KR20150140723A - 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

선택된 표현형을 갖는 식물을 생산하기 위한, 식물에서의 병행 또는 순차적 트랜스진 스택킹을 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 본 개시내용은 식물에서의 정밀 형질전환, 유전자 표적화, 표적화된 게놈 변형 및 단백질 발현을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 식물 게놈 내의 내인성 유전자좌 (예를 들어, 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자좌)에서의 선택차를 이용하는, 외인성 서열을 통합시키고 형질을 스택킹하기 위한 신규, 트랜스제닉 마커-미사용 전략을 기재한다.

Description

식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR INTEGRATION OF AN EXOGENOUS SEQUENCE WITHIN THE GENOME OF PLANTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 4월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 61/809,097 및 2013년 5월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 61/820,461을 우선권 주장하며, 이로써 이들 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
연방정부 지원 연구 하에 이루어진 발명에 대한 권리의 진술
해당 없음.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 사본은 본 명세서와 공동으로 EFS-웹을 통해 ASCII 포맷 서열 목록으로서 전자적으로 제출되었다. 이러한 ASCII 포맷 문서에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시내용은 게놈 조작, 특히 식물 내로의 외인성 서열의 통합, 예를 들어 다수의 게놈에 걸친 (예를 들어 다배수체 식물에서) 다수의 대립유전자의 동시 게놈 편집의 분야에 있다.
식품 생산에 대한 증가하는 전세계적 수요의 과제에 대처하기 위해, 농업 생산성을 개선하기 위한 다수의 효과적인 접근법 (예를 들어, 증진된 수확량 또는 조작된 해충 저항성)은 돌연변이 육종, 또는 형질전환에 의한 신규 유전자의 작물 종 게놈 내로의 도입에 의존한다. 두 방법은 모두 본질적으로 비-특이적이며 상대적으로 비효율적이다. 예를 들어, 통상적인 식물 형질전환 방법은 무작위 위치에서 게놈 내로 통합되는 외인성 DNA를 전달한다. 이들 방법의 무작위 특성은, 바람직한 속성을 갖는 트랜스제닉 식물주를 확인하고 단리하기 위해 구축물당 수 백개의 특유의 무작위-통합 이벤트를 생성하고 스크리닝할 것을 필요로 한다. 더욱이, 통상의 형질전환 방법은 다음을 비롯하여 트랜스진 평가에 대한 여러 과제를 불러 일으켰다: (a) 의도하지 않은 게놈 파괴로 인한 다면발현 효과가 발생하였는지 여부를 예측하기가 어려움; 및 (b) 단일 트랜스진 후보 내의 다양한 조절 요소 및 트랜스진 설계의 영향을 비교하기가 어려움 (게놈 내로의 무작위 통합에 의해 이러한 비교가 복잡해지기 때문). 결과적으로, 통상의 식물 형질 조작은 성공의 확률이 낮은 노동 및 비용 집약적 방법이다.
정밀 유전자 변형은 식물계에서 통상의 실시에서의 보급에 관련한 과제를 극복하며, 그 자체는 기본적인 식물 생물학 연구와 농업 생명공학 둘 다에서 오래 지속되어 온 달성하기 힘든 목표였다. 그러나, 벼에서의 양성-음성 약물 선택을 통한 "유전자 표적화" 또는 사전-조작된 제한 부위를 사용하는 경우를 제외하고는, 모델과 작물 둘 다의 모든 식물 종에서 표적화된 게놈 변형은 최근까지 극히 어려운 것으로 입증되어 있다. Terada et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10):1030; Terada et al. (2007) Plant Physiol 144(2):846; D'Halluin et al. (2008) Plant Biotechnology J. 6(1):93.
최근에, 게놈 DNA의 표적화된 절단을 위한 방법 및 조성물이 기재된 바 있다. 이러한 표적화 절단 이벤트를 이용하여, 예를 들어 표적화 돌연변이유발을 유도하고, 세포 DNA 서열의 표적화 결실을 유도하며, 미리 결정된 염색체 유전자좌에서의 표적화 재조합 및 통합을 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Urnov et al. (2010) Nature 435(7042):646-51]; 미국 특허 번호 8,586,526; 8,586,363; 8,409,861; 8,106,255; 7,888,121; 8,409,861 및 미국 특허 공개 20030232410; 20050026157; 20090263900; 20090117617; 20100047805; 20100257638; 20110207221; 20110239315; 20110145940을 참조하며, 이들 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 포함된다. 절단은 특정 뉴클레아제, 예컨대 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)의 사용, 또는 특정 절단을 유도하도록 조작된 crRNA/tracr RNA ('단일 가이드 RNA')를 사용한 CRISPR/Cas 시스템의 이용을 통해 발생할 수 있다. 미국 특허 공개 번호 20080182332에는 식물 게놈의 표적화된 변형을 위한 비-정규 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)의 사용이 기재되어 있고; 미국 특허 번호 8,399,218에는 식물 EPSPS 유전자좌의 ZFN-매개 표적화된 변형이 기재되어 있고; 미국 특허 번호 8,329,986에는 식물 Zp15 유전자좌의 표적화된 변형이 기재되어 있고, 미국 특허 번호 8,592,645에는 지방산 생합성에 관여하는 식물 유전자의 표적화된 변형이 기재되어 있다. 또한, 문헌 [Moehle et al. (2007) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 104(9):3055-3060]에는 명시된 유전자좌에서의 표적화된 유전자 부가를 위해 설계된 ZFN을 사용하는 것이 기재되어 있다. 미국 특허 공개 20110041195에는 동형접합 이배체 유기체의 제조 방법이 기재되어 있다.
트랜스진 (또는 형질) 스택킹은 식물의 생산에 있어서 큰 잠재성을 갖지만, 어려운 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌 [Halpin (2005) Plant Biotechnology Journal 3:141-155]을 참조한다. 또한, 유기체가 2개 이상의 중복된 (동질배수체) 또는 관련된 (이질배수체) 쌍을 이루는 세트의 염색체를 갖는 다배수는 동물에서보다 식물 종에서 보다 종종 발생한다. 예를 들어, 밀은 이배체 (2개 세트의 염색체), 사배체 (4개 세트의 염색체) 및 육배체 (6개 세트의 염색체)인 식물주를 갖는다. 추가로, 브라시카(Brassica) 속의 다수의 농업상 중요한 식물이 또한 이질사배체이다.
따라서, 식물 및 그의 자손에서 안정한 유전성 유전자 변형을 확립하기 위해, 다배수체 식물의 다양한 게놈에 걸친 다수의 대립유전자의 동시 변형을 비롯하여, 식물 게놈 내의 정확한 위치 내로의 안정한 표적화 통합의 확인, 선택 및 신속한 진행을 위한 조성물 및 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
본 개시내용은 식물에서의 정밀 형질전환, 유전자 표적화, 표적화된 게놈 변형 및 단백질 발현을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 개시내용은 식물 게놈 내의 내인성 유전자좌 (예를 들어, 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자좌)에서의 선택차를 이용하는, 외인성 서열을 통합시키고 형질을 스택킹하기 위한 신규, 트랜스제닉 마커-미사용 전략을 개시한다. 상기 전략은 내인성 식물 유전자좌, 예를 들어 하나 이상의 AHAS 파라로그에 정확하게 위치된 하나 이상의 트랜스진 (또는 하나 이상의 관심 유전자 (GOI), 여기서 트랜스진은 트랜스제닉 선택 마커 유전자를 포함하지 않음)을 갖는 식물의 생성을 용이하게 한다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 다배수체 식물 종의 다수의 게놈에 걸친 다수의 대립유전자의 동시 편집을 포함하여, 식물 게놈 내의 정확히 동일한 게놈 위치에서의 병행 및 순차적 트랜스진 스택킹 둘 다를 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 내인성 유전자의 외인성 트랜스제닉 선택 마커-미사용 선택 및/또는 게놈 변형을 허용하며, 여기서 게놈 변형은 (예를 들어, 내인성 유전자에서의 공지된 돌연변이, 예컨대 군 B 제초제 또는 ALS 억제제 제초제, 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아에 대한 내성을 부여하는 AHAS 유전자에서의 공지된 돌연변이를 이용함으로써) 내인성 유전자가 제초제 내성 식물을 발생시키는 생성물을 생산하도록 내인성 유전자에서 돌연변이를 일으킨다. 또한, 이들 트랜스진-스택킹 및/또는 동시-변형 대립유전자를 포함하는 세포 (예를 들어, 종자), 세포주, 유기체 (예를 들어, 식물) 등이 제공된다. 표적화된 게놈 편집 (삽입, 결실, 돌연변이, 트랜스진 스택킹)은 예를 들어 증가된 작물 수확량, 질병 저항성을 코딩하는 단백질, 성장을 증가시키는 단백질, 곤충 저항성을 코딩하는 단백질, 제초제 내성을 코딩하는 단백질 등을 유도할 수 있다. 증가된 수확량은 예를 들어 증가된 양의 과일 및 곡물 수확량, 식물 (또는 식물의 과일 또는 곡물)의 증가된 바이오매스, 보다 높은 함량의 과육, 보다 큰 식물, 증가된 건조 중량, 증가된 고형물 함량, 수확시 보다 높은 총 중량, 작물 색상의 증강된 강도 및/또는 균일성, 변경된 화학 (예컨대, 오일, 지방산, 탄수화물, 단백질) 특성 등을 포함할 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 식물 유전자의 하나 이상의 내인성 대립유전자에서의 정확한, 게놈 변형 (예를 들어, 트랜스진 스택킹)을 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 특정 실시양태에서, 트랜스진(들)은 식물 게놈 (예를 들어, 다배수체 식물)의 내인성 유전자좌 내로 통합된다. 트랜스진 통합은 병행 (하나 이상의 트랜스진의 하나 이상의 대립유전자 내로의 동시 통합) 또는 순차적일 수 있는 다수의 트랜스진의 통합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진은 트랜스제닉 마커를 포함하지 않지만, 형질을 포함하는 트랜스진의 통합시에, 예를 들어 트랜스진이 발현되고 AHAS 유전자좌가 변형되어 제초제 내성 (예를 들어, 군 B 제초제 또는 ALS 억제제 제초제, 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아)을 변경시키도록 하는 내인성 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자좌 (예를 들어, AHAS 유전자좌의 3' 비번역 영역) 내로의 트랜스진(들)의 통합시에 변형되는 내인성 유전자좌 내로 통합된다. 트랜스진(들)은 하나 이상의 비-자연 발생 뉴클레아제, 예를 들어 아연 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템 (조작된 단일 가이드 RNA 사용)을 이용하여 표적화 방식으로 통합된다. 트랜스진은 하나 이상의 코딩 서열 (예를 들어, 단백질), 비-코딩 서열을 포함할 수 있고/거나 하나 이상의 RNA 분자 (예를 들어, mRNA, RNAi, siRNA, shRNA 등)를 생산할 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스진 통합은 동시 (병행) 통합이다. 다른 실시양태에서, 하나 이상 트랜스진 (GOI)의 순차적 통합은, 예를 들어 AHAS 유전자좌에 의해, 다양한 제초제 (군 B 또는 ALS 억제제 제초제, 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아) 화학 선택제와 이들 특정 제초제에 대한 내성을 부여하는 공지된 AHAS 돌연변이 사이의 교대에 의해 달성된다. 또한, 본원에 기재된 임의의 식물 세포는 하나 이상의 추가의 트랜스진을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 추가의 트랜스진은 트랜스진 스택킹을 위한 표적 대립유전자(들)와는 상이한 유전자좌 (또는 상이한 유전자좌들)에서 게놈 내로 통합된다. 따라서, 다수의 내인성 유전자좌가 본원에 기재된 세포 내에 통합된 트랜스진을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 다양한 게놈 (서브-게놈)에 걸쳐 하나 이상의 유전자의 다수의 대립유전자가 동시에 변형된 다배수체 식물 세포가 본원에 개시된다. 표적화 변형은 다배수체 식물에서 유전자 활성 (예를 들어, 내인성 유전자 활성 및/또는 통합된 트랜스진의 활성)을 증진시키거나 감소시킬 수 있다 (예를 들어 제초제 내성을 변경시키는 (예를 들어, 증가시키는) AHAS에서의 돌연변이).
특정 실시양태에서, 다배수체 식물 세포에서 표적화된 게놈 변형은 indel로도 공지되어 있는 작은 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 식물 세포는 식물 또는 식물 부분 (예를 들어, 종자, 꽃, 과일), 예를 들어 밀, 대두, 옥수수, 감자, 알팔파, 벼, 보리, 해바라기, 토마토, 아라비돕시스(Arabidopsis), 목화, 브라시카(Brassica) 종 (비. 나푸스(B. napus), 비. 라파(B. rapa), 비. 올레라세아(B. oleracea), 비. 니그라(B. nigra), 비. 준세아(B. juncea), 비. 카리나타(B. carinata)), 브라키포디움(Brachypodium), 티모시 그래스 등 중 임의의 품종 내에 있 수 있다.
또 다른 측면에서, 제초제 내성에 관여하는 유전자, 예를 들어 AHAS 유전자에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 단백질 (ZFP))이 본원에 기재된다. 아연 핑거 단백질은 하나 이상의 아연 핑거 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아연 핑거)를 포함할 수 있으며, 조작되어 다배수체 식물 게놈 내의 임의의 서열에 결합될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 아연 핑거 단백질은 표적 유전자의 코딩 서열 내의 또는 인접한 서열 (예를 들어, 프로모터 또는 다른 발현 요소) 내의 표적 부위에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아연 핑거 단백질은 AHAS 유전자 내의 표적 부위, 예를 들어 표 3 및 표 13에 나타낸 표적 서열에 결합한다. 예시적인 AHAS-결합 아연 핑거의 인식 나선 영역은 표 2 및 표 12에 제시된다. 아연 핑거 단백질의 하나 이상의 성분 아연 핑거 결합 도메인은 정규 (C2H2) 아연 핑거 또는 비-정규 (예컨대, C3H) 아연 핑거일 수 있다 (예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단 아연 핑거가 비-정규 핑거일 수 있음).
또 다른 측면에서, 융합 단백질이 본원에 개시되며, 각각의 융합 단백질은 다배수체 식물 게놈 내의 유전자의 다수의 대립유전자에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 단백질)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단백질은 아연 핑거 단백질 및 기능적 도메인, 예를 들어 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인 및/또는 절단 도메인(또는 절단 절반-도메인)을 포함하는 융합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 융합 단백질은 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)이다. 절단 도메인 및 절단 절반 도메인은, 예를 들어 다양한 제한 엔도뉴클레아제 및/또는 귀소 엔도뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 한 실시양태에서, 절단 절반-도메인은 유형 IIS 제한 엔도뉴클레아제 (예를 들어, Fok I)로부터 유래된다.
다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 DNA-결합 도메인 및/또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본원에 기재된 하나 이상의 DNA-결합 도메인 및/또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 본원에 기재된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 융합 단백질은 ZFN이다.
DNA-결합 도메인 및 이들 DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질은 유전자의 코딩 영역 내, 또는 유전자 내의 또는 이에 인접한 비-코딩 서열, 예컨대 예를 들어 리더 서열, 트레일러(trailer) 서열 또는 인트론, 또는 프로모터 서열 내, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류의 비-전사 영역, 예를 들어 3' 비번역 영역 내에서 다배수체 게놈 내의 2개 이상의 내인성 유전자 (예를 들어, AHAS 유전자)에 결합하고/거나 이를 절단한다. 특정 실시양태에서, DNA-결합 도메인 및/또는 융합 단백질은 표적 유전자의 코딩 서열 또는 조절 서열에 결합하고/거나 이를 절단한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 하나 이상의 단백질, 융합 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 다배수체 식물 세포는 다수의 게놈 대립유전자 표적을 함유한다. 따라서, 본원에 기재된 조성물은 다배수체 식물 세포의 다수의 게놈 (서브-게놈으로도 지칭됨)에 존재하는 다수의 대립유전자를 표적화하는 (및 동시에 변형시키는) 하나 이상의 DNA-결합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)을 포함할 수 있다. DNA-결합 단백질은 모든 유전자 (파라로그), 하나의 또는 다수의 (그러나 전체 미만) 선택된 대립유전자를 표적화할 수 있다.
또 다른 측면에서, 다배수체 식물의 다수의 대립유전자가 변경되도록 세포에서 하나 이상의 DNA-결합 도메인 단백질 (예를 들어, 아연 핑거 단백질 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제)을 발현시키는 것을 포함하는, 다배수체 식물 세포의 다수의 게놈에 걸쳐 다수의 대립유전자를 동시에 변경시키는 방법이 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, AHAS의 발현이 변경되도록 세포에서 하나 이상의 DNA-결합 도메인 함유 단백질 (예를 들어, 아연 핑거 단백질)을 발현시키는 것을 포함하는, 식물 세포에서 하나 이상의 AHAS 유전자의 발현을 변경시키는 것이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 내인성 유전자 발현을 교란시키는 작은 삽입 및/또는 결실 ("indel")을 생성하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 한 쌍의 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 예를 들어 내인성 유전자 (예를 들어, 공여자 서열, GOI 또는 트랜스진) 또는 발현 증강 요소의 표적화된 삽입을 통해 유전자 발현을 증강시키는 것을 포함한다. 변경된 유전자 발현/기능은 식물 세포에서 증가된 광합성, 증가된 제초제 내성 및/또는 성장 변형을 일으킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 유전자 (예를 들어 AHAS)의 다수의 대립유전자의 변경된 발현 및 그에 대한 변형을 검출하고/거나 측정하기 위한 핵산 및 항체, 및 이를 사용하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 다배수체 식물 세포 내의 하나 이상의 내인성 유전자를 동시에 변형시키기 위한 방법이 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 (a) 뉴클레아제가 하나 이상의 내인성 유전자를 절단하도록 하는 조건 하에 하나 이상의 유전자 내의 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 뉴클레아제 (예를 들어, ZFN, TALEN, 메가뉴클레아제 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)를 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 다배수체 식물 세포 내로 도입시킴으로써, 하나 이상의 내인성 (예를 들어, AHAS) 유전자를 변형시키는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 예를 들어 다배수체 식물에서, 내인성 유전자의 하나 초과의 대립유전자가 절단된다. 다른 실시양태에서, 하나 초과의 내인성 유전자의 하나 이상의 대립유전자가 절단된다. 또한, 본원에 기재된 임의의 방법에서, 하나 이상의 유전자의 절단은 절단 영역 내의 뉴클레오티드의 결실, 부가 및/또는 치환을 생성하여, 예를 들어 AHAS 활성이 변경 (예를 들어, 증진 또는 감소)되도록 함으로써, 예를 들어 변형된 내인성 유전자에서의 또는 그 부근에서의 트랜스진 통합의 평가를 가능하게 할 수 있다.
또 다른 측면에서, (a) 세포를 하나 이상의 외인성 서열 (예를 들어, 공여자 벡터, 트랜스진 또는 GOI 또는 이들의 조합)과 접촉시키는 단계; 및 (b) 세포에서 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제 (예를 들어, ZFN, TALEN, 메가뉴클레아제 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 뉴클레아제는 단계 (b)에서의 염색체 DNA의 절단이 상동 재조합에 의해 게놈 내로의 외인성 서열의 혼입을 자극하도록 염색체 DNA를 절단하는 것인, 하나 이상의 외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내로 도입시키는 방법이 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 염색체 DNA는 염색체 서열 (예를 들어, 내인성 유전자)이 돌연변이되어 선택 표현형 (예를 들어, 제초제 내성)을 생산하는 생성물을 발현하도록 변형된다. 다수의 외인성 서열은 동시에 (병행) 통합될 수 있거나, 또는 단계는 트랜스진의 순차적 부가 (트랜스진 스택킹)를 위해 반복될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 트랜스진은 AHAS 유전자, 예를 들어 3' 비번역 영역 내에 도입된다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 하나 이상의 뉴클레아제는 뉴클레아제 (절단) 도메인 (예를 들어, 유형 IIs 제한 엔도뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제의 절단 도메인)과 조작된 아연 핑거 결합 도메인 사이의 융합체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 TAL 이펙터 도메인, 귀소 엔도뉴클레아제 및/또는 Crispr/Cas 단일 가이드 RNA를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 외인성 서열은 단백질 생성물을 코딩하고/거나 RNA 분자를 생산할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 외인성 서열은, 외인성 서열(들)이 삽입된 내인성 유전자좌가 변형되어 하나 이상의 측정가능한 표현형 또는 마커 (예를 들어, 내인성 AHAS의 돌연변이에 의한 제초제 내성)를 생산하도록 통합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 식물 세포 내의 내인성 유전자의 하나 이상의 대립유전자에 대한 표적화된 게놈 변형을 포함하며, 여기서 게놈 변형은 부위 특이적 뉴클레아제에 의한 절단을 따르고 게놈 변형은 내인성 유전자가 제초제 내성 식물 세포를 발생시키는 생성물을 생산하도록 내인성 유전자에서 돌연변이를 생산하는 것인, 식물 세포가 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 게놈 변형은 하나 이상의 외인성 서열의 통합을 포함한다. 추가 실시양태에서, 게놈 변형은 내인성 유전자를 돌연변이시키는 하나 이상의 indel의 도입을 포함한다. 추가 실시양태에서, 게놈 변형을 갖는 내인성 유전자는 술포닐우레아 제초제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩한다. 한 실시양태에서, 게놈 변형을 갖는 내인성 유전자는 이미다졸리논 제초제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩한다. 추가 실시양태에서, 외인성 서열은 트랜스제닉 선택 마커를 코딩하지 않는다. 추가 실시양태에서, 외인성 서열은 작물 수확량을 증가시키는 단백질, 질병 저항성을 코딩하는 단백질, 성장을 증가시키는 단백질, 곤충 저항성을 코딩하는 단백질, 제초제 내성을 코딩하는 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩한다. 후속 실시양태에서, 증가된 작물 수확량은 과일 수확량, 곡물 수확량, 바이오매스, 과육 함량, 크기, 건조 중량, 고형분 함량, 중량, 색상 강도, 색상 균일성, 변경된 화학적 특성 또는 이들의 조합에서의 증가를 포함한다. 특정 실시양태에서, 내인성 유전자는 내인성 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자이다. 추가 실시양태에서, 2개 이상 외인성 서열이 내인성 유전자 내로 통합된다. 추가 측면에서, 식물 세포는 다배수체 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 FokI 절단 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 아연 핑거 DNA-결합 도메인은 서열 35-56 및 263-278로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 부위에 결합하는 단백질을 코딩한다. 추가 실시양태에서, 식물은 밀, 대두, 옥수수, 감자, 알팔파, 벼, 보리, 해바라기, 토마토, 아라비돕시스, 목화, 브라시카 종 및 티모시 그래스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 식물 세포 내의 내인성 유전자의 하나 이상의 대립유전자에 대한 표적화된 게놈 변형을 포함하는 하나 이상의 식물 세포를 포함하며, 여기서 게놈 변형은 부위 특이적 뉴클레아제에 의한 절단을 따르고 게놈 변형은 내인성 유전자가 제초제 내성 식물 세포를 발생시키는 생성물을 생산하도록 내인성 유전자에서 돌연변이를 생산하는 것인, 식물, 식물 부분, 종자 또는 과일이 본원에 개시된다.
또 다른 측면에서, 식물 세포에서 하나 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 발현시키는 단계; 및 다배수체 식물 세포의 다수의 게놈에 걸쳐 내인성 유전자의 하나 이상의 대립유전자를 변형시키는 단계를 포함하는, 본원에 상기 개시된 바와 같은 식물 세포를 제조하는 방법이 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 내인성 유전자는 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자이다. 추가 실시양태에서, 변형은 내인성 유전자의 발현을 교란시킨다. 또 다른 실시양태에서, 변형은 내인성 유전자의 하나 이상의 대립유전자 내로의 하나 이상의 외인성 서열의 통합을 포함한다. 또한, 상기 방법에 의해 생산된 하나 이상의 식물 세포를 포함하는 식물, 식물 부분, 종자 또는 과일이 본 개시내용의 측면으로서 본원에 개시된다.
