CN102766649A - 一种以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物转基因技术领域，公开了一种以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法。该方法是以甘蔗幼嫩心叶诱导出的淡黄色、颗粒状II型胚性愈伤组织为转基因受体材料，采用负压辅助和改进的根癌农杆菌介导法，将6-磷酸甘露糖异构酶基因导入甘蔗基因组，经过在含甘露糖的培养基上筛选和分化，得到转基因甘蔗植株。本发明使用PMI正向选择标记系统，从甘蔗愈伤到分化成苗所需周期短，转化效果稳定，克服了以抗生素、除草剂等为负向筛选标记的遗传转化体系转化效率低，胚性愈伤组织诱导分化时间长和甘蔗愈伤组织容易褐变等缺陷，转化后的愈伤组织保持较高的再生能力，分子检测结果表明，转化率达58.97％。并适用于不同基因型甘蔗。

Description

一种以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域中转基因植物的方法，特别是涉及一种提高农杆菌介导的以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法。

背景技术

甘蔗(Saccharum officinarumL.)是中国乃至世界重要的糖料作物。当今甘蔗新品种的培育主要还是依靠常规杂交育种来实现。但由于甘蔗遗传背景的异源多倍性和高度杂合性，甘蔗有性杂交常存在开花困难、花期不遇、杂交不孕和不育等问题，使得甘蔗常规育种周期长，加上抗性种质资源有限，常规杂交育种很难培育出高产、高糖抗逆性强的甘蔗新品种，从而使得甘蔗新老品种更替缓慢。此外，病虫害的侵袭还直接导致甘蔗优良品种种性严重退化，造成产量和品质下降，严重威胁着整个甘蔗业的生存和可持续发展。因此，利用基因工程技术把外源优良基因有目的、有针对性地导入特定甘蔗品种，获得改良的转基因甘蔗，提高甘蔗的产量、糖分和抗逆性，成为甘蔗育种过程中除常规育种手段之外的另一条有效的、重要的途径。目前甘蔗转基因育种已成为甘蔗育种领域研究的前沿。

甘蔗转基因研究远远滞后于其它作物。甘蔗转基因研究首次报道始于1987年(Chen等，1987)。目前甘蔗遗传转化方法有原生质体电穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法等3种。原生质体很难再生出甘蔗植株且只是局限在个别基因型上，因此原生质体电穿孔法不是获得转基因甘蔗植株的有效方法(Srinivasan C et al.，1987；Taylor et al.，1992)。基因枪法不受寄主范围影响，但获得的嵌合体比例大，外源基因多拷贝插入，遗传稳定性较差，成本也较高，但因其简便易行而应用较多。目前大多数基因工程甘蔗的培育都是采用该法。与前两种方法相比，农杆菌介导法具有操作简单，成本低，可转移较大片段DNA和转基因拷贝数低等优点。1998年Arencibia等首次报导了农杆菌介导转化甘蔗的成功(Arencibia et al.，1998)。此后农杆菌介导技术在甘蔗上的应用得到快速发展(王自章等，中国农业科学，2003，36(002)：140-146.；曾艳波，华南热带农业大学硕士学位论文，2004.；苗灵凤，华南热带农业大学硕士学位论文，2005.；Molinar等，2007；顾丽红等，分子植物育种，2008，6(2)：277-280；邓智年等，广西大学博士学位论文，2007；唐建平等，分子植物育种，2009，7(003)：579-582；罗遵喜等，热带作物学报，2009，，3(11)：1646-1650.)对甘蔗遗传转化再生体系如胚性细胞的培养时期和转化，抗生素浓度及种类的选择、农杆菌介导法转化过程中的影响因素等方面都进行了较为详细的研究。但目前农杆菌介导的甘蔗遗传转化还存在转化效率较低，个别转化事件效率高但重现性差。同时由于甘蔗基因型、外植体类型和生理状态对转化效率影响较大，同一遗传转化体系并不适合不同基因型甘蔗的遗传转化。此外，表达效率不高、转基因在甘蔗中的沉默现象很严重；甘蔗转基因主要采用抗生素、除草剂等负向筛选剂等，遗传转化体系转化效率低，胚性愈伤组织诱导分化时间长和甘蔗愈伤组织容易褐变等严重缺陷。因此，建立甘蔗高效农杆菌转化技术并加以完善，对我国甘蔗功能基因组研究和特异基因资源利用，加快甘蔗抗性育种进程是十分必要的。

