのハイブリダイゼ ーションプローブを生成するために用いることができる。この配列は、よく知ら れる技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマッピン グすることができる。このような技術には、拡散させた染色体（chromosomal sp reads）に対するin situハイブリダイゼーション（Verma等（1988）Human Chrom osomes:Ａ Manual of Basic Technique,Pergamon Press，New York）、フローソ ート（flow-sorted）染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細 菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造体或いはPrice ＣＭ（1993;Blood Rev 7:127-34）及びTrask ＢＪ（1991;Trends Ganet 7:149-54）に概要が示さ れている単染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造が含まれる。 染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術は、遺伝子マッピングを延長 する際に大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の最近の例は、Whit ehead-ＭＩＴ Center for genomic Reserch（Hudson ＴＪら(1995)Science 270: 1945.1954）から最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或い は腕が知られていなくても、マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遣伝子 の配置から、関連する標識を明らかにすることができる。新しい配列は、染色体 の腕、或いはその一部への物理的マッピングにより割当てることができる。これ は位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研 究者に貴重な情報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）のよう な疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴ 〜１１ｑ２２−２３への遺伝子連鎖により粗く局所化されれば、その領域にマッ ピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節 遺伝子を表すことができる（Gatti等（1988）Nature 336:577-580）。本発明の ヌクレオチド配列は、正常者、保菌者或いは感染した個体間の転座、逆位等によ る染色体位置の違いを検出するために用いることもできる。 医薬品組成物 本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、インヒビター を、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤とともに含 んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は、任意の無菌の 生体適合性担体に含めて投与されるが、このような担体には、限定はしないが、 生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの分子は、患者 に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、医薬品添加物或いは 製薬学的に許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて投与され得る。 本発明の一実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活性なも のである。医薬品組成物の投与 医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、 局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与 、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与を含 む非経口投与を含む。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用い られ得る調合物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適 切な製薬学的に許容される 担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Remington's Pharma ceutical Sciences（Mack Publishing Co，Easton ＰＡ）”の最新版において見 出すことができる。 経口投与用の薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担体 を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治療 を受ける患者による摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、 シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の剤形として処方される。 経口投与するための製薬調製は、活性化合物と固形の賦形剤とを組み合わせる ことによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加 した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤 核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロース、マンニトー ル或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうも ろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキ シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの ようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラ チン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、クロスリンクし たポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或い はアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加え られる。 糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混 合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量 を特徴付けるために染料或いは色素 が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る 。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪 油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或 いは懸濁される。 