또 다른 측면에서, 서열 35-56 및 263-278로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 부위에 결합하는 아연 핑거 단백질이 본원에 개시된다. 추가 실시양태에서, 아연 핑거 단백질은 표 2 또는 표 12의 단일 열에 나타낸 인식 나선 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서, 식물 세포에서 하나 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 발현시키고, 여기서 하나 이상의 뉴클레아제는 하나 이상의 내인성 유전자좌의 염색체 DNA를 표적화하고 절단하는 것인 단계; 하나 이상의 외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내의 하나 이상의 내인성 유전자좌 내로 통합시키고, 여기서 하나 이상의 내인성 유전자좌는 내인성 유전자가 돌연변이되어 식물 세포에서 선택 표현형을 발생시키는 생성물을 발현하도록 변형되는 것인 단계; 및 선택 표현형을 발현하는 식물 세포를 선택하고, 여기서 하나 이상의 외인성 서열이 혼입된 식물 세포를 선택하는 것인 단계를 포함하는, 하나 이상의 외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법이 본원에 기재된다. 추가 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 서열은 공여자 폴리뉴클레오티드, 트랜스진 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 후속 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 서열의 통합은 상동 재조합 또는 비-상동 말단 연결에 의해 일어난다. 추가 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 서열은 하나 이상의 내인성 유전자좌 내로 동시에 또는 순차적으로 혼입된다. 추가 실시양태에서, 하나 이상의 내인성 유전자좌는 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, AHAS 유전자는 다배수 게놈의 A, B 또는 D 게놈 상에 위치한다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 서열은 AHAS 유전자 내로 통합된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 서열은 S653N AHAS 돌연변이를 코딩한다. 추가 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 서열은 P197S AHAS 돌연변이를 코딩한다. 후속 실시양태에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 Crispr/Cas 단일 가이드 RNA 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 부위 특이적 뉴클레아제는 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 FokI 절단 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 서열은 트랜스진을 코딩하거나, 또는 RNA 분자를 생산한다. 후속 실시양태에서, 트랜스진은 작물 수확량을 증가시키는 단백질, 질병 저항성을 코딩하는 단백질, 성장을 증가시키는 단백질, 곤충 저항성을 코딩하는 단백질, 제초제 내성을 코딩하는 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩한다. 추가 실시양태에서, 트랜스진의 통합은, 하나 이상의 내인성 유전자좌의 발현을 교란시키고 선택 표현형을 생산하는 하나 이상의 indel의 도입을 추가로 포함한다. 방법의 후속 실시양태는 하나 이상의 외인성 서열을 포함하는 선택된 식물 세포를 배양하는 단계; 및 식물 게놈의 하나 이상의 내인성 유전자좌 내에 통합된 하나 이상의 외인성 서열을 포함하는 전체 식물을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 선택제를 포함하는 선택제가 식물 세포를 선택하는데 사용된다. 다른 실시양태에서, 식물 게놈의 하나 이상의 내인성 유전자좌 내에 통합된 하나 이상의 외인성 서열을 포함하는 전체 식물은 식물 게놈의 내인성 유전자좌 내에 추가의 외인성 서열을 혼입시키기 위해 추가로 변형된다. 추가 실시양태에서, 하나 이상의 외인성 서열은 트랜스제닉 선택 마커를 코딩하지 않는다.
추가 측면에서, 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 수득된 식물 세포가 또한 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 식물 세포를 포함하는 식물이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같이 수득된 식물 세포를 포함하는 식물로부터의 종자가 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같이 수득된 식물 세포를 포함하는 식물로부터 수득된 과일이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 임의의 조성물 (세포 또는 식물) 또는 방법에서, 식물 세포는 단자엽 식물 세포 또는 쌍자엽 식물 세포를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 식물 세포는 작물 식물, 예를 들어 밀, 토마토 (또는 다른 과일 작물), 감자, 옥수수, 대두, 알팔파 등이다.
도 1은 pDAB109350의 플라스미드 지도이다.
도 2는 pDAB109360의 플라스미드 지도이다.
도 3은 pDAS000132의 플라스미드 지도이다.
도 4는 pDAS000133의 플라스미드 지도이다.
도 5는 pDAS000134의 플라스미드 지도이다.
도 6은 pDAS000135의 플라스미드 지도이다.
도 7은 pDAS000131의 플라스미드 지도이다.
도 8은 pDAS000153의 플라스미드 지도이다.
도 9는 pDAS000150의 플라스미드 지도이다.
도 10은 pDAS000143의 플라스미드 지도이다.
도 11은 pDAS000164의 플라스미드 지도이다.
도 12는 pDAS000433의 플라스미드 지도이다.
도 13은 pDAS000434의 플라스미드 지도이다.
도 14, 패널 a 및 b는 ZFN-매개, NHEJ-유도 DNA 복구를 이용한 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum)의 밀 게놈 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 외인성 마커-미사용, 순차적 트랜스진 스택킹을 도시하는 개략도이다. 도 14a는 제1 트랜스진 스택을 도시하고; 도 14b는 제2 트랜스진 스택을 도시한다.
도 15, 패널 a 및 b는 ZFN-매개, HDR-유도 DNA 복구를 이용한 트리티쿰 아에스티붐의 밀 게놈 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 외인성 마커-미사용, 순차적 트랜스진 스택킹을 도시하는 개략도이다. 도 15a는 제1 트랜스진 스택을 도시하고; 도 15b는 제2 트랜스진 스택을 도시한다.
도 16은 pDAS000435의 선형 지도를 보여주는 개략도이다.
도 17은 pDAS000436의 선형 지도를 보여주는 개략도이다.
도 18은 pDAS0000004의 플라스미드 지도이다.
도 19는 QA_pDAS000434의 플라스미드 지도이다.
본 개시내용은 다배수체 식물을 비롯한 식물 종에서의 외인성 서열 통합, 예를 들어 병행 (동시) 또는 순차적 외인성 서열 통합 (트랜스진 스택킹을 포함)을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 통합을 평가하기 위한 외인성 트랜스제닉 마커의 사용 없이 표적화 통합을 선택된 유전자좌에 제공하는데 유리하다. 특히, 트랜스제닉 마커-미사용 공여자 설계에 의한 내인성 유전자좌에서의 선택차는 회수된 비정규 통합 이벤트의 수를 감소시킴으로써 표적화된 트랜스제닉 이벤트에 대한 선택을 편중시키는 것으로 입증되었다 (Shukla et al. (2009) Nature 459(7245):437-41). 또한 본 개시내용은 내인성 유전자좌의 게놈 변형 (예를 들어, 돌연변이)에 관한 것이며, 상기 돌연변이는 마커 (표현형)로서의 역할을 하는 생성물의 생산을 유도할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 내인성 유전자좌 내로의 외인성 서열 통합, 예를 들어 트랜스진 스택킹을 제공하며, 상기 내인성 유전자는 통합에 대한 마커로서의 역할을 할 수 있다 (예를 들어, 단일 돌연변이가 제초제 내성을 부여할 수 있는 AHAS 유전자좌).
외인성 서열(들)의 (예를 들어, AHAS 유전자좌 내로의) 통합은 내인성 서열의 표적화된 이중-가닥 절단에 의해, 예를 들어 3' 비번역 영역에 위치한 서열의 절단에 의해 용이해진다. DNA-결합 도메인, 예컨대 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인, 류신 지퍼 DNA-결합 도메인, TAL DNA-결합 도메인, 아연 핑거 단백질 (ZFP)을 포함하는 융합 단백질의 사용을 통해; 또는 Crispr/Cas RNA 또는 상기 언급된 것들의 키메라 조합의 사용을 통해 절단은 상기 영역에 대해 표적화된다. 이러한 절단은 내인성 절단 부위에서의 또는 그 부근에서의 공여자 핵산 서열(들)의 통합을 자극한다. 외인성 서열의 통합은 상동성-의존성 및 상동성-비의존성 메카니즘 둘 다를 통해 진행될 수 있고, 정확히 표적화된 이벤트의 선택은 정확하게 표적화된 이벤트에서만 기능적인 선택 마커 (예를 들어, 특정 군 B 제초제 또는 ALS 억제제 제초제 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아에 대한 내성)에 대한 스크리닝을 통해 달성된다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제(들)는 하나 이상의 ZFN, 하나 이상의 TALEN, 하나 이상의 메가뉴클레아제 및/또는 하나 이상의 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 포함한다. ZFN 및 TALEN은 전형적으로 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 및 아연 핑거 DNA 결합 또는 TALE-이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하고, 단백질로서, 이들 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 또는 폴리펩티드 및 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드의 조합으로서 도입될 수 있다. ZFN 및 TALEN은 절단 절반-도메인의 이량체화 후에 이량체 단백질로서 기능할 수있다. 뉴클레아제 단량체가 "좌측" 및 "우측" 인식 도메인에 결합하는 절대 이종이량체 뉴클레아제는 회합되어 활성 뉴클레아제를 형성할 수 있는 것으로 기재된 바 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,623,618; 7,914,796; 8034,598을 참조한다. 따라서, 적절한 표적 부위가 주어졌을 때, "좌측" 단량체가 임의의 "우측" 단량체와 함께 활성 뉴클레아제를 형성할 수 있다. 이것은 다양한 조합으로 사용될 수 있는 입증된 우측 및 좌측 도메인에 기반한 유용한 뉴클레아제 부위의 수를 유의하게 증가시킨다. 예를 들어, 4개의 동종이량체 뉴클레아제의 결합 부위의 재조합으로 추가적인 12개의 이종이량체 뉴클레아제를 얻는다. 보다 중요하게는, 이는 트랜스제닉 설계에 대한 체계적인 접근을 가능하게 하며, 이에 따라 모든 새로 도입된 서열은 방출된 유전자를 절제하거나 또는 그의 옆에 있는 추가적인 유전자를 표적화하기 위해 사용될 수 있는 독특한 뉴클레아제 결합 부위에 플랭킹되게 된다. 추가적으로, 이 방법은 뉴클레아제-의존적 이중-가닥 파괴에 의해 유도되는 단일 유전자좌 내로의 스택킹 전략을 단순화시킬 수 있다.
아연 핑거 결합 도메인은 정규 (C2H2) 아연 핑거 또는 비-정규 (예컨대, C3H) 아연 핑거일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20080182332를 참조한다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아연 핑거)를 포함할 수 있고, 조작되어 임의의 내인성 유전자, 예를 들어 AHAS 유전자 내의 임의의 서열에 결합될 수 있다. 이러한 융합 단백질 (또는 단백질들)이 세포에 존재하면, 융합 단백질(들)이 그의 (그들의) 결합 부위(들)에 결합하고, 표적 유전자(들) 내에서 절단된다.
일반사항
본원에 개시된 방법의 실행, 뿐만 아니라 조성물의 제조 및 사용은, 달리 나타내지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 속하는 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야에서의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 및 2001년의 제3판; [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987] 및 주기적 최신판; [the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego]; [Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999]; 및 [METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999]를 참조한다.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 선형 또는 원형 입체형태, 및 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 용어들은 중합체의 길이와 관련하여 제한적으로 해석되지 않아야 한다. 이러한 용어들은 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체, 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티 (예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 염기쌍을 형성하는 특이성이 동일하고, 즉 A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 거대분자들 사이의 (예를 들어, 단백질과 핵산 사이의) 서열-특이적인 비-공유결합 상호작용을 지칭한다. 전체로서의 상호작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요는 없다 (예를 들어, DNA 백본 내의 포스페이트 잔기와의 접촉). 상기 상호작용은 일반적으로 10-6 M-1 이하의 해리 상수 (Kd)에 의해 특성화된다. "친화도"는 결합 강도를 지칭하고, 결합 친화도의 증가는 보다 낮은 Kd와 상관성이 있다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자와 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 이는 자신에게 결합할 수 있고/거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성), 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한가지를 초과하는 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은, 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약기된다.
"TALE DNA 결합 도메인" 또는 "TALE"은 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩티드이다. 반복 도메인은 TALE의 그의 동족 표적 DNA 서열에 대한 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위" ("반복부"로도 지칭됨)는 전형적으로 33-35개 아미노산이고, DNA-결합 특이성에 관여하는 반복 가변 이잔기 (RVD)로도 지칭되는 위치 12 및/또는 13에서의 초가변 이잔기를 포함한다. TALE 반복부는 자연 발생 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부의 서열 상동성을 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,586,526을 참조한다.
아연 핑거 결합 및 TALE 도메인은 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 아연 핑거 단백질의 조작 방법의 비-제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 아연 핑거 단백질은 합리적인 기준으로부터 주로 설계/조성되는, 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준은 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보가 저장된 데이터베이스 내의 정보를 프로세싱하기 위한 전산화된 알고리즘 및 치환 규칙의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261을 참조하며; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496을 참조한다.
"선택된" 아연 핑거 단백질 또는 TALE는 그의 생산이 주로 실험 처리, 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택에 의해 이루어지는, 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, U.S. 8,586,526, U.S. 5,789,538; U.S. 5,925,523; U.S. 6,007,988; U.S. 6,013,453; U.S. 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197 및 WO 02/099084를 참조한다.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 선형, 원형 또는 분지형일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "공여자 서열"은 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예컨대 2 내지 10,000개 뉴클레오티드 (또는 그 사이의 또는 그 초과의 임의의 정수 값)의 길이, 바람직하게는 약 100 내지 1,000개 뉴클레오티드 (또는 그 사이의 임의의 정수) 길이, 보다 바람직하게는 약 200 내지 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
"동일하지 않은 상동성 서열"은 제2 서열과 어느 정도의 서열 동일성을 공유하지만, 제2 서열과 서열이 동일하지 않은 제1 서열을 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이체 유전자의 서열에 대해 상동성이고 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 2개의 서열 사이의 상동성의 정도는 일반적인 세포 메카니즘을 사용하여 이들 사이에 상동 재조합이 일어나도록 하기에 충분하다. 2개의 동일하지 않은 상동성 서열은 임의의 길이일 수 있고, 그의 비-상동성 정도는 단일 뉴클레오티드만큼 작을 수 있거나 (예를 들어, 표적화된 상동 재조합에 의한 게놈 점 돌연변이의 교정) 또는 10 이상의 킬로염기만큼 클 수 있다 (예를 들어, 염색체 내의 미리 결정된 이소성 부위에서의 유전자 삽입). 동일하지 않은 상동성 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드는 길이가 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 20 내지 10,000개 사이의 외인성 폴리뉴클레오티드 (즉, 공여자 폴리뉴클레오티드)가 사용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것 및/또는 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하는 것, 및 이러한 서열을 제2의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열을 또한 이러한 방식으로 결정하여 비교할 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 지칭한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)을 이들의 퍼센트 동일성을 결정함으로써 비교할 수 있다. 2개의 서열 (핵산 또는 아미노산 서열)의 퍼센트 동일성은 정렬된 2개의 서열들 사이의 정확한 매치의 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열들에 대한 대략적인 정렬은 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국부 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]에서 개발된 스코어링 매트릭스를 이용함으로써 아미노산 서열에 적용할 수 있고, 문헌 [Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 정규화될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 실행이 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; 위스콘신주 매디슨)에 의해 "BestFit" 유틸리티 애플리케이션에서 제공된다. 서열 사이의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하는데 적합한 프로그램은 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어 또 다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터와 함께 사용되는 BLAST이다. 예컨대, 다음 디폴트 파라미터를 사용하여 BLASTN 및 BLASTP를 이용할 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = 블로섬62(BLOSUM62) (BLASTP의 경우); 설명 = 50개 서열; 분류 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복, 진뱅크(GenBank) + EMBL + DDBJ + PDB + 진뱅크 CDS 번역 + 스위스(Swiss) 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세정보는 인터넷에서 찾아볼 수 있다. 본원에 기재된 서열에 관하여, 목적하는 정도의 서열 동일성의 범위는 대략 80% 내지 100%, 및 그 사이의 임의의 정수 값이다. 전형적으로, 서열 사이의 퍼센트 동일성은 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 보다 바람직하게는 85-90%, 보다 더 바람직하게는 92%, 보다 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.
대안적으로, 상동성 영역들 사이에 안정한 듀플렉스가 형성되도록 하는 조건 하에 폴리뉴클레오티드들을 혼성화시킨 후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)로 소화시키고, 소화된 단편들의 크기를 결정함으로써 폴리뉴클레오티드들 사이의 서열 유사성 정도를 결정할 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩티드 서열들은, 상기의 방법들을 사용하여 결정했을 때 서열들이 적어도 약 70%-75%, 바람직하게는 80%-82%, 보다 바람직하게는 85%-90%, 보다 더 바람직하게는 92%, 보다 더욱 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성을 나타내는 경우, 서로에 대해 실질적으로 상동성이다. 본원에서 사용된 실질적인 상동성은 특정 DNA 또는 폴리펩티드 서열에 완전한 동일성을 나타내는 서열을 또한 지칭한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열이, 예를 들어 특정 시스템에 대해 규정된 바와 같은 엄격한 조건 하에, 서던 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건의 규정은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook et al.]; 문헌 [Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press]을 참조한다.
2개의 핵산 단편의 선택적인 혼성화를 하기와 같이 결정할 수 있다. 2개의 핵산 분자 사이의 서열 동일성 정도는 이러한 분자들 사이의 혼성화 이벤트의 효율 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자에 대한 완전히 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로 억제할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화를 억제하는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 혼성화 검정 (예를 들어, 서던 (DNA) 블롯, 노던 (RNA) 블롯, 용액 혼성화 등, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)을 이용하여 평가할 수 있다. 다양한 정도의 선택성을 사용하여, 예를 들어 낮은 엄격도에서 높은 엄격도까지 다양한 조건을 사용하여, 이러한 검정을 수행할 수 있다. 낮은 엄격도의 조건이 사용된 경우, 부분적인 정도의 서열 동일성도 없는 2차 프로브 (예를 들어, 표적 분자와의 서열 동일성이 약 30% 미만인 프로브)를 사용하여 비-특이적 결합의 부재를 평가할 수 있고, 이때 비-특이적 결합 이벤트의 부재 하에 2차 프로브는 표적에 혼성화하지 않을 것이다.
혼성화-기반 검출 시스템을 사용하는 경우, 참조 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브가 선택된 후, 적절한 조건의 선택에 의해 프로브 및 참조 서열이 선택적으로 서로 혼성화 또는 결합하여, 듀플렉스 분자를 형성한다. 전형적으로, 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건 하에 참조 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는, 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 약 70%의 서열 동일성을 갖는 적어도 약 10-14개 뉴클레오티드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 허용하는 조건 하에 혼성화한다. 전형적으로, 엄격한 혼성화 조건은 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90-95% 초과의 서열 동일성을 갖는 적어도 약 10-14개 뉴클레오티드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 허용한다. 프로브와 참조 서열이 특정 정도의 서열 동일성을 갖는 경우, 프로브/참조 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B. D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조).
혼성화 조건은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 혼성화 엄격도는 혼성화 조건이 미스매칭된 뉴클레오티드들을 함유하는 하이브리드의 형성을 거부하는 정도를 지칭하고, 엄격도가 높을수록 미스매칭된 하이브리드에 대한 허용이 낮아진다. 혼성화의 엄격도에 영향을 미치는 인자들은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매 예컨대 포름아미드 및 디메틸술폭시드의 농도를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 혼성화 엄격도는 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록, 및 용매 농도가 낮을수록 증가된다.
혼성화에 대한 엄격도 조건과 관련하여, 예를 들어 하기 인자: 프로브 서열의 길이 및 특성, 다양한 서열의 염기 조성, 염 및 다른 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 내의 차단제 (예를 들어, 덱스트란 술페이트, 및 폴리에틸렌 글리콜)의 존재 또는 부재, 혼성화 반응 온도 및 시간 파라미터를 변화시킴으로써, 뿐만 아니라 세척 조건을 변화시킴으로써, 수많은 등가의 조건을 사용하여 특정 엄격도를 수립할 수 있다는 것이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 특정한 세트의 혼성화 조건의 선택은 관련 기술분야에서의 표준 방법에 따라 선택된다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오티드 사이의 유전자 정보의 교환 프로세스를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, "상동 재조합 (HR)"은, 예를 들어 세포 내에서의 이중-가닥 파괴의 복구 동안 일어나는, 특수화된 형태의 교환을 지칭한다. 이러한 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 요구하고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 파괴를 경험한 분자)의 주형 복구를 위해 "공여자" 분자를 사용하며, "비-교배 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"으로서 다양하게 공지되어 있는데, 이는 이로써 유전자 정보가 공여자로부터 표적으로 전이되기 때문이다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이기를 원치 않으면서, 이러한 전달에는 파괴된 표적과 공여자 사이에 형성된 헤테로듀플렉스 DNA의 미스매치 수정, 및/또는 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는데 공여자가 사용되는 "합성-의존성 가닥 어닐링", 및/또는 관련된 프로세스가 수반될 수 있다. 이러한 특수화된 HR로 표적 분자의 서열의 변경이 종종 초래되어, 공여자 폴리뉴클레오티드의 서열의 일부분 또는 전체가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 혼입된다.
"절단"은 DNA 분자의 공유결합 백본의 파괴를 지칭한다. 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 절단이 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단 및 이중 가닥 절단 둘 다가 가능하고, 이중 가닥 절단은 2개의 별도의 단일 가닥 절단 이벤트의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단으로 평활 말단 또는 엇갈림 말단이 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드가 표적화된 이중 가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 도메인"은 DNA 절단을 위한 촉매적 활성을 보유하는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 절단 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 내에 함유될 수 있거나, 절단 활성이 2개 (또는 그 초과)의 폴리펩티드의 회합으로부터 발생될 수 있다.
"절단 절반-도메인"은, 제2의 폴리펩티드 (동일하거나 상이함)와 함께, 절단 활성 (바람직하게는 이중 가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다.
"조작된 절단 절반-도메인"은 또 다른 절단 절반-도메인 (예를 들어, 또 다른 조작된 절단 절반-도메인)과 절대적 이종이량체를 형성하도록 변형된 절단 절반-도메인이다. 또한, 미국 특허 번호 7,914,796; 8,034,598; 8,623,618 및 미국 특허 공개 번호 2011/0201055를 참조하며, 이들 전문은 본원에 참조로 포함된다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산 (주로 DNA), 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 비롯한 단백질을 포함한다. 대다수의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하고, 이때 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 팔량체와 회합된 대략 150개 염기 쌍의 DNA를 포함하고, 링커 DNA (유기체에 따라 길이가 다양함)가 뉴클레오솜 코어들 사이에 연장된다. 히스톤 H1의 분자는 일반적으로 링커 DNA와 회합된다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 모든 유형의 세포 핵단백질 (원핵 및 진핵 둘 다)을 포함하도록 의도된다. 세포 염색질은 염색체 염색질 및 에피솜 염색질 둘 다를 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈 전체 또는 그의 일부분을 이루는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 세포의 게놈을 이루는 모든 염색체의 집합체인 핵형에 의해 종종 특성화된다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 세포의 염색체 핵형의 일부분이 아닌, 복제 핵산, 핵단백질 복합체 또는 핵산을 포함하는 기타 구조물이다. 에피솜의 예로는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈이 포함된다.
"접근가능 영역"은 핵산 내에 존재하는 표적 부위에 표적 부위를 인식하는 외인성 분자가 결합할 수 있는, 세포 염색질 내의 부위이다. 어떠한 특정한 이론에 얽매이기를 원치 않으면서, 접근가능 영역은 뉴클레오솜 구조물 내로 패키징되지 않는 영역인 것으로 여겨진다. 접근가능 영역의 독특한 구조는 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들어 뉴클레아제에 대한 감수성에 의해 종종 검출될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합에 충분한 조건이 존재하는 경우, 결합 분자가 결합할 핵산의 부분을 규정하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'는 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다. 또한, 표 3 및 13에는 표 2 및 표 12의 ZFP 인식 나선의 결합을 위한 표적 부위가 나열되어 있다.
"외인성" 분자는, 정상적으로는 세포 내에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전학적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내의 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어 꽃의 발생의 초기 단계 동안에만 세포에 존재하는 분자는 완전히 발생된 꽃의 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대해 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어 임의의 폴리펩티드 또는 그의 단편에 대한 코딩 서열, 기능 장애성 내인성 분자의 기능성 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능 장애성 버전을 포함할 수 있다. 추가로, 외인성 분자는 숙주 세포 내의 내인성 유전자의 오르토로그인 또 다른 종으로부터의 코딩 서열을 포함할 수 있다.
