CN106636192B - 一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其包括：S1：构建基础载体；S2：靶序列退火复性；S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切；S4：连接和转化；S5：重组质粒的鉴定和提取；S6：重组质粒和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切；S7：连接、转化和鉴定。其可获得能够特异性作用于草莓的CRISPR/Cas9载体，该载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点，用于草莓的遗传转化试验。

Description

一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，尤其涉及一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas9技术是自2013年兴起的一种高效简便的基因组编辑技术，目前已在动物、模式植物中得到广泛应用。CRISPR/Cas9载体主要由Cas9和sgRNA两个核心部分构成，其中Cas9蛋白主要负责对DNA双链的切割，sgRNA负责对靶序列的识别并引导Cas9蛋白进入切割位点。能够在植物上应用的CRISPR/Cas9载体中，Cas9基因主要由双CaMV 35S启动子或泛素(Ubiquitin)基因启动子等组成型启动子启动，sgRNA片段则由U6snRNA或U3snRNA的启动子启动。由于物种之间的相对独立性，不同物种的U6、U3或Ubi启动子等在其它物种内的启动强度可能出现不同程度的下降，这在亲缘关系较远的物种间尤为显著，而Cas9和sgRNA的表达水平与CRISPR/Cas9的编辑效果紧密相关，因此，针对不同物种分别采用物种特异性的启动子能够收到更好的效果。

目前，拟南芥的U6-1、U6-26、U6-29启动子，水稻的U6、U3启动子，小麦的U3启动子，玉米的U6、Ubi启动子等已先后被应用于各自的CRISPR/Cas9载体中，同时根据不同物种的密码子偏好性分别对Cas9基因序列进行了优化，以尽可能提高Cas9和sgRNA的表达水平，取得了极好的编辑效果。然而，能够特异性作用于草莓的CRISPR/Cas9载体还未见报道。

发明内容

为克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一类能够特异性应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其包括：

S1：构建基础载体

以pUC19载体为骨架，采用森林草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.1所示的pSG01载体；

以pUC19载体为骨架，采用栽培草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.2所示的pSG02载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以双CaMV 35S启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQID NO.3所示的pCCF001载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQ ID NO.4所示的pCCU001载体；

S2：靶序列退火复性：合成互补的Oligo DNA，将合成的Oligo序列进行退火复性获得DNA双链序列，并稀释；

S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01和/或pSG02载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；

S4：连接和转化：配置连接体系，将S2获得的稀释后的DNA双链序列与S3获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中；

S5：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中振荡培养，分别以M13fwd和Oligo-R为引物进行菌液PCR鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒；

S6：重组质粒和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切：将S5得到的重组质粒和S1构建的pCCF001或pCCU001质粒进行双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段；

S7：连接、转化和鉴定：配置连接体系，将S6获得的酶切回收目标片段进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中，挑单菌落于LB/Kan液体培养基中震荡培养，并进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养，提取质粒，即获得构建好的CRISPR/Cas9载体。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在所述步骤S2中，合成一对互补的Oligo DNA，即序列为SEQID NO.5所示的Oligo-F，序列为SEQ ID NO.6所示的Oligo-R。

进一步，在所述步骤S2中，合成两对互补的Oligo DNA，即序列为SEQ ID NO.7所示的Oligo1-F、序列为SEQ ID NO.8所示的Oligo1-R、序列为SEQ ID NO.9所示的Oligo2-F、序列为SEQ ID NO.10所示的Oligo2-R。

进一步，在步骤S2中，将所述合成的Oligo DNA序列进行退火复性的反应程序为：95℃变性5min，每30s降温1℃，降温至25℃，并于4℃保存。

进一步，在步骤S3中，采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01或pSG02载体，反应体系100μL，37℃反应过夜，65℃反应20min获得相应的酶切产物。

进一步，在步骤S3中，采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01和pSG02载体，反应体系100μL，37℃反应过夜，65℃反应20min获得相应的酶切产物。

进一步，在所述步骤S5中，所得到的重组质粒为pSG01-CZ或pSG02-CZ；在所述步骤S6中，将步骤S5中得到的pSG01-CZ或pSG02-CZ重组质粒、pCCF001或pCCU001质粒分别采用KpnI和XbaI进行双酶切，37℃酶切3h后65℃反应20min，获得相应的酶切产物。

进一步，在所述步骤S5中，所得到的重组质粒为pSG01-CZ和pSG02-CZ；在所述步骤S6中，将步骤S5中得到的pSG01-CZ重组质粒采用BamHI和KpnI进行双酶切，pSG02-CZ重组质粒采用XbaI和BamHI进行双酶切；将pCCF001或pCCU001质粒采用KpnI和XbaI进行双酶切，37℃酶切3h后65℃反应20min，获得相应的酶切产物。

