CN111321167A - 一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术及植物学领域，更具体的说属于提供了一种用于异源蛋白表达的滚环复制重组载体的构建方法、重组载体及其应用。本申请通过提出的构建方法，构建了基于SPLCV序列为主的高效滚环复制瞬时表达载体，显著提升了异源核酸及蛋白在植物上持续时间和表达丰度，其结果具有高度的可重复性和可靠性。本发明提供的重组载体具有对异源蛋白极长表达时间(>20天相较于普通瞬时表达T载体)、极高表达丰度的载体(>30倍表达，相较于普通瞬时表达T载体)的分子工具载体，赋予了不同植物(烟草，甘薯，牵牛)的异源蛋白表达能力，弥补了相关植物对于利用瞬时表达研究基因功能的空白。

Description

一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术及植物学领域，更具体的说属于开发了一种在不同植物进行异源蛋白高效瞬时表达的滚环复制重组载体的构建方法、重组载体及应用。

背景技术

利用植物进行异源蛋白表达是研究植物的通用研究技术，例如植物功能基因研究中通过使用模式植物(拟南芥、本氏烟)对非模式植物的未知基因进行表达从而验证其基因功能；利用植物反应器(菠菜、烟草)对某些药用蛋白进行表达并分离纯化目的蛋白。通过分子克隆方式获得具有能持续稳定进行外源基因表达的转基因植物是进行异源蛋白表达的最好方式；但是因其载体构建复杂，转化程序时间长(往往需要6-10个月)等因素影响，直接限制了该方法的使用。

构建带有T-DNA插入区的瞬时表达载体是进行植物异源蛋白表达研究的备选方案，通过将构建完成的载体转化农杆菌后利用注射器直接侵染植物，可以使注射区域在一段时间内稳定持续的表达目的蛋白，该方法操作简单，时效性强，全部流程可能只需要10天左右即可完成；但是该方法也存在着一些固有缺陷，直接限制了该方法的使用：(1)持续时间短，蛋白的最长表达时间也仅能保持5-7天左右；(2).对较大分子量的蛋白表达能力差；(3)过量注射菌体容易导致超敏反应从而引起注射区域的枯萎坏死。

甘薯卷叶病毒(SPLCV；Sweet Potato Leaf Curl Virus)属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属(Begomoviruses)是一种典型的单链环状DNA分子病毒。

因此，提供一种新的构建植物异源蛋白表达重组载体的方法及重组载体以对目前植物异源蛋白表达研究具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种异源蛋白表达重组载体的构建方法、重组载体及其应用，该载体能对多种植物实现异源蛋白的高效瞬时表达。

为此，本发明提供了一种不同植物异源蛋白表达重组载体的构建方法，所述的构建方法采用了在普通T-DNA载体pCambia0390中插入甘薯卷叶病毒复制子基因，使其成为具有甘薯卷叶病毒复制子基因的滚环复制载体pCa-SPLCV-mid,其中预留了部分酶切位点作为异源基因连入表达的靶位点。

进一步的，所述的构建方法采用植物内源启动子序列作为重组载体的启动子，如pNbUBI.U4克隆自普通本氏烟基因组DNA；pIbCHIA、pIbUBI克隆自甘薯基因组DNA。

进一步的，所述的构建方法采用反向SPLCV-IL作为重组载体的串联接头，其基因序列如SEQ ID NO:4；采用SPLCV基因组非编码区的部分序列构建终止子T-SPLCV-nIR，其基因序列如SEQ ID NO：6。

进一步的，所述的方法包括如下步骤：

步骤1)分别设计2对带有接头的克隆引物对SPLCV序列进行扩增，其中第一段扩增序列仅仅包括SPLCV-IL区域，第二段扩增序列包含SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR；

步骤2)：将克隆获得的PCR产物纯化后分别连接进入预先利用限制性内切酶HindIII/BamHI酶切后的pCambia0390中，获得命名为pCambia0390-SPLCV-mid的中间载体，连接方法为同源重组连接；

步骤3)：将获得并测序验证无误的原始载体-SPLCV-mid中间载体利用限制性内切酶 PstI/BamHI双酶切切开，对酶切产物进行纯化后利用同源重组的方式连入完整的植物内源启动子-EGFP(绿色荧光蛋白)-tHSP(终止子)基因表达框；

其中，所述的步骤1)中2对带有接头的克隆引物序列分别为

pCa-SPLCV IL 1F:如SEQ ID NO：7

pCa-SPLCV IL 1R:如SEQ ID NO：8

pCa-SPLCV UTR 1F:如SEQ ID NO：9

pCa-SPLCV UTR 1R:如SEQ ID NO:10。

进一步的，所述步骤2)中优选使用pCambia0390作为原始载体，获得pCambia0390-SPLCV-mid中间载体，其基因序列如SEQ ID NO:11。

进一步的，所述的植物内源启动子为克隆自野生型本氏烟的pNbUBI.U4，其基因序列如 SEQ ID NO：12；获得的基因表达框为pNbUBI.U4(启动子)-EGFP(绿色荧光蛋白)-tHSP(终止子)。

本发明还提供如上述构建方法在不同植物高效瞬时基因表达中的应用。

本发明还提供构建方法构建构建的在甘薯及野生种、牵牛、烟草高效瞬时表达中的应用。

本发明还提供上述构建方法构建的重组载体在不同植物高效瞬时基因表达中的应用。

本发明还提供上述构建方法构建的重组载体在甘薯及野生种、牵牛、烟草高效瞬时表达中的应用。

有益效果：

本申请创造性的将双生病毒中的甘薯卷叶病毒应用于改造生物工程载体，并提出了具有创造性的构建方法，从而实现了异源蛋白高效稳定表达。

本申请配套使用的启动子类型提高了所构建重组载体的使用范围。

本申请将载体不同表达区域的间隔终止子替换为病毒原有的非编码序列显著提高了载体稳定性和使用便捷性。

本申请提供的利用甘薯卷叶病毒的复制子序列实现高效滚环复制载体的构建方法，相较于常规T-DNA插入载体，其表达异源蛋白的能力更高，具体表现在其异源蛋白表达持续时间> 20天，核酸表达水平>约30倍，蛋白积累丰度>约10倍。这种滚环复制载体采用了甘薯卷叶病毒的复制子蛋白(SPLCV/AC1-AC4)。