非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、 本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理 緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。 水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール 或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を増加する物質が含み得る。更に、活 性成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶 媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリ ド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に 応じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるよう になる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。 局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透 剤を配合する。このような浸透剤は、従来より周知である。製造と保管 本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、 顆粒化処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或 いは凍結乾燥処理により製造される。 この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸 、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに 形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製 剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝 剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜７％のマンニトールにおけ る凍結乾燥粉末である。 製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調 製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため にラベル付けされる。ＰＴＥＣの投与の場合、このようなラベルには、投与の量 、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的 を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業 者の能力の範囲内で行うことができる。 任意の化合物の場合、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或いは 通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッ セイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的な 投与量や投与経路を決定することができる。 治療的に有効な投与量とは、症状や疾病を寛解するタンパク質、その抗体、ア ンタゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治 療有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死 投与量）及びＥＤ５０（個体群の５０％において治療的に効果のある投与量）を 決定するための、細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により 決定することができる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、 比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組 成物が好ましい。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られ るデータは、ヒトへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができ る。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を 達成する循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、 患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。 正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。 投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患 者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感 受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４ 日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて ２週間に１度、投与してもよい。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大 約１ｇであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方法に関 するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第４，６５７， ７６０、５，２０６，３４４或いは５，２２５，２１２号を参照されたい。当業 者は、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やそのインヒビター用の剤形とは異 なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの 送達は、細胞、病状、位置等によって決まってくる。 ＰＴＥＣを、免疫無防備状態のの患者において発現させるか、適切な剤形で送 達することが企図されている。臨床的設定では、ＰＴＥＣレベルの硬直的監視に より、担当外科医が、増殖を促進し、トキシックショック症候群のような他のサ イトカインが関与する問題を回避するような範囲にＰＴＥＣレベルを調節するこ とが可能となる。同様に、感染症または癌患者へのＰＴＥＣのアンタゴニストま たはインヒビターの投与、監視により、不必要な副作用を最小限に抑えることが できる。 以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本 発明をこの実施例に限定しようとするものではない。産業上の応用 １ 前立腺ｃＤＮＡライブラリーの構築 インサイト社クローンＮｏ．836820からのｐｔｅｃ完全長遺伝子を、前立腺ラ イブラリー（ＰＲＯＳＮＯＴ07）から単離されたｃＤＮＡのなかから同定した。 このＰＲＯＳＮＯＴ07ｃＤＮＡライブラリーは、６９歳の段製から採取された非 腫瘍性前立腺組織（標本#0182B;Mayo Clinic,Rochester ＭＮ）から作製した。 病理学的報告によれば、この患者は腺癌を患っていた（Gleason grade3+4）。 