CN116622650A - 一种自噬-溶酶体靶向病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种自噬‑溶酶体靶向病毒及其制备方法和应用。所述自噬‑溶酶体靶向病毒含有被自噬‑溶酶体系统识别的自噬‑溶酶体靶向分子。本发明的自噬‑溶酶体靶向病毒的复制可调控，可以在特定的细胞系中高效复制、大量生产制备，但在正常的细胞中病毒的复制能力被减弱甚至完全失去复制能力，可广泛应用于制备活疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗或强毒的安全模型等，具有安全可控性，且还具有良好的免疫原性，此外，所述自噬‑溶酶体靶向病毒可以作为溶瘤病毒，不仅可以直接杀伤肿瘤，而且可以激活机体对肿瘤免疫效果。

Description

一种自噬-溶酶体靶向病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种自噬-溶酶体靶向病毒及其制备方法和应用。
背景技术
疫苗是预防病毒感染最有效的手段之一，然而目前仍存在明显局限性，包括安全性差、免疫效果差、或技术复杂不通用等，且难以实现疫苗个性化定制。
如CN107537030A公开一种三价流感病毒亚单位疫苗及其制备方法，采用裂解剂和新的纯化方法将裂解后的病毒蛋白进一步纯化，制成四价流感病毒亚单位疫苗，其中每剂含甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型共三种流感血凝素含量在80％以上，不含佐剂，不含硫柳汞等防腐剂，还提供了该流感疫苗的制备方法，包括以下步骤：病毒接种，病毒增殖培养，尿囊液收获，澄清，超滤浓缩，灭活，裂解和超速离心纯化，凝胶过滤层析纯化(超滤)，混配，过滤除菌，分装，包装等步骤，提供的流感病毒亚单位疫苗可以提高流感疫苗的安全性，消除了佐剂带来的不良反应，消除了硫柳汞引起的毒副作用，但制备工艺复杂，且不具备通用性，产品类型单一。
综上所述，探索并建立下一代疫苗创新的新理论、新方法和新策略是当今世界科技前沿的热点和难点(125questions:Exploration and discovery.Science,doi:www.science.org/content/resource/125-questions-exploration-and-discovery(2021).)。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种自噬-溶酶体靶向病毒及其制备方法和应用，所述自噬-溶酶体靶向病毒包含能被自噬-溶酶体系统识别的分子，病毒的复制可被有效控制，可广泛应用于活疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、强毒的安全模型等，具有安全的可控性，且具备良好的免疫原性，所述制备方法工艺简单且具备通用性，可应用于任意病毒疫苗的制备。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种自噬-溶酶体靶向病毒，所述自噬-溶酶体靶向病毒含有被自噬-溶酶体系统识别的自噬-溶酶体靶向分子。
本发明中，术语“自噬-溶酶体靶向分子(Autophagy-Targeting molecules)”是指能被自噬-溶酶体系统识别的多肽、氨基酸序列、蛋白或者其他分子等，本发明发现将所述自噬-溶酶体靶向分子的编码核苷酸序列引入到病毒的基因组中，该自噬-溶酶体靶向分子可以随着病毒基因组的复制而复制，并且可以随着病毒蛋白的翻译而融合表达于病毒蛋白中，从而得到被自噬-溶酶体靶向分子定点修饰的病毒，即自噬-溶酶体靶向病毒，Autophagy-Targeting chimeric virus(AUTOTAC virus，AUTOTAC病毒)，自噬-溶酶体系统会识别与病毒蛋白融合的自噬-溶酶体靶向分子，从而降解病毒蛋白，病毒的复制能力被减弱甚至完全失去复制能力，因此，AUTOTAC病毒具备高安全性。
所述自噬-溶酶体靶向分子优选自具有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.79任一项所示氨基酸序列的多肽或其中至少两种的组合(如表1所示)。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子与所述自噬-溶酶体靶向病毒的病毒蛋白连接。
本发明中，所述自噬-溶酶体靶向分子可连接在病毒蛋白中的任意位点。
优选地，所述噬-溶酶体靶向分子连接在病毒蛋白的C端和/或N端。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子和所述病毒蛋白之间通过连接链连接。
根据本发明，所述自噬-溶酶体靶向分子，可以是相同的自噬-溶酶体靶向分子，也可以是不同的自噬-溶酶体靶向分子的组合，所述连接链可以是相同的连接链，也可以是不同的连接链的组合。
优选地，所述连接链包括被切割的分子。
本发明中，由于自噬-溶酶体系统广泛存在于宿主细胞中，为了避免AUTOTAC病毒在制备过程中被细胞内的自噬-溶酶体系统降解导致生产效率降低，首先，在病毒蛋白与自噬-溶酶体靶向分子之间引入了可以被选择性切割的连接链(linker)，该连接链可以在特定的人工改造的细胞系中被切割，从而将病毒蛋白与自噬-溶酶体靶向分子分离，病毒蛋白不再会被自噬-溶酶体系统降解而得以保留，因此AUTOTAC病毒可以在该特定的人工改造的细胞系中高效复制、大量生产制备。而在正常的细胞中，自噬-溶酶体系统会识别与病毒蛋白融合的自噬-溶酶体靶向分子，从而降解病毒蛋白，病毒的复制能力被减弱甚至完全失去复制能力。此外，AUTOTAC病毒还可以进一步被修饰，例如引入一些免疫增强剂到病毒蛋白的特定区域或者特定氨基酸，从而得到性能改善的病毒，而得到免疫原性增强的AUTOTAC病毒。此外，还可采用自噬-溶酶体系统敲除或功能缺陷的细胞系，进行AUTOTAC病毒的制备，这类细胞系不仅可以制备自噬-溶酶体靶向分子引入病毒蛋白N端和/或C端的AUTOTAC病毒，而且可以用于制备自噬-溶酶体靶向分子引入病毒蛋白其他任意位点的AUTOTAC病毒。
本发明的另一个目的为在流感病毒基因组中引入了可被条件性切割的自噬-溶酶体靶向分子的编码核苷酸序列或者无需切割的自噬-溶酶体靶向分子的编码核苷酸序列，使得病毒只有在能够将自噬-溶酶体靶向分子切掉或者失活的特定的病毒生产体系中才可以复制，利用AUTOTAC病毒对该特定病毒生产体系的依赖，可以在该系统中进行AUTOTAC病毒的大量制备，由于人体和动物等的正常细胞中存在自噬-溶酶体系统，可以识别与病毒蛋白融合表达的自噬-溶酶体靶向分子，从而将病毒蛋白降解，因此制备出来的AUTOTAC病毒在动物和人体中复制繁殖能力减弱甚至缺陷，增加了病毒的安全性，从而使得该AUTOTAC病毒成了名副其实的流感病毒活疫苗。此外，动物和人体等的自噬-溶酶体系统可以识别多种自噬-溶酶体靶向分子，因此可以在病毒蛋白中引入不同种类、不同数量的自噬-溶酶体靶向分子；而可以被选择性切割的连接链(linker)也有多种，因此可以引入不同种类、不同数量的连接链来实现自噬-溶酶体靶向分子的选择性切割；这些不同种类和数量的自噬-溶酶体靶向分子和连接链可以进行任意组合，可以为制备不同复制效率、不同减毒程度的病毒疫苗提供保证，这对于流感病毒疫苗的生产效率和免疫原性至关重要。
综上所述，本发明自噬-溶酶体靶向病毒的原理在于：(1)引入到病毒蛋白特定位点的自噬-溶酶体靶向分子可以被正常宿主细胞中的自噬-溶酶体系统识别，从而将相关的病毒蛋白降解、失活；(2)引入到病毒蛋白特定位点的自噬-溶酶体靶向分子可以在特定的病毒生产系统中被抑制，或者通过连接链被选择性地切割，而与病毒蛋白分离，从而避免或减少病毒蛋白被自噬-溶酶体途径降解；(3)引入到病毒蛋白特定位点的自噬-溶酶体靶向分子在正常宿主细胞中不能被抑制，或者链接自噬-溶酶体靶向分子与病毒蛋白的连接链在正常宿主细胞中不能被切割，因此制备出来的病毒在动物和人体等的宿主细胞中可以被自噬-溶酶体途径识别、降解，而复制能力降低甚至完全失去复制繁殖能力，增加了病毒的安全性。
表1
优选地，所述被切割的分子包括被烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virusprotease，TEVp)切割的分子、被凝血酶敏切割的分子(酶切位点为LVPR*GS，如SEQ IDNO.80 LEAGCKNFFPRSFTSCGSLE，*表示切割发生的位置)、被凝血因子Xa切割的分子(酶切位点为IDGR*)、被肠激酶切割的分子(酶切位点为DDDDK*)、被3C蛋白酶切割的分子(酶切位点为ETLFQ*GP)、被SUMO蛋白酶切割的分子、被细菌明胶酶切割的分子(如GPLGV)或自剪切的分子中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述被烟草蚀斑病毒蛋白酶切割的分子包括多肽，所述多肽具有通式I所示的氨基酸序列。
E-Xaa-Xaa-Y-Xaa-Q-$ 通式I。
其中，Xaa代表任意氨基酸，$代表氨基酸G、S或M中的任意一种。切割发生在Q和G之间，或者Q和S之间，或者Q和M之间。
优选地，所述被细菌明胶酶切割的分子包括氨基酸序列为GPLGV的多肽。
优选地，所述自剪切的分子包括2A短肽。
优选地，所述2A短肽包括猪捷申病毒(porcine teschovirus-1)的P2A、马鼻炎病毒(equine rhinitis A virus)的E2A、口蹄疫病毒(foot ans mouth disease virus)的F2A或T2A中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述连接链选自具有如SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.106中任一项所示氨基酸序列的多肽(如表2所示)。
表2
序列编号 氨基酸序列 序列编号 氨基酸序列
SEQ ID No.81 ENLYFQG SEQ ID No.94 QNLIFQG
SEQ ID No.82 ENLYFQS SEQ ID No.95 RNLYFQC
SEQ ID No.83 ENLYFQM SEQ ID No.96 ECLYHQG
SEQ ID No.84 DNLYFQG SEQ ID No.97 ERLYVQM
SEQ ID No.85 GNLYFQG SEQ ID No.98 ESEYCQE
SEQ ID No.86 YNLYFQG SEQ ID No.99 EVMYSQA
SEQ ID No.87 MNLYFQG SEQ ID No.100 EFLYIQD
SEQ ID No.88 WNLYFQG SEQ ID No.101 ERGYGQV
SEQ ID No.89 CNLYFQG SEQ ID No.102 EVWYCQC
SEQ ID No.90 RNLYFQG SEQ ID No.103 EVAYGQK
SEQ ID No.91 LNLYFQG SEQ ID No.104 ESRYVQS
SEQ ID No.92 RNLYFQS SEQ ID No.105 EGEYWQR
SEQ ID No.93 ANLYFQG SEQ ID No.106 ESNYGQM
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链之间还包含柔性接头。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子、连接链和柔性接头具有如下连接方式：
柔性接头-连接链-柔性接头-自噬-溶酶体靶向分子。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子、连接链和柔性接头按所述柔性接头-连接链-柔性接头-自噬-溶酶体靶向分子的连接方式连接后包括具有如SEQ ID NO.107-SEQ IDNO.185中任一项所示氨基酸序列的多肽(如表3所示)。
表3
优选地，所述自噬-溶酶体靶向病毒由野生病毒经过遗传改造制备得到。
优选地，所述野生病毒选自流感病毒、艾滋病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、丙肝病毒、乙肝病毒、甲肝病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、水泡性口炎病毒、呼吸道合胞病毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、寨卡病毒、中东呼吸综合征病毒、轮状病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、汉坦病毒、新型肠道病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、蓝耳病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、细小病毒、朊病毒、天花病毒、烟草花叶病毒、腺相关病毒、噬菌体、疱疹病毒、西尼罗河病毒、诺如病毒、人博卡病毒或冠状病毒中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述野生病毒为流感病毒、艾滋病毒或新冠病毒SARS-CoV-2。
优选地，所述流感病毒包括H1N1、H5N1、H7N9、H3N2或B型流感病毒中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向病毒为自噬-溶酶体靶向流感病毒。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向流感病毒的PA蛋白、PB1蛋白、PB2蛋白、NP蛋白、HA蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白或NEP蛋白中的一个或多个连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PA蛋白和PB2蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PA蛋白和PB1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PB2蛋白和PB1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PA蛋白、PB2蛋白和PB1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PA蛋白、PB2蛋白、PB1蛋白和M1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PA蛋白、PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白和NP蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PB2蛋白、PB1蛋白和M1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PB1蛋白和M1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PB2蛋白和M1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白和NS1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白和NEP蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述NS1蛋白和NEP蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