本申请构建的载体可以使用农杆菌及不同的侵染方法(真空负压抽滤、注射器表面注射) 实现跨多种物种(甘薯及野生种、牵牛、烟草)的高效表达：对于本氏烟叶片，拟南芥等相对易于侵染的组织，仅使用针管注射即可实现异源基因的高效表达：对于一些表面蜡质丰富较难直接侵染的植物组织如甘薯、三浅裂野牵牛、朝日牵牛。利用表面活性剂加真空抽滤的方法通用能实现高效的农杆菌侵染及基因表达。

附图说明

图1质粒的构建设计模式图及滚环复制检测结果示意图。

其中，图1a为质粒的构建设计模式图；图1b滚环复制检测结果示意图。

图2 T-SPLCV-nIR的二级结构。

图3 pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP与T-DNA载体pRI201-EGFP表达效率比较。

图4利用该载体实现多物种的EGFP表达。

图5利用不同植物启动子实现滚环复制的EGFP表达。

图6 pCambia0390-SPLCV-mid基因序列图谱。

具体实施方式

滚环复制是病毒、噬菌体等特有的一种基因组复制方式，具有高效产生巨量基因拷贝的能力。通过特别的分子生物学手段促使外源基因以滚环复制的形式进行高效复制，能显著提高外源基因的表达效率。

本申请利用甘薯卷叶病毒复制子构建的异源基因表达载体采取了较为特殊的构建方式，其主要为不同启动子及终止序列的使用，一方面本申请使用了植物内源启动子序列作为启动子；另外该载体的构建过程中并没有使用常规真核表达启动子，而是采取了SPLCV基因组非编码区的部分序列构建了终止子，该短终止子序列命名为T-SPLCV-nIR。本申请方法创制出了一种利用甘薯卷叶病毒复制子相关原件，能在不同植物体内实现滚环复制的高效瞬时表达载体。

本实施例中所使用的甘薯卷叶病毒基因组序列来自江苏省徐州市区域分离获得的病毒株系，为了方便表达，命名为SPLCV-XZ。在本实施例中，我们通过本申请提出的构建方法，构建了基于SPLCV-XZ序列为主的高效滚环复制瞬时表达载体，显著提升了异源核酸及蛋白在植物上持续时间和表达丰度，其结果具有高度的可重复性和可靠性。

本实施例中所使用的载体系列包括：pCambia0390,pGEM(采购自Proegma公司)系统，后续所使用的滚环复制表达载体以及对应中间载体都依赖于此进行修改后获得的新载体系统。

本申请中所使用的外源核酸序列：

启动子：pNbUBI.U4(克隆自野生型本氏烟)，基因序列如SEQ ID NO：12；pIbCHIA(克隆自甘薯栽培种Xu29，基因序列如SEQ ID NO：16)；pIbUBI(克隆自甘薯栽培种徐薯29，基因序列如SEQ ID NO：15)。

相关对应序列信息：

终止子：NOS terminator，HSP terminator(参考自NCBI公开数据)，T-SPLCV-nIR

目的基因：EGFP(参考自NCBI公开数据)

本申请文件中所使用的菌株：大肠杆菌株系,农杆菌株系GV31O1，上述株系均来自上海唯地生物科技有限公司)。

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1、获取SPLCV-XZ病毒基因

通过获取徐州地区典型带有甘薯卷叶病毒表型的植株，通过液氮急冻研磨后利用CTAB 法提取DNA，并利用该病毒的保守引物进行PCR引物扩增获得对应PCR产物。

保守引物序列为RAC 1F:gcactgggattccacaagatcttcc(SEQ ID NO：1)

RAC 1R:attggggtggaactgggtgga(SEQ ID NO：2)

所述PCR扩增反应条件为：98℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共计32个循环。)

将PCR产物利用T-载体连接试剂盒(购买自北京全式金生物科技有限公司)进行连接环化获得克隆质粒，将获得的克隆质粒寄送测序公司进行测序，获得甘薯卷叶病毒徐州株系，命名为(SPLCV-XZ)，基因如SEQ ID NO：3。

实施例2以本发明的构建方法构建pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP重组载体

本发明高效表达重组载体构建的具体方法如下：

步骤1)，针对测序获得的基因信息设计引物进行后续工作，分别设计2对带有接头的克隆引物对SPLCV-XZ序列进行扩增，其中第一段扩增序列仅仅包括SPLCV-IL(SEQ IDNO： 4)(284bp)区域，第二段扩增序列包含SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR(1900bp)(SEQ ID NO：5)，其中T-SPLCV-XZ-nIR为SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR(1900bp)的尾端序列，其具体序列为：T-SPLCV-XZ-nIR(SEQ ID NO：6)：taaaatttgttttta(其结构为Poly A的类似物，充当终止子的作用，其RNA二级结构如图2)，在本载体设计中作为终止子参与病毒复制蛋白的转录终止，本中间载体的构建对应引物序列如下：

pCa-SPLCV IL 1F:atgttgggcccggcgcgccatttgctgacgtatgcaatgggt(SEQ ID NO：7)

pCa-SPLCV IL 1R:ggggatcCtgcagccaagcttcttggcggccaagactggaa(SEQ ID NO：8)

pCa-SPLCV UTR 1F:aagaggagtccacCATGGTAtaaaatttgtttttattaatacagtaatac(SEQ ID NO：9)

pCa-SPLCV UTR 1R:agcgttaacactagtcagatctcttggcggccaagactggaaca(SEQ IDNO：10)