특히, 외인성 분자는 소분자, 예컨대 조합 화학 프로세스에 의해 생성된 것, 또는 거대분자 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 폴리사카라이드, 상기 분자들의 임의의 변형 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며; 선형, 분지형 또는 원형일 수 있고; 임의의 길이일 수 있다. 핵산에는 듀플렉스를 형성할 수 있는 것들, 뿐만 아니라 트리플렉스-형성 핵산이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,176,996 및 5,422,251을 참조한다. 단백질에는 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 레콤비나제, 리가제, 토포이소머라제, 기라제 및 헬라카제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 상기 용어는 식물 세포 내로 도입된 외인성 서열인 "트랜스진" 또는 "관심 유전자"를 포함한다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 원형질체 형질전환, 탄화규소 (예컨대, 휘스커스(WHISKERS)™), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환, 지질-매개 전달 (즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주사, 세포 융합, 입자 포격 (예컨대 "유전자 총" 사용), 인산칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
반면에, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에 특정 발달 단계에서 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 기타 소기관의 게놈, 또는 자연-발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자에는 단백질, 예를 들어 전사 인자 및 효소가 포함될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "외인성 핵산의 생성물"은 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 생성물을 둘 다, 예를 들어 전사 생성물 (RNA와 같은 폴리뉴클레오티드) 및 번역 생성물 (폴리펩티드)을 포함한다.
"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가 연결된, 바람직하게는 공유결합으로 연결된 분자이다. 서브유닛 분자들은 동일한 화학 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 분자의 예는 융합 단백질, 예를 들어 DNA-결합 도메인 (예를 들어, ZFP, TALE 및/또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)과 뉴클레아제 (절단) 도메인 (예를 들어, 엔도뉴클레아제, 메가뉴클레아제 등) 사이의 융합체, 및 융합 핵산 (예를 들어, 상기 기재된 융합 단백질을 코딩하는 핵산)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 제2 유형의 융합 분자의 예로는 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩티드 사이의 융합체, 및 작은 홈 결합제와 핵산 사이의 융합체가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
세포 내에서의 융합 단백질의 발현은 융합 단백질을 세포에 전달함으로써 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달함으로써 유도될 수 있고, 후자의 경우 상기 폴리뉴클레오티드가 전사되고, 전사체가 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 라이게이션이 세포 내에서의 단백질의 발현에서 또한 수반될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포에 전달하는 방법이 본 발명의 다른 곳에서 제시된다.
본 발명의 목적을 위해, "유전자"는 유전자 생성물 (하기 참조)을 코딩하는 DNA 영역, 뿐만 아니라 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다 (이러한 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부와 관계없이). 따라서, 유전자에는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 집입 부위, 인핸서, 사일렌서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
"유전자 발현"은 유전자 내에 함유된 정보가 유전자 생성물로 전환되는 것을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 기타 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생산되는 단백질일 수 있다. 유전자 생성물에는 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 프로세스에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질이 또한 포함된다.
유전자 발현의 "조정"은 유전자 활성에서의 변화를 지칭한다. 발현 조정에는 유전자 활성화 및 유전자 억제가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
"트랜스제닉 선택 마커"는 키메라 유전자 발현 카세트를 포함하도록 프로모터 및 3'-UTR에 작동가능하게 연결된 마커 유전자를 포함하는 외인성 서열을 지칭한다. 트랜스제닉 선택 마커의 비제한적 예는 제초제 내성, 항생제 내성 및 시각적 리포터 마커를 포함한다. 트랜스제닉 선택 마커는 표적화 통합을 통해 공여자 서열과 함께 통합될 수 있다. 이에 따라 트랜스제닉 선택 마커는 공여자의 통합을 평가하는데 사용되는 생성물을 발현하다. 대조적으로, 본원에 기재된 방법 및 조성물은, 예를 들어 내부로 통합되어 내인성 표적 유전자좌로부터 선택 마커를 생산하는 (즉, 이 경우에 사용된 선택 마커는 트랜스제닉이 아님), 내인성 유전자를 돌연변이시키는 공여자를 사용함으로써, 트랜스제닉 선택 마커의 공동-통합을 필요로 하지 않으면서 임의의 공여자 서열의 통합을 가능하게 한다. 선택 마커의 비제한적 예는 본원에 기재된 바와 같은 돌연변이된 AHAS 유전자를 비롯한 제초제 내성 마커를 포함한다.
"식물" 세포에는 단자엽 (외떡잎) 또는 쌍자엽 (쌍떡잎) 식물의 세포가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 단자엽 식물의 비제한적 예는 곡물 식물, 예컨대 옥수수, 벼, 보리, 귀리, 밀, 소르굼, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 양파, 바나나, 및 코코넛을 포함한다. 쌍자엽 식물의 비제한적 예는 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 사탕무, 감자, 상추, 멜론, 대두, 카놀라 (평지씨), 및 알팔파를 포함한다. 식물 세포는 식물의 임의의 부분으로부터 및/또는 임의의 식물 발달 단계로부터 수득될 수 있다.
"관심 영역"은 외인성 분자가 결합하는 것이 바람직한 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대 유전자 또는 유전자 내부의 또는 그에 인접한 비-코딩 서열이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합을 목적으로 할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역은 염색체, 에피솜, 소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈 내에 존재할 수 있다. 관심 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 전사된 비-코딩 영역 예컨대 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류의 비-전사 영역 내에 있을 수 있다. 관심 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍만큼 작거나 또는 2,000개 뉴클레오티드 쌍까지의 길이, 또는 뉴클레오티드 쌍의 임의의 정수 값일 수 있다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동적으로 연결된" (또는 "작동가능하게 연결된")은 2개 이상의 성분 (예컨대 서열 요소)의 병렬배치와 관련하여 상호교환가능하게 사용되고, 이때 성분들은 양쪽 성분 모두가 정상적으로 기능하고 하나 이상의 성분이 하나 이상의 다른 성분에 발휘되는 기능을 매개할 수 있게 하도록 정렬된다. 예시로서, 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터는, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 응답하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 일반적으로 전사 조절 서열은 코딩 서열과 시스 형태로 작동적으로 연결되지만, 이에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서와 코딩 서열이 인접하지 않더라도, 인핸서는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "작동적으로 연결된"은 각각의 성분이 다른 성분에 연결된 상태에서 이렇게 연결되지 않았을 때와 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, DNA-결합 도메인 (ZFP, TALE)이 절단 도메인 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 도메인 예컨대 FokI, 메가뉴클레아제 도메인 등)과 융합된 융합 폴리펩티드에 관하여, 융합 폴리펩티드 내에서 DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있으면서 절단 (뉴클레아제) 도메인이 표적 부위 근처에서 DNA를 절단시킬 수 있다면, DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동적 연결 하에 있다. 뉴클레아제 도메인은 또한 DNA 결합 능력을 나타낼 수 있다 (예를 들어, DNA에도 결합할 수 있는 ZFP 또는 TALE 도메인에 융합된 뉴클레아제). 유사하게, DNA-결합 도메인이 활성화 또는 억제 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드에 관하여, 융합 폴리펩티드 내에서 DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있으면서 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향조절할 수 있거나 억제 도메인이 유전자 발현을 하향조절할 수 있다면, DNA-결합 도메인과 활성화 도메인은 작동적 연결 하에 있다. 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능적 단편"은 서열이 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능적 단편은 대응하는 천연 분자보다 더 많거나, 더 적거나, 동일한 수의 잔기를 보유할 수 있고/거나, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능 (예를 들어, 코딩 기능, 또 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 유사하게, 단백질의 기능을 결정하는 방법이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어 필터-결합, 전기영동 이동성-변화, 또는 면역침전 검정에 의해 결정될 수 있다. 겔 전기영동에 의해 DNA 절단을 검정할 수 있다. 상기 문헌 [Ausubel et al.]을 참조한다. 또 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력을, 예를 들어 공동-면역침전, 2-하이브리드 검정 또는 상보성 (유전학적 및 생화학적 둘 다)에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Fields et al. (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 번호 5,585,245 및 PCT WO 98/44350을 참조한다.
DNA-결합 도메인
임의의 DNA-결합 도메인이 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 아연 핑거 단백질을 포함한다. 아연 핑거 결합 도메인은 하나 이상의 아연 핑거를 포함한다. Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.:56-65; 미국 특허 번호 6,453,242. 본원에 기재된 아연 핑거 결합 도메인은 일반적으로 2, 3, 4, 5, 6 또는 심지어 그 초과의 아연 핑거를 포함한다.
전형적으로, 단일 아연 핑거 도메인은 약 30개 아미노산 길이이다. 각각의 아연 핑거 도메인 (모티프)이 2개의 베타 시트 (2개의 불변 시스테인 잔기를 함유하는 베타 회전으로 유지됨) 및 알파 나선 (2개의 불변 히스티딘 잔기를 함유함)을 함유하며 이들이 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘에 의한 아연 원자의 배위를 통해 특정한 입체형태로 유지된다는 것이 구조 연구에서 입증되었다.
아연 핑거는 정규 C2H2 아연 핑거 (즉, 아연 이온이 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘 잔기에 의해 배위된 것) 및 비-정규 아연 핑거, 예를 들어 C3H 아연 핑거 (아연 이온이 3개의 시스테인 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기에 의해 배위된 것) 및 C4 아연 핑거 (아연 이온이 4개의 시스테인 잔기에 의해 배위된 것) 둘 다를 포함한다. 또한 WO 02/057293; 및 또한 식물에서 사용하기 위한 비-정규 ZFP에 관한 미국 특허 공개 번호 20080182332를 참조한다.
조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연 발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법에는 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중자 (또는 사중자) 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 여기서 각각의 삼중자 또는 사중자 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중자 또는 사중자 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 회합된다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 비롯한 예시적인 선택 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다.
아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증강이, 예를 들어 미국 특허 번호 6,794,136에 기재된 바 있다.
개별적인 아연 핑거가 3개-뉴클레오티드 (즉, 삼중자) 서열 (또는 인접한 아연 핑거의 4개-뉴클레오티드 결합 부위와 1개의 뉴클레오티드가 중첩될 수 있는 4개-뉴클레오티드 서열)에 결합하기 때문에, 아연 핑거 결합 도메인이 결합하도록 조작되는 서열 (예를 들어, 표적 서열)의 길이는 조작된 아연 핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거의 개수를 결정할 것이다. 예를 들어, 핑거 모티프가 중첩 하위부위에 결합하지 않는 ZFP에 대해, 6개-뉴클레오티드 표적 서열에 2개-핑거 결합 도메인이 결합하고, 9개-뉴클레오티드 표적 서열에 3개-핑거 결합 도메인이 결합한다. 본원에 나타낸 바와 같이, 표적 부위 내의 개별적인 아연 핑거들에 대한 결합 부위 (즉, 하위부위)는 인접할 필요가 없고, 다중-핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거들 사이의 아미노산 서열 (즉, 핑거간 링커)의 길이 및 특성에 따라, 1개 또는 수개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
다중-핑거 아연 핑거 결합 도메인에서, 인접한 아연 핑거들은 대략 5개 아미노산의 아미노산 링커 서열 (소위 "정규" 핑거간 링커)에 의해, 또는 대안적으로 하나 이상의 비-정규 링커에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261을 참조한다. 3개 초과의 핑거를 포함하는 조작된 아연 핑거 결합 도메인의 경우, 몇몇 경우는 특정 아연 핑거 사이에 보다 긴 ("비-정규") 핑거간 링커를 삽입하는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 상기 결합 도메인에 의해 결합 친화도 및/또는 결합 특이성이 증가될 수 있기 때문이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,479,626 및 WO 01/53480을 참조한다. 따라서, 다중-핑거 아연 핑거 결합 도메인이 비-정규 핑거간 링커의 존재 및 위치와 관련하여 또한 특성화될 수 있다. 예를 들어, 3개의 핑거 (2개의 정규 핑거간 링커로 연결됨), 긴 링커 및 3개의 추가적인 핑거 (2개의 정규 핑거간 링커로 연결됨)을 포함하는 6개-핑거 아연 핑거 결합 도메인은 2x3 배위로 표시된다. 유사하게, 2개의 핑거 (그 사이에 정규 링커 포함), 긴 링커 및 2개의 추가적인 핑거 (정규 링커에 의해 연결됨)를 포함하는 결합 도메인은 2x2 배위로 표시된다. 3개의 2개-핑거 단위 (각각의 경우에, 2개의 핑거는 정규 링커에 의해 연결되고, 각각의 2개-핑거 단위는 긴 링커에 의해 인접한 2개의 핑거 단위에 연결됨)를 포함하는 단백질은 3x2 배위로 지칭된다.
다중-핑거 결합 도메인 내의 2개의 인접한 아연 핑거 사이에 긴 링커 또는 비-정규 핑거간 링커가 존재하면, 종종 2개의 핑거가 표적 서열 내에서 바로 인접하지 않은 하위부위들에 결합하게 된다. 따라서, 표적 부위 내의 하위부위들 사이에 뉴클레오티드 1개 이상의 갭이 있을 수 있으며, 즉, 표적 부위가 아연 핑거에 접촉되지 않는 1개 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 2x2 아연 핑거 결합 도메인은 1개의 뉴클레오티드에 의해 분리된 6개-뉴클레오티드 서열 2개에 결합할 수 있으며, 즉, 이는 13개-뉴클레오티드 표적 부위에 결합한다. 또한, 문헌 [Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441] 및 WO 01/53480을 참조한다.
상기 논의된 바와 같이, 표적 하위부위는 단일 아연 핑거에 의해 결합된 3개- 또는 4개-뉴클레오티드 서열이다. 특정 목적을 위해, 2개-핑거 단위는 "결합 모듈"로 표시된다. 결합 모듈은, 예를 들어 특정한 6개-뉴클레오티드 표적 서열에 결합하는, 다중-핑거 단백질 (일반적으로 3개의 핑거)의 상황에서 2개의 인접한 핑거를 선택함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 개별적인 아연 핑거들의 조립에 의해 모듈이 구축될 수 있다. 또한 WO 98/53057 및 WO 01/53480을 참조한다.
대안적으로, DNA-결합 도메인은 뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]을 참조한다. 또한, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 번호 20070117128을 참조한다. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 뉴클레아제의 상황에서 전체적으로 (즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록) 변경될 수 있거나 또는 이종 DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 단백질 또는 TALE) 또는 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다. 메가뉴클레아제로부터 유래된 DNA-결합 도메인은 또한 DNA 결합 활성을 나타낼 수 있다.
다른 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,586,526을 참조하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다. 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물 식물에서 많은 질병을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 크산토모나스의 병원성은 25종 초과의 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포 내로 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 의존한다. 이러한 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 트랜스크립톰을 조작하는 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE)가 있다 (문헌 [Kay et al. (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특성화된 TALE 중 하나는 크산토모나스 캄페스트그리스 병원형 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TALE는 탠덤 반복부의 집중된 도메인을 함유하고, 각각의 반복부는 상기 단백질의 DNA 결합 특이성에 핵심적인 약 34개의 아미노산을 함유한다. 또한, 이들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (검토에 대해서는, 문헌 [Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 또한, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서, 알. 솔라나세아룸 생물변이형 1 균주 GMI1000 및 생물변이형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동성인 brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 발견되었다 (문헌 [Heuer et al. (2007) Appland Envir Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인 내의 1,575 bp의 결실에서 상이하다. 그러나, 두 유전자 생성물은 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다.
따라서, 일부 실시양태에서, 표적 유전자좌 내의 표적 부위에 결합하는 DNA 결합 도메인은 식물 병원체 크산토모나스 (문헌 [Boch et al., (2009) Science 326: 1509-1512 및 Moscou and Bogdanove, (2009) Science326: 1501] 참조) 및 랄스토니아 (문헌 [Heuer et al. (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13): 4379-4384] 참조)로부터 유래된 것들과 유사한 TAL 이펙터로부터의 조작된 도메인이다 (미국 특허 번호 8,586,526; 8,420,782 및 8,440,431). TALEN은 C-cap 및/또는 N-cap 서열 (예를 들어, TALE 백본의 C-말단 및/또는 N-말단 절단) (예를 들어, "+17", "+63" C-cap)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,586,526을 참조한다.
또 다른 대안으로서, DNA-결합 도메인은 류신 지퍼 단백질로부터 유래될 수 있다. 류신 지퍼는 유전자 발현과 연관된 중요한 전사 인자인 다수의 진핵 조절 단백질에서 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 단백질 부류이다. 류신 지퍼는 동물, 식물, 효모 등을 포함한 여러 가지 계 전반에 걸쳐 이들 전사 인자에 공유된 공통의 구조적 모티프를 지칭한다. 류신 지퍼는, 류신 잔기가 α-나선을 통하여 균일하게 간격을 두고 두 폴리펩티드의 류신 잔기가 나선의 동일한 면 상에서 종결되도록 하는 방식으로 특정 DNA 서열과 결합하는 두 폴리펩티드 (동종이량체 또는 이종이량체)에 의해 형성된다. 류신 지퍼의 DNA 결합 특이성이 본원에 개시된 DNA-결합 도메인에 이용될 수 있다.
절단 도메인
상기 나타낸 바와 같이, 임의의 DNA-결합 도메인은 절단 (뉴클레아제) 도메인과 회합될 수 있다. 예를 들어, 귀소 엔도뉴클레아제는 뉴클레아제 기능을 유지시키면서 그의 DNA-결합 특이성을 변형시킬 수 있다. 추가로, 아연 핑거 단백질은 또한 뉴클레아제 (절단) 도메인에 융합되어 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성할 수 있다. TALE 단백질은 뉴클레아제 (절단) 도메인에 연결되어 TALEN을 형성할 수 있다.
본원에 개시된 융합 단백질의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]을 참조한다. DNA를 절단하는 추가의 효소가 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미크로코쿠스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한, 문헌 [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993] 참조). 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 비제한적 예는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다. 또한, 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]를 참조한다. 이러한 효소들 (또는 그의 기능적 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종에 존재하고, DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있고 (인식 부위에서), 결합 부위에서 또는 그 부근에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, 유형 IIS)는 인식 부위에서 떨어진 부위에서 DNA를 절단하며, 분리가능한 결합 도메인 및 절단 도메인을 갖는다. 예컨대, 유형 IIS 효소 FokI는 한 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 9개 뉴클레오티드에서 및 다른 가닥 상의 그의 인식 부위로부터 13개 뉴클레오티드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 문헌 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]을 참조한다. 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은 하나 이상의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인), 및 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는, 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에 사용된 FokI 효소의 일부가 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 핑거-FokI 융합체를 이용한 세포 서열의 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 표적화 대체의 경우, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여, 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자를 사용할 수도 있다. 아연 핑거-FokI 융합체를 이용한 표적화 절단 및 표적화 서열 변경에 대한 파라미터가 본 명세서의 다른 부분에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 또는 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다량체화 (예를 들어, 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 미국 공개 번호 20070134796에 기재되어 있으며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
절단 특이성을 증강시키기 위해, 절단 도메인을 변형시킬 수도 있다. 특정 실시양태에서, 절단 절반-도메인의 변이체를 사용하며, 이들 변이체는 절단 절반-도메인의 동종이량체화를 최소화하거나 방지한다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서의 아미노산 잔기는 FokI 절단 절반-도메인의 이량체화에 영향을 미치기 위한 모든 표적이다. 이러한 변형된 절단 절반-도메인의 비제한적 예는 미국 특허 번호 7,888,121; 7,914,796 및 8,034,598에 상세히 기재되어 있고; 이들은 본원에 참조로 포함된다. 실시예를 또한 참조한다.
절대 이종이량체를 형성하는 FokI의 추가적인 조작된 절단 절반-도메인이 또한 본원에 기재된 ZFN에 사용할 수도 있다. 절대적 이종이량체를 형성하는 Fok I의 예시적인 조작된 절단 절반-도메인은 제1 절단 절반-도메인이 Fok I의 위치 490 및 538의 아미노산 잔기에서의 돌연변이를 포함하고 제2 절단 절반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서의 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서, 한 실시양태에서, 490에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 교체하고; 538에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체하고; 486에서의 돌연변이는 Gln (Q)를 Glu (E)로 교체하고; 위치 499에서의 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 교체한다. 구체적으로, 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 "E490K:I538K"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 하나의 절단 절반-도메인에서 위치 490 (E→K) 및 538 (I→K)을 돌연변이시키고, "Q486E:I499L"로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생산하기 위해 또 다른 절단 절반-도메인에서 위치 486 (Q→E) 및 499 (I→L)를 돌연변이시킴으로써 제조하였다. 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 비정상적 절단이 최소화되거나 또는 제거된 절대적 이종이량체 돌연변이체이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,914,796 및 8,034,598을 참조하며, 이들 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함되다. 특정 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 486, 499 및 496 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 486의 야생형 Gln (Q) 잔기를 Glu (E) 잔기로, 위치 499의 야생형 Iso (I) 잔기를 Leu (L) 잔기로, 위치 496의 야생형 Asn (N) 잔기를 Asp (D) 또는 Glu (E) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490, 538 및 537 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 538의 야생형 Iso (I) 잔기를 Lys (K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490 및 537 (야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에 돌연변이, 예를 들어 위치 490의 야생형 Glu (E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 537의 야생형 His (H) 잔기를 Lys (K) 잔기 또는 Arg (R) 잔기로 교체한 돌연변이 (각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로도 지칭됨)를 포함한다. (미국 특허 공개 번호 20110201055 참조). 다른 실시양태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 "Sharkey" 및/또는 "Sharkey'" 돌연변이를 포함한다 (문헌 [Guo et al., (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107] 참조).
본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적합한 방법을 이용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 7,914,796; 8,034,598 및 8,623,618; 및 미국 특허 공개 번호 20110201055에 기재된 바와 같은 야생형 절단 절반-도메인 (Fok I)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제는 TALEN으로도 지칭되는, 조작된 TALE DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 및/또는 메가뉴클레아제 도메인)포함한다. 사용자 선택의 표적 서열과의 강건한 부위 특이적 상호작용을 위해 이들 TALEN 단백질을 조작하기 위한 방법 및 조성물이 발표된 바 있다 (미국 특허 번호 8,586,526 참조). 일부 실시양태에서, TALEN은 엔도뉴클레아제 (예를 들어, FokI) 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, TALE-뉴클레아제는 메가 TAL이다. 이들 메가 TAL 뉴클레아제는 TALE DNA 결합 도메인 및 메가뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 메가뉴클레아제 절단 도메인은 단량체로서 활성이고, 활성을 위해 이량체화를 필요로 하지 않는다. (문헌 [Boissel et al ., (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224] 참조). 추가로, 뉴클레아제 도메인은 또한 DNA-결합 기능성을 나타낼 수 있다.
추가 실시양태에서, 뉴클레아제는 콤팩트 TALEN (cTALEN)을 포함한다. 이들은 TALE DNA 결합 도메인을 TevI 뉴클레아제 도메인에 연결하는 단일 쇄 융합 단백질이다. 융합 단백질은, TALE DNA 결합 도메인이 TevI 뉴클레아제 도메인에 대하여 어디에 위치해 있는지에 따라 TALE 영역에 국재화된 닉카제로서 작용할 수 있거나 또는 이중 가닥 절단을 생성할 수 있다 (문헌 [Beurdeley et al. (2013) Nat Comm: 1-8 DOI: 10.1038/ncomms2782] 참조). 임의의 TALEN은 추가의 TALEN과 조합되어 사용될 수 있다 (예를 들어, 하나 이상의 TALEN (cTALEN 또는 FokI-TALEN)과 하나 이상의 메가-TAL).