进一步，在所述步骤S7中，所述菌液PCR鉴定以M13rev和Oligo-R为引物。

进一步，在所述步骤S7中，所述菌液PCR鉴定以Oligo1-F和Oligo2-R为引物。

与现有技术相比，本发明提供的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法可获得能够特异性作用于草莓的CRISPR/Cas9载体，该载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点，用于草莓的遗传转化试验。

附图说明

图1为pSG01载体的图谱；

图2为pSG02载体的图谱；

图3为pCCF001载体的图谱；

图4为pCCU001载体的图谱；

图5为本发明提供的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法的流程图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本实施例的目的在于提供一类能够特异性应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体，为实现此目标，该类CRISPR/Cas9载体由以下部分构成，具体包含以下内容：

1.pSG01载体：以pUC19载体为骨架，采用森林草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段。该载体图谱如图1所示，其目标片段序列如下(SEQ ID NO.1)：

GAATTGGGATCCGGTACC TCTAGAGGGATCCCTAGAGATtaATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATG

其中分别是M13fwd引物的序列和M13rev引物的互补序列，是FvU6promoter序列，是guide序列，是sgRNAscaffold序列，是FvU6terminator序列。

2、pSG02载体：以pUC19载体为骨架，采用栽培草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段。该载体图谱如图2所示，其目标片段序列如下(SEQ ID NO.2)：

GAATTGGGATCCGGTACC TCTAGAGGGATCCCTAGAGATtaATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATG

其中分别是M13fwd引物的序列和M13rev引物的互补序列，是FaU6promoter序列，是guide序列，是sgRNAscaffold序列，是FaU6terminator序列。

3、pCCF001载体：以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以双CaMV 35S启动子和NOS终止子转录该基因。该载体图谱如图3所示，其目标片段序列如下(SEQ IDNO.3)：

CATGATTAC TTGCGTATTGGCTAGAGCAGCTTGCCAAC AATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCGAGCTTTCGCAGATCCCGGGGGGCAATGAGCC

GGTGACCAGCTCGAATTTCCCC

其中是M13rev引物序列，是2x35S promoter序列，是多克隆位点(MCS)序列，是根据森林草莓基因的密码子偏好性优化的Cas9序列，是NOS terminator序列。

4、pCCU001载体：以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi启动子和NOS终止子转录该基因。该载体图谱如图4所示，其目标片段序列如下(SEQ ID NO.4)：

CATGATTAC TTGCGTATTGGCTAGAGCAGCTTGCCAAC

GGTGACCAGCTCGAATTTCCCC

其中是M13rev引物序列，是森林草莓Ubi promoter序列，是多克隆位点(MCS)序列，是根据森林草莓基因的密码子偏好性优化的Cas9序列，是NOS terminator序列。

具体地，CRISPR/Cas9载体的构建方法如图5所示，包括：

S1：构建基础载体

以pUC19载体为骨架，采用森林草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.1所示的pSG01载体；

以pUC19载体为骨架，采用栽培草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.2所示的pSG02载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以双CaMV 35S启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQID NO.3所示的pCCF001载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQ ID NO.4所示的pCCU001载体；

S2：靶序列退火复性：合成互补的Oligo DNA，将合成的Oligo序列进行退火复性获得DNA双链序列，并稀释；

S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01和/或pSG02载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；

S4：连接和转化：配置连接体系，将S2获得的稀释后的DNA双链序列与S3获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中；

S5：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中振荡培养，分别以M13fwd和Oligo-R为引物进行菌液PCR鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒；

S6：重组质粒和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切：将S5得到的重组质粒和S1构建的pCCF001或pCCU001质粒进行双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段；

S7：连接、转化和鉴定：配置连接体系，将S6获得的酶切回收目标片段进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中，挑单菌落于LB/Kan液体培养基中振荡培养，并进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养，提取质粒，即获得构建好的CRISPR/Cas9载体。

实施方式1

本实施方式给出了作用于单个位点的CRISPR/Cas9载体制备过程：

(1)靶序列退火复性。根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo DNA，序列为(SEQID NO.5)：Oligo-F:CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，Oligo-R(SEQ ID NO.6)：AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。将合成的Ol igo序列按照表1进行退火复性，反应程序为：95℃变性5min，1℃/30s降温至25℃，4℃保存。将得到的DNA双链序列稀释至0.1μM。

表1靶序列退火复性的反应体系

(2)pSG01或pSG02质粒的酶切。采用限制性内切酶Bbs I酶切pSG01或pSG02载体，反应体系100μL，如表2，，37℃反应过夜，65℃反应20min，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收，并使用核酸蛋白仪测定浓度。

表2BbsI酶切pSG01或pSG02载体的反应体系

(3)连接和转化。按照表3配置连接体系，16℃反应30min后4℃反应过夜。将全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌JM109中。

表3复性产物与pSG01或pSG02酶切片段的连接反应体系

(4)重组质粒的鉴定和提取。挑单菌落于800μl的LB/Amp液体培养基中，37℃振荡培养，以M13fwd和Oligo-R为引物进行菌液PCR鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒pSG01-CZ或pSG02-CZ。

(5)pSG01-CZ或pSG02-CZ和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切。将得到的pSG01-CZ或pSG02-CZ重组质粒、pCCF001或pCCU001质粒分别采用KpnI和XbaI进行双酶切，37℃酶切3h后65℃反应20min。酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段，并用核酸蛋白仪测定浓度。

(6)连接、转化和鉴定。按照表4配置连接体系，16℃反应30min后4℃反应过夜。将全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中；挑单菌落于800μl的LB/Kan液体培养基中，37℃振荡培养；以M13rev和Ol igo-R为引物进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养，提取质粒，-20℃保存。该质粒即为构建好的作用于单个位点的CRISPR/Cas9载体，可用于下一步的草莓遗传转化试验。

表4酶切回收片段的连接反应体系

实施方式2

本实施方式给出了作用于两个位点的CRISPR/Cas9载体制备过程：

(1)靶序列退火复性。根据选定的靶序列，合成两对互补的Oligo DNA，序列为：Oligo1-F:CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID NO.7)，Oligo1-R：AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID NO.8)，Oligo2-F:CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQID NO.9)，Oligo2-R：AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(SEQ ID NO.10)。将合成的Oligo序列分别按照表5进行退火复性，反应程序为：95℃变性5min，1℃/30s降温至25℃，4℃保存。将得到的DNA双链序列稀释至0.1μM。

表5靶序列退火复性的反应体系

(2)pSG01和pSG02质粒的酶切。采用限制性内切酶BbsI分别酶切pSG01和pSG02载体，反应体系100μL，如表6所示，37℃反应过夜，65℃反应20min，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收，并使用核酸蛋白仪测定浓度。

表6Bbs I酶切pSG01或pSG02载体的反应体系

(3)连接和转化。按照表7分别配置连接体系，16℃反应30min后4℃反应过夜，将全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中。

表7复性产物与pSG01或pSG02酶切片段的连接反应体系

(4)重组质粒的鉴定和提取。分别挑单菌落于800μl的LB/Amp液体培养基中，37℃振荡培养；分别以M13fwd和Oligo-R为引物进行菌液PCR鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒pSG01-CZ和pSG02-CZ。

(5)pSG01-CZ、pSG02-CZ和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切。将得到的pSG01-CZ重组质粒采用BamHI和KpnI进行双酶切，pSG02-CZ重组质粒采用XbaI和BamHI进行双酶切；将pCCF001或pCCU001质粒采用KpnI和XbaI进行双酶切，37℃酶切3h后65℃反应20min。酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段，并用核酸蛋白仪测定浓度。

(6)连接、转化和鉴定。按照表8配置连接体系，16℃反应30min后4℃反应过夜；将全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中；挑单菌落于800μl的LB/Kan液体培养基中，37℃振荡培养；以Ol igo1-F和Ol igo2-R为引物进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养，提取质粒，-20℃保存。该质粒即为构建好的作用于两个位点的CRISPR/Cas9载体，可用于下一步的草莓遗传转化试验。

表8酶切回收片段的连接反应体系

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 838

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtaaaacgac ggccagtgaa ttgggatccg gtaccaggag aagagagatg gtgttgaaca 60

gctatgtagc ggtaagagta gcaaacatgt cggcatacgc gtgtcaatac atagcttgca 120

atcccgagag attgagtagc gaccaagttc tgtacctcct cttctgcttc ccgttccttc 180

aactccgtcg cttcctcctc aacttccgac gacgaccctc cccttgattc cttgtaattt 240

cactctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctca tgtatcaaag catacgattc 300

tctactttgt tgtttcctga attcaagatc taggatatct gagatccatg ccatttcgaa 360

tttgaccaag gccctgttat gactttattg tgctcaaatc tataacagat tgcaaacgcc 420

tctcaggccc aaacagtccc caactcttaa agagcaaagg ctacgaaata atcccacatc 480

ggaaacctct gtctacaagg acttctttat atacaattga ctcccatcta agcttgggtc 540

ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 600

aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct ttttttgcaa ttttttgcaa ttttttgctt 660

gatcttctgc tgtattaact atcactatat gtctgtatta agtaaccttt tcttgcaatt 720

tttggcttga tcttctgctg tataaactat cggtgtgttt ctagagggat ccctagagat 780

taatcgtcga cctgcaggca tgcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctg 838