所述PCR扩增反应条件为：98℃变性30秒，62℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共计32个循环)。

步骤2，将克隆获得的PCR产物纯化后分别连接进入预先利用HindIII/BamHI酶切后的 pCambia0390，获得pCambia0390-SPLCV-mid(示意图如图5；基因序列如SEQ ID NO：11) 载体中，连接方法为同源重组连接，连接参数为按照摩尔浓度比使得片段1(SPLCV-IL(284bp))：片段2(SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR(1900bp))：纯化酶切载体(HindIII/BamHI酶切后的pCambia0390)等于5:5:1，37摄氏度连接30min，连接试剂盒采购自南京诺唯赞有限公司(C113),载体设计结果图见附图1a。

第三步，将获得并测序验证无误的pCambia0390-SPLCV-mid载体利用PstI/BamHI(限制性内切酶菌均购自与Takara公司，酶切条件为37度1小时)双酶切切开，对酶切产物进行纯化后利用同源重组的方式(连接条件及参数上同)连入完整的pNbU4(启动子)-EGFP(绿色荧光蛋白)-tHSP(终止子)基因表达框(扩增自pRI201-EGFP，载体pRI201购自Takara公司)，获得pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP载体，其中pNbU4(启动子)基因序列如SEQ ID NO：12。

实施例3本发明重组载体的在本氏烟烟草中的高效表达检验

将pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP利用化学转化法转化农杆菌GV3101后获得阳性菌液，利用1ml无菌注射器注射至本氏烟烟草的左侧，命名为pRI201-EGFP。为了验证实验效果，在本氏烟烟草的右侧注射由T-DNA载体转化的农杆菌GV3101，命名为T-DNA pRI201-EGFP。注射3-15天后，按照荧光强弱比较两边对于EGFP的表达效率。

为了检测滚环复制是否在注射区域发生，设计滚环复制检测引物：

Check RAC 1F:gcactgggattccacaagatcttcc(SEQ ID NO：13)

Check RAC 1R:attggggtggaactgggtgga(SEQ ID NO：14)

并按照各个时段提取样本，分别检测其RNA表达水平及蛋白表达水平。

实验结果显示，和对照T-DNA载体pRI201-EGFP相比，由 pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP介导的GFP的核酸表达水平约为对照的30倍(图3a)，蛋白表达水平约为对照的为20倍(图3b)。滚环复制检测引物的实验结果也表示(图1b))， pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP发生了滚环复制，而对照并没有扩增获得目的片段，证明未发生滚环复制，因此，pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP载体的设计是成功的，可以介导外源核酸发生正确的滚环复制(图1b)。

实施例4本发明所构建重组载体的在不同植物中的瞬时表达检验

利用真空抽滤装置对表达困难的植物进行侵染工作，将上述实施例3获得pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP的农杆菌菌液大摇扩增至200ml，利用植物瞬时表达侵染液将其吸光值OD600稀释至0.4，分别加入表明活性剂Trixton 100浓度至0.05％，以及200umol/L 的乙酰丁香酮进行后续侵染工作，将待侵染的甘薯，牵牛，以及三浅裂野牵牛叶片浸没至菌液底部，真空抽滤至压力达到0.1Mpa后保持1min,快速释放压力并重复三次，获得侵染处理后的植物样本。处理2天后，观察瞬时发生的表型。实验结果显示如图4，抽滤区域出现强荧光，因此表明该载体结合农杆菌真空抽滤技术可以实现对于瞬时表达困难的植物的侵染工作 (甘薯，牵牛，以及trifda牵牛)。

实施例5本发明所构建重组载体使用不同植物启动子进行异源基因表达。

将获得并测序验证无误的pCambia0390-SPLCV-mid载体利用PstI/BamHI(限制性内切酶菌均购自与Takara公司，酶切条件为37度1小时)双酶切切开，对酶切产物进行纯化后利用同源重组的方式(连接条件及参数上同)连入完整的pIbUBI/pIbCHIA(启动子)-EGFP(绿色荧光蛋白)-tHSP(终止子)基因表达框(扩增自pRI201-(pIbUBI) EGFP/pRI201-(pIbCHIA)EGFP，载体pRI201购自Takara公司,启动子克隆及替换已提前构建成功)，获得pCambia0390-SPLCV pIbUBI-EGFP、pCambia0390-SPLCV pIbCHIA-EGFP载体，其中pIbUBI(启动子)基因序列如SEQ ID NO：15；pIbCHIA(启动子)基因序列如SEQ ID NO：16。将实施例3的pCambia0390-SPLCV/NbU4-EGFP以及上述两个载体以及对照载体 pRI201利用化学转化法转化农杆菌GV3101后获得4种阳性菌液，利用1ml无菌注射器注射至本氏烟烟草的4点，并一一编号。注射3-15天后，按照荧光强弱比较4种处理的EGFP强度，实验结果(图5)表明，该滚环复制载体可以兼容多种不同启动子序列，拓展了其使用范围。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcactgggat tccacaagat cttcc 25

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attggggtgg aactgggtgg a 21

<210> 3

<211> 3116

<212> DNA

<213> 甘薯( Ipomoea batatas)