뉴클레아제는 표준 기술을 이용하여, 예를 들어 소위 "분할-효소" 기술을 이용하여 핵산 표적 부위에서 생체내에서 조립될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20090068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별개의 발현 구축물 상에서 발현될 수 있거나, 또는 개별 성분이, 예를 들어 자가-절단 2A 펩티드 또는 IRES 서열에 의해 분리되는 하나의 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 성분은 개별적인 아연 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는 예를 들어 미국 특허 번호 8,563,314에 기재된 바와 같은 효모-기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제 발현 구축물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 용이하게 설계할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 및 국제 공개 WO 07/014275를 참조한다. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노스 및/또는 갈락토스의 존재 하에 활성화되고 (탈억제되고) 글루코스의 존재 하에 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 제어 하에 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템을 포함한다. 시스템의 RNA 성분을 코딩하는 CRISPR (다발의 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문 반복) 유전자좌, 및 단백질을 코딩하는 cas (CRISPR-연관) 유전자좌 (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60)는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 이룬다. 미생물 숙주 내의 CRISPR 유전자좌는 CRISPR-연관 (Cas) 유전자의 조합 뿐만 아니라 CRISPR-매개 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-코딩 RNA 요소를 함유한다.
유형 II CRISPR은 가장 잘 특성화된 시스템 중의 하나이고, 4개의 순차적 단계에서 표적화된 DNA 이중-가닥 파괴를 수행한다. 첫번째로, 2개의 비-코딩 RNA인 프리-crRNA 어레이 및 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 두번째로, tracrRNA는 프리-crRNA의 반복 영역에 혼성화하고, 프리-crRNA의 개별적인 스페이서 서열을 함유하는 성숙 crRNA 내로의 프로세싱을 매개한다. 세번째로, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체는 crRNA 상의 스페이서와, 표적 인식을 위한 추가의 요건인 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)의 옆에 존재하는 표적 DNA 상의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성을 통해 Cas9를 표적 DNA로 유도한다. 마지막으로, Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내의 이중-가닥 파괴를 생성한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 하기 3 단계를 포함한다: (i) '적응'으로 불리는 과정에서, 추후의 공격을 방지하기 위해 외래 DNA 서열의 CRISPR 어레이 내로의 삽입, (ii) 관련 단백질의 발현, 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 프로세싱, 이어서 (iii) 외래 핵산에 대한 RNA-매개 간섭. 따라서, 박테리아 세포에서, 소위 'Cas' 단백질 중 몇몇은 CRISPR/Cas 시스템의 천연 기능과 연관되고, 외래 DNA의 삽입 등과 같은 기능에서 역할을 수행한다.
특정 실시양태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질의 "기능적 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능적 유도체"는 대응하는 천연 서열 폴리펩티드와 공통적인 생물학적 특성을 갖는다면, 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩티드의 유도체 및 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능적 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형 둘 다, 및 그의 융합체를 포괄한다. Cas 폴리펩티드의 적합한 유도체 또는 그의 단편은 Cas 단백질의 돌연변이체, 융합체, 공유 변형 또는 그의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. Cas 단백질 또는 그의 단편, 뿐만 아니라 Cas 단백질의 유도체 또는 그의 단편을 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 수득가능하거나, 또는 화학적으로 합성되거나 또는 이들 2가지 절차의 조합에 의해 수득가능할 수 있다. 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하는 세포, 또는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고 내인성 Cas 단백질을 보다 높은 발현 수준으로 생산하도록, 또는 내인성 Cas와 동일하거나 상이한 Cas를 코딩하는 외인성으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된 세포일 수 있다. 일부 경우에, 세포는 Cas 단백질을 자연적으로 생산하지 않고, Cas 단백질을 생산하도록 유전자 조작된다. 예를 들어, 미국 가출원 번호 61/823,689를 참조한다.
따라서, 뉴클레아제는 임의의 유전자 내의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을, 결합 부위에서 또는 그 부근에서 DNA를 절단하는 뉴클레아제 도메인과 조합하여 포함한다.
융합 단백질
융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계 및 구축 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 도메인, TALE) 및 조절 또는 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인)을 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 설계 및 구축 방법은 미국 특허 8,586,526; 8,592,645; 8,399,218; 8,329,986; 7,888,121; 6,453,242; 및 6,534,261 및 미국 특허 출원 공개 2007/0134796에 기재되어 있고, 이들 전문은 본원에 참조로 포함된다. 특정 실시양태에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 구축한다. 이러한 폴리뉴클레오티드가 벡터 내로 삽입될 수 있고, 벡터가 세포 내로 도입될 수 있다 (폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 벡터 및 방법에 관한 추가적인 개시내용에 대해서는 하기 참조).
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 아연 핑거 뉴클레아제 또는 TALEN은 아연 핑거 결합 도메인 또는 TALE DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, 유형 IIS 제한 효소 및/또는 메가뉴클레아제 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, ZFN 또는 TALEN은 FokI 제한 효소로부터의 절단 절반-도메인을 포함하고, 이러한 2개의 융합 단백질은 세포에서 발현된다. 세포 내에서의 2개의 융합 단백질의 발현은 2개의 단백질을 세포에 전달하는 것; 1개의 단백질 및 단백질들 중 1개를 코딩하는 1개의 핵산을 세포에 전달하는 것; 각각 단백질들 중 하나를 코딩하는 2개의 핵산을 세포에 전달하는 것; 또는 양쪽 단백질을 코딩하는 단일 핵산을 세포에 전달하는 것으로부터 유도될 수 있다. 추가 실시양태에서, 융합 단백질은 2개의 절단 절반 도메인 및 아연 핑거 또는 TALE 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 이러한 경우에, 단일 융합 단백질이 세포 내에서 발현되고, 이론에 얽매이기를 원치 않으면서, 절단 절반-도메인들의 분자내 이량체 형성의 결과로서 DNA를 절단하는 것으로 여겨진다.
특정 실시양태에서, 융합 단백질 (예컨대, ZFP-FokI 융합체)의 성분들은, DNA-결합 도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 절반-도메인이 카르복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이는 FokI 효소로부터 유래된 것들과 같은 자연 발생 이량체화 절단 도메인 내에서의 절단 도메인의 상대적 배향을 반영하며, 여기서 DNA-결합 도메인은 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 절반-도메인은 카르복시 말단 가장 근처에 있다. 이러한 실시양태에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위한 절단 절반-도메인들의 이량체화는 대향하는 DNA 가닥들 상의 부위에 융합 단백질들이 결합함으로써 유발되고, 이때 결합 부위들의 5' 말단들이 서로에 대해 근위에 있다.
추가 실시양태에서, 융합 단백질 (예컨대, ZFP-FokI 융합체)의 성분들은, 절단 절반-도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 아연 핑거 도메인이 카르복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이러한 실시양태에서, 기능적 뉴클레아제를 형성하기 위한 절단 절반-도메인들의 이량체화는 대향하는 DNA 가닥들 상의 부위에 융합 단백질들이 결합함으로써 유발되고, 이때 결합 부위들의 3' 말단들이 서로에 대해 근위에 있다.
또 다른 추가적인 실시양태에서, 제1 융합 단백질은 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있는 절단 절반-도메인 및 카르복시-말단 가장 근처에 있는 아연 핑거 도메인을 함유하고, 제2 융합 단백질은 아연 핑거 도메인이 융합 단백질의 아미노 말단 가장 근처에 있고 절단 절반-도메인이 카르복시-말단 가장 근처에 있도록 배열된다. 이러한 실시양태에서, 양쪽 융합 단백질이 동일한 DNA 가닥에 결합하고, 이때 카르복시 말단 가장 근처에 아연 핑거 도메인을 함유하는 제1 융합 단백질의 결합 부위가 아미노 말단 가장 근처에 아연 핑거 도메인을 함유하는 제2 융합 단백질의 결합 부위의 5' 측면에 위치한다.
개시된 융합 단백질의 특정 실시양태에서, 아연 핑거 도메인과 절단 도메인(또는 절단 절반-도메인) 사이의 아미노산 서열은 "ZC 링커"를 나타낸다. ZC 링커는 상기 논의된 핑거간 링커와 구별되어야 한다. 예를 들어, 절단을 최적화하는 ZC 링커의 수득에 대한 상세 설명에 대해서는 미국 특허 번호 7,888,121을 참조한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 표 2에 나타낸 인식 나선 아미노산 서열 중 하나 이상을 갖는 아연 핑거 단백질 (예를 들어, 표 2의 단일 열에 나타낸 인식 나선을 갖는 성분 아연 핑거 도메인으로 구성된 아연 핑거 단백질)을 포함하는 ZFN를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 표 2 또는 12에 나타낸 하나 이상의 인식 나선을 갖는 ZFP를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ZFP 발현 벡터가 본원에 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 표 3 또는 13에 나타낸 표적 부위에 결합하는 ZFP, 또는 표 3 또는 13에 나타낸 표적 부위에 결합하는 ZFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다.
표적 부위
개시된 방법 및 조성물은 DNA-결합 도메인 (예를 들어, ZFP, TALE 등) 및 조절 도메인 또는 절단 (예를 들어, 뉴클레아제) 도메인 (또는 절단 절반-도메인)을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 DNA-결합 도메인은 하나 이상의 식물 유전자에서 세포 염색질 내의 서열에 결합함으로써 절단, 및 표적 서열의 부근으로의 하나 이상의 외인성 서열 (트랜스진 포함)의 표적화 통합을 유도한다.
본 개시내용의 다른 곳에 기재된 바와 같이, DNA-결합 도메인은 실제로 모든 원하는 서열에 결합되도록 조작될 수 있다. 따라서, 유전자 조절, 절단 또는 재조합이 요구되는 서열을 함유하는 관심 영역을 확인한 후에, 하나 이상의 DNA-결합 도메인을 조작하여 관심 영역 내의 하나 이상의 서열에 결합하도록 할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA-결합 도메인은 표 3 또는 표 13에 나타낸 바와 같은 하나 이상의 AHAS 유전자 내의 표적 부위에 결합하는 아연 핑거 단백질을 포함한다.
DNA-결합 도메인에 의한 결합 (예를 들어, 표적 부위)을 위한, 임의의 유전자의 세포 염색질 내 관심 게놈 영역의 표적 부위의 선택은 예를 들어 미국 특허 번호 6,453,242에 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 간단한 시각적 검사를 표적 부위의 선택에 또한 사용할 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 청구된 방법에서 표적 부위 선택을 위한 임의의 수단이 사용될 수 있다.
표적 부위는 일반적으로 다수의 인접한 표적 하위부위들로 구성된다. 아연 핑거 단백질의 경우에, 표적 하위부위는 개별적인 아연 핑거가 결합하는 서열 (통상적으로 뉴클레오티드 삼중자, 또는 인접한 사중자와 1개의 뉴클레오티드가 중첩될 수 있는 뉴클레오티드 사중자)을 지칭한다. 예를 들어 미국 특허 번호 6,794,136을 참조한다. 아연 핑거 단백질이 최대의 접촉을 이루는 가닥을 표적 가닥 "1차 인식 가닥" 또는 "1차 접촉 가닥"으로 지정하면, 일부 아연 핑거 단백질은 표적 가닥 내의 3개 염기의 삼중자 및 비-표적 가닥 상의 4번째 염기에 결합한다. 표적 부위는 일반적으로 길이가 뉴클레오티드 9개 이상이고, 따라서 3개 이상의 아연 핑거를 포함하는 아연 핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 그러나, 예를 들어 4개-핑거 결합 도메인의 12개-뉴클레오티드 표적 부위에의 결합, 5개-핑거 결합 도메인의 15개-뉴클레오티드 표적 부위에의 결합, 또는 6개-핑거 결합 도메인의 18개-뉴클레오티드 표적 부위에의 결합이 또한 가능하다. 보다 큰 결합 도메인 (예컨대, 7개-, 8개-, 9개-핑거 및 그 초과)의 보다 긴 표적 부위로의 결합이 또한 가능하다는 것이 명백할 것이다.
표적 부위가 뉴클레오티드 3개의 배수일 필요는 없다. 예를 들어, 교차-가닥 상호작용이 발생하는 경우 (예를 들어, 미국 특허 6,453,242 및 6,794,136 참조), 다중-핑거 결합 도메인의 개별적인 아연 핑거들 중 하나 이상이 중첩 사중자 하위부위에 결합할 수 있다. 그 결과, 3개-핑거 단백질은, 10번째 뉴클레오티드가 말단 핑거에 결합된 사중자의 일부인 10개-뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있고, 4개-핑거 단백질은 13번째 뉴클레오티드가 말단 핑거에 결합된 사중자의 일부인 13개-뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 등이다.
특정 실시양태에서, 표적 부위는 AHAS 유전자좌 (비번역 영역, 예컨대 AHAS의 3' 비번역 영역 포함)에 있다. 적합한 AHAS 표적 부위의 비제한적 예는 표 3 및 표 13에 제시된다. AHAS (AHAS/ALS로도 공지됨) 유전자는 옥수수, 대두, 목화, 아라비돕시스, 벼, 해바라기, 밀, 보리, 사탕무 및 브라시카를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 모든 주요 식물 종에 존재한다. 식물 성능에 대한 부정적 페널티 없이 다양한 구조적 부류의 제초제에 대해 생성된 단백질 감수성을 변경시키는, AHAS 구조적 유전자 서열에 대한 특정 아미노산 변형이 기재된 바 있다. 예를 들어, 이미다졸리논-내성 옥수수 (제아 메이스 L.(Zea mays L.)) [Currie RS, Kwon CS and Penner D, Magnitude of imazethapyr resistance of corn (Zea mays) hybrids with altered acetolactate synthase. Weed Sci 43:578-582 (1995), Wright TR and Penner D, Corn (Zea mays) acetolactate synthase sensitivity to four classes of ALS-inhibiting herbicides. Weed Sci 46:8-12 (1998), Siehl DL, Bengtson AS, Brockman JP, Butler JH, Kraatz GW, Lamoreaux RJ and Subramanian MV, Patterns of cross tolerance to herbicides inhibiting acetohydroxyacid synthase in commercial corn hybrids designed for tolerance to imidazolinones. Crop Sci 36:274-278 (1996), 및 Bailey WA and Wilcut JW, Tolerance of imidazolinone-resistant corn (Zea mays) to diclosulam. Weed Technol 17:60-64 (2003)], 벼 (오리자 사티바 L.(Oryza sativa L.)) [Webster EP and Masson JA, Acetolactate synthase-inhibiting herbicides on imidazolinone-tolerant rice. Weed Sci 49:652-657 (2001) 및, Gealy DR, Mitten DH and Rutger JN, Gene flow between red rice (Oryza sativa) and herbicide-resistant rice (O sativa): implications for weed management. Weed Technol 17:627-645 (2003)], 빵밀 (트리티쿰 아에스티붐 L.(Triticum aestivum L.)) [Newhouse K, Smith WA, Starrett MA, Schaefer TJ and Singh BK, Tolerance to imidazolinone herbicides in wheat. Plant Physiol 100:882-886 (1992), 및 Pozniak CJ and Hucl PJ, Genetic analysis of imidazolinone resistance in mutation-derived lines of common wheat. Crop Sci 44:23-30 (2004)], 및 유지종자 평지 (브라시카 나푸스(Brassica napus) 및 B. 준세아 L. 크제른(B. juncea L. Czern.)) [Shaner DL, Bascomb NF and Smith W, Imidazolinoneresistant crops: selection, characterization and management, in Herbicide resistant crops, edited by Duke SO, CRC Press, Boca Raton, pp 143-157 (1996) 및 Swanson EB, Herrgesell MJ, Arnoldo M, Sippell DW and Wong RSC, Microspore mutagenesis and selection: canola plants with field tolerance to the imidazolinones. Theor Appl Genet 78:525-530 (1989)]가 돌연변이유발, 선택 및 상업적 육종 기술을 통해 개발되었고, 각각 1992, 2003, 2002 및 1996년 이후로 상업화되었다. 이미다졸리논 제초제에 내성이 있는 AHAS 효소를 코딩하는 몇몇 AHAS 유전자가 자연 발생 돌연변이로서 및 화학적으로 유도된 돌연변이유발의 과정을 통해 식물에서 발견된 바 있다. S653N 돌연변이가 식물에서 이미다졸리논 제초제에 대한 내성을 생성하는 AHAS 유전자에서의 5가지 가장 통상적인 단일-점 돌연변이 중 하나이다 (Tan, S., Evans, R.R., Dahmer, M.L., Singh, B.K., and Shaner, D.L. (2005) Imidazolinone-tolerant crops: History, current status and future. Pest Manag. Sci. 61:246-257).
다중-핑거 결합 도메인 내의 개별적인 아연 핑거들 사이의 아미노산 링커 서열의 길이 및 특성이 표적 서열에 대한 결합에 또한 영향을 미친다. 예를 들어, 다중-핑거 결합 도메인 내의 인접한 아연 핑거들 사이의 소위 "비-정규 링커", "긴 링커" 또는 "구조화 링커"의 존재는 이들 핑거들이 바로 인접하지 않은 하위부위들에 결합하도록 할 수 있다. 이러한 링커의 비제한적 예는 예를 들어 미국 특허 번호 6,479,626 및 7,851,216에 기재되어 있다. 따라서, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 표적 부위 내의 하나 이상의 하위부위가 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 뉴클레오티드에 의해 서로로부터 분리될 수 있다. 한가지 예를 제공하자면, 4개-핑거 결합 도메인은, 서열 내에 2개의 인접한 3개-뉴클레오티드 하위부위, 개재 뉴클레오티드 및 2개의 인접한 삼중자 하위부위를 포함하는 13개-뉴클레오티드 표적 부위에 결합할 수 있다. 또한, 상이한 수의 뉴클레오티드에 의해 분리된 표적 부위에 결합시키기 위해 인공 뉴클레아제를 연결하는 방법 및 조성물에 대해서는 미국 특허 공개 번호 20090305419 및 20110287512를 참조한다. 서열들 (예를 들어, 표적 부위들) 사이의 거리는 서로 가장 가까운 서열 가장자리들로부터 측정된, 2개의 서열 사이에 개재된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 개수를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 DNA-결합 도메인 (예를 들어 ZFP 및 TALE) 및 전사 조절 도메인 (예를 들어 활성화 또는 억제 도메인)을 포함하는 융합 단백질을 구축함으로써, 전사 인자 기능을 갖는 DNA-결합 도메인이 설계된다. 전사 인자 기능의 경우, 프로모터와의 간단한 결합 및 충분한 근접성이 일반적으로 요구되는 전부이다. 프로모터에 대한 정확한 위치, 배향 및 한계 내의 거리는 크게 중요하지 않다. 이러한 특징은 인공 전사 인자를 구축하는 표적 부위를 선택하는데 상당한 유연성을 제공한다. 따라서, DNA-결합 도메인에 의해 인식되는 표적 부위는, 임의로 조절 도메인에 연결된, 유전자 발현의 활성화 또는 억제를 가능하게 하는 표적 유전자 내의 임의의 적합한 부위일 수 있다. 바람직한 표적 부위는 전사 시작 부위의 하류 또는 상류에 인접한 영역을 포함한다. 또한, 인핸서 영역에 위치된 표적 부위, 억제자 부위, RNA 폴리머라제 중지 부위, 및 특이적 조절 부위 (예컨대, SP-1 부위, 저산소상태 반응 요소, 핵 수용체 인지 요소, p53 결합 부위)는 cDNA 코딩 영역 내 또는 발현된 서열 태그 (EST) 코딩 영역 내에 위치한다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제 활성을 갖는 ZFP가 설계된다. 세포 내에 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 ZFN의 (또는 각각 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 두 융합 단백질의) 발현은 표적 서열의 부근에서의 절단을 일으킨다. 특정 실시양태에서, 절단은 2개의 아연 핑거 도메인/절단 절반-도메인 융합 분자의 별개의 표적 부위에의 결합에 의존한다. 2개의 표적 부위는 대향하는 DNA 가닥 상에 있을 수 있거나, 또는 다르게는 표적 부위 둘 다는 동일한 DNA 가닥 상에 있을 수 있다.
ZFP가 유전자 발현을 조정하는지 여부를 결정하기 위해 다양한 검정이 이용될 수 있다. 특정한 ZFP의 활성은 다양한 시험관내 및 생체내 검정을 이용하여, 예를 들어 면역검정 (예컨대, ELISA 및 항체를 사용한 면역조직화학 검정), 혼성화 검정 (예컨대, RNase 보호, 노던, 계내 혼성화, 올리고뉴클레오티드 어레이 연구), 비색 검정, 증폭 검정, 효소 활성 검정, 표현형 검정 등을 이용하여, 예를 들어 단백질 또는 mRNA 수준, 생성물 수준, 효소 활성, 리포터 유전자의 전사 활성화 또는 억제를 측정함으로써 검정될 수 있다.
ZFP는 전형적으로, ELISA 검정을 이용한 다음 효소 발현 시스템을 이용하여 시험관내 활성에 대해 우선 시험된다. ZFP가 종종 리포터 유전자를 사용한 일시적인 발현 시스템을 이용하여 우선 시험되고, 이어서 표적 내인성 유전자의 조절이 세포에서 및 전체 식물에서, 생체내 및 생체외 둘 다에서 시험된다. ZFP는 세포에서 재조합에 의해 발현되거나, 식물 내로 이식된 세포에서 재조합에 의해 발현되거나, 또는 트랜스제닉 식물에서 재조합에 의해 발현될 수 있을 뿐만 아니라 하기 기재된 전달 비히클을 사용하여 식물 또는 세포에 단백질로서 투여될 수 있다. 이러한 세포는 고정화되거나, 용액에 있거나, 식물 내로 주입되거나, 또는 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 식물에서 자연적으로 발생할 수 있다.
트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 식물이 또한 생체내 내인성 유전자 발현의 조절을 조사하기 위한 바람직한 실시양태로 사용된다. 트랜스제닉 식물은 선택의 ZFP를 안정하게 발현할 수 있다. 대안적으로, 선택의 ZFP를 일시적으로 발현하거나 ZFP를 전달 비히클 중에 투여한 식물이 이용될 수 있다. 내인성 유전자 발현의 조절은 본원에 기재된 검정 중 어느 하나를 이용하여 시험된다.
표적화된 절단 방법
개시된 방법 및 조성물이 세포 염색질의 관심 영역 (예를 들어, 예컨대 AHAS 유전자 내의 또는 그에 인접한, 게놈 내의 바람직한 또는 미리 결정된 부위)에서 DNA를 절단하는데 사용될 수 있다. 이러한 표적화된 DNA 절단을 위해, DNA-결합 도메인 (예를 들어, 아연 핑거 단백질 또는 TALE)이 미리 결정된 절단 부위에서 또는 그 부근에서 표적 부위에 결합하도록 조작되고, 조작된 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이 세포 내에서 발현된다. 융합 단백질의 DNA-결합 부분이 표적 부위에 결합하면, DNA가 절단 도메인에 의해 표적 부위 부근에서 절단된다.
대안적으로, 각각 DNA-결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 세포 내에서 발현되고, 기능적 절단 도메인을 재구성하고 표적 부위 부근에서 DNA를 절단하는 방식으로 병렬배치된 표적 부위들에 결합한다. 한 실시양태에서, 절단은 2개의 DNA-결합 도메인의 표적 부위 사이에서 발생한다. 아연 핑거 결합 도메인들 중 하나 또는 둘 다가 조작될 수 있다.
아연 핑거 결합 도메인-절단 도메인 융합 폴리펩티드를 사용하는 표적화된 절단을 위해, 결합 부위가 절단 부위를 포함할 수 있거나, 또는 결합 부위의 가까운 가장자리가 절단 부위로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 1 내지 50개 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있다. 절단 부위와 관련하여, 결합 부위의 정확한 위치는 특정 절단 도메인, 및 ZC 링커의 길이에 따라 달라질 것이다. 각각 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 폴리펩티드가 사용되는 방법의 경우, 일반적으로 결합 부위들은 절단 부위에 걸쳐진다. 따라서, 제1 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위의 한쪽 측면 상의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 1 내지 50개 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있고, 제2 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위의 또 다른 측면 상의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 1 내지 50개 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 절단 부위를 맵핑하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
따라서, 본원에 기재된 방법은 절단 도메인에 융합된 조작된 아연 핑거 결합 도메인을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 결합 도메인은 절단이 바람직한 곳 또는 그 부근에서 표적 서열에 결합하도록 조작된다. 융합 단백질, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물 세포 내로 도입된다. 세포 내로 도입되거나 세포 내에서 발현되면, 융합 단백질이 표적 서열에 결합하고, 표적 서열에서 또는 그 부근에서 절단한다. 정확한 절단 부위는 절단 도메인의 특성 및/또는 결합 도메인과 절단 도메인 사이의 링커 서열의 존재 및/또는 특성에 따라 달라진다. 각각 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 사용되는 경우, 결합 부위의 가까운 가장자리들 사이의 거리는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 1 내지 50개 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드)일 수 있다. 최적 수준의 절단은 또한 2개의 융합 단백질의 결합 부위들 사이의 거리 (예를 들어, 문헌 [Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-3369; Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297] 참조) 및 각각의 융합 단백질 내의 ZC 링커의 길이 둘 다에 따라 달라질 수 있다. 또한, 미국 특허 공개 20050064474A1 및 국제 특허 공개 WO05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809를 참조한다.