在本发明的一个实施方案中，利用反向遗传技术，可以将现有的流感病毒模型的任意基因替换成其他亚型或者毒株的基因，或者将现有的流感病毒模型替换成其他亚型或者毒株，从而制备出其他亚型或者毒株的流感病毒，可以应用于任意亚型或毒株的流感病毒，而且制备出的病毒在可以选择性切掉自噬-溶酶体靶向分子的细胞株中大量复制，而在正常的宿主细胞中会被噬-溶酶体系统识别降解。此外，该方法可以适用于其他亚型或者毒株，包括H1N1，H1N2，H1N3，H1N8，H1N9，H2N2，H2N3，H2N8，H3N1，H3N2，H3N8，H4N2，H4N4，H4N6，H4N8，H5N1，H5N2，H5N3，H5N6，H5N8，H5N9，H6N1，H6N2，H6N4，H6N5，H6N6，H6N8，H7N1，H7N2，H7N3，H7N7，H7N8，H7N9，H8N4，H9N1，H9N2，H9N5，H9N8，H10N3，H10N4，H10N7，H10N8，H10N9，H11N2，H11N6，H11N9，H12N1，H12N3，H12N5，H13N6，H13N8，H14N5，H15N2，H15N8，H16N3，H17N10和H18N11。此外，利用反向遗传技术，还可以制备多价流感病毒，如含有H1N1、H3N2、B型流感病毒表面抗原的多价流感病毒。更重要的是，制备出的突变型强毒和多价病毒具有非常高的安全性和有效性。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向病毒为自噬-溶酶体靶向冠状病毒。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向冠状病毒中刺突蛋白、包膜糖蛋白、膜糖蛋白、核衣壳蛋白、非结构蛋白1、非结构蛋白2、非结构蛋白3、非结构蛋白4、非结构蛋白5、非结构蛋白6、非结构蛋白7、非结构蛋白8、非结构蛋白9、非结构蛋白10、非结构蛋白11、非结构蛋白12、非结构蛋白13、非结构蛋白14、非结构蛋白15、非结构蛋白16、3a蛋白、3b蛋白、6蛋白、7a蛋白、7b蛋白、8a蛋白、8b蛋白、9b蛋白、3C样蛋白酶、前导蛋白、2’-O-核糖甲基转移酶、核酸内切酶、3’-至-5’核酸外切酶、解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶、orf1a多聚蛋白、ORF10蛋白、ORF8蛋白、ORF7a蛋白、ORF6蛋白或ORF3a蛋白中的一个或多个连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向冠状病毒为自噬-溶酶体靶向新冠病毒SARS-CoV-2。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向病毒为自噬-溶酶体靶向HIV病毒。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向HIV病毒的Gag多聚蛋白、pol多聚蛋白、gp160、HIV转录反式激活子、病毒体蛋白表达调节蛋白、病毒负因子、慢病毒蛋白R、病毒感染性因子、病毒蛋白U、基质蛋白、衣壳蛋白、间隔肽1、核衣壳蛋白、间隔肽2、P6、逆转录酶、核糖核酸酶H、整合酶、HIV蛋白酶、gp120、gp41蛋白中的一个或多个中连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子含有编码如第一方面所述的自噬-溶酶体靶向病毒的核酸序列。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有如第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞包括表达切割所述连接链的蛋白酶的细胞或自噬-溶酶体系统缺陷的细胞。
优选地，所述蛋白酶包括烟草蚀斑病毒蛋白酶。
优选地，所述表达选择性切割所述连接链的蛋白酶的细胞由HEK293T细胞或MDCK细胞制备得到。
优选地，所述自噬-溶酶体系统缺陷的细胞缺失LC3A蛋白、LC3B蛋白、LC3C蛋白、GABARAP蛋白、GABARAPL1蛋白或GABARAPL2蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述重组细胞含有第三方面所述的表达载体或第二方面所述核酸分子。
本发明中，所述重组细胞可以用于第一方面所述自噬-溶酶体靶向病毒的制备。
第五方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的自噬-溶酶体靶向病毒的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)统计分析野生病毒的宿主细胞内的自噬-溶酶体系统的表达分布，利用生物信息学分析和病毒蛋白质结构预测，选择引入自噬-溶酶体靶向分子和连接链的病毒蛋白及其中的引入位点；
(2)在所述引入位点的编码基因处插入编码自噬-溶酶体靶向分子和连接链的核苷酸序列；
(3)将步骤(2)得到的基因突变后的病毒蛋白的编码核苷酸序列与载体连接，得到表达载体；
(4)利用反向遗传技术，将步骤(3)中的表达载体与用于病毒拯救的表达载体共转染到细胞中，进行细胞培养，得到所述自噬-溶酶体靶向病毒；
优选地，步骤(3)所述载体包括质粒；
优选地，步骤(4)所述细胞包括表达切割所述连接链的蛋白酶的细胞或自噬-溶酶体系统缺陷的细胞；
优选地，所述表达切割所述连接链的蛋白酶的细胞表达的蛋白酶为烟草蚀斑病毒蛋白酶；
优选地，所述自噬-溶酶体系统缺陷的细胞中缺失LC3A蛋白、LC3B蛋白、LC3C蛋白、GABARAP蛋白、GABARAPL1蛋白或GABARAPL2蛋白中的任意一种或至少两种；
优选地，步骤(1)之前还包括构建表达选择性切割所述连接链的蛋白酶的细胞的步骤；
优选地，所述表达切割所述连接链的蛋白酶的细胞的野生细胞(指进行遗传改造的初始细胞)包括哺乳动物细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、Vero细胞、MDCK.2细胞、HEK293T细胞、MDCK细胞、A549细胞、BHK细胞、BHK-21/BRS细胞、Sp2/0细胞、HEK293细胞、293F细胞、HeLa细胞、TZM-bl细胞、Sup-T1细胞、MRC-5细胞和VMK细胞、LLC-MK2细胞、HCT-8细胞、Huh-7细胞或Caco2细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为HEK293T细胞和/或MDCK细胞。
优选地，步骤(4)所述细胞培养的培养基中含有自噬-溶酶体抑制剂。
优选地，所述自噬-溶酶体抑制剂包括3-Methyladenine(3-MA)、渥曼青霉素(Wortmannin)、Lys01或LY294002中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1’)统计分析野生病毒的宿主细胞内的自噬-溶酶体系统的表达分布，利用生物信息学分析和病毒蛋白质结构预测，选择引入自噬-溶酶体靶向分子和连接链的病毒蛋白及其中的引入位点；
(2’)使用基因工程的方法，在所述引入位点的编码基因处引入编码自噬-溶酶体靶向分子和连接链的核苷酸序列；
(3’)将步骤(2’)得到的基因突变后的病毒蛋白的编码核苷酸序列与载体连接，得到表达载体；
(4’)构建表达切割所述连接链的蛋白酶的表达载体；
(5’)利用反向遗传技术，将步骤(3’)得到的表达载体、用于病毒拯救的表达载体以及步骤(4’)得到的表达载体共同转染细胞，进行细胞培养，得到所述自噬-溶酶体靶向病毒。
优选地，所述野生病毒为流感病毒。
优选地，所述方法还包括检测的步骤，所述检测包括通过测定得到的自噬-溶酶体靶向病毒在所述表达选择性切割所述连接链的蛋白酶的细胞与未经改造的正常宿主细胞中的复制能力，来确定所述自噬-溶酶体靶向病毒是否改造成功，其中，在所述表达选择性切割所述连接链的蛋白酶的细胞中复制，在未经改造的正常宿主细胞中复制能力降低或不能复制的自噬-溶酶体靶向病毒为改造成功的自噬-溶酶体靶向病毒。
优选地，所述方法还包括使用改造成功的自噬-溶酶体靶向病毒载体，重复步骤(1)～(4)或(1’)～(5’)，使得自噬-溶酶体靶向病毒的多个病毒蛋白上均引入自噬-溶酶体靶向分子和连接链；或者在自噬-溶酶体靶向病毒的任一病毒蛋白上引入多个自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
根据本发明的具体的实施例，提供了一种自噬-溶酶体靶向流感病毒的制备和大规模生产的方法，包括以下步骤：
(1”)构建细胞系：将烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp转导至哺乳动物细胞系中，构建可以稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp的细胞系；
优选地，所述哺乳动物细胞系为HEK293T细胞系和MDCK细胞系；
构建的稳定细胞系为HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp；需要说明的是，虽然在本实施例中，优选烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEVp)及其对应的可切割序列作为研究对象，但本领域技术人员应理解的是，该发明技术的原理可以拓展至其他任何具有切割作用的分子(包括蛋白、多肽、核酸、及化学分子)；
(2”)位点选择：通过对宿主体内的自噬-溶酶体体系的表达分布进行统计分析、对流感病毒进行生物信息学和蛋白质结构预测，预测分析在流感病毒的各个蛋白中引入自噬-溶酶体靶向分子及连接链烟草蚀斑病毒蛋白酶切割序列后的流感病毒的蛋白结构，以确定引入自噬-溶酶体靶向分子和连接链的基因片段及位点；
优选地，在编码流感病毒的不同蛋白的基因片段中选择一个或多个插入位点；
(3”)基因突变：使用基因工程的方法，在所确定的流感病毒蛋白及选择位点的编码基因处引入编码自噬-溶酶体靶向分子和连接链的核苷酸序列；
(4”)构建质粒：
将步骤(3”)得到的基因突变后的病毒蛋白的编码核苷酸序列与质粒连接，得到编码质粒；
(5”)利用反向遗传技术，将步骤(4”)中的质粒与用于流感病毒拯救的其他质粒在步骤(1”)得到的稳定表达TEVp的稳定细胞中共转染，获得自噬-溶酶体靶向流感病毒；
其中，在自噬-溶酶体靶向流感病毒的基因组中引入了自噬-溶酶体靶向分子及烟草蚀斑病毒蛋白酶切割序列的编码核苷酸序列，从而在对应的流感病毒的蛋白中引入自噬-溶酶体靶向分子及烟草蚀斑病毒蛋白酶切割序列得到自噬-溶酶体靶向分子修饰的流感病毒(AUTOTAC流感病毒)；
优选地，将转染成功后的宿主细胞在含有0.5％FBS、2μg/mL TPCK-trypsin的DMEM培养基中培养；
简言之，将得到的突变序列表达载体与其他病毒拯救所需的质粒以及过表达TEVp的质粒共同转染宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有0.5％FBS、2μg/mL TPCK-trypsin的DMEM培养基中培养；
任选地，(6”)将该自噬-溶酶体靶向流感病毒在稳定表达TEVp的稳定细胞系中进行大规模生产；
优选地，转染约4天后，或者当包装出的病毒使(1”)中的宿主细胞完全病变或者90％以上病变后，收集上清，用于感染新的MDCK-TEVp细胞，培养基为含有0.5％FBS、2μg/mLTPCK-trypsin的DMEM培养基，感染4天后，或当感染的病毒使(1”)中的宿主细胞完全病变后，收集上清，即得到自噬-溶酶体靶向流感病毒。
优选地，所述自噬-溶酶体靶向流感病毒的制备方法还包括步骤(7”)检测：通过测定步骤(5”)得到的自噬-溶酶体靶向流感病毒对TEVp的依赖性以及其包装产物的失活对自噬-溶酶体途径的依赖性，来确定所述自噬-溶酶体靶向流感病毒是否改造成功；
具体地，将上清离心并过0.45μm滤膜去除细胞碎片，对包装产物进行TEVp依赖性的检测，以及包装产物的失活对自噬-溶酶体途径的依赖性，保留维持着TEVp依赖性的突变体设定为改造成功的候选物，所谓包装产物的TEVp依赖性，指的是使用所述方法包装的病毒在TEVp高表达的细胞系中可以复制增殖，而在不表达TEVp的正常细胞中复制能力降低或者缺陷。
任选地，所述自噬-溶酶体靶向流感病毒的制备方法还包括步骤(8”)使用改造成功的自噬-溶酶体靶向流感病毒载体重复步骤(2”)～(5”)，使得自噬-溶酶体靶向流感病毒的多个病毒蛋白上均引入了自噬-溶酶体靶向分子和连接链；或者在自噬-溶酶体靶向流感病毒的任一病毒蛋白上引入多个自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，通过测定得到的自噬-溶酶体靶向流感病毒对TEVp的依赖性以及其包装产物的失活对自噬-溶酶体途径的依赖性，来确定所述自噬-溶酶体靶向病毒是否改造成功；保留经过长期传代仍旧维持着对TEVp的依赖性的自噬-溶酶体靶向病毒为改造成功候选物；
任选地，所述自噬-溶酶体靶向流感病毒的制备方法方法还包括(9”)选择改造成功的候选物，并对产物进行纯化；
(10”)对(9”)中的自噬-溶酶体靶向流感病毒进行安全性或免疫原性检测，相比野生型病毒，安全的流感病毒为改造成功的流感病毒。
在本发明的一个具体的实施方案中，通过将自噬-溶酶体靶向流感病毒基因插入到载体(例如pHH21质粒)中，将所述的载体与拯救流感病毒所需的其他载体一起转染可以选择性切掉自噬-溶酶体靶向分子的稳定细胞系，优选HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp，即可获得AUTOTAC流感病毒，该病毒在可以选择性切掉自噬-溶酶体靶向分子的稳定细胞系，优选HEK293T-TEVp和/或MDCK-TEVp中进行大量扩增制备。
在本发明的一个实施方案中，为了提高流感病毒的产出效率，以及将来的工业化生产，建立了可以稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp的稳定细胞系(优选HEK293T-TEVp和MDCK-TEVp)，该哺乳动物稳定细胞系还解决了传统使用鸡胚繁殖病毒易引起人体过敏等不良反应的缺点。为了进一步提高产出效率，可以在病毒培养基中加入适量的自噬-溶酶体抑制剂用于抑制自噬-溶酶体系统对病毒蛋白的降解；或者可以使用自噬-溶酶体系统缺陷的细胞系，如LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP、GABARAPL1或GABARAPL2等自噬-溶酶体系统关键蛋白中的一个或者多个蛋白敲除或者敲低的细胞系。
为了建立稳定表达TEVp的哺乳动物细胞细胞系，发明人构建了带有嘌呤霉素抗性的慢病毒过表达载体，其携带TEVp的表达基因，通过病毒分别转导HEK293T细胞和MDCK细胞，并经过嘌呤霉素筛选，得到稳定表达TEVp的稳定细胞株，将这些稳定细胞株单克隆化，进行单克隆培养，利用Western blotting和RT-qPCR分选出TEVp表达量最高的稳定细胞株，即为最终的稳定细胞系HEK293T细胞和MDCK细胞。
经中空纤维柱和凝胶层析方法、蔗糖梯度密度离心方法或者PEG沉淀方法，即可得到纯化后的突变型AUTOTAC流感病毒，经体内外实验初步证明，AUTOTAC流感病毒具有优良的安全性和遗传稳定性，并且与灭活病毒相比具有更好的免疫效果。
第六方面，本发明提供第一方面所述的所述的自噬-溶酶体靶向病毒、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的表达载体或第四方面所述的重组细胞在制备预防和/或治疗病毒或肿瘤的药物中的应用。
第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含第一方面所述的自噬-溶酶体靶向病毒。
优选地，所述药物组合物还含有辅料。
优选地，所述辅料包括药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物包括疫苗。
优选地，所述疫苗为减毒活疫苗、复制无能活疫苗(包括复制减弱或者缺陷活疫苗)或复制可控活疫苗。
第八方面，本发明提供一种溶瘤病毒，所述溶瘤病毒包含第一方面所述的自噬-溶酶体靶向病毒。
本发明中提供了所述AUTOTAC病毒作为溶瘤病毒的用途，其不仅可以单独使用，一方面直接杀伤肿瘤细胞，一方面可以激活机体的抗肿瘤免疫，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤；其还可以与抗肿瘤药物联用，其他协同效应。
第九方面，本发明提供一种制备减毒活病毒、复制无能活病毒(包括复制减弱或者缺陷活病毒)、复制可控活病毒以及制备用于预防和治疗病毒感染相关疫苗和药物的方法，所述方法包括第五方面所述的自噬-溶酶体靶向病毒的制备方法。
第十方面，本发明提供了一种制备所述的自噬-溶酶体靶向病毒的系统，所述系统包括稳定表达对自噬-溶酶体靶向病毒的连接链具有选择性切割作用的蛋白酶的细胞；