发明内容：

本发明的目的是提供一种提高农杆菌介导的甘露糖为筛选剂的甘蔗遗传转化效率方法。

针对现有技术不足，本发明采取的技术方案是：

(1)以甘蔗II胚性愈伤组织作为转化受体材料；(2)以甘露糖作为正向筛选剂；(3)农杆菌重悬液体培养及共培养；(4)负压辅助；(5)农杆菌液与培养物的共培养；(6)在MS基本培养基中添加10～30mg/L柠檬酸。将外源基因高效率的导入受体细胞，并通过选择培养获得较高诱导再生频率和转化效率的转基因甘蔗植株，从而建立了一个甘蔗高效遗传转化方法。

本发明在常用的农杆菌悬浮液体培养基或共培养培养基中添加0.5～3mg/L精氨酸。

常规农杆菌重悬液体培养基及共培养培养基为MS基本成分+10g/L葡萄糖，pH5.2。

利用负压辅助，将重悬的农杆菌侵染液与甘蔗胚性愈伤组织混合，在40～60kPa负压条件下静置5～10分钟，然后常压侵染15～30min。

共培养的方法为：在共培养基表面铺一层无菌滤纸，保持农杆菌侵染后愈伤组织周围无积水。

在甘蔗组培过程中培养基中添加10～30mg/L柠檬酸，防止甘蔗组织发生褐变。

转化后的甘蔗II型胚性愈伤组织具有较强的再生能力，转化率在58.97％以上。

本发明中，农杆菌介导的遗传转化程序基本上与邓智年(邓智年等，野苋菜凝集素基因的克隆及转基因研究。广西大学博士学位论文，2007.)等报道相同，不同之处在于：在MS基本培养基中添加10～30mg/L柠檬酸；在农杆菌重悬液体培养基或共培养培养基中添加了0.5～3mg/L精氨酸(Arg)；将重悬的农杆菌侵染液与甘蔗胚性愈伤组织混合，在40～60kPa负压条件下共培养5～10分钟，然后常压侵染15～30min。取出用无菌滤纸吸干菌液，然后转接到铺在共培养基表面的一层无菌滤纸上，以保持愈伤组织周围相对干燥，从而保持较好的生长活力，提高芽分化率和转化效率。共培养3～5天后，愈伤组织在含有适宜抗生素的培养基上抑菌，在含有合适浓度甘露糖(PMI)的筛选培养基上进行抗性愈伤继代筛选、芽分化筛选和生根筛选，诱导出较高再生频率的甘蔗转化植株。

本发明中，甘蔗II胚性愈伤组织作为遗传转化的受体，其使用标准为淡黄色、颗粒状、表面干燥、直径约为1～2mm愈伤组织。新诱导产生的愈伤组织，必须经过2～5次继代，才能筛选到上述优质的I I胚性愈伤组织。

本发明中选用的植物材料为甘蔗ROC22、GT21和GT28。

提高甘蔗遗传转化的方法包括如下步骤：

(1)挑取农杆菌单菌落接种到10mL的YEP液体培养基(含25mg/L利福平Rif，25mg/L链霉素Str，50mg/L壮观霉素Spec)中，28℃，200rpm振荡培养至对数生长期。取1mL菌液放入50mL含相同抗生素的YEP培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD为0.5～0.6。将菌液转移到离心管中，4℃，5000rpm离心5～8min，收集菌体。将菌体重悬于等体积含100umol/L～200umol/L乙酰丁香酮和0.5～3mg/L精氨酸的液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养0.5～1h，做转化备用液。