<400> 3

tgctgacgta tgcaatgggt gctctcaaaa ctctacggaa tggggggctt tgggtgctca 60

tttataccga gctcccaaat ggcaatttgg gaattatgca aaagtttttg aaattcaaat 120

ccccaatttt cgccccaaaa gcggccaccg tataatatta ccggtggccg cgcgcccttt 180

aaaagtgggc cccacaaggg gaccacgcgt cttttacttt aatgctttaa tgattactca 240

cctttaaatt gaccaatcct gttccagtct tggccgccaa gaatggatac cctgtgggac 300

ccattgcaga acccacttcc ggatacttta tacggtttta ggtgtatgct ttctgtaaaa 360

tacttgcaga gtattttgaa gaaatacgag ccagggacct tagggttcga gctctgttcg 420

gagttaatcc gtattttcag ggtcaggcag tatgacaggg cgaattcccg tttcgcggag 480

atatcatcca tatgggggga gaccggtaag acggaggctg aacttcgaga cagctatcgt 540

gccttacact gggaatgctg tcccaattgc tgcccgaagc tatgtcccgg tttcaagagg 600

cgcccggatg aagagaagga agggtgatcg catcccgaag gggtgtgtgg gtccctgtaa 660

ggtacaggat tatgagttca agatggatgt tccacacagt gggacctttg tttgtgtatc 720

tgatttcact aggggaactg ggcttaccca tcgcttgggt aagcgtgttt gcattaagtc 780

gatgggcata gatggtaagg tctggatgga tgacaatgtg gccaagagag atcataccaa 840

cataattact tactggttga ttcgagatag gaggcccaac aaggatccct tgacatttgc 900

acaggccttt actatgtatg acaatgagcc cactactgct aagatccgaa tggatcttag 960

ggataggatg caggttctga agaaattctc tgttacagtt tctggtggcc cttacaacca 1020

caaggagcag gctttggtta gaaagttttt taagggtctg tataatcatg taacttataa 1080

tcacaaggaa gaggcgaagt atgagaatca tttagagaat gcattgatgt tgtatagtgc 1140

tagtagtcat gctagcaatc ctgtgtatca gaccctgcgt tgcagggctt atttctatga 1200

ttcacataat aattaataaa atttgttttt attaatacag taataccttt acatcatcat 1260

tacaatctat tgtgtctact tcgtctatcc gaggacatgt tcttggtaga ctcctaatta 1320

caagaactaa attaagcaaa ctaaaaaaac ctaaactagc taattcagta cagatgcgcc 1380

atttaaggcg ttccaaaata ccagtccagc tgtgagaagc accagttaga cgggtcgtcg 1440

atatccggaa ttgcaggaag atcttgtgga atcccagtgc tcttctctcc ctgtagttga 1500

ccctcagttg gaatttgagg atggttctcc cctgtgcact ctcgtggaca tacatcagtc 1560

ttaggtagaa tggtgcagtc cgacccgcag acatggggtt ggtgtcgaat tctagtgctc 1620

tcatagtctg agcatgactt agtgattccc ctgtgcgtga atccatgctg gtacttgcag 1680

gtttgggtga tgaaggctga acacccgcag cccttccaca ctatcctcgt cctcgtttca 1740

ggaactttcc tcttggcctt cttcgcctct gcgtgtagtg gctcctgaat gggacacttc 1800

ctcttgattc cagaagggag attggacatc gcagaatatt gcgttcttta atgcccaatt 1860

cttgagtgct tcttgctctg gtttgtccaa ccagagttta aatgaggagc cctctcctgg 1920

attgcagagg aagatagtgg gaattccacc tttaatttga actggcttcc cgtatttaca 1980

gttggattgc cagtccttct gggcccccat gaattcctta aagtgcttta ggtattgggg 2040

gttgacgtca tcaatgacgt tataccaagc actgttgctg taaactttag ggcttagatc 2100

taaatgccca cacaaataat tgtgagggcc caaagacctg gcccatactg ttttgcctat 2160

tctgcttggg ccttcaataa caattgatat gggtctatct ggccgcgcag cggaatccat 2220

gacattttca gcggcccagt cgctgataat gtcaggaacg gcattgaaag aagaagaaga 2280

aaaaggagaa gaatatacag aaggaggagg agaaaaaatc ctatctaaat tactacgcaa 2340

attatgatat tgaaaaataa aatctttagg gagtttctcc ctaattattg ctaatgccgc 2400

ctcagcagag cctgcgttta aggcttctgc tgctgcatca ttagccgtct gctgacctcc 2460

tctagcagat ctgccgtcga cctggaattc accccagtcg atgtaatctc cgtccttctc 2520

gatgtatgcc ttgacatctg aggaggattt agctccctgg aaattggggt ggaactgggt 2580

ggaattatga gggtgcacga ggtcgaaatg tcttggattt ctgaactggg ctttaccctt 2640

gaattgaata agggcatgga ggtgcagaga cccatcttga tgttgctctt gagcaactct 2700

gataaatagt ttatcagatg ggcactggat tttctgtaat aggtctaagg cttgctcttt 2760

atttaaagag catttgggat aagtaaggaa aatattttta gccttaactt ggaaacttgc 2820

ttgacgaggc attttgctga cgtatgcaat gggtgctctc aaaactctac ggaatggggg 2880

gctttgggtg ctcatttata ccgagctccc aaatggcaat ttgggaatta tgcaaaagtt 2940

tttgaaattc aaatccccaa ttttcgcccc aaaagcggcc accgtataat attaccggtg 3000

gccgcgcgcc ctttaaaagt gggccccaca aggggaccac gcgtctttta ctttaatgct 3060

ttaatgatta ctcaccttta aattgaccaa tcctgttcca gtcttggccg ccaaga 3116

<210> 4

<211> 284

<212> DNA

<213> 甘薯( Ipomoea batatas)

<400> 4

tttgctgacg tatgcaatgg gtgctctcaa aactctacgg aatggggggc tttgggtgct 60

catttatacc gagctcccaa atggcaattt gggaattatg caaaagtttt tgaaattcaa 120

atccccaatt ttcgccccaa aagcggccac cgtataatat taccggtggc cgcgcgccct 180

ttaaaagtgg gccccacaag gggaccacgc gtcttttact ttaatgcttt aatgattact 240

cacctttaaa ttgaccaatc ctgttccagt cttggccgcc aaga 284

<210> 5

<211> 1900

<212> DNA

<213> 甘薯( Ipomoea batatas)