优选地，所述细胞为稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp的细胞系或者自噬-溶酶体系统缺陷的细胞系，更优选地，所述细胞系为稳定表达烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp的HEK293T细胞系或MDCK细胞系，所述自噬-溶酶体系统缺陷的细胞系包括LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP、GABARAPL1或GABARAPL2等自噬-溶酶体系统关键蛋白中的一个或者多个蛋白敲除或者敲低的细胞系。
本发明中上述药物组合物、疫苗、溶瘤病毒可以在本发明制备定点突变修饰的AUTOTAC流感病毒的基础上采用本领域常规技术制备；它们可以用于预防或治疗流感病毒感染，包括人和动物的流感病毒感染；它们还可以用于治疗肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)通用性：蛋白质是所有病毒的共性生命物质，只需要在想要降解的病毒蛋白中引入“可切割的或者无需切割的自噬-溶酶体靶向分子”，就可以控制病毒的复制。因此该技术可用于所有病毒疫苗的制备；
(2)可供选择的自噬-溶酶体靶向分子有成千上万种，这些分子都可以被开发利用来制备这种病毒疫苗或者溶瘤病毒，因此有丰富的后备资源可供选择；
(3)操作简单：只需要简单的病毒载体的构建和病毒的制备技术，生产者不需要太多的病毒生物学知识就可以制备这类疫苗；
(4)实验证明，该技术可以用于设计成具有不同失活程度的疫苗，具有安全的可控性，且具有良好的免疫原性；
(5)实验证明，自噬-溶酶体靶向病毒可以作为溶瘤病毒。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1构建包含可切割的自噬-溶酶体靶向分子的流感病毒WSN的基因载体
本实施例构建包含可切割的自噬-溶酶体靶向分子的流感病毒WSN的基因载体。
(1)获取拯救野生型流感病毒WSN的质粒
根据pubmed公布的流感病毒A/WSN/1933的基因序列，相关网址包括：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+PB2；
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+PB1；
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+PA；
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+HA；
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+NA；
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+NP；
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+M；
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝WSN+NS；
经全基因合成，获得该流感病毒各个基因片段的基因，然后将其分别连接在pHH21、pCDNA3(neo)、pcAAGGS/MCS载体上(获自北京中科裕博生物技术有限公司)，获得拯救野生型流感病毒WSN的质粒。获得的质粒的命名及构成如表4所示。
表4
简称 质粒名称 关键基因 酶切位点 构建好的质粒结构
Ben1 PHH21 PB2 BsmBI pPolI-WSN-PB2
Ben2 PHH21 PB1 BsmBI pPolI-WSN-PB1
Ben3 PHH21 PA BsmBI pPolI-WSN-PA
Ben4 PHH21 HA BsmBI pPolI-WSN-HA
Ben5 PHH21 NP BsmBI pPolI-WSN-NP
Ben6 PHH21 NA BsmBI pPolI-WSN-NA
Ben7 PHH21 M BsmBI pPolI-WSN-M
Ben8 PHH21 NS BsmBI pPolI-WSN-NS
Ben9 pcDNA3(neo) PB2 EcoRI pcDNA3(neo)-PB2
Ben10 pcDNA3(neo) PB1 EcoRI pcDNA3(neo)-PB1
Ben11 pcDNA3(neo) PA EcoRI pcDNA3(neo)-PA
Ben13 pcAGGS/MCS NP EcoRI pcAGGS/MCS-NP
(2)构建引入可切割的自噬-溶酶体靶向分子的病毒载体
在流感病毒WSN的各个病毒蛋白(PA，PB2，PB1，NP，HA，NA，M1，M2，NS1，NEP)对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可被TEVp切割的自噬-溶酶体靶向分子的基因序列，并构建了如下的病毒载体。
具体地，在病毒的任一蛋白上引入所述可被TEVp切掉的自噬-溶酶体靶向分子的基因序列及其表达的氨基酸序列如下，将所用氨基酸序列对应的基因序列进行人源化优化，并插入到目的蛋白基因的编码区C端、终止密码子之前；并经测序验证突变构建成功。
发明人构建的病毒载体示例：
在M1蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别根据插入序列编号命名，命名为M1-AUTOTAC-107，M1-AUTOTAC-108，M1-AUTOTAC-109，M1-AUTOTAC-110，……(此处为根据序列编号依次命名，不再一一列举)，M1-AUTOTAC-185。
在PA蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为PA-AUTOTAC-107，PA-AUTOTAC-108，PA-AUTOTAC-109，PA-AUTOTAC-110，……，PA-AUTOTAC-185。
在PB2蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为PB2-AUTOTAC-107，PB2-AUTOTAC-108，PB2-AUTOTAC-109，PB2-AUTOTAC-110，……，PB2-AUTOTAC-185。
在PB1蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为PB1-AUTOTAC-107，PB1-AUTOTAC-108，PB1-AUTOTAC-109，PB1-AUTOTAC-110，……，PB1-AUTOTAC-185。
在NP蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为NP-AUTOTAC-107，NP-AUTOTAC-108，NP-AUTOTAC-109，NP-AUTOTAC-110，……，NP-AUTOTAC-185。
在HA蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为HA-AUTOTAC-107，HA-AUTOTAC-108，HA-AUTOTAC-109，HA-AUTOTAC-110，……，HA-AUTOTAC-185。
在NA蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为NA-AUTOTAC-107，NA-AUTOTAC-108，NA-AUTOTAC-109,NA-AUTOTAC-110，……，NA-AUTOTAC-185。
在M2蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为M2-AUTOTAC-107,M2-AUTOTAC-108，M2-AUTOTAC-109，M2-AUTOTAC-110，……，M2-AUTOTAC-185。
在NS1蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为NS1-AUTOTAC-107，NS1-AUTOTAC-108，NS1-AUTOTAC-109，NS1-AUTOTAC-110，……，NS1-AUTOTAC-185。
在NEP蛋白对应的基因编码区的C端、终止密码子之前，分别引入可以编码SEQ IDNO.107～SEQ ID NO.185氨基酸序列的基因序列，构建成功的病毒载体分别命名为NEP-AUTOTAC-107，NEP-AUTOTAC-108，NEP-AUTOTAC-109，NEP-AUTOTAC-110，……，NEP-AUTOTAC-185。
实施例2定点突变修饰后的AUTOTAC流感病毒的拯救
按照常规的拯救流感病毒方法，将拯救流感病毒所用的12个质粒共转染稳定细胞系，并使用实施例1中定点突变改造的质粒替换这12个质粒中相应的质粒，对应于六孔板的每个孔，每种质粒加0.2μg，转染后，观察细胞的病变情况，筛选出可以拯救出病毒并且对TEVp具有依赖性的插入位点、自噬-溶酶体靶向分子、可被TEVp切割的连接链linker、以及它们的组合。筛选出的毒株根据蛋白及引入的可切割的自噬-溶酶体靶向分子进行命名。
示例说明，将Ben3 pPolI-WSN-PA质粒上引入可切割自噬-溶酶体靶向分子SEQ IDNO.107之后，将该质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben1 pPolI-WSN-PB2；Ben2 pPolI-WSN-PB1；Ben4 pPolI-WSN-HA；Ben5 pPolI-WSN-NP；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben7 pPolI-WSN-M；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA3(neo)-PB2；Ben10 pcDNA3(neo)-PB1；Ben11 pcDNA3(neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染表达TEVp的稳定细胞系，从而拯救出在流感病毒PA基因片段上引入SEQ ID NO.107的突变型流感病毒，命名为PA-AUTOTAC-107。在Ben7pPolI-WSN-M质粒上的M1蛋白的编码区C端引入可切割自噬-溶酶体靶向分子SEQ IDNO.107之后，将该质粒与拯救流感病毒的其他质粒Ben1 pPolI-WSN-PB2；Ben2 pPolI-WSN-PB1；Ben3 pPolI-WSN-PA；Ben4 pPolI-WSN-HA；Ben5 pPolI-WSN-NP；Ben6 pPolI-WSN-NA；Ben8 pPolI-WSN-NS；Ben9 pcDNA3(neo)-PB2；Ben10 pcDNA3(neo)-PB1；Ben11 pcDNA3(neo)-PA；Ben13 pcAGGS/MCS-NP共同转染表达TEVp的稳定细胞系，从而拯救出在流感病毒M1基因片段上引入SEQ ID NO.107的突变型流感病毒，命名为M1-AUTOTAC-107。
依照同样的方法，可获取其他位点引入可切割的自噬-溶酶体靶向分子的突变型流感病毒，并按照同样的规则进行命名。
按照能否引起细胞病变的标准对构建的所有AUTOTAC病毒载体进行考察：如果可以引起HEK293T-TEVp和/或MDCK-TEVp细胞病变，说明该AUTOTAC病毒拯救成功；如果不能引起HEK293T-TEVp和/或MDCK-TEVp细胞病变，说明该AUTOTAC病毒拯救失败。部分的突变型流感病毒的拯救情况作为示例，可见表5，表5中总结了可以引起MDCK-TEVp细胞发生病变的部分AUTOTAC流感病毒毒株。所述结果表明在流感病毒的8个基因片段上均可引入可选择性切割的自噬-溶酶体靶向分子，并且均可以拯救出AUTOTAC流感病毒。
表5
从上述突变位点、可切割的自噬-溶酶体靶向分子中，选择拯救流感病毒效率高、遗传稳定、且在正常宿主细胞最终复制能力明显下降甚至完全消失的突变修饰方式(如M1-AUTOTAC-107和PA-AUTOTAC-108)，进行组合，制备含有多个自噬-溶酶体靶向分子的流感病毒，并从中进一步选择优选的毒株。
实施例3包含(不需要切割的)自噬-溶酶体靶向分子的流感病毒WSN的基因载体的构建以及相应AUTOTAC病毒的拯救
重组载体的命名原则如下：
1.在病毒蛋白N端引入自噬-溶酶体靶向分子，构建的病毒载体命名为“病毒蛋白名称-N-自噬-溶酶体靶向分子”；
2.在病毒蛋白C端引入自噬-溶酶体靶向分子，构建的病毒载体命名为“病毒蛋白名称-C-自噬-溶酶体靶向分子”；
3.在病毒蛋白的编码区内部引入自噬-溶酶体靶向分子，构建的病毒载体，命名为“病毒蛋白名称-与引入位点相邻的上游氨基酸的名称和氨基酸编号-自噬-溶酶体靶向分子”。
构建的重组质粒如下：
PB2-N-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-R70-D自噬-溶酶体靶向分子、PB2-I176-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-V457-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-N510-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-Y531-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-A623-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-D680-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-E700-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-C-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-N-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-D70-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-D295-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-R327-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-R430-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-F490-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-T566-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-N626-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-G710-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-C-自噬-溶酶体靶向分子、PA-N-自噬-溶酶体靶向分子、PA-D294-自噬-溶酶体靶向分子、PA-N350-自噬-溶酶体靶向分子、PA-E372-自噬-溶酶体靶向分子、PA-L425-自噬-溶酶体靶向分子、PA-H510-自噬-溶酶体靶向分子、PA-A553-自噬-溶酶体靶向分子、PA-E604-自噬-溶酶体靶向分子、PA-S624-自噬-溶酶体靶向分子、PA-C-自噬-溶酶体靶向分子、NP-N-自噬-溶酶体靶向分子、NP-G126-自噬-溶酶体靶向分子、NP-N247-自噬-溶酶体靶向分子、NP-R317-自噬-溶酶体靶向分子、NP-V353-自噬-溶酶体靶向分子、NP-A366-自噬-溶酶体靶向分子、NP-Q409-自噬-溶酶体靶向分子、NP-E465-自噬-溶酶体靶向分子、NP-M481-自噬-溶酶体靶向分子、NP-C-自噬-溶酶体靶向分子、M1-N-自噬-溶酶体靶向分子、M1-A33-自噬-溶酶体靶向分子、M1-V68-自噬-溶酶体靶向分子、M1-D89-自噬-溶酶体靶向分子、M1-R105-自噬-溶酶体靶向分子、M1-M135-自噬-溶酶体靶向分子、M1-Q164-自噬-溶酶体靶向分子、M1-H222-自噬-溶酶体靶向分子、M1-A239-自噬-溶酶体靶向分子、M1