(2)将生长旺盛的甘蔗II型胚性愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上培养4～5天，活化后的愈伤组织作为转化材料。用镊子将愈伤组织夹碎成大小约为1～2mm左右小颗粒，置超净工作台上吹风30～60min至干缩状。

(3)将重悬的农杆菌侵染液与甘蔗胚性愈伤组织混合，在40～60kPa负压条件下共培养5～10分钟，然后常压侵染15～30min。取出愈伤，用无菌滤纸吸干菌液，然后转接到铺在无抗生素的含100umol/L～150umol/L的乙酰丁香酮和0.5～3mg/L精氨酸的共培养基表面的一层无菌滤纸上，26℃黑暗共培养3～5天。

(4)愈伤组织用无菌水清洗后转移至新的继代培养基(含300mg/L头孢霉素Cef)上恢复培养7～10天，然后转至选择培养基上进行筛选培养。

(5)选择培养基是在继代培养基和分化培养基中加入10～30g/L甘露糖(PMI)和300mg/L头孢霉素。每15～20天继代一次。

(6)经过2～3次甘露糖筛选，将抗性愈伤转至无甘露糖的继代培养基中恢复培养4天。

(7)抗性愈伤转到选择分化培养基上诱导植株再生。

(8)在甘蔗愈伤组织诱导及遗传转化过程中，MS基本培养基均添加10～30mg/L柠檬酸。

在前人转化方法的基础上，结合本发明的方法，转化后的甘蔗II型胚性愈伤组织具有较强的再生能力，转化率在58.97％以上。

所述6-磷酸甘露糖异构酶基因在GenBank中的登记号为：M15380。

所述植物表达载体可为任意一种可在甘蔗中表达外源基因的植物表达载体。如pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA3301等，其中，pCAMBIA3301为优选的植物双元表达载体。

所述筛选和分化培养基中的甘露糖可为纯的甘露糖或甘露糖与其他糖类的组合，所述甘露糖可谓任一构型的甘露糖。

所述愈伤组织筛选培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖10～30g/L，2，4二氯苯氧乙酸(2，4-D)1～2mg/L，柠檬酸10～30mg/L，蔗糖10～30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

所述选择分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖10～30g/L，1.0～2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤(6-BA)、0.05～0.1mg/L萘乙酸(NAA)，柠檬酸10～30mg/L，蔗糖10～30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

所述选择生根培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖10～40g/L，0.5～2.0mg/LNAA、1～2.5mg/L的吲哚丁酸(IBA)，柠檬酸10～30mg/L，蔗糖10～40g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

携带有6-磷酸甘露糖异构酶基因的植物表达载体可通过使用农杆菌介导法、基因枪法、电击法等方法转化甘蔗胚性愈伤组织，优选为农杆菌介导法；所述农杆菌可为任意一种根癌农杆菌或发根农杆菌，优选为根癌农杆菌EHA105。

所述甘蔗胚性愈伤组织为甘蔗幼嫩心叶或茎尖组织、幼穗诱导获得的II型胚性愈伤组织。

本发明的特点在于：在建立了完善的甘蔗高频再生体系的基础上，通过改进前人的转化方法，通过农杆菌介导和负压辅助相结合，利用植物表达载体将6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(ManA)导入甘蔗胚性愈伤组织，经过在含甘露糖的培养基上筛选和分化，得到转基因甘蔗植株。本发明使农杆菌介导的甘蔗遗传转化效率明显提高，并适用于不同基因型甘蔗。