<210> 2

<211> 812

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtaaaacgac ggccagtgaa ttgggatccg gtaccaggag aagagagatg gtgttgaaca 60

gctatgtagc ggtaagagta gcaaacatgt cggcatacgc gtgtcaatac atagcttgca 120

atcccgagag attgagtagc gaccaagttc tgtacctcct cttctgcttc ccgttccttc 180

aactccgtcg cttcctcctc aacttccgac gacgaccctc cccttgattc cttgtaattt 240

cactctctct ctctctcatg tatcaaagca tacgattctc tattttgttg tttcctgaat 300

tcaagatcta ggatatctga gatccatgcc atttcgaatt tgaccaaggc cctgctatga 360

ctttattgtg ctcaaatcta taacagattg caaacgcctc tcaggcccaa acagtcccca 420

acctttaaag agcaaaggct acgaaataat cccacatcgg aaacctctgt ctacaaggac 480

ttctttatat acaattgact cccatctaag ctcgggtctt cgagaagacc tgttttagag 540

ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag 600

tcggtgcttt tttttgcaat tttttgcttg atcttctgct gtattaacta tcactatatg 660

tctgtattaa gtaacctttt cttgcaattt ttggcttgat cttctgctgt ataaactatc 720

ggtgtgttaa gaatctagag ggatccctag agattaatcg tcgacctgca ggcatgcaag 780

cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tg 812

<210> 3

<211> 5499

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 60

tcgacctgca ggcatgcaag cttttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga 120

gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc 180

tattgagact tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 240

tatctgtcac ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca 300

ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg 360

acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca 420

agtggattga tgtgataaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa 480

agatacagtc tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg 540

aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa 600

ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc 660

ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 720

agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag 780

ggatgacgca caatcccact atccttcgca agaccttcct ctatataagg aagttcattt 840

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gcttatctac cttgcccttg ctcatatgat taagttcagg ggtcatttct tgattgaggg 1560

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tgacgatctt gataacttgc ttgcccagat tggtgatcag tatgccgatt tgttccttgc 1920

agctaagaac ctttctgatg ccatcttgct ttctgatatt cttagggtca acactgagat 1980

tactaaggcc ccactttctg cctctatgat taagaggtac gatgagcatc atcaggatct 2040

tactcttctt aaggcccttg tcaggcagca gcttccagag aagtacaagg agattttctt 2100

tgatcagtct aagaacggtt acgccggtta cattgatggt ggagcctctc aggaagagtt 2160

ctacaagttc attaagccta ttcttgagaa gatggatggt actgaagagt tgcttgtcaa 2220

gttgaacagg gaggatttgc ttcgcaagca gaggactttc gacaacggtt ctattccaca 2280

tcagattcat cttggagagc ttcatgccat tcttaggcgc caggaggatt tctacccatt 2340

ccttaaggat aacagggaga agattgagaa gattcttaca ttcaggattc catactatgt 2400

cggtccactt gccaggggta actctaggtt cgcttggatg actaggaagt ctgaggaaac 2460

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gggtatgagg aagccagcct tcctttctgg tgagcagaag aaagccattg tcgatctttt 2700