<400> 5

taaaatttgt ttttattaat acagtaatac ctttacatca tcattacaat ctattgtgtc 60

tacttcgtct atccgaggac atgttcttgg tagactccta attacaagaa ctaaattaag 120

caaactaaaa aaacctaaac tagctaattc agtacagatg cgccatttaa ggcgttccaa 180

aataccagtc cagctgtgag aagcaccagt tagacgggtc gtcgatatcc ggaattgcag 240

gaagatcttg tggaatccca gtgctcttct ctccctgtag ttgaccctca gttggaattt 300

gaggatggtt ctcccctgtg cactctcgtg gacatacatc agtcttaggt agaatggtgc 360

agtccgaccc gcagacatgg ggttggtgtc gaattctagt gctctcatag tctgagcatg 420

acttagtgat tcccctgtgc gtgaatccat gctggtactt gcaggtttgg gtgatgaagg 480

ctgaacaccc gcagcccttc cacactatcc tcgtcctcgt ttcaggaact ttcctcttgg 540

ccttcttcgc ctctgcgtgt agtggctcct gaatgggaca cttcctcttg attccagaag 600

ggagattgga catcgcagaa tattgcgttc tttaatgccc aattcttgag tgcttcttgc 660

tctggtttgt ccaaccagag tttaaatgag gagccctctc ctggattgca gaggaagata 720

gtgggaattc cacctttaat ttgaactggc ttcccgtatt tacagttgga ttgccagtcc 780

ttctgggccc ccatgaattc cttaaagtgc tttaggtatt gggggttgac gtcatcaatg 840

acgttatacc aagcactgtt gctgtaaact ttagggctta gatctaaatg cccacacaaa 900

taattgtgag ggcccaaaga cctggcccat actgttttgc ctattctgct tgggccttca 960

ataacaattg atatgggtct atctggccgc gcagcggaat ccatgacatt ttcagcggcc 1020

cagtcgctga taatgtcagg aacggcattg aaagaagaag aagaaaaagg agaagaatat 1080

acagaaggag gaggagaaaa aatcctatct aaattactac gcaaattatg atattgaaaa 1140

ataaaatctt tagggagttt ctccctaatt attgctaatg ccgcctcagc agagcctgcg 1200

tttaaggctt ctgctgctgc atcattagcc gtctgctgac ctcctctagc agatctgccg 1260

tcgacctgga attcacccca gtcgatgtaa tctccgtcct tctcgatgta tgccttgaca 1320

tctgaggagg atttagctcc ctggaaattg gggtggaact gggtggaatt atgagggtgc 1380

acgaggtcga aatgtcttgg atttctgaac tgggctttac ccttgaattg aataagggca 1440

tggaggtgca gagacccatc ttgatgttgc tcttgagcaa ctctgataaa tagtttatca 1500

gatgggcact ggattttctg taataggtct aaggcttgct ctttatttaa agagcatttg 1560

ggataagtaa ggaaaatatt tttagcctta acttggaaac ttgcttgacg aggcattttg 1620

ctgacgtatg caatgggtgc tctcaaaact ctacggaatg gggggctttg ggtgctcatt 1680

tataccgagc tcccaaatgg caatttggga attatgcaaa agtttttgaa attcaaatcc 1740

ccaattttcg ccccaaaagc ggccaccgta taatattacc ggtggccgcg cgccctttaa 1800

aagtgggccc cacaagggga ccacgcgtct tttactttaa tgctttaatg attactcacc 1860

tttaaattga ccaatcctgt tccagtcttg gccgccaaga 1900

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 甘薯( Ipomoea batatas)

<400> 6

taaaatttgt tttta 15

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgttgggcc cggcgcgcca tttgctgacg tatgcaatgg gt 42

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggatcctg cagccaagct tcttggcggc caagactgga a 41

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aagaggagtc caccatggta taaaatttgt ttttattaat acagtaatac 50

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcgttaaca ctagtcagat ctcttggcgg ccaagactgg aaca 44

<210> 11

<211> 8990

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctaagagaaa agagcgttta ttagaataac ggatatttaa aagggcgtga aaaggtttat 60

ccgttcgtcc atttgtatgt gcatgccaac cacagggttc ccctcgggat caaagtactt 120

tgatccaacc cctccgctgc tatagtgcag tcggcttctg acgttcagtg cagccgtctt 180

ctgaaaacga catgtcgcac aagtcctaag ttacgcgaca ggctgccgcc ctgccctttt 240

cctggcgttt tcttgtcgcg tgttttagtc gcataaagta gaatacttgc gactagaacc 300

ggagacatta cgccatgaac aagagcgccg ccgctggcct gctgggctat gcccgcgtca 360

gcaccgacga ccaggacttg accaaccaac gggccgaact gcacgcggcc ggctgcacca 420

agctgttttc cgagaagatc accggcacca ggcgcgaccg cccggagctg gccaggatgc 480

ttgaccacct acgccctggc gacgttgtga cagtgaccag gctagaccgc ctggcccgca 540

gcacccgcga cctactggac attgccgagc gcatccagga ggccggcgcg ggcctgcgta 600

gcctggcaga gccgtgggcc gacaccacca cgccggccgg ccgcatggtg ttgaccgtgt 660

tcgccggcat tgccgagttc gagcgttccc taatcatcga ccgcacccgg agcgggcgcg 720

aggccgccaa ggcccgaggc gtgaagtttg gcccccgccc taccctcacc ccggcacaga 780

tcgcgcacgc ccgcgagctg atcgaccagg aaggccgcac cgtgaaagag gcggctgcac 840

tgcttggcgt gcatcgctcg accctgtacc gcgcacttga gcgcagcgag gaagtgacgc 900

ccaccgaggc caggcggcgc ggtgccttcc gtgaggacgc attgaccgag gccgacgccc 960

tggcggccgc cgagaatgaa cgccaagagg aacaagcatg aaaccgcacc aggacggcca 1020

ggacgaaccg tttttcatta ccgaagagat cgaggcggag atgatcgcgg ccgggtacgt 1080

gttcgagccg cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat gaaatcctgg ccggtttgtc 1140