附图说明

图1为载体pPMI3301T-DNA区的示意图。

图2为愈伤选择继代培养获得抗性愈伤组织图。

图3为在生根培养基上生长的转基因甘蔗植株图。

图4为转基因甘蔗PCR检测结果图。

图5为转基因甘蔗叶片中的PMI检测结果图。

具体实施方式

实施例1

一、6-磷酸甘露糖异构酶基因manA的克隆

参照GenBank中6-磷酸甘露糖异构酶基因manA(M15380)的设计引物和进行PCR克隆。

二、含有manA的植物双元表达载体pPMI3301的构建。

本发明使用的植物双元表达载体为pCAMBIA3301。将克隆获得的6-磷酸甘露糖异构酶基因manA替代质粒pCAMBIA3301上的htp基因得带一个双元表达载体，命名为pPMI3301，其T-DNA区示意图如图1所示(LB：T-DNA区左边界；RB：T-DNA区右边界；Ubi：玉米泛素启动子；NOS：胭脂碱合成酶终止序列；manA：6-磷酸甘露糖异构酶基因)。

三、转基因甘蔗的获得

1、转化受体的制备

以甘蔗ROC22茎尖生长锥以上10cm长的心叶段为外植体，切成厚度约1～2mm的薄片，放入无菌水中浸泡后取出在无菌滤纸上吸干水分，接种于愈伤组织诱导培养基中，28℃避光培养至诱导出胚性愈伤组织。经过2～5次继代培养，获得淡黄色、颗粒状的甘蔗II胚性愈伤组织。所述愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2.5mg/L 2，4-D，柠檬酸25mg/L，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。所述愈伤组织继代培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2.0mg/L 2，4-D，柠檬酸25mg/L，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。转化前将生长旺盛的甘蔗II型胚性愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上培养4天，活化后的愈伤组织作为转化材料。用镊子将活化的愈伤组织夹碎成大小约为1～2mm左右小颗粒，置于超净工作台上吹风60min至干缩状。

2、农杆菌工程菌液的制备

(1)挑取农杆菌单菌落接种到10mL含25mg/L利福平，25mg/L Str，50mg/L Spec的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至对数生长期。

(2)取1mL菌液放入50mL含相同抗生素的YEP培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD为0.5～0.6。

(3)将菌液转移到离心管中，4℃，5000rpm离心5min，收集菌体。将菌体重悬于等体积含100umol/L乙酰丁香酮(AS)和2mg/L精氨酸(Arg)的农杆菌重悬液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养1小时诱导细菌Vir基因的表达，作转化备用液。所述农杆菌重悬液体培养基为MS基本成分+10g/L葡萄糖，pH5.2。

3、农杆菌介导的甘蔗遗传转化

(1)将生长旺盛的甘蔗II型胚性愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上培养4天，活化后的愈伤组织作为转化材料。用镊子将愈伤组织夹碎成大小约为1～2mm左右小颗粒，置超净工作台上吹风60min至干缩状。取经过处理呈干缩状态的甘蔗II型胚性愈伤组织100块转至培养皿中，加入EHA105/pPMI3301农杆菌重悬菌液，在50kPa负压条件下共培养8分钟，然后常压侵染20min。

(2)取出愈伤，用无菌滤纸吸干菌液，然后转接到铺在共培养基表面的一层无菌滤纸上，26℃黑暗共培养4天。所述共培养基是在MS基本培养基的基础上添加2，4-D 1.5mg/L，柠檬酸25mg/L，含100umol/L的乙酰丁香酮、2mg/L精氨酸、蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(3)愈伤组织用无菌水清洗后转移至含头孢霉素的恢复培养基上恢复培养7天。所述恢复培养基是在MS基本培养基的基础上添加2，4-D 2mg/L，柠檬酸25mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(4)将愈伤组织转入含头孢霉素和甘露糖的愈伤组织筛选培养基，每20天继代一次。所述愈伤组织筛选培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖30g/L，2，4-D 2mg/L，柠檬酸25mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖10g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(5)经过2次甘露糖筛选，将抗性愈伤转至无甘露糖的愈伤组织继代培养基中恢复培养4天。