冷凍組織を、Brinkmann Homogenaizer Polytron-ＰＴ 3000（Brinkmann Instr uments社、Westbury ＮＹ)を用いて即座に破砕し、グアニジウムイソチオシアネ ートを含む緩衝液に溶解した。可溶化液を５．７Ｍの塩化セシウムクッションに 負荷し、Beckman L8-70ＭUltracetrifuge（Beckman Instruments社）においてBe ckman ＳＷ28ロータを用いて、周囲温度で２５０００ｒｐｍの回転数で１８時間 遠心分離した。ＲＮＡを一度はｐＨ４．０の酸性フェノールで抽出し、０．３Ｍ の酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ、そ のＲＮＡを水に再懸濁し、３７℃で１５分間ＤＮアーゼ処理した。そして、Qiag en Oligotex kit（ＱＩＡＧＥＮ社、Chatsworth ＣＡ）を用いてＲＮＡを単離し た。このＲＮＡは、SuperScript Plasmid System for cＤＮＡ Synthesis and P lasmid Cloning（catalog#18248-013,GibcolBRL)で、その推奨プロトコルに従っ て処理した。ｃＤＮＡはSepharose ＣＬ4Ｂカラム（catalog#275105,Pharmacia ）上で分画化し、これらのｃＤＮＡで４００ｂｐを超えるものはをpSport Ｉに リゲートした。次いで、このファスミドpSport ＩをＤＨ5ａ（商標）コンピテン ト細胞（catalog#18258-012,Gibco/ＢＲＬ）に入れて形質転換させた。 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、ＲＥＡＬ Prep 96 Plasmid Kit for R apid Extraction Alkaline Lysis Plasmid Minipreps（Catatog#26173;ＱＩＡＧ ＥＮ社）を用いて精製した。このキットはマルチチャネル試薬ディスペンサを用 いて、９６穴ブロック内の９６サンプルを同時に精製することができる。以下の 変更点を除いて、推奨プロトコルを用いた。１）９６個の穴には、２５ｍｇ／Ｌ のカルベニシリン及び０．４％のグリセロールを有する無菌のTerrific Broth（ Cat#22711，ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標），Gaithersbung ＭＤ）の１ｍｌのみをそれぞれ充填した。２）その穴に接種し、次いで０．３ｍ ｌの溶解緩衝液と溶解した後、１９時間培養した。３）イソプロパノール沈殿に 続けて、プラスミドＤＮＡペレットを、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁した。プロ トコルの最終工程の後、サンプルを、貯蔵のためにBeckman ９６穴ルブロックに トランスファーした。 ｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cycler（ＰＴＣ200;ＭＪ Research 社,Watertown ＭＡ）及びApplied Biosystems377 ＤＮＡ Sequencing Systems（Perkin Elmer社）を組み合わせてHamilton Micro Lab2200 （Hamilton社,Reno ＮＶ）を用いるSanger Ｆ及びＡＲ Coulson（1975;Ｊ Mol B iol 94:441f）の方法により行い、リーディングフレームを決定した。 ３ ｃＤＮＡクローン及び推定タンパク質の相同性検索 各ｃＤＮＡを、ＡＢＩ ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）670配列解析システム（Perkin Elmer）に組み込まれた検索アルゴリズムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋの配列と比 較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（ＴＲＷ社、 LosAngeles ＣＡ）を用いて相同な領域を決定していた。配列の比較をどのよう に行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセ ット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の 配列に対して相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配 列には、初期値とともにスコアが付けられた。これによって、これらの相同な領 域をドットマトリクスホモロジープロット法を用いて検定し、相同な領域と偶然 の一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアライメントを用い て表示した。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＩＮＨＥＲＩＴ（商標）670配列解 析システムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Patt ern Specification Language及びパラメータウィンドウを用いて、タンパク質デ ータベースから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにス コアを付けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有 意な相同性を有する領域と偶然の一致とを区別した。 ＢＬＡＳＴは、Basic Local Alignment Search Tool（Altschul ＳＦ(1993)Ｊ Mol Evol36:290.300;Altschul,ＳＦ等(1990)Ｊ Mol Biol215:403- 10）を表しており、これを用いて局部的な配列アライメントを検索した。ＢＬＡ ＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似 性を求める。そのアライメントの局所性のために、ＢＬＡＳＴは厳密な一致を求 める際に、すなわちホモログを求める際に特に有効である。ＢＬＡＳＴは間隙を 含まない一致を求めるのに役立つ。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本的な単位 は、High-scoring Segment Pair（ＨＳＰ）である。 ＨＳＰは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが 、そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのア ライメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満 足、即ち、カットオフスコアを超えている。ＢＬＡＳＴアプローチは問い合わせ 配列とデータベース配列との間のＨＳＰを見つけ出すものであり、見出された任 意の一致の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足す る一致のみを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知ら せるための統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベー ス検索の情況においてＨＳＰ（或いはＨＳＰの組）の発生の機会の期待される頻 度の上側の境界として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース 配列がプログラム出力において報告される。 ４ 調節エレメントを回復するまでのｐｔｅｃの延長 完全長ＰＴＥＣの核酸配列（配列番号：１）は、ゲノムライブラリから５’配 列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いることがで きる。