-C-自噬-溶酶体靶向分子、M2-C-自噬-溶酶体靶向分子、NEP-C-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-N-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-A76-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-A82-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-H101-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-A122-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-T151-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-L163-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-C-自噬-溶酶体靶向分子、HA-N-自噬-溶酶体靶向分子、HA-C-自噬-溶酶体靶向分子、NA-N-自噬-溶酶体靶向分子、NA-C-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-N-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-R70-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-I176-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-V457-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-N510-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-Y531-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-A623-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-D680-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-E700-自噬-溶酶体靶向分子、PB2-C-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-N-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-D70-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-D295-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-R327-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-R430-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-F490-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-T566自噬-溶酶体靶向分子、PB1-N626-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-G710-自噬-溶酶体靶向分子、PB1-C-自噬-溶酶体靶向分子、PA-N-自噬-溶酶体靶向分子、PA-D294-自噬-溶酶体靶向分子、PA-N350-自噬-溶酶体靶向分子、PA-E372-自噬-溶酶体靶向分子、PA-L425-自噬-溶酶体靶向分子、PA-H510-自噬-溶酶体靶向分子、PA-A553-自噬-溶酶体靶向分子、PA-E604-自噬-溶酶体靶向分子、PA-S624-自噬-溶酶体靶向分子、PA-C-自噬-溶酶体靶向分子、NP-N-自噬-溶酶体靶向分子、NP-G126-自噬-溶酶体靶向分子、NP-N247-自噬-溶酶体靶向分子、NP-R317-自噬-溶酶体靶向分子、NP-V353-自噬-溶酶体靶向分子、NP-A366-自噬-溶酶体靶向分子、NP-Q409-自噬-溶酶体靶向分子、NP-E465-自噬-溶酶体靶向分子、NP-M481-自噬-溶酶体靶向分子、NP-C-自噬-溶酶体靶向分子、M1-N-自噬-溶酶体靶向分子、M1-A33-自噬-溶酶体靶向分子、M1-V68-自噬-溶酶体靶向分子、M1-D89-自噬-溶酶体靶向分子、M1-R105-自噬-溶酶体靶向分子、M1-M135-自噬-溶酶体靶向分子、M1-Q164-自噬-溶酶体靶向分子、M1-H222-自噬-溶酶体靶向分子、M1-A239-自噬-溶酶体靶向分子、M1-C-自噬-溶酶体靶向分子、M2-C-自噬-溶酶体靶向分子、NEP-C-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-N-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-A76-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-A82-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-H101-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-A122-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-T151-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-L163-自噬-溶酶体靶向分子、NS1-C-自噬-溶酶体靶向分子、HA-N-自噬-溶酶体靶向分子、HA-C-自噬-溶酶体靶向分子、NA-N-自噬-溶酶体靶向分子和NA-C-自噬-溶酶体靶向分子。
其中，自噬-溶酶体靶向分子的氨基酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.79所示。
将上述重组载体导入自噬-溶酶体系统缺陷的细胞系，包装得到所述含有自噬-溶酶体靶向分子的重组病毒：
使用本实施例中的重组载体替换对应的野生型质粒，并与其他11种质粒共转染自噬-溶酶体系统缺陷的哺乳动物细胞系(示例：重组载体PB2-N-自噬-溶酶体靶向分子SEQID NO.1替代质粒Ben1，与其他11种质粒共转染)，每种质粒的加入量为0.2μg，转染后的细胞在含有0.5％FBS、2μg/mL TPCK-胰蛋白酶的DMEM培养基中培养。
转染4天后，宿主细胞完全病变或者90％以上病变后，收集上清，感染新的自噬-溶酶体系统缺陷的细胞，培养基为含有0.5％FBS、2μg/mL TPCK-胰蛋白酶的DMEM培养基，感染4天后，宿主细胞完全病变后，收集上清。
上清离心并过0.4μm滤膜去除细胞碎片，对包装产物进行自噬-溶酶体系统缺陷依赖性的检测，以及包装产物的失活对自噬-溶酶体系统的依赖性，保留维持着自噬-溶酶体系统缺陷依赖性的突变体即为重组病毒。
按照与重组载体相同的方式，对制备得到的重组病毒进行命名。示例，用重组载体PB2-N-自噬-溶酶体靶向分子SEQ ID NO.1替代质粒Ben1，制备出来的病毒命名为PB2-N-自噬-溶酶体靶向分子SEQ ID NO.1；用重组载体PB2-N-自噬-溶酶体靶向分子SEQ ID NO.2替代质粒Ben1，制备出来的病毒命名为PB2-N-自噬-溶酶体靶向分子SEQ ID NO.2；以此类推。
结果表明在流感病毒的8个基因片段上均可引入(不需要切割的)自噬-溶酶体靶向分子，并且均可以拯救出AUTOTAC流感病毒。
实施例4定点突变的流感病毒的拯救和纯化
(1)含有可切割的自噬-溶酶体靶向分子的AUTOTAC病毒的拯救
将实施例2的步骤中定点突变改造后的流感病毒的拯救中获得的突变型流感病毒包装质粒共转染表达TEVp的稳定细胞系，6小时候换成新的培养基，培养基中含有1％的FBS和2μg/mL的TPCK-trypsin，并以正常细胞作为对照。此拯救实验采用的阳性对照为野生型流感病毒WSN，除了拯救病毒的质粒不同之外，其余条件均与突变型流感病毒的拯救条件相同。转染完成后，每天观察细胞的状态，用TEVp稳定细胞系中出现病变，而正常细胞不出现病变或者病变较少的突变体为阳性突变体。而野生型流感病毒在TEVp稳定细胞系和正常细胞系中均出现病变。
(2)AUTOTAC流感病毒的纯化
a.当步骤(1)拯救突变型AUTOTAC流感病毒的稳定系细胞完全病变时，或者转染大约4天后，收集细胞上清，于5000×g离心10min，用新的稳定细胞系进行大量扩增，待细胞完全病变或者扩增大约4天后，收集细胞上清，过0.45μm的滤膜；
b.使用蔗糖梯度梯度密度离心的方法纯化流感病毒。具体步骤如下：将1)中的病毒液用50mL离心管(高速专用)于105×g离心2h，沉淀用1mL PBS重悬；
c.用NTE Buffer(100mM NaCl，10mM Tris-Cl，pH7.4，1mM EDTA)溶解蔗糖，配成20％蔗糖溶液，过0.45μm滤膜；
d.将步骤c的蔗糖加入到50mL，将b中的PBS重悬液滴在蔗糖溶液上，11×104×g，离心2h；
e.沉淀加约15mL NTE buffer，11×104×g，继续离心2h；
f.将步骤e中的沉淀用PBS重悬。
实施例5自噬-溶酶体靶向流感病毒在细胞水平的安全性考察
通过对制备出的突变型AUTOTAC流感病毒M-AUTOTAC-107进行TEVp蛋白的依赖性考察来确认AUTOTAC病毒的安全性；进行长期的传代培养，来考察该突变型病毒中可切割的自噬-溶酶体靶向分子的稳定性。
具体实验1：将制备的突变型AUTOTAC流感病毒按照MOI＝0.01的比例感染MDCK-TEVp细胞和正常的MDCK细胞，4天后取上清检测病毒的滴度，将AUTOTAC病毒在MDCK-TEVp细胞中的病毒滴度定为100％，比较AUTOTAC病毒在MDCK-TEVp细胞和正常MDCK细胞中的相对病毒滴度，可知病毒在两种细胞中的复制能力差异。
具体实验2：将新制备出的突变型AUTOTAC流感病毒按照MOI＝0.01的比例接种在新的培养基中并感染稳定系细胞，培养基中含有1％FBS、2μg/mL的TPCK-trypsin，并用正常的细胞系作为对照。待TEVp稳定细胞系完全病变后时，取出上清，过0.45μm的滤膜，再按照MOI＝0.01的比例接种在新的培养基中并感染稳定系细胞，同样以正常的细胞系作为对照。如此重复，进行长期的病毒传代。通过基因测序检测引入的自噬-溶酶体靶向分子是否发生了突变。
结果表明，AUTOTAC病毒在MDCK-TEVp细胞中可以复制增殖，而在正常的MDCK细胞中的复制能力显著降低甚至不能复制，即具有对TEVp的依赖性，说明该病毒是安全的。另外，经过长期传代，突变型AUTOTAC病毒毒株中引入的自噬-溶酶体靶向分子没有发生突变，说明在流感病毒基因中引入的可切割的自噬-溶酶体靶向分子是稳定存在的，进而说明在遗传上是稳定的。
实施例6考察自噬-溶酶体靶向流感病毒复制能力的减弱是否是由细胞的自噬-溶酶体调控的
以M1-AUTOTAC-107为代表性毒株，考察了设计的AUTOTAC流感病毒在正常细胞中的复制能力的减弱是否是由细胞内的自噬-溶酶体系统介导的。
具体实验1：将制备的突变型AUTOTAC流感病毒或野生型病毒感染正常的MDCK细胞(MOI＝0.1)，培养基中补充100nM自噬-溶酶体抑制剂(3-Methyladenine(3-MA)、Wortmannin(渥曼青霉素)、LY294002等)或者相同稀释比例的DMSO作为对照。分别在感染后24h和48h，收集细胞样品，用western blot检测病毒M1蛋白水平。
具体实验2：将制备的突变型AUTOTAC流感病毒或野生型病毒感染MDCK-TEVp细胞和正常的MDCK细胞(MOI＝0.01)，培养基中补充不同浓度(0，50或者100nM)的自噬-溶酶体抑制剂(3-Methyladenine(3-MA)、Wortmannin(渥曼青霉素)、LY294002等)或者相同稀释比例的DMSO作为对照，在感染后48h，将细胞用4％PFA固定，用免疫荧光实验检测病毒M1蛋白水平。
结果表明，野生型病毒在感染MDCK细胞后，可以大量复制，产生大量的病毒蛋白。相比之下，AUTOTAC病毒的病毒蛋白M1上修饰了自噬-溶酶体靶向分子SEQ ID NO107后，在感染后48h后病毒的M1蛋白会被降解；而培养基中加入自噬-溶酶体抑制剂(3-Methyladenine(3-MA)、Wortmannin(渥曼青霉素)、LY294002等)后，自噬-溶酶体介导的病毒蛋白M1的降解被抑制。该实验结果说明，发明人引入的自噬-溶酶体靶向分子可以介导病毒蛋白的降解；AUTOTAC病毒在正常细胞中复制能力的降低是由自噬-溶酶体介导的病毒蛋白的降解引起的，符合本发明原理。
由免疫荧光实验结果可知，AUTOTAC病毒在感染MDCK-TEVp细胞后可以大量复制，并合成大量的病毒蛋白。而AUTOTAC病毒感染正常的MDCK细胞后，无法大量复制，因此检测到较少的病毒蛋白M1的信号；而当细胞的自噬-溶酶体系统被抑制后，病毒蛋白M1的信号增加，说明当自噬-溶酶体系统被抑制后，病毒的复制能力增强。该结果上述实验2结果相符，进一步证明自噬-溶酶体靶向分子的引入会介导细胞的自噬-溶酶体对病毒蛋白的降解，进而抑制病毒的复制能力；当细胞的自噬-溶酶体系统被抑制后，病毒的复制能力会恢复。
以上结果证明，AUTOTAC病毒的复制能力的降低或者缺陷是由细胞的自噬-溶酶体系统介导的；符合发明人对AUTOTAC病毒的设计预期。
实施例7自噬-溶酶体靶向流感病毒(AUTOTAC流感病毒)在动物水平的安全性、免疫原性和保护性考察
本实施例中使用BALB/c和C57BL/6J小鼠对AUTOTAC病毒在动物水平的安全性和免疫原性及保护性进行评价。以灭活流感疫苗(IIV)为对照(灭活流感病毒疫苗为发明人根据中国药典提供的方法用同源的流感病毒颗粒制备的)，选择M1-AUTOTAC-107作为AUTOTAC病毒的代表，进行AUTOTAC病毒的安全性、免疫原性和保护性评价。
安全性评价具体实验：
(1)将30只6-8周的雌性BALB/c小鼠或C57BL/6J小鼠，分成3组，每组10只；
(2)接种病毒：第一组滴鼻接种PBS；第二组滴鼻接种105PFU M1-AUTOTAC-107；第三组接种105PFU野生型WSN流感病毒；
(3)接种三天后，每组取5只小鼠，取其肺组织，检测其中的病毒滴度；
(4)继续观察监测每组剩余5只小鼠的体重和死亡情况，持续14天。
结果表明：野生型病毒可以在小鼠的肺中高度复制，并引起小鼠体重明显下降和死亡。而AUTOTAC病毒在小鼠肺中的复制能力很弱，并且不会引起小鼠体重下降，也不会引起小鼠死亡。因此AUTOTAC病毒疫苗具有良好的安全性。
免疫原性和保护性评价：
(1)将60只6-8周的雌性BALB/c小鼠或C57BL/6J小鼠，分成3组，每组20只；
(2)接种病毒：第一组滴鼻接种PBS；第二组滴鼻接种105PFU M1-AUTOTAC-107；第三组接种105PFU灭活流感疫苗；
(3)接种一周后，每组取5只小鼠，取其肺组织和脾脏，检测其中的T细胞免疫反应；
(4)接种三周后，每组取5只小鼠，取血，用于血凝抑制(HI)试验、中和(NT)抗体检测、ELISA实验检测其中的抗体免疫反应；
(5)接种三周后，每组小鼠鼻腔接种2×105PFU的野生型WSN流感病毒；
(6)接种野生型病毒三天后，每组取5只小鼠，取其肺组织，检测其中的病毒滴度；
(7)继续观察监测每组剩余5只小鼠的体重和死亡情况，持续14天；
结果表明，AUTOTAC病毒就可以在动物体内诱导高水平的血凝抑制抗体滴度、中和抗体滴度、anti-NP IgG、anti-NP IgA等。AUTOTAC病毒诱导的血凝抑制抗体、中和抗体、anti-NP IgG、anti-NP IgA水平，显著高于由灭活疫苗诱导的抗体水平。AUTOTAC病毒疫苗的接种可以显著减少动物肺组织中的野生型病毒滴度；AUTOTAC病毒疫苗提供的保护性显著地优于灭活疫苗。
实施例8 AUTOTAC病毒作为溶瘤病毒的评价
本实施例中使用C57BL/c的黑色素瘤荷瘤模型，对AUTOTAC流感病毒的溶瘤效果进行评价，具体实验包括以下步骤：