gttcaagact aacaggaagg tcactgtcaa gcagcttaag gaggattact tcaagaaaat 2760

tgagtgcttc gattctgtcg agatttctgg tgtcgaggat aggttcaatg cctctcttgg 2820

tacttaccat gatttgctta agatcattaa ggacaaagac ttccttgata acgaagagaa 2880

cgaggatatt cttgaggata ttgtccttac attgactctt ttcgaggatc gcgagatgat 2940

tgaagagagg cttaagactt acgcccatct tttcgatgac aaggtcatga agcagcttaa 3000

gcgcaggcgc tacactggtt ggggtaggct ttctaggaag ttgatcaatg gtattaggga 3060

taagcagtct ggtaagacta ttcttgattt cttgaagtct gatggtttcg ccaatcgcaa 3120

cttcatgcag cttattcatg atgactctct tactttcaag gaggatattc agaaggccca 3180

ggtgtctggt cagggagatt ctcttcatga gcatattgcc aaccttgccg gttctccagc 3240

cattaagaaa ggtattcttc agactgtcaa ggtcgtggat gagcttgtga aggtcatggg 3300

taggcataag ccagagaaca tcgtcattga gatggctagg gagaatcaga caactcagaa 3360

gggtcagaag aactctaggg agaggatgaa gaggattgag gaaggtatta aggagcttgg 3420

ttctcagatt ttgaaggagc atccagtcga gaacactcag cttcagaatg agaagttgta 3480

cctttactat cttcagaacg gtagggatat gtacgtcgat caggagcttg atattaacag 3540

gctttctgac tacgatgtcg atcatattgt cccacagtcc ttccttaagg atgactctat 3600

tgacaacaag gtccttacta ggtctgacaa gaatcgcggt aagtctgata acgtgccatc 3660

tgaggaagtc gtgaagaaaa tgaagaacta ctggaggcag cttttgaatg ccaagttgat 3720

tactcagagg aagttcgata accttactaa ggccgagagg ggaggtttgt ctgagcttga 3780

taaggccggt ttcattaaga ggcagcttgt cgagactagg cagattacta agcatgtcgc 3840

ccagattctt gattctagga tgaacactaa gtacgatgag aacgacaagt tgattaggga 3900

ggtcaaggtg attactctta agtctaagtt ggtgtctgat ttcaggaagg atttccagtt 3960

ctacaaggtc agggagatta acaattacca tcatgcccat gatgcctacc ttaatgccgt 4020

ggtcggtact gcccttatta agaaataccc aaagttggag tctgagttcg tctacggtga 4080

ttacaaggtc tacgatgtca ggaagatgat tgccaagtct gaacaggaga ttggtaaggc 4140

cactgctaag tacttctttt actccaacat tatgaacttc tttaagactg agattactct 4200

tgccaacggt gagattcgca agaggccact tattgagact aatggtgaga ctggtgagat 4260

tgtctgggat aagggtaggg atttcgccac tgtcaggaag gtcctttcta tgccacaggt 4320

caacattgtc aaaaagactg aggtccagac tggaggtttc tctaaggagt ctattcttcc 4380

taagaggaac tctgataagt tgattgccag gaagaaagat tgggacccta agaaatacgg 4440

tggattcgat tctccaactg tcgcctactc tgtccttgtc gtggccaagg tcgagaaggg 4500

taagtctaag aaacttaagt ctgtcaagga gttgcttggt attactatta tggagcgctc 4560

ttccttcgag aagaatccaa ttgatttcct tgaggccaag ggttacaagg aggtcaagaa 4620

agatcttatt atcaagttgc caaagtactc tcttttcgag cttgagaacg gtaggaagag 4680

gatgcttgcc tctgccggtg agcttcagaa gggtaatgag cttgcccttc catccaagta 4740

cgtcaacttc ctttaccttg cctctcatta cgagaagttg aagggttctc cagaggataa 4800

cgagcagaag cagcttttcg tcgagcagca taagcattac cttgatgaga ttatcgagca 4860

gatttctgag ttctctaaga gggtcattct tgccgatgcc aatcttgata aggtcctttc 4920

tgcctacaac aagcatcgcg ataagcctat tagggagcag gccgagaaca ttatccattt 4980

gttcactctt actaaccttg gtgccccagc cgcattcaag tacttcgaca caactattga 5040

taggaagagg tacacttcta ctaaggaggt ccttgatgcc actcttattc atcagtccat 5100

tactggtctt tacgagacta ggattgatct ttctcagctt ggtggagata agaggccagc 5160

cgctactaag aaagccggtc aggccaagaa aaagaaacca aagaagaaga ggaaggtcgg 5220

ttagggtgac cagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa 5280

gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta 5340

agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta 5400

gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg 5460

ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatc 5499

<210> 4

<211> 6683

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 60

tcgacctgca ggcatgcaag cttttgcgta ttggctagag cagcttgcca accggacaca 120

catgtacata ctagtccgga aataaatatt ttccctataa ctatggttca tgttgagata 180

tgaatcctca catcgggaat atgaaacatt gcatgtgggt ttataaggga ttgggccact 240

ccattcacat tgccaatcag ttttggatgt gaaccccaga ctactttatc atggtatcaa 300

agcgggttac ccacgtccat ttgtgaatgc gtaacaacca tatgaactcc acgtcaccca 360

aaagttgtcc atatgtttga cttgaaaatt cgccacacgt gcggggtcgt gttgagatat 420