특정 실시양태에서, 절단 도메인은 2개의 절단 절반-도메인을 포함하고, 이들 둘 다는 결합 도메인, 제1 절단 절반-도메인 및 제2 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드의 부분이다. 절단 절반-도메인은 DNA를 절단하는 기능을 하는 한 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
절단 절반-도메인은 또한 별개의 분자에 제공될 수 있다. 예를 들어, 2개의 융합 폴리펩티드가 세포 내로 도입될 수 있고, 여기서 각각의 폴리펩티드는 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함한다. 절단 절반-도메인들은 DNA를 절단하는 기능을 하는 한 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 추가로, 융합 폴리펩티드들이 결합되면, 절단 도메인의 재구성 (예를 들어, 절반-도메인들의 이량체화에 의한 재구성)을 허용하도록 2개의 절단 절반-도메인이 서로에 대해 공간적으로 배향됨으로써, 기능적 절단 도메인이 형성되도록 절반-도메인들이 서로에 대해 놓여, 관심 영역 내의 세포 염색질의 절단을 초래하는 방식으로 전형적으로 배치된 표적 서열들에, 결합 도메인들이 결합한다. 일반적으로, 재구성된 절단 도메인에 의한 절단은 2개의 표적 서열들 사이에 위치한 부위에서 일어난다. 단백질들 중 하나 또는 둘 다가 그의 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다.
2개의 융합 단백질이 동일한 극성 또는 반대의 극성으로 관심 영역에서 결합할 수 있고, 이들의 결합 부위 (즉, 표적 부위)는 임의의 개수의 뉴클레오티드, 예를 들어 0 내지 200개의 뉴클레오티드 또는 이들 사이의 임의의 정수 값의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각 아연 핑거 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질에 대한 결합 부위들은 다른 결합 부위에 가장 가까운 각각의 결합 부위의 가장자리로부터 측정했을 때 5 내지 18개의 뉴클레오티드, 예를 들어 5-8개의 뉴클레오티드, 또는 15-18개의 뉴클레오티드, 또는 6개의 뉴클레오티드, 또는 16개의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있을 수 있고, 절단은 결합 부위들 사이에서 일어난다.
DNA가 절단되는 부위는 일반적으로 2개의 융합 단백질에 대한 결합 부위들 사이에 존재한다. DNA의 이중 가닥 파괴는 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 뉴클레오티드만큼 오프셋된 2개의 단일 가닥 파괴 또는 "닉"으로부터 종종 초래된다 (예를 들어, 천연 Fok I에 의한 이중 가닥 DNA의 절단은 4개의 뉴클레오티드만큼 오프셋된 단일 가닥 파괴로부터 초래된다). 따라서, 절단이 반드시 각각의 DNA 가닥 상의 정확히 대향하는 부위에서 일어나지는 않는다. 또한, 융합 단백질들의 구조 및 표적 부위들 사이의 거리가, 단일 뉴클레오티드 쌍에 인접하여 절단이 일어나는지 또는 여러 부위에서 절단이 일어나는지에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 표적화된 재조합 및 표적화된 돌연변이유발 (하기 참조)을 비롯한 다수의 용도에 대해, 광범위한 뉴클레오티드 내에서의 절단이 일반적으로 충분하고, 특정 염기쌍들 사이에서의 절단이 요구되지 않는다.
상기 나타낸 바와 같이, 융합 단백질(들)이 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드로서 도입될 수 있다. 예를 들어, 각각 상기 언급된 폴리펩티드들 중 하나를 코딩하는 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있고, 폴리펩티드들이 발현되어 각각 그의 표적 서열에 결합하면, 표적 서열에서 또는 그 부근에서 절단이 일어난다. 대안적으로, 융합 폴리펩티드 둘 다를 코딩하는 서열들을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입된다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 DNA 및/또는 RNA의 임의의 변형 형태 또는 유사체일 수 있다.
절단 특이성을 증강시키기 위해, 추가적인 조성물이 또한 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 절단 절반-도메인들이 제한된 이중 가닥 절단 활성을 나타낼 수 있다. 각각 3개-핑거 아연 핑거 도메인 및 절단 절반-도메인을 함유하는 2개의 융합 단백질이 세포 내로 도입되는 방법에서, 어느 하나의 단백질은 대략 9개-뉴클레오티드 표적 부위를 명시한다. 18개의 뉴클레오티드의 총 표적 서열이 포유동물 및 식물 게놈에서 고유한 것으로 여겨지지만, 임의의 주어진 9개-뉴클레오티드 표적 부위가 인간 게놈에서 평균적으로 대략 23,000회 발생한다. 따라서, 단일 절반-도메인의 부위-특이적 결합으로 인해, 비-특이적 절단이 발생할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 2개의 융합 단백질과 함께 세포에서 발현되는, 뉴클레아제 (또는 이를 코딩하는 핵산)의 우성-음성 돌연변이체의 사용을 고려한다. 우성-음성 돌연변이체는 이량체화될 수 있지만, 이량체화되면 이중-가닥 절단을 유도할 수 없다. 우성-음성 돌연변이체를 융합 단백질에 대해 몰 과량으로 제공함으로써, 융합 단백질 둘 다가 결합된 영역에서만 기능적 절단 절반-도메인의 국소적인 농도가 이량체화 및 이중 가닥 절단이 일어나기에 충분히 높아질 것이다.
다른 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인(들)은 이들이 단일-가닥 절단을 유도하는 점에서 닉카제이다. 특정 실시양태에서, 닉카제는 2개의 뉴클레아제 도메인을 포함하며, 이중 하나는 뉴클레아제가 단지 단일-가닥 파괴를 일으키도록 변형된다 (예를 들어, 촉매적으로 불활성이 됨). 이러한 닉카제는 예를 들어 미국 특허 공개 번호 20100047805에 기재되어 있다. 2개의 닉카제를 사용하여 이중-가닥 파괴를 유도할 수 있다.
발현 벡터
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 융합 단백질 (예를 들어, ZFN, TALEN 등)을 코딩하는 핵산을, 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로 형질전환시키기 위한 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 벡터는 원핵 벡터 (예컨대 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 곤충 벡터) 또는 진핵 벡터일 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 또한, 세포에 투여하기 위해, 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다.
융합 단백질 발현을 위해, 융합 단백질을 코딩하는 서열은 전형적으로 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝된다. 적합한 원핵 및 진핵 프로모터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]; 및 상기 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al.)]에 기재되어 있다. ZFP 발현을 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어 이. 콜라이, 바실루스(Bacillus) 종, 및 살모넬라(Salmonella)에서 얻을 수 있다 (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)). 상기 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포에 대한 진핵 발현 시스템은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 또한 상업적으로 입수가능하다.
융합 단백질-코딩 핵산의 발현을 지시하는데 사용된 프로모터는 특정 용도에 따라 달라진다. 예컨대, 숙주 세포에 적합한 강력한 구성적 프로모터가 융합 단백질의 발현 및 정제에 전형적으로 사용된다.
대조적으로, 식물 유전자의 조절을 위해 융합 단백질을 생체내 투여할 경우에 (하기 "식물 세포로의 핵산 전달" 섹션 참조), 융합 단백질의 특정 용도에 따라 구성적, 조절된 (예컨대, 발달 동안, 조직 또는 세포 유형에 의해 또는 환경에 의해) 또는 유도성 프로모터가 사용된다. 식물 프로모터의 비제한적 예는 에이. 탈리아나(A. thaliana) 유비퀴틴-3 (ubi-3)으로부터 유래된 프로모터 서열 (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493); 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 만노핀 신테타제 (Δmas)로부터 유래된 프로모터 서열 (Petolino et al., 미국 특허 번호 6,730,824); 및/또는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 (CsVMV)로부터 유래된 프로모터 서열 (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139)을 포함한다. 실시예를 또한 참조한다.
프로모터 이외에도, 발현 벡터는 숙주 세포 (원핵 또는 진핵)에서의 핵산 발현에 필요한 모든 추가적인 요소들을 함유하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 전형적으로 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는, 예컨대 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 (리보솜 결합 부위 포함), 및 예컨대, 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 또는 번역 종결에 요구되는 신호를 함유한다. 상기 카세트의 추가의 요소는, 예컨대 인핸서, 이종 스플라이싱 신호, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스로부터의 2A 서열 (Mattion et al. (1996) J. Virol. 70:8124-8127) 및/또는 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함할 수 있다.
세포 내로 유전자 정보를 수송하기 위해 사용되는 특정 발현 벡터는 융합 단백질의 의도한 용도, 예컨대 식물, 동물, 박테리아, 진균, 원충 등에서의 발현과 관련하여 선택된다 (하기 기재된 발현 벡터 참조). 표준 박테리아 및 동물 발현 벡터는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 공개 20050064474A1 및 국제 특허 공개 WO 05/084190, WO 05/014791 및 WO 03/080809에 상세히 기재되어 있다.
표준 형질감염 방법을 사용하여, 다량의 단백질을 발현하는 박테리아, 식물, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포주를 생산한 다음, 표준 기술을 이용하여 이를 정제할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)] 참조). 진핵 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행된다 (예를 들어, 문헌 [Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds., 1983)] 참조).
외래 뉴클레오티드 서열을 상기 숙주 세포 내로 도입하기 위한 널리 공지된 임의의 절차를 이용할 수 있다. 이들은 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예컨대, 초음파천공), 리포솜, 미세주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 아크로박테리움-매개 형질전환, 탄화규소 (예컨대, 휘스커스™) 매개 형질전환, 에피솜형 및 통합형 둘 다, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 널리 공지된 기타 모든 방법을 포함한다 (예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook et al.] 참조). 필요한 것은 단지, 이용된 특정한 유전자 조작 절차가 하나 이상의 유전자를 선택 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 성공적으로 도입할 수 있어야 한다는 것이다.
공여자
상기 나타낸 바와 같이, 예를 들어 스택킹을 위한, 하나 이상의 외인성 서열 ("공여자 서열" 또는 "공여자" 또는 "트랜스진"으로도 불림)의 삽입이 또한 달성될 수 있다. 공여자 서열은 상동성인 2개의 영역에 의해 플랭킹된 비-상동 서열을 함유하여 관심 위치에서 효율적 HDR을 가능하게 할 수 있다. 추가적으로, 공여자 서열은 세포 염색질 내의 관심 영역에 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 공여자 분자는 세포 염색질에 대한 여러 개의 비연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 정상적으로는 관심 영역 내에 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열이 공여자 핵산 분자 내에 존재할 수 있고, 관심 영역 내의 서열에 대한 상동성 영역이 상기 서열에 플랭킹될 수 있다.
공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 선형 또는 원형 형태로 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20100047805; 20110281361; 및 20110207221을 참조한다. 선형 형태로 도입되면, 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 공여자 서열의 말단들이 보호될 수 있다 (예를 들어, 엑소뉴클레오라이틱(exonucleolytic) 분해로부터). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고/거나, 자가-상보적 올리고뉴클레오티드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 라이게이션된다. 예를 들어, 문헌 [Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오티드를 보호하기 위한 추가적인 방법에는 말단 아미노 기(들)의 부가, 및 변형된 뉴클레오티드 연결, 예컨대 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기의 사용이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 복제 기점, 프로모터 및 항생제 저항성을 코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 공여자 폴리뉴클레오티드는 네이키드 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결핍 렌티바이러스 (IDLV))에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20090117617을 참조한다.
공여자는 일반적으로 통합 부위에서의 내인성 프로모터, 즉 공여자가 삽입되는 내인성 유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 의해 그의 발현이 유도되도록 삽입된다. 그러나, 공여자가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있음이 명백할 것이다. 또한, 공여자 분자는 내인성 유전자 중 모두가 또는 일부가 발현되거나 또는 아무것도 발현되지 않도록 내인성 유전자 내로 삽입될 수 있다.
또한, 발현을 위해 요구되지 않지만, 외인성 서열은 또한, 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 코딩하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
공여자 서열은, 내인성 유전자의 기능이 변경되어 트랜스진 통합에 대한 내인성 마커로서의 역할을 하도록 내인성 유전자 (또는 유전자의 다수의 대립유전자) 내로 도입되어 게놈 변형을 일으킨다. 특정 실시양태에서, 트랜스진(들)이 도입된 내인성 유전자좌는 AHAS 유전자좌이다. 위치 653에서 세린의 아스파라긴으로의 단일 돌연변이 (S653N)를 비롯하여, AHAS 유전자에서의 몇몇 돌연변이는 군 B 또는 ALS 억제제 제초제 내성 (예를 들어 이미다졸리논 또는 술포닐우레아)을 부여하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Lee et al. (2011) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 108: 8909-8913, 및 Tan, S., Evans, R.R., Dahmer, M.L., Singh, B.K., and Shaner, D.L. (2005) Imidazolinone-tolerant crops: History, current status and future. Pest Manag. Sci. 61:246-257]을 참조한다.
AHAS는 식물 발달의 모든 단계에서 전사적으로 활성이며, 유전자 침묵 (예를 들어, DNA, 히스톤 메틸화, iRNA 등에 의해)의 경향이 없고, 이 유전자좌 내로의 신규 유전자의 삽입 또는 식물 형질전환이 숙주 식물의 농경학적 또는 품질 특성에 부정적인 영향을 미치지 않기 때문에, 하나의 바람직한 유전자좌이다. AHAS 유전자좌의 편재 특성, 및 카놀라, 옥수수, 해바라기, 목화, 대두, 사탕무, 밀 및 임의의 다른 식물에서의 AHAS 유전자좌 또는 유전자좌들 변경이 농경학적 또는 품질 페널티를 수반하지 않는다는 명백한 상업적 증거는 AHAS 유전자좌가 모든 상업적으로 관련된 식물 종에 걸쳐 광범위한 부류의 바람직한 표적 유전자좌를 나타낸다는 것을 의미한다.
야생형 (제초제 감수성) AHAS 유전자좌 내로의 공여자 DNA의 통합은 전형적으로 외인성 서열 (예를 들어 트랜스진) 및 내인성 AHAS에 대한 돌연변이 둘 다를 도입하여 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 게놈 변형 (즉, 제초제 내성 식물 세포를 발생시키는 생성물)을 생산하고, 따라서 트랜스제닉 선택 마커 시스템이 아닌 내인성 이미다졸리논 선택 시스템을 이용한, 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다. AHAS 유전자좌에서 제2 트랜스진의 스택킹은, 하나 이상의 추가의 트랜스진을 도입하여 이미다졸리논에 대한 감수성, 그러나 술포닐우레아에 대한 내성 (즉, 제초제 내성 식물 세포를 발생시키는 생성물)을 부여하는 공여자 DNA의 통합에 의해 달성될 수 있고, 따라서 이는 술포닐우레아 선택제를 사용한 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다. 제3 트랜스진의 스택킹은, 추가의 트랜스진(들)을 도입하여 술포닐우레아에 대한 감수성 및 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 공여자 DNA의 통합에 의해 달성될 수 있고, 따라서 이는 이미다졸리논 선택제를 사용한 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다. 이에 따라 순차적 트랜스진 스택킹의 계속적 라운드가, 돌연변이 (예를 들어, 게놈 변형)를 야생형 AHAS에 도입하는 공여자 분자를 사용함으로써 가능해지고, 따라서 이는 술포닐우레아와 이미다졸리논 화학적 선택제 사이의 차등 순환을 가능하게 한다.
식물 세포로의 핵산 전달
상기 나타낸 바와 같이, 다양한 통상적인 기술에 의해 DNA 구축물 (예를 들어, 뉴클레아제(들) 및/또는 공여자(들))이 원하는 식물 숙주 내로 (예를 들어, 그의 게놈 내로) 도입될 수 있다. 이러한 기술의 검토에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463; 및 Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9]을 참조한다. 또한, 미국 특허 공개 번호 20090205083; 20100199389; 20110167521 및 20110189775를 참조하며, 이들 전문은 본원에 참조로 포함된다. 하나 이상의 DNA 구축물이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다는 것이 명백할 것이고, 예를 들어 뉴클레아제(들)는 공여자(들)를 보유하는 구축물(들)과 동일한 구축물 또는 상이한 구축물에 의해 보유될 수 있다.
DNA 구축물(들)은 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주사와 같은 기술을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입될 수 있거나, 또는 DNA 구축물은 바이오리스틱 방법, 예컨대 DNA 입자 포격을 이용하여 식물 조직으로 직접 도입될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 대안적으로, DNA 구축물은 나노입자 형질전환을 통하여 식물 세포 내로 도입될 수 있다 (예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 20090104700 참조). 대안적으로, DNA 구축물은 적합한 T-DNA 경계/플랭킹 영역과 조합될 수 있고, 이는 통상의 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 숙주 벡터 내로 도입될 수 있다. 종양유전자의 무장해제 및 이원 벡터의 개발 및 사용을 비롯하여, 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 기술이 과학 문헌에 널리 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Horsch et al. (1984) Science 233:496-498, 및 [Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803]을 참조한다.
또한, 유전자 전달은 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스, 예컨대 리조비움(Rhizobium) 종 NGR234, 시노리조보이움 멜리로티(Sinorhizoboium meliloti), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 이용하여 달성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4]을 참조한다.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병독성 기능은, 세포가 이원 T-DNA 벡터 (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) 또는 공동-배양 절차 (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231)를 이용하여 박테리아에 의해 감염되는 경우에, 구축물 및 인접한 마커를 함유하는 T-가닥이 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템은 쌍자잎 식물을 조작하는데 사용된다 (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). 아그로박테리움 형질전환 시스템은 또한 단자엽 식물 및 식물 세포에 DNA를 형질전환시키는데, 뿐만 아니라 전달하는데 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 5,591,616; 문헌 [Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; 및 Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434]을 참조한다.
대안적 유전자 전달 및 형질전환 방법은 네이키드 DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)- 또는 전기천공-매개 흡수를 통한 원형질체 형질전환 (Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; 및 Shimamoto (1989) Nature 338:274-276) 및 식물 조직의 전기천공 (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 식물 세포 형질전환을 위한 추가의 방법은 미세주사, 탄화규소 (예를 들어, 휘스커스™) 매개 DNA 흡수 (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418), 및 미세입자 폭격 (문헌 [Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; 및 Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618] 참조)을 포함한다. 최종적으로, 나노입자, 나노담체 및 세포 침투 펩티드가 식물 세포 내로 DNA, RNA, 펩티드 및/또는 단백질을 전달하는데 사용될 수 있다 (WO/2011/26644, WO/2009/046384 및 WO/2008/148223 참조).
개시된 방법 및 조성물을 사용하여 외인성 서열을 AHAS 유전자 내로 삽입할 수 있다. 이는, 식물 게놈 내로 도입된 트랜스진의 발현이 그의 통합 부위에 결정적으로 의존하고 상기에 나타낸 바와 같이 AHAS가 트랜스진 통합에 적합한 부위를 제공하기 때문에 유용하다. 따라서, 예를 들어 제초제 내성, 곤충 저항성, 영양소, 항생제 또는 치료 분자를 코딩하는 유전자는 표적화 재조합에 의해, 그의 발현에 유리한 식물 게놈 영역 내로 삽입할 수 있다.
임의의 상기 형질전환 기술에 의해 생산된 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 보유하고, 따라서 원하는 표현형을 보유하는 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 이러한 재생 기술은 목적 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초제 마커에 전형적으로 의존하는, 조직 배양 성장 배지 내의 특정 피토호르몬의 조작에 의존한다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; 및 Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기재되어 있다. 식물 캘러스, 체외이식편, 기관, 화분, 배아 또는 그의 부분으로부터 재생이 또한 달성될 수 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로, 문헌 [Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에 기재되어 있다.
식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여, 본질적으로 모든 식물에 원하는 형질을 부여할 수 있다. 본 개시내용의 핵산 구축물 및 상기 언급된 다양한 형질전환 방법을 사용하여 본원에 기재된 목적 생리학적 및 농업적 특성을 위해 광범위한 식물 및 식물 세포 시스템을 조작할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조작하기 위한 표적 식물 및 식물 세포에는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예컨대 작물, 예를 들어 곡물 작물 (예를 들어, 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 과일 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 뿌리 채소 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 잎 채소 작물 (예를 들어, 상추, 시금치); 현화 식물 (예를 들어, 페튜니아, 장미, 국화), 침엽수 및 소나무 (예를 들어, 전나무, 가문비나무); 식물환경복원에 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속 축적 식물); 오일 작물 (예를 들어, 해바라기, 평지 종자) 및 실험 목적으로 사용되는 식물 (예를 들어, 아라비돕시스)이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 개시된 방법 및 조성물은 아스파라구스(Asparagus), 아베나(Avena), 브라시카(Brassica), 시트루스(Citrus), 시트룰루스(Citrullus), 캅시쿰(Capsicum), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 다우쿠스(Daucus), 에리게론(Erigeron), 글리신(Glycine), 고시피움(Gossypium), 호르데움(Hordeum), 락투카(Lactuca), 롤리움(Lolium), 리코페르시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 만니호트(Manihot), 니코티아나(Nicotiana), 오리코프라그무스(Orychophragmus), 오리자(Oryza), 페르세아(Persea), 파세올루스(Phaseolus), 피숨(Pisum), 피루스(Pyrus), 프루누스(Prunus), 라파누스(Raphanus), 세칼레(Secale), 솔라눔(Solanum), 소르굼(Sorghum), 트리티쿰(Triticum), 비티스(Vitis), 비그나(Vigna), 및 제아(Zea) 속으로부터의 종을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 광범위한 식물 전반에 걸쳐 사용된다.
식물 세포 내로 도입되는 핵산의 도입을 이용하여 본질적으로 모든 식물에 원하는 소질을 부여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 식물 세포에 통합된 트랜스진(들)은 증가된 과일 수확량, 식물 (또는 식물의 과일)의 증가된 바이오매스, 보다 높은 함량의 과육, 집중된 착과, 보다 큰 식물, 증가된 생중량, 증가된 건조 중량, 증가된 고형물 함량, 수확시 보다 높은 총 중량, 작물 색상의 증강된 강도 및/또는 균일성, 변경된 화학 (예를 들어, 오일, 지방산, 탄수화물, 단백질) 특성 등을 갖는 식물을 생성한다.
통상의 기술자는 외인성 서열이 식물 세포 내로 일시적으로 혼입될 수 있음을 인식할 것이다. 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 도입은 서열이 도입된 식물 세포의 세포 기구를 이용할 수 있다. 식물 세포 내로 일시적으로 혼입된 ZFN을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 표적 서열의 게놈 DNA를 분석하여 임의의 indel, 반전, 또는 삽입을 확인하고 결정함으로써 검정될 수 있다. 이들 유형의 재배열은 게놈 DNA 서열 내의 표적 부위의 절단 및 이후의 DNA 복구로부터 발생한다. 또한, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 발현은 통상의 기술자에게 공지된 마커 유전자 발현의 시험을 가능하게 하는 방법을 사용하여 검정될 수 있다. 다양한 식물, 조직 및 DNA 전달 시스템을 사용한 마커 유전자의 일시적인 발현이 보고된 바 있다. 일시적 분석 시스템은 임의의 관심 식물 종을 사용한 임의의 일시적 식물 검정에서 조직의 전기천공 또는 입자 포격을 통한 직접적 유전자 전달을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 일시적 시스템은 다양한 조직 공급원으로부터의 원형질체의 전기천공 또는 관심 특정 조직의 입자 포격을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용은 부위 특이적 엔도뉴클레아제 (예를 들어, ZFN)를 평가하고 표적 유전자 (예를 들어, AHAS) 내에 트랜스진 및/또는 돌연변이를 도입하여 게놈 변형을 일으키는 임의의 일시적 발현 시스템의 사용을 포괄한다. 적절한 전달 시스템을 통한 일시적인 시험에 구상되는 식물 조직의 예는 잎 기반 조직, 캘러스, 자엽, 뿌리, 내배유, 배아, 꽃 조직, 화분, 표피 조직을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
통상의 기술자는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 트랜스제닉 식물에 안정하게 혼입될 수 있음을 인식할 것이다. 외인성 폴리뉴클레오티드 서열이 작동가능한 것으로 확인되면, 이를 유성 교배에 의해 다른 식물 내로 도입할 수 있다. 교배될 종에 따라, 임의의 다수의 표준 번식 기술이 사용될 수 있다.