(1)在小鼠(购自维通利华，5-8周龄，雌性)的背部皮下注射黑色素瘤，饲养8天，当瘤体体积达到约100mm3时，开始下面的实验操作；
(2)向瘤体内注射50μL AUTOTAC流感病毒(M1-AUTOTAC-107)，以注射等量PBS作为对照组，每间隔1天注射1次，共注射4次；
(3)每天检测瘤体的体积。
结果表明，自噬-溶酶体靶向流感病毒可以有效抑制肿瘤体积的增加，证明自噬-溶酶体靶向流感病毒具备成为溶瘤病毒的潜能。
综上所述，本发明创造性设计一种自噬-溶酶体靶向病毒，其可以在特定的人工细胞系中高效复制、大量生产制备，但在正常的细胞中病毒的复制能力被减弱甚至完全失去复制能力，可广泛应用于活疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、强毒的安全模型等，具有安全可控性，且具有良好的免疫原性，此外，所述自噬-溶酶体靶向病毒可以作为溶瘤病毒，不仅可以直接杀伤肿瘤，而且可以激活机体对肿瘤免疫效果，提供的病毒制备方法工艺简单且具备通用性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种自噬-溶酶体靶向病毒及其制备方法和应用
<130> 2022-02-08
<160> 185
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
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1 5
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Arg Pro Glu Glu Gln Met Glu Ser Asp Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp
1 5 10 15
Asp Trp Thr His Leu Ser
20
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Ala Met Gly Ser Ala Ser Ser Glu Asp Tyr Ile Ile Ile Leu Pro
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Gly Ala Met Gly Ser Ala Ser Ser Glu Asp Trp Ile Ile Ile Leu Pro
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Ser His Lys Ser Asp Trp Ile Phe Leu Pro Asn Ala Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Asp Ala Thr Tyr Thr Trp Glu His Leu Ala Trp Pro
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala Gly Asp
1 5 10
<210> 13
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Glu Gln Ser Leu Pro Pro Pro Ala Gly Leu Asn Ser Ser Trp Val Glu
1 5 10 15
Leu Pro Met Asn Ser Ser
20
<210> 14
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Pro Glu Asp Asp Trp Ile Glu Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Gln Ala Ala Ala Ser Gln Ser Pro
20 25
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Pro Glu Asp Asp Trp Ile Glu Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Ala
1 5 10 15
<210> 16
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Val Glu Glu Glu Trp Val Ile Val Ser Asp Glu Glu Ile Glu Glu Ala
1 5 10 15
Arg Gln Lys Ala Pro Leu Glu Ile Thr Glu Tyr
20 25
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Glu Gly Asp Asp Phe Glu Leu Leu Asp Gln Ser Glu Leu Asp Gln Ile
1 5 10 15
Glu Ser Glu Leu Gly Leu Thr Gln Asp Gln
20 25
<210> 18
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys Gln Ile
1 5 10 15
Gln Glu Ser Gly Ser Ser Leu Pro Glu Thr
20 25
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Gly Ser Ser Glu Asp Ser Phe Val Glu Ile Arg Met Ala Glu
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Ser Ser Gly Ser Ser Glu Asp Ser Phe Val Glu Ile
1 5 10
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Ser Ser Gly Ser Ser Glu Asp Ser Trp Val Glu Ile
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Glu Glu Gly Glu Glu Glu Asp Glu Trp Val Glu Ile
1 5 10
<210> 23
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Ile Val Asp Glu Phe Glu Glu Leu Gly Glu Gln Glu Ser Asp Ile Asp
1 5 10 15
Glu Phe Asp Leu Leu Glu Gly
20
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Asp Tyr Glu Ser Asp Asp Asp Ser Tyr Glu Val Leu Asp Leu Thr Glu
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Asp Tyr Glu Ser Asp Asp Asp Ser Tyr Glu Val Leu Asp Leu Thr Glu
1 5 10 15
Tyr
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Asp
1 5 10 15
Pro Ser Thr Gly
20
<210> 27
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys Gln Ile
1 5 10 15
Gln Glu Trp
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Trp
1 5 10
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys Gln Ile
1 5 10 15
Trp
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Leu Glu Arg Val Thr Asp Tyr Ala Glu Glu Lys Glu
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Asp
1 5 10 15
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Gly Ser Ser Glu Asp Ser Phe Val Glu Ile Arg Met Ala Glu Gly Glu
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Glu Asn Glu Glu Asp Ile Leu Val Val Thr Thr Gln Gly Glu Val
1 5 10 15
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
Ser Ala Ser Ser Glu Asp Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Glu Cys Phe Asp
1 5 10 15
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Ala Gly Leu Asn Ser Ser Trp Val Glu Leu Pro Met Asn Ser Ser Asn
1 5 10 15
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Glu Ser Asp Asp Asp Ser Tyr Glu Val Leu Asp Leu Thr Glu Tyr Ala
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Leu Asp Glu Lys Asp Gly Phe Ile Phe Val Asn Tyr Ser Glu Gly Gln
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Pro Pro Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
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1 5 10 15
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 40
Ser Ser Cys Asp Thr Asp Asp Phe Val Met Val Pro Ala Gln Phe Pro
1 5 10 15
Gly
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 41
Ser Gly Val Glu Tyr Tyr Trp Asp Gln Leu Asn Glu Thr Val Phe Thr
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 42
Asp Ala Ala Thr Leu Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Phe Ala Glu Phe Glu
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 43
Glu Lys Glu Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 44
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 45
Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 46
Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 47
Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 48
Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 49
Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 50
Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp
1 5 10
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 51
Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 52
Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 53
Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 54
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 55
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 56
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 57
Glu Lys Glu Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 58
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Leu Pro Leu Lys Leu Thr Ile Tyr
20
<210> 59
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 59
Gly Gly Ser Ser Gly Asn Thr His Asp Asp Phe Val Met Ile Asp Phe
1 5 10 15
Lys Pro Ala Phe Ser Lys Asp Asp
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 60
Ser Lys Asp Ser Ser Cys Asp Thr Asp Asp Phe Val Met Val Pro Ala
1 5 10 15
Gln Phe Pro Gly Asp Leu Val Ala
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 61
Pro Asp Ser Ile Asp Ala His Thr Phe Asp Phe Glu Thr Ile Pro His
1 5 10 15
Pro Asn Ile Glu Gln Thr Ile His
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 62
Ser Asp Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser
1 5 10 15
Lys Glu Val Asp Pro Ser Thr Gly
20
<210> 63
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 63
Thr Asp Tyr Arg Pro Pro Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp
1 5 10 15
Glu Glu Leu Cys Gln Ile Gln Glu
20
<210> 64
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<211> 12
<212> PRT
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<400> 65
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Phe Glu Xaa Leu Xaa Xaa