gaatcccata tcgagaatat aagaccttgc ttgtgggttt ataaagaatt gggccactct 480

atccattacc aatcggtttt ggatgtgaac cccagactac ttcctaagat gctagatttc 540

tctctcaggg tttctttccc ttgcattcta aatgtcatgc tttatcactc atgtaagttc 600

tgaattgtct gaagaactag gagaatgttg ttgtgtcttg caggctcctc atgtttatgt 660

ttttgcattt acctgctggg aagccacttt tagtcgagtg cttctgttgt tacttattag 720

ttcatttcta ctattccttc aatactaatt cagacctgaa catttgaaca aacagaaaac 780

agacttggaa gtgacaactt cccaagctag caatttggca agaaaagggg atgtcttgct 840

actctagttt ccacacacaa attaagttta aggactaatt tcagtttacc ccatcaactt 900

taggtcgatc atcatgttag tccttcttct ttcaatttca tcaaaaacac cctttaactc 960

ccaattttca tcagctgcgc atgtccaaac ctccaatctc catcaaattc ctctgtcaag 1020

tgatgacttg atatcaaaaa gaaagtcaaa ttctgaaagt tacctttcgg accatttttc 1080

cctcatatcg atacacatct tcgttcccat cacaacctcc taaccttagt gattttggtg 1140

ggattgaatg caatttgtct attttttttt cttcttcttc ttgatatcaa gtcatcactt 1200

gacagaggaa tttgatagag attggaggtt tgaacatgcg cggctgatga aaattgggag 1260

ttgaggggtg tttttgatga aattgaaaga agaaggacta acatgattaa cctaaagttg 1320

atgggggtaa actgaaatta atcctaagtt taaatagcca aatggctagc ttgaatccct 1380

tccttttcat aataagggaa caaatgcata tatgaatgtt caatgataca tcaattccac 1440

tcggaaggtg agatttgcta tggtgaataa atgactaaat gagtacctta ataccttatc 1500

agcaagtttg gagcaagaaa agttaatcgg agtaattgca agaaccaaga agttatcgtt 1560

acgctcaata aaaaataaat tatttaatag atgattcgat gtcgaatata atttttaaca 1620

tgagactaaa cttttcaagt gatgttgttc gatttaatcg tgtagttctg atgttgttcg 1680

ccaaaatttt ctagtaaggt gttaaaatga acaatgtata tatattttct tctagctgag 1740

ctctgaagct gtatgatcac gaaaacattt acctttgcaa agaggacaga aggaaagagc 1800

agaatttaca tatggcataa aatattttgt gaataaccat attccagaag gtaacagaag 1860

ttttcccgag gaaaatatat ccaaaatagc ctgggttttg gatttagcac ctggaaggtt 1920

ctggaccgtt cggtagatct attgcggacc acaaattcat cttccttcac gcataagaat 1980

tggatatgga gtcggcttcc tcctctatat aaaccaccct ccagtcccct tctttcctca 2040

caattatcaa agaaagcctc ttacaagccc tagtaatcca gatttccttt cgatctaaat 2100

tcaatcccaa tcatggacta caaggatcat gatggtgatt acaaggatca tgatattgat 2160

tacaaggatg atgatgataa gatggcccca aagaagaaga ggaaggtcgg tattcatggt 2220

gtccctgccg ctgataagaa atactccatt ggacttgata ttggtactaa ctctgtcggt 2280

tgggccgtca ttactgatga gtacaaggtg ccatctaaga aattcaaagt ccttggtaac 2340

actgataggc attccatcaa aaagaacctt attggtgccc ttttgttcga ctctggtgag 2400

acagctgaag ctactaggct taagaggact gccaggcgca ggtacactag gcgcaagaac 2460

cgcatttgct atcttcagga gatcttctct aatgagatgg ccaaggtcga tgactccttc 2520

tttcataggc ttgaggaatc tttccttgtc gaggaagata agaaacatga gaggcatcct 2580

attttcggta acattgtcga tgaggtcgcc taccatgaga agtacccaac tatttaccat 2640

cttcgcaaga aacttgtcga ttctactgac aaggctgatc ttaggcttat ctaccttgcc 2700

cttgctcata tgattaagtt caggggtcat ttcttgattg agggagatct taacccagat 2760

aactctgatg tcgacaagtt gttcattcag cttgtgcaga cttacaatca gcttttcgaa 2820

gagaacccta ttaacgcctc tggtgtcgat gctaaggcca ttctttctgc caggctttcc 2880

aagtctcgca ggcttgagaa ccttattgct cagcttccag gtgagaaaaa gaacggtttg 2940

ttcggtaatc ttattgccct ttctcttggt cttacaccta acttcaagtc taacttcgat 3000

cttgctgagg atgccaagtt gcagctttct aaggacactt acgatgacga tcttgataac 3060

ttgcttgccc agattggtga tcagtatgcc gatttgttcc ttgcagctaa gaacctttct 3120

gatgccatct tgctttctga tattcttagg gtcaacactg agattactaa ggccccactt 3180

tctgcctcta tgattaagag gtacgatgag catcatcagg atcttactct tcttaaggcc 3240

cttgtcaggc agcagcttcc agagaagtac aaggagattt tctttgatca gtctaagaac 3300

ggttacgccg gttacattga tggtggagcc tctcaggaag agttctacaa gttcattaag 3360

cctattcttg agaagatgga tggtactgaa gagttgcttg tcaagttgaa cagggaggat 3420

ttgcttcgca agcagaggac tttcgacaac ggttctattc cacatcagat tcatcttgga 3480

gagcttcatg ccattcttag gcgccaggag gatttctacc cattccttaa ggataacagg 3540

gagaagattg agaagattct tacattcagg attccatact atgtcggtcc acttgccagg 3600

ggtaactcta ggttcgcttg gatgactagg aagtctgagg aaactattac tccttggaac 3660