tgatgccaag ctggcggcct ggccggccag cttggccgct gaagaaaccg agcgccgccg 1200

tctaaaaagg tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt catgcggtcg ctgcgtatat 1260

gatgcgatga gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca tgaaggttat cgctgtactt 1320

aaccagaaag gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc atctagcccg cgccctgcaa 1380

ctcgccgggg ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc agggcagtgc ccgcgattgg 1440

gcggccgtgc gggaagatca accgctaacc gttgtcggca tcgaccgccc gacgattgac 1500

cgcgacgtga aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga tcgacggagc gccccaggcg 1560

gcggacttgg ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg tgctgattcc ggtgcagcca 1620

agcccttacg acatatgggc caccgccgac ctggtggagc tggttaagca gcgcattgag 1680

gtcacggatg gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc gggcgatcaa aggcacgcgc 1740

atcggcggtg aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc tgcccattct tgagtcccgt 1800

atcacgcagc gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg gcacaaccgt tcttgaatca 1860

gaacccgagg gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg ccgctgaaat taaatcaaaa 1920

ctcatttgag ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag cacaaacacg ctaagtgccg 1980

gccgtccgag cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc cagcctggca gacacgccag 2040

ccatgaagcg ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg aagatgtacg 2100

cggtacgcca aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg cagctaccag 2160

agtaaatgag caaatgaata aatgagtaga tgaattttag cggctaaagg aggcggcatg 2220

gaaaatcaag aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc ccatgtgtgg aggaacgggc 2280

ggttggccag gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct gcaatggcac tggaaccccc 2340

aagcccgagg aatcggcgtg agcggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg 2400

cgctgggtga tgacctggtg gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca 2460

tcgaggcaga agcacgcccc ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag 2520

aatcccggca accgccggca gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg 2580

agcaaccaga ttttttcgtt ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca 2640

tcatggacgt ggccgttttc cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc 2700

gctacgagct tccagacggg cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg 2760

tgtgggatta cgacctggta ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat 2820

accgggaagg gaagggagac aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac 2880

tcaagttctg ccggcgagcc gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca 2940

ttcggttaaa caccacgcac gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc 3000

tggtgacggt atccgagggt gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa 3060

ccgggcggcc ggagtacatc gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag 3120

aaggcaagaa cccggacgtg ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca 3180

tcggccgttt tctctaccgc ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt 3240

tgttcaagac gatctacgaa cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca 3300

ccgtgcgcaa gctgatcggg tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg 3360

ggcaggctgg cccgatccta gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg 3420

ccggttccta atgtacggag cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc 3480

gaaaaggtct ctttcctgtg gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga 3540

accggaaccc gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag 3600

tgactgatat aaaagagaaa aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta 3660

aaactcttaa aacccgcctg gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc 3720

tgcaaaaagc gcctaccctt cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc 3780

ctatcgcggc cgctggccgc tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc 3840

gcggacaagc cgcgccgtcg ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc 3900

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 3960

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 4020

ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 4080

ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 4140

cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 4200

actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 4260

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 4320

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 4380

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 4440

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 4500

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 4560

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 4620

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 4680

cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 4740

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 4800

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 4860

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 4920

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 4980

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtactaaa 5040

acaattcatc cagtaaaata taatatttta ttttctccca atcaggcttg atccccagta 5100

agtcaaaaaa tagctcgaca tactgttctt ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc 5160

agaaggcaat gtcataccac ttgtccgccc tgccgcttct cccaagatca ataaagccac 5220

ttactttgcc atctttcaca aagatgttgc tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa 5280

gttcctcttc gggcttttcc gtctttaaaa aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg 5340

gagtgtcttc ttcccagttt tcgcaatcca catcggccag atcgttattc agtaagtaat 5400

ccaattcggc taagcggctg tctaagctat tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg 5460

agtgaaagag cctgatgcac tccgcataca gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat 5520

cttcatactc ttccgagcaa aggacgccat cggcctcact catgagcaga ttgctccagc 5580

catcatgccg ttcaaagtgc aggacctttg gaacaggcag ctttccttcc agccatagca 5640

tcatgtcctt ttcccgttcc acatcatagg tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt 5700

ttaaatatag gttttcattt tctcccacca gcttatatac cttagcagga gacattcctt 5760

ccgtatcttt tacgcagcgg tatttttcga tcagtttttt caattccggt gatattctca 5820

ttttagccat ttattatttc cttcctcttt tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc 5880

taattataac aagacgaact ccaattcact gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca 5940

gaaaacagct ttttcaaagt tgttttcaaa gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc 6000

gattttgaaa ccgcggtgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc 6060

taccctccgc gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat 6120

agcatcggta acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc 6180

cggactgatg ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc 6240

tgttggctgg ctggtggcag gatatattgt ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt 6300