(6)抗性愈伤转至选择分化培养基中，26℃，Lux2000～3000，每天光照16小时诱导出芽。所述选择分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖30g/L，2.0mg/L的6-BA、0.05/LNAA，柠檬酸25mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖10g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(7)经过筛选，分化，将存活的幼苗移至壮苗培养基中。所述壮苗培养基是在MS基本培养基的基础上添加2.0mg/L的6-BA、0.05/L NAA，柠檬酸30mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖40g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(8)待苗长至2～3cm时移至选择生根培养基。所述选择生根培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖30g/L，0.5mg/L NAA、1mg/L的IBA，柠檬酸25mg/L，蔗糖10g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(9)长出10条根左右，打开瓶盖移至室外炼苗，2天后将小苗取出，流水洗净附着的培养基，放在空气相对湿度为80％的温室中培养，待苗成活后分单株种植于装有营养土的盆中。

4、转基因甘蔗的分子检测

取甘蔗再生植株的幼嫩叶片0.2g，用改良SDS法提取甘蔗基因组DNA，以此为模板，引物序列1：5’-GGTCCACCATGTGAAGGCA-3’和引物2：5’-CCATCGGAATACTTGCGGC-3’，PCR扩增manA，PCR反应条件为：94℃4min；94℃30sec，55℃40sec，72℃1min，共35个循环；最后72℃10min。对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示。

5、转基因甘蔗植株的PMI活性检测

取经PCR检测为阳性的转基因甘蔗植株及非转基因对照植株的叶片各250mg，加入250mL50mM的Tris-HCl(pH7.5)充分研磨，14000rpm离心20分钟，取上清液50ul加入100uL 50mM的Tris-HCl(pH7.5)，然后与100uL显色底物(包括25uL磷酸烟酰胺腺嘌呤(10nmM)，25uL磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(10nmM)，25uL磷酸葡糖异构酶(10U/mL)，12.5uL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(10U/mL)，5uL 6-磷酸甘露糖(50mM)和32.5uL Tris-HCl(50mM，pH7.5)混合反应，用分光光度计在340nm波长下检测OD值。

转化植株的PCR与PMI活性检测结果表明植株再生频率达72.51％，转化率达58.97％。(再生频率＝产生再生苗的愈伤数/接种的幼胚总数；转化率＝阳性转化苗/用于转化的幼胚总数。)

实施例2

1、转化受体的制备

以甘蔗GT28幼穗为外植体，切成长度约1～2mm的切段，接种于愈伤组织诱导培养基中，28℃避光培养。30天后将愈伤组织转移到新的继代培养基上，每25天继代一次，继代2次，获得淡黄色、颗粒状的甘蔗II胚性愈伤组织。所述愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2mg/L 2，4-D，柠檬酸10mg/L，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。所述愈伤组织继代培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1.5mg/L 2，4-D，柠檬酸10mg/L，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。转化前将生长旺盛的甘蔗II型胚性愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上培养4天，活化后的愈伤组织作为转化材料。用镊子将活化的愈伤组织夹碎成大小约为1～2mm左右小颗粒，置于超净工作台上吹风30min至干缩状。

2、农杆菌工程菌液的制备

(1)挑取农杆菌单菌落接种到10mL含25mg/L利福平，25mg/L Str，50mg/L Spec的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至对数生长期。

(2)取1mL菌液放入50mL含相同抗生素的YEP培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD为0.5～0.6。

(3)将菌液转移到离心管中，4℃，5000rpm离心5min，收集菌体。将菌体重悬于等体积含150umol/L乙酰丁香酮(AS)和0.5mg/L精氨酸(Arg)的农杆菌重悬液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养1小时诱导细菌Vir基因的表达，作转化备用液。所述农杆菌重悬液体培养基为MS基本成分+10g/L葡萄糖，pH5.2。