조작된 식물 물질을 외인성 DNA 서열 상에 존재하는 마커에 의해 코딩된 표현형에 대해 선택 또는 스크리닝함으로써, 형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물을 확인 및 단리할 수 있다. 마커는 또한 선택 마커 또는 리포터 마커로서 기재되고 지칭될 수 있다. 마커는 형질전환된 식물 ("형질전환체")의 확인 및 선택을 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 마커는 외인성 서열로서 식물 세포의 게놈 내로 혼입된다. 일부 예에서, 외인성 마커 서열은 공여자 서열로서 부위 특이적 표적 유전자좌에서 식물 게놈 내로 혼입되며, 여기서 공여자 서열은 선택제 (예를 들어, 제초제 등)에 대한 내성을 생성하는 돌연변이를 함유한다. 다른 예에서, 외인성 마커 서열은 트랜스진 (즉, "트랜스제닉 선택 마커")으로서 식물 게놈 내로 혼입되며, 여기서 마커 유전자는 키메라 유전자 발현 카세트가 포함되도록 프로모터 및 3'-UTR에 작동가능하게 연결된다. 마커 유전자의 발현은 시각적 마커 단백질의 발현 또는 선택제 (예를 들어, 제초제, 항생제 등)에 대한 내성을 일으킨다.
예를 들어, 선택은, 형질전환 유전자 구축물이 내성을 부여하는 대상인 항생제 또는 제초제 (즉, 선택제로도 기재됨)의 억제량을 함유하는 배지 상에서 조작된 식물 물질을 성장시킴으로써 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 선택 마커 유전자는 제초제 내성 유전자를 포함한다.
제초제 내성 마커는 제초제에 비감수성인 변형된 표적 단백질, 또는 제초제가 작용할 수 있게 되기 전에 식물 내에서 제초제를 분해하고 해독시키는 효소를 코딩한다. 예를 들어, 제초제에 비감수성인 변형된 표적 단백질은 글리포세이트에 대한 내성을 포함할 것이다. 글리포세이트에 대한 식물 내성은 돌연변이체 표적 효소 5-엔올피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)를 코딩하는 유전자를 사용함으로써 수득되었다. EPSPS에 대한 유전자 및 돌연변이체는 널리 공지되어 있고, 돌연변이체 5-엔올피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSP), dgt-28 및 aroA 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자의 다양한 형태의 생체내 돌연변이유발을 통해 글리포세이트에 대한 내성을 제공한다. 식물에서 제초제를 분해하고 해독시키는 효소의 예는 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 내성을 포함할 것이다. 이들 제초제에 대한 내성은 트랜스진으로서 식물 세포 내에서 pat 또는 DSM-2, 니트릴라제, aad-1 또는 aad-12 유전자를 코딩하는 박테리아 유전자를 발현시킴으로써 얻는다. 포스포노 화합물에 대한 내성 유전자는 스트렙토미세스(Streptomyces) 종, 예를 들어 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토미세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes)로부터의 bar 및 pat 유전자, 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로피온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함한다. 시클로헥산디온 및/또는 아릴옥시페녹시프로판산 (할록시포프, 디클로포프, 페녹시프로프, 플루아지포프, 퀴잘로포프 포함)에 대한 내성을 부여하는 예시적인 유전자는 아세틸 조효소 A 카르복실라제 (ACCase), 예컨대; Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3의 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)을 포함하는 제초제는 광합성을 억제할 수 있다. 다른 제초제 내성 유전자 서열은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
항생제 저항성 마커는, 식물 상에서 항생제가 작용할 수 있게 되기 전에 식물 내에서 항생제를 분해하고 해독시키는 효소를 코딩한다. 적절한 농도로 사용되었을 때 식물 성장 및 발달을 방해할 수 있는 다양한 유형의 항생제, 예컨대 카나마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신 및 히그로마이신이 공지되어 있다. 외인성 서열 (예를 들어, 박테리아 유전자)이 수득되고, 트랜스진으로서 발현되어 항생제를 파괴시킬 수 있다. 예를 들어, 항생제 내성 마커 유전자는 항생제 저항성을 코딩하는 외인성 서열, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제, 스펙티노마이신 저항성, 카나마이신 저항성 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 유전자를 포함한다.
추가로, 형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한 가시적 마커 유전자를 코딩하는 리포터 유전자의 활성에 대한 스크리닝에 의해 확인될 수 있다. 리포터 유전자는 전형적으로 재조합 핵산 구축물로서 제공되고 트랜스진으로서 식물 세포 내로 통합된다. β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), DsRed, β-갈락토시다제를 코딩하는 리포터 유전자와 같은 단백질의 시각적 관찰을 이용하여 형질전환체를 확인하고 선택할 수 있다. 이러한 선택 및 스크리닝 방법론은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
마커 유전자들의 상기 목록은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 임의의 리포터 또는 선택 마커 유전자가 본 개시내용에 포괄된다. 더욱이, 잡초 종을 방제하기 위해 재배지 환경에 적용된 제초제에 대한 내성을 제공하도록 사용되는 형질 (예를 들어, 제초제 내성 형질)과 비교하여, 형질전환된 식물의 확인 및 선택을 위해 마커 (예를 들어, 제초제 내성 마커)가 주로 사용된다는 것을 인지해야 한다.
물리적 및 생화학적 방법을 또한 사용하여, 안정하게 삽입된 유전자 구축물을 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체, 또는 부위-특이적 엔도뉴클레아제(예컨대, ZFN)의 일시적인 발현으로부터 유래된 표적 유전자 변경 게놈 DNA를 함유하는 식물 세포를 확인할 수 있다. 이들 방법은 1) 재조합 DNA 삽입체의 구조를 검출하고 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구축물의 RNA 전사체를 검출하고 조사하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 상기 유전자 생성물이 유전자 구축물에 의해 코딩되는 경우, 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소적 검정; 4) 유전자 구축물 생성물이 단백질인 경우, 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전 또는 효소 결합 면역검정 (ELISA)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 기술, 예컨대 계내 혼성화, 효소 염색, 및 면역염색을 또한 사용하여, 특정 식물 기관 및 조직에서의 재조합 구축물의 존재 또는 발현을 검출할 수 있다. 모든 이러한 검정을 행하기 위한 방법은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하는 유전자 조작의 효과는, 예를 들어 관심 조직으로부터 단리된 RNA (예를 들어, mRNA)의 노던 분석에 의해 관찰될 수 있다. 전형적으로, mRNA가 존재하거나, mRNA 양이 증가하였다면, 상응하는 트랜스진이 발현되는 것으로 추정될 수 있다. 유전자 및/또는 코딩된 폴리펩티드 활성을 측정하는 다른 방법도 사용될 수 있다. 사용된 기질 및 반응 생성물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라, 상이한 유형의 효소적 검정이 사용될 수 있다. 추가로, 발현된 폴리펩티드의 수준은 면역화학적으로, 즉, ELISA, RIA, EIA 및 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 항체 기반 검정, 예컨대 전기영동 검출 검정 (염색 또는 웨스턴 블롯팅 이용)에 의해 측정될 수 있다. 한 가지 비제한적 예로서, ELISA 검정을 이용한 AAD-1 및 PAT 단백질의 검출이 미국 특허 공개 번호 20090093366에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 트랜스진은 식물의 일부 조직에서 또는 일부 발달 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 트랜스진은 실질적으로 그의 전체 생활 주기에 따라 실질적으로 모든 식물 조직에서 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합 발현 방식이 또한 적용가능하다.
본 개시내용은 또한 트랜스진 또는 유전자 구축물을 갖는, 상기 기재된 트랜스제닉 식물의 종자를 포함한다. 본 개시내용은 또한 트랜스진 또는 유전자 구축물을 갖는, 상기 기재된 트랜스제닉 식물의 자손, 클론, 세포주 또는 세포를 포함한다.
융합 단백질 (예컨대, ZFN) 및 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터는 유전자 조절, 표적화 절단 및/또는 재조합을 위해 식물에 직접 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 식물은 다수의 파라로그 표적 유전자를 함유한다. 예를 들어, AHAS에 대해, 브라시카 나푸스는 5개의 파라로그를 포함하고 밀은 3개의 파라로그를 포함한다. 따라서, 하나 이상의 상이한 융합 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터가 식물 내의 하나 이상의 이들 파라로그 유전자를 표적화하기 위해 식물에 투여될 수 있다.
유효량의 투여는 처리하고자 하는 식물 세포와 궁극적으로 접촉되도록 융합 단백질을 상기 식물 세포 내로 도입시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. ZFP는 바람직하게는 허용되는 담체와 함께, 임의의 적합한 방식으로 투여된다. 이러한 조정제를 투여하는 적절한 방법은 통상의 기술자가 이용가능하고 이들에게 널리 공지되어 있으며, 한가지를 초과하는 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 종종 특정 경로가 또 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
담체가 또한 사용될 수 있고, 이는 투여될 특정 조성물, 뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 이용 가능한 광범위한 적합한 담체 제제가 존재한다.
실시예
실시예 1: AHAS 게놈 표적 서열의 특성화
AHAS 서열의 확인
3개의 동조 AHAS 유전자에 대한 전사된 영역을 확인하고, 결정하였다. 이들 신규 서열을 서열 1, 서열 2 및 서열 3으로서 나열하였다. 선행 서열분석 노력에서는 트리티쿰 아에스티붐으로부터 AHAS 유전자의 동조 카피를 확인하고 염색체 6A, 6B 및 6D의 긴 아암에 유전적으로 맵핑하였다 (Anderson et al., (2004) Weed Science 52:83-90; 및 Li et al., (2008) Molecular Breeding 22:217-225). 발현된 서열 태그 (EST)의 서열 분석 및 진뱅크(Genbank)에서 이용가능한 게놈 서열 (수탁 번호: AY210405.1, AY210407.1, AY210406.1, AY210408.1, FJ997628.1, FJ997629.1, FJ997631.1, FJ997630.1, FJ997627.1, AY273827.1)을 사용하여 AHAS 유전자의 동조 카피에 대한 전사된 영역 (서열 1-3)을 결정하였다.
전사된 영역의 상류 및 하류에 위치하는 신규한 비-코딩 서열을 최초로 특성화하였다. 이들 비-코딩 서열을 완전히 특성화하기 위해, AHAS 유전자의 3개의 동조 카피 각각에 대해 전사된 서열을, 트리티쿰 아에스티붐 재배종 차이니즈 스프링(cv. Chinese Spring)의 전체 게놈 샷건 서열분석으로부터 생성된 비조립된 로슈(ROCHE) 454™ 서열 리드(read)를 스크리닝하기 위한 BLASTN™ 질의서열로서 사용하였다. 트리티쿰 아에스티붐 재배종 차이니즈 스프링의 로슈 454™ 서열 리드는 5배 서열 적용범위(coverage)로 생성되었다. 서열 조립은 로슈 454™의 시퀀처(SEQUENCHER) 소프트웨어™ (진코드스(GeneCodes), 미시건주 앤 아버)를 사용하여 완료하였다. 유의한 BLASTN™ 히트(hit) (E-값 <0.0001)를 갖는 서열 리드를 사용하여 이들 비-전사된 영역을 특성화하였다. BLASTN™ 분석 및 서열 조립의 반복 라운드를 수행하였다. 각각의 반복은, 모든 서열이 단일 연속적인 서열로서 컴파일링되도록 선행 반복으로부터 조립된 AHAS 서열을 통합하였다. 각각 염색체 6A, 6B 및 6D에 위치하는 동조 AHAS 유전자에 대한 총 4,384, 7,590 및 6,205개의 게놈 서열이 특성화되었다 (서열 4-6).
트리티쿰 아에스티붐 재배종 밥화이트(Bobwhite) MPB26RH로부터 단리된 AHAS 유전자의 서열 분석
고도의 특이성으로 서열에 결합할 수 있는 특이적인 아연 핑거 단백질의 설계에 적합한 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해 트리티쿰 아에스티붐 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터 AHAS 유전자의 동조 카피를 클로닝하고 서열분석하였다. 진뱅크 및 로슈 454™ AHAS 유전자 서열에 존재하는 뉴클레오티드의 주석을 확인하기 위해, 그리고 재배종 밥화이트 MPB26RH 및 진뱅크 및 로슈 454™ 서열을 얻은 다른 밀 변종 사이의 대립유전자 변이 때문에, 트리티쿰 아에스티붐 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터 얻은 AHAS 뉴클레오티드 서열의 서열 분석이 필요하였다.
AHAS 유전자의 증폭을 위해 PCR 프라이머의 코호트 (표 1)를 설계하였다. 프라이머는 CLUSTALW™를 사용하여 생성된 다수의 서열 정렬로부터 생산된 컨센서스 서열로부터 설계하였다 (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Research 22:4673-80). 서열 정렬은 5배 적용범위에서 완료된 로슈 454™ 서열분석으로부터 생성된 재배종 차이니즈 스프링 서열분석 데이타로부터 조립되었다.
표 1에 나타낸 바와 같이, PCR 프라이머는 3개의 모든 동조 서열을 증폭하거나 단일 동조 서열만을 증폭하도록 설계되었다. 예를 들어, AHAS 유전자의 전사된 영역을 증폭하기 위해 사용된 PCR 프라이머는 모든 3개의 동조 카피를 단일 다중 PCR 반응에서 동시에 증폭하도록 설계되었다. 비-전사된 영역을 증폭하기 위해 사용된 PCR 프라이머는 3개의 모든 동조 카피를 증폭하거나 단일 동조 카피만을 증폭하도록 설계되었다. 모든 PCR 프라이머는 길이가 18 내지 27개 뉴클레오티드이고 융점이 60 내지 65℃, 최적 63℃가 되도록 설계되었다. 또한, 몇몇 프라이머는 각각의 밀 서브-게놈으로부터의 유전자 카피를 구별하는 뉴클레오티드 서열 변이에 걸쳐 끝에서 두 번째의 염기 (포스포로티오에이트 연결을 함유하고 표 1에 별표 [*]로 표시됨)를 위치시키도록 설계되었다. 표 1에 설계 및 합성된 PCR 프라이머를 나열하였다.
표 1: AHAS 서열의 PCR 증폭에 사용된 프라이머 서열
Figure pct00001
서브-게놈-특이적 증폭을, 각각의 밀 서브-게놈으로부터의 유전자 카피를 구별하는 뉴클레오티드 서열 변이 위에 끝에서 두 번째의 염기 (포스포로티오에이트 연결을 함유함)를 위치시키도록 설계된 프라이머를 사용하는 온-오프 PCR (Yang et al., (2005) Biochemical and Biophysical Research Communications 328:265-72)을 사용하여 달성하였다. 2개의 상이한 세트의 PCR 조건이 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터 AHAS 유전자의 동조 카피를 증폭하기 위해 사용되었다. 전사된 영역에 대해, PCR 반응액은 0.2 mM dNTP, 1X 이몰라제(IMMOLASE) PCR™ 완충제 (바이올린(Bioline), 매사추세츠주 타운튼), 1.5 mM MgCl2, 0.25 단위 이몰라제 DNA 폴리머라제™ (바이올린, 매사추세츠주 타운튼), 각각 0.2 μM의 정방향 및 역방향 프라이머, 및 약 50 ng 게놈 DNA를 함유하였다. AHAS_1F1 및 AHAS_1R1 프라이머를 함유하는 반응액에 8% (v/v) DMSO를 보충하였다. 비-전사된 영역에 대해, PCR 반응액은 0.2 mM dNTP, 1X 퓨젼(PHUSION) GC 완충제™ (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 입스위치)), 0.5 단위 HOT-START 퓨젼 DNA™ 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스), 0.2 μM의 각각의 정방향 및 역방향 프라이머, 및 약 50 ng 게놈 DNA를 함유하였다. PCR을 MJ PTC200® 써모사이클러 (바이오라드(BioRad), 캘리포니아주 허큘레스)를 사용하여 최종 25 μl 반응 부피로 수행하였다. PCR 순환 이후, 반응 생성물을 정제하고, PGEM-T 이지 벡터(EASY VECTOR)™ (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)를 이용하여 이. 콜라이 JM109 세포 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 DNAEASY 플라스미드 DNA 정제 키트™ (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아)로 추출하고, ABI3730XL® 자동 모세관 전기영동 플랫폼에서 빅다이(BIGDYE)® v3.1 화학 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 생거(Sanger) 서열분석하였다. 시퀀처 소프트웨어™ (진코드스, 미시건주 앤 아버)를 사용하여 수행된 서열 분석을 이용하여 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터 각각의 동조 유전자 카피 (서열 25, 서열 26, 및 서열 27)에 대한 컨센서스 서열을 생성하였다. CLUSTALW™를 사용하여, AHAS 유전자 카피를 구별하는 동조 서열 변이가 확인된 다수의 컨센서스 서열 정렬을 생산하였다.
실시예 2: AHAS 유전자 서열에 특이적인 아연 핑거 결합 도메인의 설계
AHAS 유전자의 동조 카피의 확인된 DNA 서열에 대해 지시된 아연 핑거 단백질을 상기 기재된 바와 같이 설계하였다. 예를 들어, 문헌 [Urnov et al., (2005) Nature 435:646-551]을 참조한다. 예시적인 표적 서열 및 인식 나선을 표 2 (인식 나선 영역 설계) 및 표 3 (표적 부위)에 제시하였다. 표 3에서, ZFP 인식 나선이 접촉하는 표적 부위 내의 뉴클레오티드를 대문자로 나타내고; 비-접촉된 뉴클레오티드를 소문자로 나타낸다. 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 표적 부위는 다음과 같은 AHAS 유전자 내의 4개의 영역에 있었다: 세린 653 아미노산 잔기의 약 500-bp 상류 영역, 세린 653 아미노산 잔기에 인접한 (30-bp 이내) 상류 영역, 세린 653 아미노산 잔기에 인접한 (80-bp 이내) 하류 영역, 및 세린 653 아미노산 잔기의 약 400-bp 하류 영역.
표 2: AHAS 아연 핑거 설계 (N/A는 "적용가능하지 않음"을 나타냄)
Figure pct00002
Figure pct00003
표 3: AHAS 아연 핑거의 표적 부위
Figure pct00004
Figure pct00005
AHAS 아연 핑거 설계를 CCHC 구조의 적어도 하나의 핑거를 갖는 단백질을 코딩하는 아연 핑거 발현 벡터 내로 혼입하였다. 미국 특허 공개 번호 2008/0182332를 참조한다. 특히, 각각의 단백질 내의 마지막 핑거는 인식 나선에 대한 CCHC 백본을 가졌다. 비-정규 아연 핑거-코딩 서열을, 제아 메이스로부터 유래된 opaque-2 핵 국재화 신호 및 4개의 아미노산 ZC 링커를 통해 유형 IIS 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인 (문헌 [Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579)에 융합시켜, AHAS 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 형성하였다. 미국 특허 번호 7,888,121을 참조한다.
활성 뉴클레아제 확인을 위해 이전에 입증된 출아 효모 기반 시스템을 이용하여 최적 아연 핑거를 절단 활성에 대해 검증하였다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2009/0111119; 문헌 [Doyon et al., (2008) Nat Biotechnology 26:702-708; Geurts et al., (2009) Science 325:433]을 참조한다. 다양한 기능적 도메인에 대한 아연 핑거를 생체내 사용을 위해 선택하였다. 추정 AHAS 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 결합하도록 설계, 생산 및 시험된 다수의 ZFN 중에서, 13종의 ZFN이 높은 수준의 생체내 활성을 갖는 것으로 확인되었고, 추가 실험을 위해 선택되었다. 11종의 ZFN은 3개의 동조 유전자 카피에 결합하도록 설계하고, 2종의 ZFN (29989-2A-29988 및 30006-2A-30008)은 염색체 6D 상의 유전자 카피에만 결합하도록 설계하였다. 13종의 ZFN은 식물체내 특유한 AHAS 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 효율적으로 결합하여 절단할 수 있는 것으로 특성화되었다. 예시적인 벡터가 하기 기재되어 있다.
실시예 3: 일과성 검정을 이용한 AHAS 유전자의 아연 핑거 뉴클레아제 절단의 평가
ZFN 구축물 조립
실시예 2에 기재된 바와 같은 효모 검정을 이용하여 확인된 ZFN 유전자 발현 구축물을 함유하는 플라스미드 벡터를 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 기능 및 기술을 사용하여 설계하고 제작하였다. 각각의 ZFN-코딩 서열을 아연 핑거 뉴클레아제의 상류에 위치한 opaque-2 핵 국재화 신호 (Maddaloni et al., (1989) Nuc. Acids Res. 17:7532)를 코딩하는 서열에 융합하였다.
융합 단백질의 발현을, 5' 비번역 영역 (UTR)을 포함하는 제아 메이스 유비퀴틴 유전자로부터 구성적 프로모터에 의해 유도하였다 (Toki et al., (1992) Plant Physiology 100; 1503-07). 발현 카세트는 또한 제아 메이스 퍼옥시다제 (Per5) 유전자로부터의 3' UTR (전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위 포함)을 포함하였다 (미국 특허 공개 번호 2004/0158887). 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 (Szymczak et al., (2004) Nat Biotechnol. 22:760-760)로부터의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 자가-가수분해 2A를 구축물 내로 클로닝된 2개의 아연 핑거 뉴클레아제 융합 단백질 사이에 부가하였다.
플라스미드 벡터를 인-퓨전(IN-FUSION)™ 어드밴티지 테크놀로지(Advantage Technology) (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 조립하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (매사추세츠주 입스위치)로부터 입수하였고, T4 DNA 리가제 (인비트로겐, 캘리포니아주 칼스배드)를 DNA 라이게이션을 위해 사용하였다. 플라스미드 제조는 공급업체의 지침에 따라 뉴클레오스핀(NUCLEOSPIN)® 플라스미드 키트 (머셔레이-나겔 인크.(Macherey-Nagel Inc.), 펜실베니아주 베들레헴)) 또는 플라스미드 미디(Midi) 키트 (퀴아젠)를 사용하여 수행하였다. DNA 단편은 아가로스 트리스-아세테이트 겔 전기영동 후에 퀴아퀵(QIAQUICK) 겔 추출 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 단리하였다. 라이게이션 반응의 콜로니를 초기에 미니프렙(miniprep) DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적 서열분석 업체 (유로핀스 MWG 오페론(Eurofins MWG Operon), 앨라배마주 헌츠빌)에 의해 서열분석하였다. 서열 데이터를 수집하고, 시퀀처™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션(Gene Codes Corp.), 미시건주 앤 아버)를 사용하여 분석하였다.
생성된 13종의 플라스미드 구축물: pDAB109350 (ZFN 29732-2A-29730), pDAB109351 (ZFN 29732-2A-29731), pDAB109352 (ZFN 29753-2A-29754), pDAB109353 (ZFN 29968-2A-29967), pDAB109354 (ZFN 29965-2A-29964), pDAB109355 (ZFN 29968-2A-29966), pDAB109356 (ZFN 29969-2A-29967), pDAB109357 (ZFN 29971-2A-29970), pDAB109358 (ZFN 29989-2A-29988), pDAB109359 (ZFN 30006-2A-30008), pDAB109360 (ZFN 30012-2A-30018), pDAB109361 (ZFN 30014-2A-30018) 및 pDAB109385 (ZFN 29770-2A-29769)를 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.