ttcgaggaag tcgtggataa gggtgcctct gcccagtcct tcattgagag gatgactaac 3720

ttcgacaaga accttccaaa cgagaaggtc cttcctaagc attctctttt gtacgagtac 3780

ttcactgtct acaacgagct tactaaggtc aagtacgtca ctgagggtat gaggaagcca 3840

gccttccttt ctggtgagca gaagaaagcc attgtcgatc ttttgttcaa gactaacagg 3900

aaggtcactg tcaagcagct taaggaggat tacttcaaga aaattgagtg cttcgattct 3960

gtcgagattt ctggtgtcga ggataggttc aatgcctctc ttggtactta ccatgatttg 4020

cttaagatca ttaaggacaa agacttcctt gataacgaag agaacgagga tattcttgag 4080

gatattgtcc ttacattgac tcttttcgag gatcgcgaga tgattgaaga gaggcttaag 4140

acttacgccc atcttttcga tgacaaggtc atgaagcagc ttaagcgcag gcgctacact 4200

ggttggggta ggctttctag gaagttgatc aatggtatta gggataagca gtctggtaag 4260

actattcttg atttcttgaa gtctgatggt ttcgccaatc gcaacttcat gcagcttatt 4320

catgatgact ctcttacttt caaggaggat attcagaagg cccaggtgtc tggtcaggga 4380

gattctcttc atgagcatat tgccaacctt gccggttctc cagccattaa gaaaggtatt 4440

cttcagactg tcaaggtcgt ggatgagctt gtgaaggtca tgggtaggca taagccagag 4500

aacatcgtca ttgagatggc tagggagaat cagacaactc agaagggtca gaagaactct 4560

agggagagga tgaagaggat tgaggaaggt attaaggagc ttggttctca gattttgaag 4620

gagcatccag tcgagaacac tcagcttcag aatgagaagt tgtaccttta ctatcttcag 4680

aacggtaggg atatgtacgt cgatcaggag cttgatatta acaggctttc tgactacgat 4740

gtcgatcata ttgtcccaca gtccttcctt aaggatgact ctattgacaa caaggtcctt 4800

actaggtctg acaagaatcg cggtaagtct gataacgtgc catctgagga agtcgtgaag 4860

aaaatgaaga actactggag gcagcttttg aatgccaagt tgattactca gaggaagttc 4920

gataacctta ctaaggccga gaggggaggt ttgtctgagc ttgataaggc cggtttcatt 4980

aagaggcagc ttgtcgagac taggcagatt actaagcatg tcgcccagat tcttgattct 5040

aggatgaaca ctaagtacga tgagaacgac aagttgatta gggaggtcaa ggtgattact 5100

cttaagtcta agttggtgtc tgatttcagg aaggatttcc agttctacaa ggtcagggag 5160

attaacaatt accatcatgc ccatgatgcc taccttaatg ccgtggtcgg tactgccctt 5220

attaagaaat acccaaagtt ggagtctgag ttcgtctacg gtgattacaa ggtctacgat 5280

gtcaggaaga tgattgccaa gtctgaacag gagattggta aggccactgc taagtacttc 5340

ttttactcca acattatgaa cttctttaag actgagatta ctcttgccaa cggtgagatt 5400

cgcaagaggc cacttattga gactaatggt gagactggtg agattgtctg ggataagggt 5460

agggatttcg ccactgtcag gaaggtcctt tctatgccac aggtcaacat tgtcaaaaag 5520

actgaggtcc agactggagg tttctctaag gagtctattc ttcctaagag gaactctgat 5580

aagttgattg ccaggaagaa agattgggac cctaagaaat acggtggatt cgattctcca 5640

actgtcgcct actctgtcct tgtcgtggcc aaggtcgaga agggtaagtc taagaaactt 5700

aagtctgtca aggagttgct tggtattact attatggagc gctcttcctt cgagaagaat 5760

ccaattgatt tccttgaggc caagggttac aaggaggtca agaaagatct tattatcaag 5820

ttgccaaagt actctctttt cgagcttgag aacggtagga agaggatgct tgcctctgcc 5880

ggtgagcttc agaagggtaa tgagcttgcc cttccatcca agtacgtcaa cttcctttac 5940

cttgcctctc attacgagaa gttgaagggt tctccagagg ataacgagca gaagcagctt 6000

ttcgtcgagc agcataagca ttaccttgat gagattatcg agcagatttc tgagttctct 6060

aagagggtca ttcttgccga tgccaatctt gataaggtcc tttctgccta caacaagcat 6120

cgcgataagc ctattaggga gcaggccgag aacattatcc atttgttcac tcttactaac 6180

cttggtgccc cagccgcatt caagtacttc gacacaacta ttgataggaa gaggtacact 6240

tctactaagg aggtccttga tgccactctt attcatcagt ccattactgg tctttacgag 6300

actaggattg atctttctca gcttggtgga gataagaggc cagccgctac taagaaagcc 6360

ggtcaggcca agaaaaagaa accaaagaag aagaggaagg tcggttaggg tgaccagctc 6420

gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 6480

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 6540

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 6600

catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 6660

ggtgtcatct atgttactag atc 6683

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

caccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

caccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

caccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

Claims (10)