3、农杆菌介导的甘蔗遗传转化

(1)取经过活化处理呈干缩状态的甘蔗II型胚性愈伤组织100块转至培养皿中，加入EHA105/pPMI3301农杆菌重悬菌液，在40kPa负压条件下共培养10分钟，然后常压侵染30min。

(2)取出愈伤，用无菌滤纸吸干菌液，然后转接到铺在共培养基表面的一层无菌滤纸上，26℃黑暗共培养3天。所述共培养基是在MS基本培养基的基础上添加2，4-D 1.5mg/L，柠檬酸10mg/L，含150umol/L的乙酰丁香酮、0.5mg/L精氨酸、蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(3)愈伤组织用无菌水清洗后转移至含头孢霉素的恢复培养基上恢复培养8天。所述恢复培养基是在MS基本培养基的基础上添加2，4-D 1.5mg/L，柠檬酸10mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(4)将愈伤组织转入含头孢霉素和甘露糖的愈伤组织筛选培养基，每20天继代一次。所述愈伤组织筛选培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖10g/L，2，4-D 1.5mg/L，柠檬酸10mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(5)经过2次甘露糖筛选，将抗性愈伤转至无甘露糖的愈伤组织继代培养基中恢复培养4天。

(6)抗性愈伤转至选择分化培养基中，26℃，Lux2000～3000，每天光照16小时诱导出芽。所述选择分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖20g/L，1.0mg/L的6-BA、0.05/LNAA，柠檬酸25mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖20g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(7)经过筛选，分化，将存活的幼苗移至壮苗培养基中。所述壮苗培养基是在MS基本培养基的基础上添加1.0mg/L的6-BA、0.05/L NAA，柠檬酸10mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖40g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(8)待苗长至2～3cm时移至选择生根培养基。所述选择生根培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖30g/L，1.0mg/L NAA、2.5mg/L的IBA，柠檬酸25mg/L，蔗糖10g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(9)长出10条根左右，打开瓶盖移至室外炼苗，2天后将小苗取出，流水洗净附着的培养基，放在空气相对湿度为80％的温室中培养，待苗成活后分单株种植于装有营养土的盆中。转化植株的PCR与PMI活性检测结果表明植株再生频率达78.46％，转化率达61.25％。

实施例3

1、转化受体的制备

以甘蔗GT21 1～2mm茎尖为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基中，28℃避光培养。25天后将愈伤组织转移到新的继代培养基上，每25天继代一次，继代3次，获得淡黄色、颗粒状的甘蔗I I胚性愈伤组织。所述愈伤诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加2mg/L2，4-D，柠檬酸30mg/L，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。所述愈伤组织继代培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加1mg/L2，4-D，柠檬酸30mg/L，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。转化前将生长旺盛的甘蔗II型胚性愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上培养5天，活化后的愈伤组织作为转化材料。用镊子将活化的愈伤组织夹碎成大小约为1～2mm左右小颗粒，置于超净工作台上吹风45min至干缩状。

2、农杆菌工程菌液的制备

(1)挑取农杆菌单菌落接种到10mL含25mg/L利福平，25mg/L Str，50mg/L Spec的YEP液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至对数生长期。

(2)取1mL菌液放入50mL含相同抗生素的YEP培养基中，28℃，200rpm振荡培养至0D为0.5～0.6。

(3)将菌液转移到离心管中，4℃，5000rpm离心5min，收集菌体。将菌体重悬于等体积含120umol/L乙酰丁香酮(AS)和3mg/L精氨酸(Arg)的农杆菌重悬液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养1小时诱导细菌Vir基因的表达，作转化备用液。所述农杆菌重悬液体培养基为MS基本成分+10g/L葡萄糖，pH5.2。

3、农杆菌介导的甘蔗遗传转化

(1)取经过活化处理呈干缩状态的甘蔗II型胚性愈伤组织100块转至培养皿中，加入EHA105/pPMI3301农杆菌重悬菌液，在60kPa负压条件下共培养5分钟，然后常压侵染15min。