aataacacat tgcggacgtt tttaatgtac tgaattaacg ccgaattaat tcctaggcca 6360

ccatgttggg cccggcgcgc catttgctga cgtatgcaat gggtgctctc aaaactctac 6420

ggaatggggg gctttgggtg ctcatttata ccgagctccc aaatggcaat ttgggaatta 6480

tgcaaaagtt tttgaaattc aaatccccaa ttttcgcccc aaaagcggcc accgtataat 6540

attaccggtg gccgcgcgcc ctttaaaagt gggccccaca aggggaccac gcgtctttta 6600

ctttaatgct ttaatgatta ctcaccttta aattgaccaa tcctgttcca gtcttggccg 6660

ccaagaagct tggctgcagg atccccggga attctaagag gagtccacca tggtataaaa 6720

tttgttttta ttaatacagt aataccttta catcatcatt acaatctatt gtgtctactt 6780

cgtctatccg aggacatgtt cttggtagac tcctaattac aagaactaaa ttaagcaaac 6840

taaaaaaacc taaactagct aattcagtac agatgcgcca tttaaggcgt tccaaaatac 6900

cagtccagct gtgagaagca ccagttagac gggtcgtcga tatccggaat tgcaggaaga 6960

tcttgtggaa tcccagtgct cttctctccc tgtagttgac cctcagttgg aatttgagga 7020

tggttctccc ctgtgcactc tcgtggacat acatcagtct taggtagaat ggtgcagtcc 7080

gacccgcaga catggggttg gtgtcgaatt ctagtgctct catagtctga gcatgactta 7140

gtgattcccc tgtgcgtgaa tccatgctgg tacttgcagg tttgggtgat gaaggctgaa 7200

cacccgcagc ccttccacac tatcctcgtc ctcgtttcag gaactttcct cttggccttc 7260

ttcgcctctg cgtgtagtgg ctcctgaatg ggacacttcc tcttgattcc agaagggaga 7320

ttggacatcg cagaatattg cgttctttaa tgcccaattc ttgagtgctt cttgctctgg 7380

tttgtccaac cagagtttaa atgaggagcc ctctcctgga ttgcagagga agatagtggg 7440

aattccacct ttaatttgaa ctggcttccc gtatttacag ttggattgcc agtccttctg 7500

ggcccccatg aattccttaa agtgctttag gtattggggg ttgacgtcat caatgacgtt 7560

ataccaagca ctgttgctgt aaactttagg gcttagatct aaatgcccac acaaataatt 7620

gtgagggccc aaagacctgg cccatactgt tttgcctatt ctgcttgggc cttcaataac 7680

aattgatatg ggtctatctg gccgcgcagc ggaatccatg acattttcag cggcccagtc 7740

gctgataatg tcaggaacgg cattgaaaga agaagaagaa aaaggagaag aatatacaga 7800

aggaggagga gaaaaaatcc tatctaaatt actacgcaaa ttatgatatt gaaaaataaa 7860

atctttaggg agtttctccc taattattgc taatgccgcc tcagcagagc ctgcgtttaa 7920

ggcttctgct gctgcatcat tagccgtctg ctgacctcct ctagcagatc tgccgtcgac 7980

ctggaattca ccccagtcga tgtaatctcc gtccttctcg atgtatgcct tgacatctga 8040

ggaggattta gctccctgga aattggggtg gaactgggtg gaattatgag ggtgcacgag 8100

gtcgaaatgt cttggatttc tgaactgggc tttacccttg aattgaataa gggcatggag 8160

gtgcagagac ccatcttgat gttgctcttg agcaactctg ataaatagtt tatcagatgg 8220

gcactggatt ttctgtaata ggtctaaggc ttgctcttta tttaaagagc atttgggata 8280

agtaaggaaa atatttttag ccttaacttg gaaacttgct tgacgaggca ttttgctgac 8340

gtatgcaatg ggtgctctca aaactctacg gaatgggggg ctttgggtgc tcatttatac 8400

cgagctccca aatggcaatt tgggaattat gcaaaagttt ttgaaattca aatccccaat 8460

tttcgcccca aaagcggcca ccgtataata ttaccggtgg ccgcgcgccc tttaaaagtg 8520

ggccccacaa ggggaccacg cgtcttttac tttaatgctt taatgattac tcacctttaa 8580

attgaccaat cctgttccag tcttggccgc caagagatct gactagtgtt aacgctagcc 8640

accaccacca ccaccacgtg tgaattacag gtgaccagct cgaatttccc cgatcgttca 8700

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 8760

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 8820

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 8880

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 8940

gatcgggaat taaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac 8990

<210> 12

<211> 675

<212> DNA

<213> 本氏烟(Nicotiana benthamiana)

<400> 12

aatgtaacgt aagaagttgc tagtcaaaag gcacctaatt ttctccaccg ctcaaaggaa 60

aggacaaggt agcagtagcg tgtaggtttg gtgctgtaca aaataaacga gacacgtgtt 120

gtcttatgat aggataatcc atgaggcaat ttcgtctaaa gtcggccatt tcacctttaa 180

aaggaccctc tttgttccca aattcttatc ctttgatttc tctattctca ttatctcctc 240

aacttttctc tctttattca aacgcctctc aaggtgcatt aatttcttct ttcttctttt 300

tgtttctctt attgtatgct atttttattt aatttagatc taaattttaa ggatctaaaa 360

aactcaattt tgatttgttt aatcgctctg tatatgtact aagttgaaat ttttttgtgc 420

gtttattttg ttagatatat attttaagat ctgaagtatc atttggtcag aataaaaatc 480

aattgaattt gttattgcta tgtatacagt taaaaaattc tatcttgatt aacagagctg 540

aatctgtgtg ctgattttgt ttgattttta tgtataaaaa attgttatta atcttgttca 600

ttgttttgta tttgcacaaa gtcagaattt tgggtgagtt attttgatga ttgaaacttt 660

tttctgtata tacag 675

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcactgggat tccacaagat cttcc 25