1.一种应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，包括：

S1：构建基础载体

以pUC19载体为骨架，采用森林草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.1所示的pSG01载体；

以pUC19载体为骨架，采用栽培草莓的U6snRNA基因的启动子和终止子，转录sgRNA片段，获得目标片段序列为SEQ ID NO.2所示的pSG02载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以双CaMV 35S启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQ IDNO.3所示的pCCF001载体；

以pCAMBIA1302或pCAMBIA1301载体为骨架，采用森林草莓基因的密码子偏好性优化Cas9基因序列，以森林草莓的Ubi启动子和NOS终止子转录该基因，获得目标片段序列为SEQID NO.4所示的pCCU001载体；

S2：靶序列退火复性：合成互补的Oligo DNA，将合成的Oligo序列进行退火复性获得DNA双链序列，并稀释；

S3：pSG01和/或pSG02质粒的酶切：采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01和/或pSG02载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；

S4：连接和转化：配置连接体系，将S2获得的稀释后的DNA双链序列与S3获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中；

S5：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于LB/Amp液体培养基中振荡培养，分别以M13fwd和序列为SEQ ID NO.6所示的Oligo-R为引物进行菌液PCR鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的LB/Amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒，其中，M13fwd的序列为GTAAAACGACGGCCAGT；

S6：重组质粒和pCCF001或pCCU001质粒的双酶切：将S5得到的重组质粒和S1构建的pCCF001或pCCU001质粒进行双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段；

S7：连接、转化和鉴定：配置连接体系，将S6获得的酶切回收目标片段进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激法转化至大肠杆菌JM109中，挑单菌落于LB/Kan液体培养基中振荡培养，并进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的LB/Kan液体培养基中培养，提取质粒，即获得构建好的CRISPR/Cas9载体。

2.根据权利要求1所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，合成一对互补的Oligo DNA，即序列为SEQ ID NO.5所示的Oligo-F，序列为SEQ ID NO.6所示的Oligo-R。

3.根据权利要求1所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S2中，合成两对互补的Oligo DNA，即序列为SEQ ID NO.7所示的Oligo1-F、序列为SEQ ID NO.8所示的Oligo1-R、序列为SEQ ID NO.9所示的Oligo2-F、序列为SEQ IDNO.10所示的Oligo2-R。

4.根据权利要求2或3所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，将所述合成的Oligo DNA序列进行退火复性的反应程序为：95℃变性5min，每30s降温1℃，降温至25℃，并于4℃保存。

5.根据权利要求2所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在步骤S3中，采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01或pSG02载体，反应体系100μL，37℃反应过夜，65℃反应20min获得相应的酶切产物。

6.根据权利要求3所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在步骤S3中，采用限制性内切酶BbsI酶切pSG01和pSG02载体，反应体系100μL，37℃反应过夜，65℃反应20min获得相应的酶切产物。

7.根据权利要求2或5所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S5中，所得到的重组质粒为pSG01-CZ或pSG02-CZ；

在所述步骤S6中，将步骤S5中得到的pSG01-CZ或pSG02-CZ重组质粒、pCCF001或pCCU001质粒分别采用KpnI和XbaI进行双酶切，37℃酶切3h后65℃反应20min，获得相应的酶切产物。

8.根据权利要求3或6所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S5中，所得到的重组质粒为pSG01-CZ和pSG02-CZ；

在所述步骤S6中，将步骤S5中得到的pSG01-CZ重组质粒采用BamHI和KpnI进行双酶切，pSG02-CZ重组质粒采用XbaI和BamHI进行双酶切；将pCCF001或pCCU001质粒采用KpnI和XbaI进行双酶切，37℃酶切3h后65℃反应20min，获得相应的酶切产物。

9.根据权利要求7所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S7中，所述菌液PCR鉴定以M13rev和Oligo-R为引物，其中，M13rev的序列为CAGGAAACAGCTATGAC。

10.根据权利要求8所述的应用于草莓上的CRISPR/Cas9载体的构建方法，其特征在于，在所述步骤S7中，所述菌液PCR鉴定以Oligo1-F和Oligo2-R为引物。