대표적인 플라스미드 pDAB109350 및 pDAB109360을 도 1 및 도 2에 제시하였다.
형질감염을 위한 ZFN 구축물로부터의 DNA의 제조
트리티쿰 아에스티붐 원형질체로의 전달 전에, 각각의 ZFN 구축물에 대한 플라스미드 DNA를, 공급업체의 지침에 따라 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙(PURE YIELD PLASMID MAXIPREP) 시스템® (프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 위스콘신주 매디슨) 또는 플라스미드 맥시(MAXI) 키트® (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 이. 콜라이의 배양물로부터 제조하였다.
밀 엽육세포 원형질체의 단리
밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 엽육세포 원형질체를 다음과 같은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-매개 DNA 전달을 이용한 형질감염을 위해 제조하였다.
성숙 종자를 80% (v/v) 에탄올에 30초 동안 침지시키고, 수돗물로 2회 세정한 후, 선회 진탕기 상에서 140 rpm에서 20분 동안 20% 도메스토스(DOMESTOS)® (0.8% v/v 유효 염소)로 세척함으로써 표면 멸균하였다. 도메스토스®를 경사분리하여 제거하고, 종자를 멸균수로 4회 세정하였다. 종자를 와트만(WHATMAN)™ 여과지 상에 두어 잉여 물을 제거하였다. 종자를 멸균 페트리(PETRI)™ 디쉬에 몇 장의 물에 적신 멸균 와트만™ 여과지 상에 두고, 24℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 종자를 15분간 진탕하면서 15% 도메스토스®로 2차 표면 멸균한 다음, 상기 기재된 바와 같이 멸균수로 세정하였다. 종자를 24℃에서 24시간 동안 무라쉬게(Murashige) 및 스쿠그(Skooge) (MS) 고체화 배지 상에 두었다. 최종적으로, 종자를 10분간 진탕하면서 10% 도메스토스®로 3차 표면 멸균한 다음, 상기 기재된 바와 같이 멸균수로 세정하였다. 종자를 종구(crease)를 아래쪽으로 해서 MS 고체화 배지 상에 두었고 (페트리™ 디쉬당 10개의 종자), 암실에서 24℃에서 14-21일 동안 발아시켰다.
발아된 종자로부터 약 2-3 g의 잎 물질을 2-3 cm 길이로 절단하고, 사전에 칭량된 페트리™ 디쉬에 놓았다. 잎집 및 황화 잎 물질은 버렸다. 약 10 mL의 잎 효소 소화 믹스 (0.6 M 만니톨, 10 mM MES, 1.5% w/v 셀룰라제 R10, 0.3% w/v 마세로자임(macerozyme), 1 mM CaCl2, 0.1% 소 혈청 알부민, 0.025% v/v 플루론산, 5 mM β-머캅토에탄올, pH 5.7)을 페트리™ 디쉬 내로 피펫팅하고, 잎 물질을 날카로운 메스 칼날을 사용하여 1-2 mm 절편으로 횡으로 잘게 잘랐다. 잎 물질 건조에 의해 발생하는 세포 손상을 방지하기 위해 잎 소화 믹스의 존재 하에 잎 물질을 잘게 잘랐다. 추가의 잎 효소 소화 믹스를 잎 물질 생중량 1 g당 10 mL의 부피로 페트리™ 디쉬에 첨가하고, 진공 (20" Hg) 압력에 30분 동안 적용하였다. 페트리™ 디쉬를 파라필름(PARAFILM)®으로 밀봉하고, 4-5시간 동안 부드럽게 회전 진탕하면서 28℃에서 인큐베이션하였다.
잎 절편으로부터 효소 소화 믹스 내로 방출된 엽육세포 원형질체를, 소화 현탁액을 100 마이크로미터 메쉬를 통해 50 mL 수집 튜브 내로 통과시킴으로써 식물 파편으로부터 단리하였다. 원형질체의 수득량을 최대화하기 위해, 소화된 잎 물질을 3회 세척하였다. 각각의 세척은 10 mL 세척 완충제 (20 mM KCl, 4 mM MES, 0.6 M 만니톨, pH 5.6)를 페트리™ 디쉬에 첨가한 후, 1분 동안 부드럽게 회전시키고, 이어서 세척 완충제를 100 마이크로미터 체를 통해 동일한 50 mL 수집 튜브 내로 통과시킴으로써 수행하였다. 이어서, 여과된 원형질체 현탁액을 70 마이크로미터 체에 통과시킨 후, 40 마이크로미터 체에 통과시켰다. 이어서, 6 mL 분취량의 여과된 원형질체 현탁액을 뚜껑이 있는 12 mL 둥근 바닥 원심분리 튜브로 옮기고, 70 g 및 12℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 이후, 상청액을 제거하고, 원형질체 펠릿을 각각 7 mL 세척 완충제 중에 재현탁시켰다. 원형질체를 상기 기재된 바와 같이 원심분리에 의해 2차로 펠릿화하였다. 원형질체를 각각 1 mL 세척 완충제 중에 재현탁시키고, 2개의 원심분리 튜브에 모았다. 세척 완충제 부피를 각각의 튜브에서 7 mL의 최종 부피로 조정한 후, 원심분리를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 상청액의 제거 이후, 원형질체 펠릿을 1 mL 세척 완충제 중에 재현탁시키고, 단일 튜브에 모았다. 엽육세포 원형질체의 수득량을 노이바우어(Neubauer) 혈구계를 사용하여 추정하였다. 에반스 블루(Evans Blue) 염색을 사용하여, 회수된 살아있는 세포의 비율을 결정하였다.
엽육세포 원형질체의 PEG-매개 형질감염
약 106개의 엽육세포 원형질체를 12 mL 둥근 바닥 튜브에 첨가하고, 70 g에서 원심분리하여 펠릿화한 후, 상청액을 제거하였다. 원형질체를 70 μg의 플라스미드 DNA를 함유하는 600 μl 세척 완충제 중에 재현탁시켰다. 플라스미드 DNA는 상기 기재된 아연 핑거 뉴클레아제 구축물로 이루어졌다. 이어서, 동일한 부피의 40% PEG 용액 (40% w/v PEG 4,000, 0.8 M 만니톨, 1M Ca(NO3)2, pH 5.6)을 튜브의 부드러운 회전에 의해 동시에 혼합하면서 원형질체 현탁액에 천천히 첨가하였다. 원형질체 현탁액을 임의의 교반 없이 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
추가의 6 mL 부피의 세척 완충제를 1 mL, 2 mL 및 3 mL의 순차적인 분취량으로 원형질체 현탁액에 천천히 첨가하였다. 동시에 부드럽게 혼합하여 각각의 순차적인 분취량을 함유하는 균질 현탁액을 유지하였다. 원형질체 현탁액의 절반을 제2의 12 mL 둥근 바닥 튜브로 옮기고, 추가의 3 mL 부피의 세척 완충제를 동시에 부드럽게 혼합하면서 각각의 튜브에 천천히 첨가하였다. 원형질체를 10분 동안 70 g에서 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 원형질체 펠릿을 각각 1 mL 세척 완충제 중에 재현탁시킨 후, 한쌍의 둥근 바닥 튜브로부터의 원형질체를 단일 12 mL 튜브에 모았다. 추가의 7 mL 세척 완충제를 모은 원형질체에 첨가한 후, 상기 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 상청액을 완전히 제거하고, 원형질체 펠릿을 2 mL 퀴아오(Qiao) 배지 (0.44% w/v MS + 비타민, 3 mM MES, 0.0001% w/v 2,4-D, 0.6 M 글루코스, pH 5.7) 중에 재현탁시켰다. 원형질체 현탁액을 멸균 3 cm 페트리™ 디쉬로 옮기고, 암실에서 24℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
엽육세포 원형질체로부터의 게놈 DNA 단리
형질감염된 원형질체를 3 cm 페트리™ 디쉬로부터 2 mL 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 세포를 70 g에서 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 형질감염된 원형질체의 회수를 최대화하기 위해, 페트리™ 디쉬를 1 mL의 세척 완충제로 3회 세정하였다. 각각의 세정은 세척 완충제를 페트리™ 디쉬에서 1분 동안 회전시킨 후, 액체를 동일한 2 ml 미세원심분리 튜브에 전달함으로써 수행하였다. 각각의 세정 종료시에, 세포를 70 g에서 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 펠릿화된 원형질체를 액체 질소로 급속 냉동한 후, -40℃ 및 133 x 10-3 mBar 압력에서 랍콘코 프리존(LABCONCO FREEZONE) 4.5® (랍콘코(Labconco), 미주리주 캔자스 시티)에서 24시간 동안 동결 건조하였다. 동결건조된 세포를, 조직 파괴를 필요로 하지 않으면서 원형질체 세포를 용해 완충제에 직접 첨가한 것을 제외하고는 제조업체의 지침에 따라 DNEASY® 식물 DNA 추출 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 DNA 추출에 적용하였다.
ZFN 서열 절단을 위한 원형질체 게놈 DNA의 PCR 검정
AHAS 유전자좌에 대해 설계된 ZFN의 절단 효능 및 표적 부위 특이성을 조사할 수 있도록, 하나 이상의 ZFN 표적 부위가 포획되는 300-bp까지의 단편을 증폭하도록 PCR 프라이머를 설계하였다. 프라이머 중의 하나는 포획된 ZFN 표적 부위(들)의 100-bp 윈도우 내에 존재하도록 설계되었다. 상기 설계 전략에서, 형질감염된 원형질체 내의 표적 ZFN 부위의 완전성을 평가하기 위해 일루미나(Illumina) 짧은 리드 기술을 사용할 수 있다. 또한, PCR 프라이머는, AHAS 유전자의 3개의 동조 카피를 증폭시키고 동조체를 구별하는 뉴클레오티드 서열 변이가 포획되도록 하여 일루미나 서열 리드가 이들이 유래된 밀 서브-게놈을 명백하게 추적할 수 있도록 설계되었다.
총 4개 세트의 PCR 프라이머를 ZFN 표적 부위 유전자좌를 증폭하기 위해 설계하였다 (표 4). 일루미나 짧은 리드 서열분석 화학과의 상용성을 제공하기 위해 각각 정방향 및 역방향 프라이머의 5' 말단에 일루미나 SP1 및 SP2 서열을 갖도록 각각의 프라이머 세트를 합성하였다. 합성된 프라이머는 또한 끝에서 두 번째의 5' 및 3' 뉴클레오티드 (표 4에 별표 [*]로 표시함)에 포스포로티오에이트 연결을 함유하였다. 5' 포스포로티오에이트 연결은 일루미나 SP1 및 SP2 서열의 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공하였고, 3' 포스포로티오에이트 연결은 온-오프 PCR을 사용한 표적 AHAS 서열의 증폭에 대한 PCR 특이성을 개선하였다 (Yang et al., (2005)). 모든 PCR 프라이머는 길이가 18 내지 27개 뉴클레오티드이고 융점이 60 내지 65℃, 최적 63℃가 되도록 설계되었다.
표 4에서, AHAS 유전자에 특이적인 뉴클레오티드를 대문자로 나타내고; 일루미나 SP1 및 SP2 서열에 대응하는 뉴클레오티드는 소문자로 나타낸다. 각각의 프라이머 세트를 PCR 증폭 생성물의 생거-기반 서열분석을 통해 3개의 동조 AHAS 유전자 카피의 증폭에 대해 실험에 의해 시험하였다.
표 4: AHAS ZFN 절단 효능 및 표적 부위 특이성을 평가하기 위해 사용된 프라이머 서열
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형질감염된 밀 엽육세포 원형질체로부터 추출된 게놈 DNA로부터의 ZFN 표적 부위 유전자좌의 PCR 증폭을 이용하여, 합성에 의한 일루미나-기반 서열분석 기술을 위한 정확한 포맷으로, 필수적인 유전자좌 특이적 DNA 분자를 생성하였다. 각각의 PCR 검정은 200 ng의 출발 DNA (트리티쿰 아에스티붐 게놈의 약 12,500개 세포 등가물)에 대한 작업에 최적화시켰다. 충분한 카피의 트리티쿰 아에스티붐 게놈이 ZFN 효율 및 표적 부위 특이성의 신뢰가능한 평가를 위해 검정됨을 보장하기 위해 형질감염된 샘플마다 다중 반응을 수행하였다. 개별 원형질체로부터 취한 트리티쿰 아에스티붐 게놈의 200,000개 카피와 동등한 약 16회의 PCR 검정을 형질감염된 샘플마다 수행하였다. 단일 PCR 마스터-믹스를 각각의 형질감염된 샘플에 대해 제조하였다. ZFN 표적 부위의 최적 PCR 증폭을 보장하기 위해 (즉, PCR 시약이 제한되는 것을 방지하고 PCR이 지수 증폭기에 유지되도록 보장하기 위해), 초기 검정은 표적 조직에 대해 수행하기 위한 최적 사이클 수를 결정하기 위해 정량적 PCR 방법을 이용하여 수행하였다. 초기 PCR은 MX3000P 써모사이클러™ (스트라타진(Stratagene)) 상에서 필요한 음성 대조군 반응을 사용하여 수행하였다. 정량적 PCR 기구로부터 수집한 데이터 결과로부터, 형광의 상대적인 증가를 사이클별로 플롯팅하고, 공통 분자의 과다-순환 및 편향 증폭을 감소시키기 위한 시도로 반응에 시약이 제한되지 않도록 하면서 충분한 증폭을 제시할 사이클 수를 검정마다 결정하였다. 미사용 마스터 믹스는 정량적 PCR 분석이 종료되고 최적 사이클 수가 결정될 때까지 얼음 상에서 유지하였다. 이어서, 남은 마스터 믹스를 요구되는 수의 반응 튜브 (ZFN 검정당 약 16개) 내에 분취하고, PCR 증폭을 최적 사이클 수에 대해 수행하였다. 증폭 이후, 동일한 ZFN 표적 부위에 대한 샘플을 함께 모으고, ZFN당 200 μl의 모은 생성물을 제조업체의 지침에 따라 퀴아퀵 미니일루트(MINIELUTE) PCR 정제 키트™ (퀴아젠)로 정제하였다.
일루미나 짧은 리드 기술을 사용하여 샘플의 서열을 분석할 수 있도록, 추가 라운드의 PCR을 수행하여, 일루미나 P5 및 P7 서열, 및 서열 리드를 이들이 기원하는 샘플에 대해 명백하게 추적하는데 사용될 수 있는 서열 바코드 인덱스를 증폭된 DNA 단편 상에 도입하였다. 이것은, 부분적으로 제1 증폭 라운드에 첨가된 SP1 및 SP2 서열에 상보성이지만, 또한 샘플 인덱스 및 P5 및 P7 서열을 함유하는 프라이머를 사용하여 수행하였다. 통상적인 단편의 과다 증폭을 보이지 않으면서 추가의 서열을 주형에 부가하기 위해 필요한 최적 PCR 사이클 수를 상기 기재된 바와 같이 정량적 PCR 사이클 분석에 의해 결정하였다. 증폭 이후, 생성된 생성물을 1:1.7의 DNA 대 비드 비로 앰퓨어 마그네틱 비즈(AMPURE MAGNETIC BEADS)® (베크만-쿨터(Beckman-Coulter))를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 적정하여, 제조업체의 지침에 따라 PCR-기반 라이브러리 정량 키트 (KAPA)를 사용하여 일루미나 짧은 리드 기술에 의해 서열분석하였다. 샘플을 cBot 클러스터 생성 키트 (일루미나)를 사용한 서열분석을 위해 제조하고, 제조업체의 지침에 따라 100-bp 쌍형성 말단 서열 리드를 생성하기 위해 일루미나 GAIIx™ 또는 HISEQ2000™ 기기 (일루미나)에서 서열분석하였다.
표적 ZFN 부위에서 NHEJ를 검출하기 위한 데이터 분석
형질감염된 엽육세포 원형질체에 대해 제조된 샘플 라이브러리에 대한 일루미나 짧은 리드 서열 데이터의 생성 후에, 표적 ZFN 부위에서 결실된 뉴클레오티드를 확인하기 위해 생물정보학적 분석을 수행하였다. 상기 결실은 비-상동 말단 연결 (NHEJ) DNA 복구에 의한 식물체내 ZFN 활성의 지표로 공지되어 있다.
NHEJ 결실을 갖는 서열 리드를 확인하기 위해서, HISEQ2000™ 기기 (일루미나)에서 생성된 서열 데이터의 처리를 위한 제조업체 공급된 스크립트를 사용하여, 짧은 서열 리드를 이들이 기원하는 원형질체 샘플에 컴퓨터에 의해 먼저 할당하였다. 샘플 할당은 상기 기재된 바와 같이 라이브러리 제조 동안 도입된 바코드 인덱스 서열을 기초로 하였다. 라이브러리 제조를 위해 사용된 6-bp 바코드 인덱스가 서로 적어도 2-단계 서열 차이에 의해 구별되는 경우에 정확한 샘플 할당이 확정되었다.
샘플 할당 후에, 품질 필터에 모든 서열을 통과시켰다. 품질 필터링은 맞춤 개발된 PERL 스크립트에서 시행하였다. 서열 리드는 3개 초과의 모호한 염기가 존재하거나, 또는 중간 프레드(Phred) 스코어가 20 미만이거나, 또는 프레드 스코어가 20 미만인 3개 이상의 연속적인 염기가 존재하거나, 또는 서열 리드의 길이가 40개 뉴클레오티드보다 짧은 경우에 제외되었다.
이어서, 품질 트리밍된 서열을 이들이 기원하는 밀 서브-게놈에 대해 추적하였다. 이것은, 서브-게놈 할당이 상기 기재된 바와 같이 AHAS 유전자의 3개의 동조 카피를 증폭하기 위해 사용된 PCR 프라이머에 의해 포획된 뉴클레오티드 서열 변이체의 반수체로부터 결정되는 제2 맞춤 개발된 PERL 스크립트를 사용하여 수행하였다.
최종적으로, 서브-게놈-할당된 서열 리드 내의 ZFN 절단 부위에서 NHEJ 결실의 빈도를 제3 맞춤 개발된 PERL 스크립트 및 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 2010 (마이크로소프트 코포레이션(Microsoft Corporation))에서 수동 데이터 조작을 사용하여 각각의 샘플에 대해 결정하였다. 이것은 각각의 샘플 내의 각각의 서브-게놈에 대한 특유한 NHEJ 결실의 빈도를 계수함으로써 수행하였다.
2개의 접근법을 사용하여, 시험된 ZFN의 절단 효율 및 특이성을 평가하였다. 절단 효율은 ZFN 표적 부위에 NHEJ 결실을 함유하는 서브-게놈 할당된 서열의 비율로서 표현하였다 (1백만 리드당 부 (ppm)). 그의 관찰된 절단 효율에 의한 ZFN의 순위 평가를 사용하여 서브-게놈-특이적 방식으로 AHAS 유전자의 4개의 표적 영역 각각에 대한 최고의 절단 활성을 갖는 ZFN을 확인하였다.
시험된 모든 ZFN은 식물체내 ZFN 활성에 대해 예상된 것과 일치하는 NHEJ 결실 크기 분포를 보였다. 절단 특이성은 3개의 서브-게놈에 걸쳐 관찰된 절단 효율의 비율로서 표현하였다. 데이터 분석에서 생물학적 반복시험의 포함은 시험된 ZFN의 절단 활성 및 특이성의 순위에 실질적으로 영향을 주지 않았다.
이들 결과로부터, 플라스미드 pDAB109350 상에 코딩된 ZFN (즉, ZFN 29732 및 29730) 및 pDAB109360 상에 코딩된 ZFN (즉, ZFN 30012 및 30018)을 각각의 3개의 밀 서브-게놈에서의 그의 유의한 게놈 DNA 절단 활성의 특징을 고려하여 후속적인 실험에서 식물체내 표적화를 위해 선택하였다.
실시예 4: 일과성 검정을 사용한 ZFN-매개 AHAS 유전자 편집에 대한 공여자 설계의 평가
밀에서 내인성 AHAS 유전자좌에서의 ZFN-매개 게놈 편집을 조사하기 위해, 일련의 실험을 수행하여, 상동 재조합 (HR)-유도 및 비-상동 말단 연결 (NHEJ)-유도 DNA 복구의 효율에 대한 공여자 설계의 효과를 평가하였다. 이들 실험은, 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서 이미다졸리논 부류 제초제에 대한 내성을 부여하는 상기 기재된 S653N 돌연변이 (Li et al., (2008) Molecular Breeding 22:217-225)의 ZFN-매개 부가에 대한, 또는 대안적으로 표적화된 ZFN 절단에 의해 내인성 AHAS 유전자좌에 생성된 이중 가닥 DNA 파괴에서 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제 서열 부위의 ZFN-매개 도입에 대한 효율을 모니터링하기 위해 일과성 검정을 사용하였다.
HR-유도 DNA 복구를 위한 공여자 설계
공여자 DNA 설계는 ZFN 29732 및 29730에 대한 표적 절단 부위의 각 측면에 플랭킹된 750-bp 상동성 아암 (즉, 내인성 AHAS 유전자와 동일한 서열)을 함유하는 플라스미드 DNA 벡터를 기반으로 하였다. 플라스미드 DNA 벡터를 각각의 3개의 밀 서브-게놈에 대해 설계하였다: pDAS000132 (도 3), pDAS000133 (도 4) 및 pDAS000134 (도 5)를 각각 A-, B- 및 D-게놈에 대해 설계하였다 (서열 65, 서열 66 및 서열 67). ZFN-매개 HR-유도 DNA 복구에 의해 내인성 AHAS 유전자의 표적 동조 카피에서 이미다졸리논 부류 제초제에 대한 내성을 부여하는 게놈 변형으로서 S653N (AGC→ATT) 돌연변이가 도입되도록 각각의 플라스미드 DNA 벡터를 설계하였다. 2개의 추가의 플라스미드 DNA 구축물을 또한 D-게놈을 표적화하도록 설계하였다. 제1 플라스미드 DNA, pDAS000135 (서열 68) (도 6)는, 각각 S653N 돌연변이의 15-bp 상류 및 하류에 위치하는 2개의 추가의 (동일) 단일 뉴클레오티드 점 돌연변이를 함유하는 것을 제외하고는, pDAS000134와 동일하였다. 제2 플라스미드 DNA, pDAS000131 (서열 69) (도 7)은 S653N 돌연변이를 함유하지 않았지만, 내인성 AHAS 유전자의 D-게놈 카피에서 표적 ZFN 절단에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 절단에 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 (즉, GAATTC)를 도입하도록 설계되었다.
NHEJ-유도 DNA 복구를 위한 공여자 설계
2가지 유형의 공여자 DNA 설계를 NHEJ-유도 DNA 복구를 위해 사용하였다.
제1 유형의 공여자 설계는 밀에서 내인성 AHAS 유전자와 상동성을 공유하지 않는 41-bp의 서열을 포함하는 선형의 이중 가닥 DNA 분자였다. 2개의 공여자 DNA 분자는 각각 AHAS 유전자의 3개의 동조 카피를 표적화하도록 설계되었다. 두 공여자 DNA 분자는 ZFN-매개 NHEJ-유도 DNA 복구를 용이하게 하기 위한 라이게이션 오버행을 제공하기 위해 돌출된 5' 및 3' 말단을 보유하였다. 2개의 공여자 DNA 분자는 이들의 돌출된 3' 말단에서의 서열이 상이하였다. 제1 공여자 DNA 분자인 pDAS000152 (서열 74 및 서열 75)는 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의한 내인성 AHAS 유전자의 절단에 의해 생성되는 것과 상용성인 라이게이션 오버행을 제공하고 NHEJ-유도 DNA 복구를 통해 이중 가닥 DNA 파괴의 부위에서 내인성 AHAS 유전자 내로의 41-bp 공여자 분자의 삽입을 야기하도록 설계되었다. 제2 공여자 DNA 분자 pDAS000149 (서열 76 및 서열 77)는 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨) 및 ZFN 30012 및 30018 (플라스미드 pDAB109360 상에 코딩됨)에 의한 내인성 AHAS 유전자의 이중 절단에 의해 생성되는 것과 상용성인 라이게이션 오버행을 제공하고 ZFN에 의해 생성된 2개의 이중 가닥 DNA 파괴 사이에 함유된 내인성 AHAS 서열이 NHEJ-유도 DNA 복구를 통해 41-bp 공여자 분자로 교체되도록 설계되었다.