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

attggggtgg aactgggtgg a 21

<210> 15

<211> 1159

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 15

taccactcgc tctacgttgg cgaaaatggc gtctccagat ctgggggcga cgggagccat 60

ggaagccttc gatccgagct gctactgttg atttagtaca aactacaaag tatctgggat 120

atcgagtgtg ccttcgactt cgatttcgat ccctgtatta gcacaaaatg ggaagaaccg 180

ggtcggactc aattcggttt catccattac cgcacggccc aaatgtttgg gctttttttt 240

tttttcgatt tctgacccgt ctgagaaatg taacattgta aaggattttt ggtgataaaa 300

taaaatattg ggttactttt ttctttttta gtagtactga ttctattata aatattgaat 360

tattttactc attttttttg tttatattga cattttagtt gttattatat tatgatgata 420

tgatcacttg taatgatttt ttattttttt atatttttat acttttacca caattcatat 480

tattatattt gattcgttca ccttagtaat tatttttata ttatataaac atgaattcat 540

gataatgtat ttcatgtaaa tacaaattaa tggtatttag aattattatt attatatgaa 600

aaaatgaata gtataaaaca aatttataaa ttttgcctga tccgatattt atgaagcgcg 660

taggttttga agtcaaaatc ggctacttgc caattgccat ttcccaacct aataatctcc 720

gccacgcaaa gaaaatccga caaataatgc aagccattgc gtgtggtatc gatcaataca 780

cgtaatatcc gacgcgtgtc cctccttcat aggtgaacaa gataagtatt ttcttcgcaa 840

gccggtcgag acgcctttat aatcttctcc tccctcgccc tttctcatcc atcattcgat 900

ttctctactg tgaatttctt cttcctcaaa accttctctc aaggtaacga aagtttcctc 960

aatcttcttt ctgttttgtt tattgttttt attgttattg ttaattttat gtgttaatct 1020

tattcgagaa ttggggatct gggggctgcg ttcttcgatc ttcataaatt gcaattggtt 1080

ttagggtttt ttttgattga atcggtgctg tttatgtttg tgtttgatgg ttaattggat 1140

ttggatttgg attatacag 1159

<210> 16

<211> 1044

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 16

cacgaacgca cgactacatg taccgcgtct ttatgtaaaa aatcatattt caaatcgaat 60

tacagaaaac tttaactacg tatctggaca aaaatttctt tgatatcata gtaattctat 120

ttttacaaac caaacattga aatttaaatt ctcactttat tctcctacta tttatctttc 180

ataaaattat aattttttct cttctaattc cctccttgca attaacatcc cattagtttt 240

ttttttttaa ataagtcaaa aatataaatt cattatttaa tctatattat ctataacaat 300

ctggaaaaat aggcattcgt aatcggaacg gaaagccttt taggcaggga gtgggagtga 360

ttgaaaattt gagacgccgc gtctagacat aaattgttga tggtgacgat tgaccttatc 420

accccgccac cctaattttg ttttttggtt ggttccatca tttctgctca ctttttcttc 480

ttttttatta aatgtttatc actatgtcaa aagttatagt tagtaacaaa tgtgtaatac 540

tgtttttttc cactcatgta acaattagca ttgtttttcg aatataataa gataaactct 600

acccctatat aataattcat atataataca atataaatca cactaagaag aagtgatata 660

ctgatgatat caatacttaa ttgtatgtga gaagaaaaat aaaggtttta tgtattttct 720

ctaatctgag aattgaatat gaagcatata tttcaaagtg cgtgtggaga aaattcaaag 780

tctgtactga aatcaatctt gaaagctatc aatcaatggt caagccaaac tccaacacgt 840

agcatcaaca tagcgtgtaa caatgttcaa tgacaaaact tccatagctt agcagccatg 900

agagataatg atccctttgt ctttctggaa atctgcaagt ggaaaagtca tgcaaaacct 960

ctaccatggc gcctataaat acgtagcagc tccaataacc ttaaactcac cacatacatt 1020

atcatagaag tagtgaaaaa catc 1044

Claims (10)

1.一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法，其特征在于，所述的构建方法采用了在普通T-DNA载体pCambia0390中插入甘薯卷叶病毒复制子基因，使其成为具有甘薯卷叶病毒复制子基因的滚环复制载体，并预留部分酶切位点作为异源基因连入表达的靶位点。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法采用植物内源启动子序列作为重组载体表达异源基因的启动子。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法采用反向SPLCV-IL作为滚环复制重组载体的串联接头，其基因序列如SEQ ID NO:4；采用SPLCV基因组非编码区的部分序列构建终止子T-SPLCV-nIR，其基因序列如SEQ ID NO：6。

4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1)分别设计2对带有接头的克隆引物对SPLCV序列进行扩增，其中第一段扩增序列仅仅包括SPLCV-IL区域，第二段扩增序列包含SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR区域；

步骤2)将步骤1)克隆获得的PCR产物纯化后分别连接进入预先利用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切后的pCambia0390中，获得命名为pCambia0390-SPLCV-mid的中间载体，其基因序列如SEQ ID NO:11；连接方法为同源重组连接；

步骤3)将获得并测序验证无误的pCambia0390-SPLCV-mid中间载体利用限制性内切酶PstI/BamHI双酶切切开，对酶切产物进行纯化后利用同源重组的方式连入完整的植物内源启动子-EGFP(绿色荧光蛋白)-tHSP(终止子)基因表达框，获得重组载体；

其中，所述的步骤1)中2对带有接头的克隆引物序列分别为

pCa-SPLCV IL 1F:如SEQ ID NO：7

pCa-SPLCV IL 1R:如SEQ ID NO：8

pCa-SPLCV UTR 1F:如SEQ ID NO：9

pCa-SPLCV UTR 1R:如SEQ ID NO:10。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的植物内源启动子为克隆自野生型本氏烟的pNbUBI.U4，其基因序列如SEQ ID NO：12。

6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的植物内源启动子为克隆自甘薯基因组DNA的pIbUBI或是pIbCHIA；基因序列分别如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。

7.如权利要求1-6任一构建方法在不同植物高效瞬时基因表达中的应用。

8.如权利要求1-6任一构建方法在甘薯及野生种、牵牛、烟草、番茄高效瞬时表达中的应用。

9.权利要求1-6任一方法所述的重组载体在不同植物高效瞬时基因表达中的应用。

10.如权利要求1-6任一方法构建的重组载体在甘薯及野生种、牵牛、烟草高效瞬时表达中的应用。

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