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Trp Glu Xaa Ile Xaa Xaa
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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<212> PRT
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 68
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<211> 13
<212> PRT
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 70
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<211> 16
<212> PRT
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<221> misc_feature
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 71
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 72
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1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 73
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 74
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 75
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 76
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<213> 人工序列
<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 79
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
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Leu Glu Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Pro Arg Ser Phe Thr Ser Cys
1 5 10 15
Gly Ser Leu Glu
20
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<213> 人工序列
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Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
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<213> 人工序列
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Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
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<213> 人工序列
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Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Met
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Met Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
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Leu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
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Arg Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5
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<213> 人工序列
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Glu Arg Gly Tyr Gly Gln Val
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<213> 人工序列
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Glu Val Ala Tyr Gly Gln Lys
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 104
Glu Ser Arg Tyr Val Gln Ser
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<213> 人工序列
<400> 105
Glu Gly Glu Tyr Trp Gln Arg
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<211> 7
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<213> 人工序列
<400> 106
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<213> 人工序列
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asn Thr
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His Asp Asp Phe Val Met Ile
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<213> 人工序列
<400> 108
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Lys
1 5 10 15
Glu Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile
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<213> 人工序列
<400> 109
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Lys Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Asp Ser Thr Phe Thr Asn Ile Ser Leu Ala Asp Asp Ile
20 25 30
Asp His
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<211> 25
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<213> 人工序列
<400> 110
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Thr Trp Thr Leu Val Asp Glu Gly
20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 111
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Glu
1 5 10 15
Asp Pro Glu Thr Ser Trp Ile Leu Leu Asn
20 25
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 112
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Arg Pro
1 5 10 15
Glu Glu Gln Met Glu Ser Asp Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp
20 25 30
Thr His Leu Ser
35
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 113
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ala
1 5 10 15
Met Gly Ser Ala Ser Ser Glu Asp Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Glu Ser
20 25 30
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 114
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ala
1 5 10 15
Met Gly Ser Ala Ser Ser Glu Asp Trp Ile Ile Ile Leu Pro Glu Ser
20 25 30
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<213> 人工序列
<400> 115
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Leu
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Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro
20 25
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<211> 27
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<213> 人工序列
<400> 116
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser His
1 5 10 15
Lys Ser Asp Trp Ile Phe Leu Pro Asn Ala Ala
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<211> 26
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<213> 人工序列
<400> 117
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Ala
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Thr Tyr Thr Trp Glu His Leu Ala Trp Pro
20 25
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<213> 人工序列
<400> 118
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Gln
1 5 10 15
Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Ala Gly Asp
20 25
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<211> 36
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<213> 人工序列
<400> 119
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Gln
1 5 10 15
Ser Leu Pro Pro Pro Ala Gly Leu Asn Ser Ser Trp Val Glu Leu Pro
20 25 30
Met Asn Ser Ser
35
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 120
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Pro Glu
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Asp Asp Trp Ile Glu Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Ala Arg Gln
20 25 30
Gln Ala Ala Ala Ser Gln Ser Pro
35 40
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 121
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Pro Glu
1 5 10 15
Asp Asp Trp Ile Glu Phe Ser Ser Glu Glu Ile Arg Glu Ala
20 25 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 122
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Val Glu
1 5 10 15
Glu Glu Trp Val Ile Val Ser Asp Glu Glu Ile Glu Glu Ala Arg Gln
20 25 30
Lys Ala Pro Leu Glu Ile Thr Glu Tyr
35 40
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<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 123
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Gly
1 5 10 15
Asp Asp Phe Glu Leu Leu Asp Gln Ser Glu Leu Asp Gln Ile Glu Ser
20 25 30
Glu Leu Gly Leu Thr Gln Asp Gln
35 40
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<211> 40
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<213> 人工序列
<400> 124
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys Gln Ile Gln Glu
20 25 30
Ser Gly Ser Ser Leu Pro Glu Thr
35 40
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 125
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Glu Asp Ser Phe Val Glu Ile Arg Met Ala Glu