一方のプライマーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために 合成され、他方のプライマーはセンス方向（Ｘ ＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらのプライマーにより、周知の ｐｔｅｃ配列を「外側に」延長し、対象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド 配列を含むアンプリコンを生成できるようになった。初期プライマーは、Oligo4 .0（National Biosciences社、Plymouth ＭＮ）、或いは他の適切なプログラム を用いて、長さが２２−３０ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含有率を有し、か つ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計することができる 。結果的にヘアピン構造及びプライマー−プライマ−二量体化を生じる任意のヌ クレオチドのストレッチの延長は避けられる。 ５’上流配列を延長し、増幅するためにヒトゲノムライブラリを用いる。必要 なら、既知領域をさらに延長するためにプライマーの第２の組をデザインする。 ＸＬ-ＰＣＲキット（Perkin Elmer社）のための指示に従って、酵素と反応混 合物とを完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０ｐｍｏ ｌの各プライマと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始 する場合、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（ＰＴＣ200;ＭＪ Reserch社、Wate rtown ＭＡ）を用いて、以下のパラメータで実行される。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア ガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに 成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルか ら切り出した。さらなる精製には、ＱＩＡQuick（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社 ）のような市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて 一本鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にす る平滑末端を作った。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、 １μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチド キナーゼを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イ ンキュベートする。コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適切な溶媒内 にある）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯ Ｃ培地（Sembrook Ｊ等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーシ ョンの後、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani（ＬＢ ）寒天上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し 、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れ られた１５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日、５μ ｌの各オーバーナイト培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に 希釈した後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレイ内に移す。 ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃 縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以 下の条件に従って行う。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動 させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。 ５ ハイブリダイゼーションプローブのラベリング 配列番号：１の核酸配列に由来するハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤ ＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。約 ２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドのラベリングについて特に記すが、大 きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチ ドを、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ^-32Ｐ]アデノシン三 リン酸（Amersham社，Chicago ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPo nt ＮＥＮ（商標）、BostonMA）とを組み合わせて用いてラベルする。標識付け られたオリゴヌクレオチドを、SephadexＧ-25 超精細樹脂カラム （Pharmacia社）を用いて精製する。それぞれ毎分１０⁷カウントを含む各部分を 、以下のエンドヌクレアーゼ（Ａｓｅｌ，ＢｇｌＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ， Ｘｂａ１或いはＰｖｕＩＩ；DuPont ＮＥＮ（商標））の１つを用いて消化され るヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析において用いる。 各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン 膜（Nytran Plus,Schleicher＆Schuell,Durham ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼ ーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、 ブロットは、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナト リウムまで段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。ＸＯＭＡ Ｔ ＡＲ（登録商標）フィルム（Kodak,Rochester ＮＹ）を、数時間かけてＰｈ ｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ（Molecular Dynamics,Sunnyvale ＣＡ）においてブロットに露光された後、ハイブリダイゼーションパターンが視 覚的に比較される。 ６ アンチセンス分子 ＰＴＥＣ配列或いはその任意の一部は、天然ＰＴＥＣのin vivoまたはin vitr o発現を抑制するために用いることができる。約２０塩基対からなるアンチセン スオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメント の場合でも概ね同じ手順を用いることができる。第１図に示すＰＴＥＣのコード 化配列に基づくオリゴヌクレオチドを用いて、天然ＰＴＥＣの発現を抑制するこ とができる。この相補的なオリゴヌクレオチドは、第２図に示す保存的５’配列 からデザインすることができ、プロモータが上流の非翻訳配列を結合するのを防 ぐことにより転写を抑止したり、或いは、リボゾームが結合するのを防止する ことによりＰＴＥＣ転写物の翻訳を抑止するために用いることができる。配列番 号：１のリーダー配列及び５’配列の適切な一部を用いることで、効果的なアン チセンスオリゴヌクレオチドは、第１図に示す、ポリペプチドのＳ₁₆〜Ｒ₂₄残基 を翻訳する領域に亘るコドンＡ₄₆〜Ｔ₇₂をオムね含むことになる。 ７ ＰＴＥＣの発現 ＰＴＥＣの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、その ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニン グ用のpBluescriptベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ株であるＸＬＩ-BlueＭＲＦ（商標 ）（Stratagene）においてＰＴＥＣを発現するのに用いる。クローニング部位の 上流には、β−ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはア ミノ基末端メチオニン及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。直後に続 くこれら８つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターであり、 多くの一義的な切断部位を含むリンカーである。 標準的な方法を用いた、ＩＰＴＧによる単離されたトランスフェクト菌株の誘 導により、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及 び完全長ＰＴＥＣからなる融合タンパク質を産生する。また、シグナル配列を加 えると、ＰＴＥＣの菌増殖培地への分泌が誘導され、後に行う活性のアッセイに おいて直接使用できるようになる。 ８ ＰＴＥＣ活性 ケモカインの走化性の活性は、通常、４８穴マイクロケモタキシスチャンバ（ Falk、前出）において測定する。各ウェルには、フィルタで仕切られた２つのコ ンパートメントがあり、細胞が一方のコンパートメ ントから他方へ化学的勾配に応じて移動することができるようになっている。Ｐ ＴＥＣが分泌されている細胞培地を、ポリカーボネート製のフィルタの一方の側 に入れ、末梢血液細胞をフィルタの他方の側の培地に懸濁する。十分なインキュ ベーション時間をおくことにより、拡散に応じて細胞がフィルタを通過し、ＰＴ ＥＣの濃度勾配が生ずる。フィルタを各ウェルから回収し、フィルタのケモカイ ンが存在する側に付着している特定の細胞型、例えば単球を、同定し、カウント する。 細胞特異性は、濃度勾配遠心分離法により得られた、好中球、単球細胞、また は白血球の高濃度集団のような分画化された細胞集団上でアッセイを実施するこ とにより決定してもよい。特定のＴ細胞集団を、ネガティブ選択用のＣＤ８＋と ＣＤ４＋に特異的な抗体を用いて精製することができる。 ９ ＰＴＥＣ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫には、ＰＡＧＥ電気泳動法（Maniat is前出を用いて精製されたＰＴＥＣを用いるが、モノクローナル法の方がより簡 単に利用することができる。ＰＴＥＣから翻訳されたアミノ酸配列をＤＮＡＳＴ ＡＲソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ社）を用いて解析して免疫抗原性の高い領域 を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には周知の手段により合成して、当 業者に周知の方法で抗体をを産生するために用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接 する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトープを選択するための解 析は、Ausubel ＦＭ等（上記）の論文に記載されている。 通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、ｆｍｏｃ−ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのペプチドシンセサイザ ーＭｏｄｅｌ ４３１Ａを用いて合成し、Ｍ−マレイ ミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ：Ausubel Ｆ Ｍ等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、 Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴペプチド− ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検 査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロ ックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ 抗ウサギＩｇＧを用いて反応させる。 １０ 特異的抗体を用いるＰＴＥＣの精製 天然ＰＴＥＣ或いは組換えＰＴＥＣは、ＰＴＥＣに対する特異的な抗体を用い るイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イムノ アフィニティーカラムは、ＣｎＢｒ活性化Sepharose（Pharmacia Biotech社）の ような活性化クロマトグラフ樹脂とＰＴＥＣ抗体とを共有結合させることにより 構成される。結合後、その樹脂を製造者の指示に従って、ブロックし洗浄する。 ＰＴＥＣを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＰＴ ＥＣを優先的に吸収できる条件下（例えば界面活性剤の存在下での高イオン強度 緩衝剤）で洗浄する。このカラムを、抗体／ＰＴＥＣ結合を切るような条件下（ 例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンの ようなカオトロピックイオン）で溶離させ、ＰＴＥＣを回収する。 １１ ＰＴＥＣと相互作用する分子の同定 ＰＴＥＣ、或いはその生物学的に活性なフラグメントを、¹²⁵Ｉボルトンハン ター試薬を用いて標識する（Bolton,ＡＥ及びHunter,ＷＭ （1973）Biochem Ｊ 133:529）。９６穴プレートのウェル内に前に入れておいた 候補分子を、標識したＰＴＥＣとともに培養し、洗浄し、標識したＰＴＥＣ複合 体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度のＰＴＥＣを用いて得られ るデータを用いて、候補分子とＰＴＥＣとの会合の数、アフィニティー並びに会 合度の値を計算する。 