(2)取出愈伤，用无菌滤纸吸干菌液，然后转接到铺在共培养基表面的一层无菌滤纸上，26℃黑暗共培养5天。所述共培养基是在MS基本培养基的基础上添加2，4-D 1mg/L，柠檬酸30mg/L，含120umol/L的乙酰丁香酮、3mg/L精氨酸、蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(3)愈伤组织用无菌水清洗后转移至含头孢霉素的恢复培养基上恢复培养10天。所述恢复培养基是在MS基本培养基的基础上添加2，4-D 1mg/L，柠檬酸30mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖30g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(4)将愈伤组织转入含头孢霉素和甘露糖的愈伤组织筛选培养基，每20天继代一次。所述愈伤组织筛选培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖25g/L，2，4-D 1mg/L，柠檬酸30mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖15g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(5)经过2次甘露糖筛选，将抗性愈伤转至无甘露糖的愈伤组织继代培养基中恢复培养4天。

(6)抗性愈伤转至选择分化培养基中，26℃，Lux2000～3000，每天光照16小时诱导出芽。所述选择分化培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖25g/L，1.5mg/L的6-BA、0.1mg/LNAA，柠檬酸30mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖15g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(7)经过筛选，分化，将存活的幼苗移至壮苗培养基中。所述壮苗培养基是在MS基本培养基的基础上添加1.0mg/L的6-BA、0.05mg/L NAA，柠檬酸30mg/L，300mg/L头孢霉素，蔗糖40g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(8)待苗长至2～3cm时移至选择生根培养基。所述选择生根培养基是在MS基本培养基的基础上添加甘露糖25g/L，2.0mg/L NAA、1.5mg/L的IBA，柠檬酸30mg/L，蔗糖15g/L和琼脂0.6％，pH5.8。

(9)长出10条根左右，打开瓶盖移至室外炼苗，2天后将小苗取出，流水洗净附着的培养基，放在空气相对湿度为80％的温室中培养，待苗成活后分单株种植于装有营养土的盆中。转化植株的PCR与PMI活性检测结果表明植株再生频率达75.90％，转化率达59.99％。

Claims (8)

1.一种以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法，其特征在于：(1)以甘蔗II胚性愈伤组织作为转化受体材料；(2)以甘露糖作为正向筛选剂；(3)农杆菌重悬液体培养及共培养；(4)负压辅助；(5)农杆菌液与培养物的共培养；(6)在MS基本培养基中添加10～30mg/L柠檬酸。

2.根据权利要求1所述的以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法，其特征在于：作为遗传转化受体的愈伤组织的筛选标准为淡黄色、颗粒状的II胚性愈伤组织。

3.根据权利要求1所述的以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法，其特征在于：在常用的农杆菌悬浮液体培养基或共培养培养基中添加0.5～3mg/L精氨酸。

4.根据权利要求3所述的以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法，其特征在于：常规农杆菌重悬液体培养基及共培养培养基为MS基本成分+10g/L葡萄糖，pH5.2。

5.根据权利要求1所述的以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法，其特征在于：利用负压辅助，将重悬的农杆菌侵染液与甘蔗胚性愈伤组织混合，在40～60kPa负压条件下静置5～10分钟，然后常压侵染15～30min。

6.根据权利要求1所述的以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法，其特征在于共培养的方法为：在共培养基表面铺一层无菌滤纸，保持农杆菌侵染后愈伤组织周围无积水。

7.根据权利要求1所述的以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法，其特征在于：在甘蔗组培过程中培养基中添加10～30mg/L柠檬酸，防止甘蔗组织发生褐变。

8.根据权利要求1所述的以甘露糖为筛选剂提高甘蔗遗传转化效率的方法，其特征在于：转化后的甘蔗II型胚性愈伤组织具有较强的再生能力，转化率在58.97％以上。

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