20 25
<210> 126
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 126
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ser Glu Asp Ser Phe Val Glu Ile
20 25
<210> 127
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 127
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ser Glu Asp Ser Trp Val Glu Ile
20 25
<210> 128
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 128
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Glu
1 5 10 15
Gly Glu Glu Glu Asp Glu Trp Val Glu Ile
20 25
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<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 129
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ile Val
1 5 10 15
Asp Glu Phe Glu Glu Leu Gly Glu Gln Glu Ser Asp Ile Asp Glu Phe
20 25 30
Asp Leu Leu Glu Gly
35
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 130
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Ser Asp Asp Asp Ser Tyr Glu Val Leu Asp Leu Thr Glu
20 25 30
<210> 131
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 131
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Ser Asp Asp Asp Ser Tyr Glu Val Leu Asp Leu Thr Glu Tyr
20 25 30
<210> 132
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 132
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Asp Pro Ser
20 25 30
Thr Gly
<210> 133
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 133
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys Gln Ile Gln Glu
20 25 30
Trp
<210> 134
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 134
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Trp
20 25
<210> 135
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 135
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys Gln Ile Trp
20 25 30
<210> 136
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 136
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Leu Glu
1 5 10 15
Arg Val Thr Asp Tyr Ala Glu Glu Lys Glu
20 25
<210> 137
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 137
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu Val Asp
20 25 30
<210> 138
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 138
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Glu Asp Ser Phe Val Glu Ile Arg Met Ala Glu Gly Glu
20 25 30
<210> 139
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 139
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Asn
1 5 10 15
Glu Glu Asp Ile Leu Val Val Thr Thr Gln Gly Glu Val
20 25
<210> 140
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 140
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ser Ser Glu Asp Tyr Ile Ile Ile Leu Pro Glu Cys Phe Asp
20 25 30
<210> 141
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 141
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ala Gly
1 5 10 15
Leu Asn Ser Ser Trp Val Glu Leu Pro Met Asn Ser Ser Asn
20 25 30
<210> 142
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 142
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Ser
1 5 10 15
Asp Asp Asp Ser Tyr Glu Val Leu Asp Leu Thr Glu Tyr Ala
20 25 30
<210> 143
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 143
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Leu Asp
1 5 10 15
Glu Lys Asp Gly Phe Ile Phe Val Asn Tyr Ser Glu Gly Gln
20 25 30
<210> 144
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 144
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Pro Pro
1 5 10 15
Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu Leu Cys
20 25 30
<210> 145
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 145
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Val
1 5 10 15
Arg Asp Arg Met Trp Leu Lys Ile Thr Ile Pro Asn Ala Phe
20 25 30
<210> 146
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 146
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser
1 5 10 15
Cys Asp Thr Asp Asp Phe Val Met Val Pro Ala Gln Phe Pro Gly
20 25 30
<210> 147
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 147
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Val Glu Tyr Tyr Trp Asp Gln Leu Asn Glu Thr Val Phe Thr
20 25 30
<210> 148
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 148
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Ala
1 5 10 15
Ala Thr Leu Thr Tyr Asp Thr Leu Arg Phe Ala Glu Phe Glu
20 25 30
<210> 149
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 149
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Lys
1 5 10 15
Glu Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
20 25 30
<210> 150
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 150
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Asp
1 5 10 15
Glu Val Asp Gly Trp Leu Ile Ile Asp Leu Pro Asp Ser Tyr
20 25 30
<210> 151
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 151
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
20 25
<210> 152
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 152
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Glu
1 5 10 15
Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
20 25
<210> 153
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 153
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Trp
1 5 10 15
Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
20 25
<210> 154
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 154
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Trp Ile
1 5 10 15
Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Cys
20
<210> 155
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 155
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr
20 25
<210> 156
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 156
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp
20 25
<210> 157
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 157
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile Asp Thr Ser
20 25
<210> 158
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 158
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Glu Trp Ile Leu Val Asp Phe Ile
20
<210> 159
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 159
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Trp Ile
1 5 10 15
Leu Val Asp Phe Ile
20
<210> 160
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 160
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asp Asp
1 5 10 15
Glu Trp Ile Leu Val
20
<210> 161
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 161
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Asp
1 5 10 15
Asp Glu Trp Ile Leu Val
20
<210> 162
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 162
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Lys Glu
1 5 10 15
Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val
20
<210> 163
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 163
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Glu Lys
1 5 10 15
Glu Asp Asp Glu Trp Ile Leu Val
20
<210> 164
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 164
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Asn Ile
1 5 10 15
Ser Gln Lys Ser Asp Glu Glu Asp Phe Val Lys Val Glu Asp Leu Pro
20 25 30
Leu Lys Leu Thr Ile Tyr
35
<210> 165
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 165