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本 発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及 び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実 施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実 施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を 実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分 野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ 37/08 ６３７Ｅ Ａ６１Ｋ 38/00 45/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 14/715 16/24 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 15/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 21/08 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 33/53 5/00 Ｂ 33/566 Ａ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ， ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，Ｕ Ｓ (72)発明者 マリー、リン・イー アメリカ合衆国カリフォルニア州94028・ ポルトラバレー・ロストラコスロード 1124

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする精製ポリ ヌクレオチド。 ２．前記核酸配列が、配列番号：１の配列または、それに相補的な配列からなる ことを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ３．活性化白血球の存在が生物学的サンプル内における請求項１のポリヌクレオ チドの発現と関係をもつような病気または疾病の診断のための診断試験方法であ って、 ａ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適切な条件の下で、前記生物学的 サンプルと、請求項１のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合させ る過程と、 ｂ）前記生物学的サンプルにおいて前記ハイブリダイゼーション複合体を検出 する過程であって、前記複合体の存在が請求項１のポリヌクレオチドの存在と相 関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする診断試験方法。 ４．前記病気または疾病が、ウィルス、細菌、心筋又は寄生虫の感染症；アレル ギー又は喘息応答；外傷が関与する機械的損傷；動脈硬化症、アテローム発生又 は膠原血管病；慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、又 は溶血性貧血のような自己免疫疾患；白血病、リンパ腫、又は癌腫；ＡＩＤＳ、 Ｘ染色体性無ガンマグロブリン血症、毛細血管拡張性運動失調、肝硬変症、嚢胞 性繊維症、真性糖尿病、肝炎及び鎌形赤血球貧血、又は白血球、特に単球、マク ロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞及びＴ細胞の活性化や過剰な増殖を 伴う即時型過敏症からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項 ３に記載の診断試験方法。 ５．請求項１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。 ６．請求項５の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 ７．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であっ て、 ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項６の宿主細胞を培養 する過程と、 ｂ）前記宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴 とするポリペプチドの生成方法。 ８．配列番号：２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。 ９．請求項８のポリペプチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬品組成物 。 １０．患者に請求項８の医薬品組成物を効果的な量だけ投与する過程を含む免疫 不全疾患の患者の治療方法。 １１．請求項１のポリヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補的な核酸配列 を含むアンチセンス分子。 １２．請求項１１のアンチセンス分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬 品組成物。 １３．患者に、請求項１２の医薬品組成物を効果的な量だけ投与する過程を含む 、活性化白血球の存在と関係する病気または疾病の患者の治療方法。 １４．前記病気または疾病が、ウィルス、細菌、心筋又は寄生虫の感染症；アレ ルギー又は喘息応答；外傷が関与する機械的損傷；動脈硬化症、アテローム発生 又は膠原血管病；慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、 又は溶血性貧血のような自己免疫疾患；白血病、リンパ腫、又は癌腫；又は白血 球、特に単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞及びＴ細胞の活 性化や過剰な増殖を伴う即時型過敏症からなる群から選択されたものであること を特徴とする請求項１３ に記載の方法。 １５．請求項８の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。 １６．生物学的サンプルにおいて、活性化Ｔリンパ球の存在が、第１図のポリペ プチドの発現と関係するような病気または疾病を診断するための診断試験方法で あって、 ａ）抗体が前記ポリペプチドに結合して抗体−ポリペプチド複合体を形成する に適切な条件の下で、前記生物学的サンプルと請求項１５の抗体とを結合する過 程と、 ｂ）前記複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が前記生物学的サ ンプルにおける前記ポリペプチドの発現と相関性を有する、該過程をと含むこと を特徴とする診断試験方法。 １７．請求項８の精製ポリペプチドに対して特異的なインヒビター。 １８．請求項１７のインヒビター及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬品組 成物。 １９．患者に請求項１８の医薬品組成物を効果的な量だけ投与する過程を含む、 活性化Ｔリンパ球の存在が関係する病気または疾病の患者の治療方法。 ２０．前記病気または疾病が、ウィルス、細菌、心筋又は寄生虫の感染症；アレ ルギー又は喘息応答；外傷が関与する機械的損傷；動脈硬化症、アテローム発生 又は膠原血管病；慢性関節リウマチ、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、 又は溶血性貧血のような自己免疫疾患；白血病、リンパ腫、又は癌腫；又は白血 球、特に単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞及びＴ細胞の活 性化や過剰な増殖を伴う即時型過敏症からなる群から選択されたものであること を特徴とする請求項１９に記載の方法。