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Ser Gly Asn Thr His Asp Asp Phe Val Met Ile Asp Phe Lys Pro
20 25 30
Ala Phe Ser Lys Asp Asp
35
<210> 166
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 166
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Asp Ser Ser Cys Asp Thr Asp Asp Phe Val Met Val Pro Ala Gln Phe
20 25 30
Pro Gly Asp Leu Val Ala
35
<210> 167
<211> 38
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<213> 人工序列
<400> 167
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Pro Asp
1 5 10 15
Ser Ile Asp Ala His Thr Phe Asp Phe Glu Thr Ile Pro His Pro Asn
20 25 30
Ile Glu Gln Thr Ile His
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Ser Asp
1 5 10 15
Asn Cys Ser Gly Gly Asp Asp Asp Trp Thr His Leu Ser Ser Lys Glu
20 25 30
Val Asp Pro Ser Thr Gly
35
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 169
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Thr Asp
1 5 10 15
Tyr Arg Pro Pro Asp Asp Ala Val Phe Asp Ile Ile Thr Asp Glu Glu
20 25 30
Leu Cys Gln Ile Gln Glu
35
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Asp Phe Glu Xaa Leu Xaa Xaa
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
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Xaa Asp Asp Asp Phe Val Xaa Ile Asp Xaa
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
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<212> PRT
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
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Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
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Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 185
Gly Ser Gly Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30

Claims (10)

1.一种自噬-溶酶体靶向病毒，其特征在于，所述自噬-溶酶体靶向病毒含有被自噬-溶酶体系统识别的自噬-溶酶体靶向分子。
2.根据权利要求1所述的自噬-溶酶体靶向病毒，其特征在于，所述自噬-溶酶体靶向分子优选自具有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.79任一项所示氨基酸序列的多肽或其中至少两种的组合；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子与所述自噬-溶酶体靶向病毒的病毒蛋白连接；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子和所述病毒蛋白之间通过连接链连接；
优选地，所述连接链包括被切割的分子；
优选地，所述被切割的分子包括被烟草蚀斑病毒蛋白酶切割的分子、被凝血酶敏切割的分子、被凝血因子Xa切割的分子、被肠激酶切割的分子、被3C蛋白酶切割的分子、被SUMO蛋白酶切割的分子、被细菌明胶酶切割的分子或自剪切的分子中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述被烟草蚀斑病毒蛋白酶切割的分子包括多肽，所述多肽具有通式I所示的氨基酸序列；
E-Xaa-Xaa-Y-Xaa-Q-$ 通式I；
其中，Xaa代表任意氨基酸，$代表氨基酸G、S或M中的任意一种；
优选地，所述被细菌明胶酶切割的分子包括氨基酸序列为GPLGV的多肽；
优选地，所述自剪切的分子包括2A短肽；
优选地，所述2A短肽包括猪捷申病毒的P2A、马鼻炎病毒的E2A、口蹄疫病毒的F2A或T2A中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述连接链选自具有如SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.106中任一项所示氨基酸序列的多肽；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链之间还包含柔性接头；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向分子、连接链和柔性接头具有如下连接方式：
柔性接头-连接链-柔性接头-自噬-溶酶体靶向分子；
所述自噬-溶酶体靶向分子、连接链和柔性接头按所述柔性接头-连接链-柔性接头-自噬-溶酶体靶向分子的连接方式连接后包括具有如SEQ ID NO.107-SEQ ID NO.185中任一项所示氨基酸序列的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的自噬-溶酶体靶向病毒，其特征在于，所述自噬-溶酶体靶向病毒由野生病毒经过遗传改造制备得到；
优选地，所述野生病毒选自流感病毒、艾滋病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、丙肝病毒、乙肝病毒、甲肝病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、EB病毒、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、水泡性口炎病毒、呼吸道合胞病毒、登革病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、寨卡病毒、中东呼吸综合征病毒、轮状病毒、狂犬病毒、麻疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、汉坦病毒、新型肠道病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、蓝耳病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、细小病毒、朊病毒、天花病毒、烟草花叶病毒、腺相关病毒、噬菌体、疱疹病毒、西尼罗河病毒、诺如病毒、人博卡病毒或冠状病毒中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述野生病毒为流感病毒、艾滋病毒或新冠病毒SARS-CoV-2；
优选地，所述流感病毒包括H1N1、H5N1、H7N9、H3N2或B型流感病毒中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向病毒为自噬-溶酶体靶向流感病毒；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向流感病毒的PA蛋白、PB1蛋白、PB2蛋白、NP蛋白、HA蛋白、NA蛋白、M1蛋白、M2蛋白、NS1蛋白或NEP蛋白中的一个或多个连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PA蛋白和PB2蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PA蛋白和PB1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PB2蛋白和PB1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PA蛋白、PB2蛋白和PB1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PA蛋白、PB2蛋白、PB1蛋白和M1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PA蛋白、PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白和NP蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PB2蛋白、PB1蛋白和M1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PB1蛋白和M1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PB2蛋白和M1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白和NS1蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述PB2蛋白、PB1蛋白、M1蛋白和NEP蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述NS1蛋白和NEP蛋白中均连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向病毒为自噬-溶酶体靶向冠状病毒；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向冠状病毒中刺突蛋白、包膜糖蛋白、膜糖蛋白、核衣壳蛋白、非结构蛋白1、非结构蛋白2、非结构蛋白3、非结构蛋白4、非结构蛋白5、非结构蛋白6、非结构蛋白7、非结构蛋白8、非结构蛋白9、非结构蛋白10、非结构蛋白11、非结构蛋白12、非结构蛋白13、非结构蛋白14、非结构蛋白15、非结构蛋白16、3a蛋白、3b蛋白、6蛋白、7a蛋白、7b蛋白、8a蛋白、8b蛋白、9b蛋白、3C样蛋白酶、前导蛋白、2’-O-核糖甲基转移酶、核酸内切酶、3’-至-5’核酸外切酶、解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶、orf1a多聚蛋白、ORF10蛋白、ORF8蛋白、ORF7a蛋白、ORF6蛋白或ORF3a蛋白中的一个或多个连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向冠状病毒为自噬-溶酶体靶向新冠病毒SARS-CoV-2；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向病毒为自噬-溶酶体靶向HIV病毒；
优选地，所述自噬-溶酶体靶向HIV病毒的Gag多聚蛋白、pol多聚蛋白、gp160、HIV转录反式激活子、病毒体蛋白表达调节蛋白、病毒负因子、慢病毒蛋白R、病毒感染性因子、病毒蛋白U、基质蛋白、衣壳蛋白、间隔肽1、核衣壳蛋白、间隔肽2、P6、逆转录酶、核糖核酸酶H、整合酶、HIV蛋白酶、gp120、gp41蛋白中的一个或多个中连接所述自噬-溶酶体靶向分子和连接链。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有编码如权利要求1-3中任一项所述的自噬-溶酶体靶向病毒的核酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求4所述的核酸分子。
6.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括表达切割所述连接链的蛋白酶的细胞或自噬-溶酶体系统缺陷的细胞；
优选地，所述蛋白酶包括烟草蚀斑病毒蛋白酶；
优选地，所述表达切割所述连接链的蛋白酶的细胞由HEK293T细胞或MDCK细胞制备得到；
优选地，所述自噬-溶酶体系统缺陷的细胞缺失LC3A蛋白、LC3B蛋白、LC3C蛋白、GABARAP蛋白、GABARAPL1蛋白或GABARAPL2蛋白中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述重组细胞含有权利要求5所述表达载体或权利要求4所述核酸分子。
7.一种制备如权利要求1-3中任一项所述的自噬-溶酶体靶向病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)统计分析野生病毒的宿主细胞内的自噬-溶酶体系统的表达分布，利用生物信息学分析和病毒蛋白质结构预测，选择引入自噬-溶酶体靶向分子和连接链的病毒蛋白及其中的引入位点；
(2)在所述引入位点的编码基因处插入编码自噬-溶酶体靶向分子和连接链的核苷酸序列；
(3)将步骤(2)得到的基因突变后的病毒蛋白的编码核苷酸序列与载体连接，得到表达载体；
(4)利用反向遗传技术，将步骤(3)中的表达载体与用于病毒拯救的表达载体共转染到细胞中，进行细胞培养，得到所述自噬-溶酶体靶向病毒；
优选地，步骤(3)所述载体包括质粒；
优选地，步骤(4)所述细胞包括表达切割所述连接链的蛋白酶的细胞或自噬-溶酶体系统缺陷的细胞；
优选地，所述表达切割所述连接链的蛋白酶的细胞表达的蛋白酶为烟草蚀斑病毒蛋白酶；
优选地，所述自噬-溶酶体系统缺陷的细胞中缺失LC3A蛋白、LC3B蛋白、LC3C蛋白、GABARAP蛋白、GABARAPL1蛋白或GABARAPL2蛋白中的任意一种或至少两种；
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1’)统计分析野生病毒的宿主细胞内的自噬-溶酶体系统的表达分布，利用生物信息学分析和病毒蛋白质结构预测，选择引入自噬-溶酶体靶向分子和连接链的病毒蛋白及其中的引入位点；
(2’)使用基因工程的方法，在所述引入位点的编码基因处引入编码自噬-溶酶体靶向分子和连接链的核苷酸序列；
(3’)将步骤(2’)得到的基因突变后的病毒蛋白的编码核苷酸序列与载体连接，得到表达载体；
(4’)构建表达切割所述连接链的蛋白酶的表达载体；
(5’)利用反向遗传技术，将步骤(3’)得到的表达载体、用于病毒拯救的表达载体以及步骤(4’)得到的表达载体共同转染细胞，进行细胞培养，得到所述自噬-溶酶体靶向病毒；
优选地，所述野生病毒为流感病毒。
8.权利要求1-3中任一项所述的所述的自噬-溶酶体靶向病毒、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体或权利要求6所述的重组细胞在制备预防和/或治疗病毒或肿瘤的药物中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的自噬-溶酶体靶向病毒；
优选地，所述药物组合物还含有辅料；
优选地，所述辅料包括药学可接受的载体、稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述药物组合物包括疫苗；
优选地，所述疫苗为减毒活疫苗、复制无能活疫苗或复制可控活疫苗。
10.一种溶瘤病毒，其特征在于，所述溶瘤病毒包含权利要求1-3中任一项所述的自噬-溶酶体靶向病毒。
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