제2 유형의 공여자는 밀에서 내인성 AHAS 유전자와 상동성을 공유하지 않고 내인성 AHAS 유전자에 이중 가닥 DNA 파괴를 생성하기 위해 사용된 ZFN(들)에 의해 인식되는 서열이 인접하는 41-bp의 서열을 함유하는 플라스미드 DNA 벡터였다. 상기 공여자 설계는 내인성 AHAS 유전자 내의 표적 부위를 절단하기 위해 사용된 동일한 ZFN(들)에 의한 플라스미드 DNA 분자로부터 특유한 41-bp 서열의 식물체내 방출, 및 NHEJ-유도 DNA 복구를 통해 내인성 AHAS 유전자 내로 방출된 41-bp 서열의 오버행 라이게이션에 적합한 돌출된 말단의 동시 생성을 허용하였다. 2개의 플라스미드 공여자 DNA 분자는 각각 AHAS 유전자의 3개의 동조 카피를 표적화하도록 설계되었다. 제1 플라스미드 공여자 분자인 pDAS000153 (서열 78 및 서열 79) (도 8)은 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의한 내인성 AHAS 유전자의 절단에 의해 생성된 것과 상용성인 방출된 41-bp DNA 단편에 라이게이션 오버행을 제공하도록 설계되었다. 제2 플라스미드 공여자 분자인 pDAS000150 (서열 80 및 서열 81) (도 9)은 한 말단에서 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의해 생성된 것과 상용성이고 다른 말단에서 ZFN 30012 및 30018 (플라스미드 pDAB109360 상에 코딩됨)에 의해 생성된 것과 상용성인 방출된 41-bp DNA 단편에 라이게이션 오버행을 제공하도록 설계되었다. 상기 설계는 ZFN 29732 및 29730 및 ZFN 30012 및 30018에 의해 생성된 2개의 이중 가닥 DNA 파괴 사이에 함유된 내인성 AHAS 유전자의 41-bp 공여자 분자 서열로의 교체를 허용하였다.
NHEJ-유도 및 HDR-유도 DNA 복구를 위한 공여자 DNA의 합성
통상의 기술자에게 통상적으로 공지된 표준 클로닝 방법을 사용하여 플라스미드 벡터를 제작하였다. 트리티쿰 아에스티붐으로의 전달 전에, 각각의 공여자 구축물에 대한 플라스미드 DNA를 공급업체의 지침에 따라 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템® (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨) 또는 플라스미드 맥시 키트® (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 이. 콜라이의 배양물로부터 제조하였다.
표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 이중 가닥 DNA 공여자 분자 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 아이오와주 코랄빌)를 합성하였다. 각각의 공여자 분자에 대해, 식물체내 엔도뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공하기 위해 각각 그의 5' 말단에 2개의 포스포로티오에이트 연결을 갖는 한 쌍의 상보성 단일 가닥 DNA 올리고머를 합성하였다. 단일 가닥 DNA 올리고머를 전장 분자에 대해 풍부화하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하고, Na+ 교환을 사용하여 합성 단계로부터의 화학적 잔재물로부터 정제하였다. 이중 가닥 공여자 분자는 통상의 기술자에게 통상적으로 공지된 표준 방법을 사용하여 등몰량의 2개의 상보성 단일 가닥 DNA 올리고머를 어닐링함으로써 형성하였다. 트리티쿰 아에스티붐으로 전달하기 전에, 이중 가닥 DNA 분자를 요구되는 농도로 멸균수에 희석하였다.
체세포 배아발생 캘러스로부터 유래된 밀 원형질체의 단리
공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 체세포 배아발생 캘러스 (SEC)로부터 유래된 원형질체를, 다음과 같은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-매개 DNA 전달을 사용한 형질감염을 위해 제조하였다:
공여자 밀 식물주의 묘목을 800 mmol m2/초로 광을 제공하는 18/16℃ (명/암) 및 16/8시간 (명/암) 광주기에서 유지되는 환경 제어된 성장실에서 성장시켰다. 밀 이삭을 개화 12-14일 후에 수집하고, 1분 동안 70% (v/v) 에탄올에 담금으로써 표면 멸균하였다. 이삭을 타작하고, 미성숙 종자를 부드럽게 진탕하면서 15분 동안 17% (v/v) 표백제 내에 멸균한 후, 멸균 증류수로 적어도 3회 세정하였다. 배아를 해부 현미경 하에 미성숙 종자로부터 무균 상태로 단리하였다. 배축을 날카로운 메스로 제거하고, 버렸다. 미절단된 소순판이 위로 향하도록 소순판을 티멘틴(TIMENTIN)™이 없는 2-4 배지가 담긴 9 cm 페트리™ 디쉬 내에 두었다. 총 25개의 소순판을 각각 9 cm 페트리™ 디쉬에 두었다. 체세포 배아발생 캘러스 (SEC) 형성을, 암실에서 24℃에서 3주 동안 인큐베이션함으로써 개시하였다. 3주 후에, SEC를 비-배아발생 캘러스로부터 분리하고, 티멘틴™이 없는 신선한 2-4 배지에 두고, 추가의 3주 동안 암실에서 24℃에서 인큐베이션하였다. SEC의 계대배양을 총 3회 반복한 후, 원형질체 제조에 사용하였다.
약 1 g의 SEC를, 캘러스의 탈수를 방지하기 위해 약 10 mL의 밀 캘러스 소화 믹스 (2.5% w/v 셀룰라제 RS, 0.2% w/v 펙톨리아제 Y23, 0.1% w/v 드리셀라제(DRISELASE)®, 14 mM CaCl2, 0.8 mM MgSO4, 0.7 mM KH2PO4, 0.6 M 만니톨, pH 5.8)를 함유하는 10 cm 페트리™ 디쉬에서 날카로운 메스 칼날을 사용하여 1-2 mm 조각으로 잘게 잘랐다. 추가의 캘러스 소화 믹스를 캘러스 생중량 1 g당 10 mL의 부피로 페트리™ 디쉬에 첨가하고, 진공 (20" Hg) 압력에 30분 동안 적용하였다. 페트리™ 디쉬를 파라필름®으로 밀봉하고, 4-5시간 동안 30-40 rpm에서 부드럽게 회전 진탕하면서 28℃에서 인큐베이션하였다.
캘러스로부터 방출된 SEC 원형질체를, 소화 현탁액을 100 마이크로미터 메쉬를 통해 50 mL 수집 튜브 내로 통과시킴으로써 단리하였다. 원형질체의 수득량을 최대화하기 위해, 소화된 캘러스 물질을 3회 세척하였다. 각각의 세척은 10 mL SEC 세척 완충제 (0.6 M 만니톨, 0.44% w/v MS, pH 5.8)를 페트리™ 디쉬에 첨가한 후, 1분 동안 부드럽게 회전시키고, 이어서 SEC 세척 완충제를 100 마이크로미터 체를 통해 동일한 50 mL 수집 튜브 내로 통과시킴으로써 수행하였다. 이어서, 여과된 원형질체 현탁액을 70 마이크로미터 체에 통과시킨 후, 40 마이크로미터 체에 통과시켰다. 이어서, 6 mL 분취량의 여과된 원형질체 현탁액을 뚜껑이 있는 12 mL 둥근 바닥 원심분리 튜브로 옮기고, 70 g 및 12℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 이후, 상청액을 제거하면서 약 0.5 mL 상청액을 남겨 두고, 원형질체 펠릿을 각각 7 mL의 22% 수크로스 용액 중에 재현탁시켰다. 수크로스/원형질체 혼합물을 2 mL SEC 세척 완충제로 조심스럽게 덮어, 2개의 용액이 혼합되지 않도록 확실하게 하였다. 원형질체를 상기 기재된 바와 같이 원심분리에 의해 2차로 원심분리하였다. SEC 세척 완충제와 수크로스 용액 사이에 가시적인 원형질체의 밴드를 피펫을 사용하여 수거하고, 깨끗한 12 mL 둥근 바닥 튜브에 넣었다. 7 mL의 SEC 세척 완충제를 원형질체에 첨가하고, 튜브를 상기 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, SEC 원형질체를 단일 튜브에 합하고, 최종 부피 1-2 mL의 SEC 세척 완충제 중에 재현탁시켰다. SEC 원형질체의 수득량을 노이바우어 혈구계를 사용하여 추정하였다. 에반스 블루 염색을 사용하여 회수된 살아있는 세포의 비율을 결정하였다.
SEC 원형질체의 PEG-매개 형질감염
약 2백만 개의 SEC 원형질체를 12 mL 둥근 바닥 튜브에 첨가하고, 70 g에서 원심분리하여 펠릿화한 후, 상청액을 제거하였다. 원형질체를 70 μg의 DNA를 함유하는 480 μl SEC 세척 완충제 중에 부드럽게 재현탁시켰다. DNA는 상기 기재된 아연 핑거 뉴클레아제 및 공여자 DNA 구축물로 이루어졌고, 실험에 필요한 몰비로 존재하는 각각의 구축물이 사용되었다. 이어서, 720 μl의 50% PEG 용액 (50% w/v PEG 4000, 0.8 M 만니톨, 1M Ca(NO3)2, pH 5.6)을 튜브의 부드러운 회전에 의해 동시에 혼합하면서 원형질체 현탁액에 천천히 첨가하였다. 원형질체 현탁액을 임의의 교반 없이 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
추가의 7 mL 부피의 SEC 세척 완충제를 1 mL, 2 mL 및 3 mL의 순차적인 분취량으로 원형질체 현탁액에 천천히 첨가하였다. 동시에 부드럽게 혼합하여 각각의 순차적인 분취량을 함유하는 균질 현탁액을 유지하였다. 원형질체 현탁액의 절반을 제2의 12 mL 둥근 바닥 튜브로 옮기고, 추가의 3 mL 부피의 SEC 세척 완충제를 동시에 부드럽게 혼합하면서 각각의 튜브에 천천히 첨가하였다. 원형질체를 10분 동안 70 g에서 원심분리하여 펠릿화하고, 상청액을 제거하였다. 원형질체 펠릿을 각각 1 mL SEC 세척 완충제 중에 재현탁시킨 후, 한쌍의 둥근 바닥 튜브로부터의 원형질체를 단일 12 mL 튜브에 모았다. 추가의 7 mL SEC 세척 완충제를 모은 원형질체에 첨가한 후, 상기 기재된 바와 같이 원심분리하였다. 상청액을 완전히 제거하고, 원형질체 펠릿을 2 mL 퀴아오 배지 중에 재현탁시켰다. 원형질체 현탁액을 멸균 3 cm 페트리™ 디쉬로 옮기고, 암실에서 24℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
미성숙 접합체 밀 배아로부터의 소순판의 단리
공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 미성숙 접합체 밀 배아의 소순판을, 다음과 같은 바이오리스틱-매개 DNA 전달을 사용한 형질감염을 위해 제조하였다:
공여자 밀 식물주의 묘목을 800 mmol m2/초로 광을 제공하는 18/16℃ (명/암) 및 16/8시간 (명/암) 광주기에서 유지되는 환경 제어된 성장실에서 성장시켰다. 밀 이삭을 개화 12-14일 후에 수집하고, 1분 동안 70% (v/v) 에탄올에 담금으로써 표면 멸균하였다. 이삭을 타작하고, 미성숙 종자를 부드럽게 진탕하면서 15분 동안 17% (v/v) 표백제 내에 멸균한 후, 멸균 증류수로 적어도 3회 세정하였다. 배아를 해부 현미경 하에 미성숙 종자로부터 무균 상태로 단리하였다. 배축을 날카로운 메스를 사용하여 제거하고, 버렸다. 미절단된 소순판이 위로 향하도록 소순판을 삼투 MS (E3 말토스) 배지가 담긴 9 cm 페트리™ 디쉬 내에 두었다. 총 20개의 소순판을 각각 9 cm 페트리™ 디쉬에 두었다. 제조된 배아를 암실에서 26℃에서 최소 4시간 동안 예비-배양한 후, 바이오리스틱-매개 DNA 전달을 사용하여 형질감염시켰다.
바이오리스틱-매개 DNA 전달에 의한 미성숙 접합체 밀 배아의 소순판의 형질감염
바이오리스틱-매개 DNA 전달을 위한 금 입자를, 40 mg의 0.6 마이크로미터 콜로이드성 금 입자 (바이오라드)를 1.5 mL 마이크로튜브 내의 1 mL의 멸균수에 첨가함으로써 제조하였다. 금 입자를 5분 동안 볼텍싱함으로써 재현탁시켰다. 10회 포격에 충분한 물질을 제조하기 위해, 50 μl 분취량의 금 입자 현탁액을, 5 μl의 멸균수 중에 재현탁시킨 5 μg의 DNA를 함유하는 1.5 mL 마이크로튜브로 옮겼다. 볼텍싱에 의한 철저한 혼합 후에, 50 μl의 2.5 M CaCl2 및 20 μl의 0.1 M 스페르미딘을 마이크로튜브에 첨가하고, 각각의 시약의 첨가 후에 철저히 혼합하였다. DNA-코팅된 금 입자를 벤치 탑 미세원심분리기에서 최대 속도로 1분 동안 원심분리하여 펠릿화하였다. 상청액을 제거하고, 1 mL의 100% 에탄올을 세척하기 위해 첨가하고, 금 입자를 재현탁시켰다. 금 입자를 상기 기재된 바와 같이 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상청액을 버렸다. DNA-코팅된 금 입자를 110 μl의 100% 에탄올에 재현탁시키고, 얼음 상에서 유지하였다. 짧은 볼텍싱 후에, 10 μl의 금 입자 용액을 마크로-캐리어(macro-carrier) 막 중앙에 두고, 공기 건조하였다.
PDS-1000/HE 입자 총 전달 시스템™ (바이오라드)을 사용하여 미성숙 접합체 밀 배아의 소순판을 바이오리스틱-매개 DNA 전달에 의해 형질감염시켰다. DNA-코팅된 금 입자의 전달은 다음 설정을 이용하여 수행하였다: 갭 2.5 cm, 정지판 개구 0.8 cm, 표적 거리 6.0 cm, 진공 91.4 - 94.8 kPa, 진공 유량 5.0 및 배기 유량 4.5. 미성숙 접합체 밀 배아의 소순판을 900 psi 파열 디스크를 사용하여 포격하였다. 20개의 소순판을 함유하는 각각의 페트리™ 디쉬를 1회 포격하였다. 포격된 소순판을 26℃에서 암실에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 캘러스 유도를 위해 배지로 옮겼다. 소순판을 캘러스 유도 배지에서 암실에서 26℃에서 7일 동안 배양하였다.
SEC 원형질체로부터의 게놈 DNA 단리
게놈 DNA를 엽육세포 원형질체에 대해 상기 기재된 절차를 사용하여 SEC 원형질체로부터 추출하였다. 형질감염을 위해 사용된 공여자 DNA의 존재를 감소시키기 위해 추가의 정제 단계를 수행하였다. 이것은 SEC 원형질체로부터의 게놈 DNA를 형질감염을 위해 사용된 공여자 DNA로부터 분리하기 위해 겔 전기영동을 사용하여 달성하였다. 추출된 DNA를 0.5X TBE를 사용하여 0.5% 아가로스 겔 내에서 3시간 동안 전기영동시켰다. DNA를 SYBR® SAFE 염색에 의해 가시화하고, SEC 원형질체로부터의 게놈 DNA에 대응하는 밴드를 절제하였다. 게놈 DNA를, 퀴아퀵™ DNA 정제 칼럼을 DNEASY 식물 DNA 추출 미니 키트™ (퀴아젠)로부터의 DNA 결합 칼럼으로 교체한 것을 제외하고는 제조업체의 지침에 따라 퀴아퀵 DNA 정제 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 아가로스 겔로부터 정제하였다.
미성숙 접합체 배아의 소순판으로부터의 게놈 DNA 단리
각각의 바이오리스틱-매개 DNA 전달을 위해 미성숙 접합체 밀 형질감염된 배아의 20개의 소순판을 15 ml 튜브에 넣고, 액체 질소로 급속 냉동한 후, -40℃ 및 133 x 10-3 mBar 압력에서 랍콘코 프리존 4.5® (랍콘코, 미주리주 캔자스 시티)에서 24시간 동안 동결 건조하였다. 동결건조된 캘러스는 제조업체의 지침에 따라 DNEASY® 식물 DNA 추출 맥시™ 키트 (퀴아젠)를 사용하여 DNA 추출에 적용하였다.
형질감염을 위해 사용된 공여자 DNA의 존재를 감소시키기 위해 추가의 정제 단계를 수행하였다. 이것은 캘러스로부터의 게놈 DNA를 형질감염을 위해 사용된 공여자 DNA로부터 분리하기 위해 겔 전기영동을 사용하여 달성하였다. 추출된 DNA를 0.5X TBE를 사용하여 0.5% 아가로스 겔 내에서 3시간 동안 전기영동시켰다. DNA를 SYBR® SAFE 염색에 의해 가시화하고, 캘러스로부터의 게놈 DNA에 대응하는 밴드를 절제하였다. 게놈 DNA를, 퀴아퀵™ DNA 정제 칼럼을 DNEASY® 식물 DNA 추출 맥시™ 키트 (퀴아젠)로부터의 DNA 결합 칼럼으로 교체한 것을 제외하고는 제조업체의 지침에 따라 퀴아퀵™ DNA 정제 키트 (퀴아젠)를 사용하여 아가로스 겔로부터 정제하였다.
ZFN-매개 AHAS 편집을 위한 게놈 DNA의 PCR 검정
HR- 및 NHEJ-유도 DNA 복구를 사용하여 밀 내의 내인성 AHAS 유전자에서 ZFN-매개 게놈 편집을 조사하고 각각의 DNA 복구 경로의 효능에 대한 공여자 DNA 설계의 효과를 평가하기 위해, PCR 검정을 사용하여 형질감염된 밀 세포의 게놈 DNA로부터의 표적 AHAS 영역을 증폭하였다. PCR 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하여, 합성에 의한 일루미나-기반 서열분석 기술을 위한 정확한 포맷으로, 필수적인 유전자좌 특이적 DNA 분자를 생성하였다. 각각의 검정은 AHAS 유전자의 각각의 3개의 동조 카피에 대해 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨) 및 ZFN 30012 및 30018 (플라스미드 pDAB109360 상에 코딩됨)에 의해 표적화된 영역을 증폭하기 위해 설계된 상기 기재된 프라이머 쌍 (서열 59 및 서열 60)을 사용하여 수행하였다. 충분한 카피의 트리티쿰 아에스티붐 게놈이 ZFN-매개 유전자 편집의 신뢰가능한 평가를 위해 검정됨을 보장하기 위해 형질감염된 샘플마다 다중 반응을 수행하였다. 형질감염된 SEC 원형질체에 대해, 개별 원형질체로부터 취한 트리티쿰 아에스티붐 게놈의 200,000개 카피와 동등한 16회까지의 PCR 검정을 형질감염된 샘플마다 수행하였다. 미성숙 접합체 배아의 형질감염된 소순판에 대해, 개별 원형질체로부터 취한 트리티쿰 아에스티붐 게놈의 600,000개 카피와 동등한 약 48회의 PCR 검정을 형질감염된 샘플마다 수행하였다. 각각의 형질감염된 샘플을 CBOT 클러스터 생성 키트™ (일루미나)를 사용한 서열분석을 위해 제조하고, 상기 기재된 바와 같은 100-bp 쌍형성 말단 서열 리드를 생성하기 위해 일루미나 GAIIx™ 또는 HISEQ2000™ 기기 (일루미나)에서 서열분석하였다.
AHAS 유전자좌에서 ZFN-매개 HR-유도 편집을 검출하기 위한 데이터 분석
형질감염된 SEC 원형질체 및 미성숙 접합체 밀 배아의 소순판에 대해 제조된 샘플 라이브러리에 대한 일루미나 짧은 리드 서열 데이터의 생성 후에, 표적 ZFN 부위에서 ZFN-매개 HR-유도 편집에 대한 분자학적 증거를 확인하기 위해 분석을 수행하였다.
HR-유도 유전자 편집에 대한 분자학적 증거를 갖는 서열 리드를 확인하기 위해, 각각의 리드를 이들이 기원하는 샘플 및 서브-게놈에 할당하고 고품질 서열만이 후속 분석에 사용됨을 보장하기 위한 품질 필터링을 수행하기 위해 짧은 서열 리드를 상기 기재된 바와 같이 우선 컴퓨터에 의해 처리하였다. 이어서, 형질감염을 위해 사용된 공여자 DNA 분자 및 내인성 AHAS 유전자좌 둘 모두에 대한 서열을 함유하는 리드를 확인하기 위해서 맞춤 개발된 PERL 스크립트 및 마이크로소프트 엑셀 2010™ (마이크로소프트 코포레이션)에서 수동 데이터 조작을 사용하였다. ZFN-매개 HR-유도 유전자 편집으로부터 발생한 서열 리드, 및 형질감염에 사용된 (임의의) 공여자 DNA의 잔재물로부터 생성된 것들 사이의 명백한 식별을 보장하기 위해, 서열 리드가 ZFN에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴의 위치에 NHEJ 결실을 또한 함유한 경우에만 유전자 편집에 대한 분자학적 증거가 선언되었다; 즉, 서열 리드는 불완전한 HR-유도 DNA 복구의 결과에 대한 증거를 보여주었다. 편집 빈도 (1백만 리드당 부로 표현)는 ZFN-매개 HR-유도 유전자 편집에 대한 증거를 보인 서브-게놈-할당된 서열 리드의 비율로서 계산하였다.
각각의 플라스미드 공여자 DNA 설계에 대해 수행된 3회의 생물학적 반복시험의 결과로부터, 밀 내의 내인성 AHAS 유전자의 3개의 동조 카피에서 ZFN-매개 HR-유도 편집을 보여주는 서열 리드의 풍부화에 대한 분자학적 증거를 얻었다 (표 5 및 표 6). pDAB109350 및 pDAS000131로 형질감염시킨 SEC 원형질체 및 미성숙 접합체 배아의 소순판 둘 모두의 샘플에서 내인성 AHAS 유전자의 3개의 모든 동조 카피 내의 ZFN 29732 및 29730에 의해 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴의 위치에서 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제 부위의 부가에 대한 강력한 분자학적 증거를 얻었다. ZFN-매개 HR-유도 유전자 편집의 빈도는 공여자 DNA 분자가 표적화된 D-게놈에서 가장 높았다. 유사하게, pDAB109350, 및 어느 한 pDAS000132, pDAS000133 또는 pDAS000134로 형질감염된 미성숙 접합체 배아의 소순판의 샘플에서 내인성 AHAS 유전자의 3개의 모든 동조 카피 내에 S653N 돌연변이를 함유하는 공여자 폴리뉴클레오티드의 도입에 대한 강력한 분자학적 증거를 얻었고; 강력한 분자학적 증거는 또한 pDAB109350 및 pDAS000134로 형질감염된 SEC 원형질체의 샘플에 대해서도 관찰되었다. ZFN-매개 HR-유도 유전자 편집의 빈도는 공여자 DNA가 설계된 서브-게놈에서 역시 가장 높았다. 중요하게, pDAB109350 및 pDAS000135로 형질감염된 SEC 원형질체 및 미성숙 접합체 배아의 소순판의 샘플에서의 편집 빈도는 pDAB109350 및 pDAS000134로 혈질감염된 샘플에 대해 관찰된 것보다 (약 10배) 더 낮았다. 이 결과는 pDAS00135 공여자 설계에서 플랭킹 돌연변이의 존재에 의해 HR-유도 DNA 복구에 대한 효율에 가해진 페널티 때문인 것으로 예상되었다.
표 5: 플라스미드 공여자 DNA 설계로 형질감염된 소순판의 3회의 생물학적 반복시험에 걸친 백만분율 (ppm) 단위의 평균 HR-유도 편집 빈도. "na"는 "적용가능하지 않음"을 나타냄.
Figure pct00007
Figure pct00008
표 6: 플라스미드 공여자 DNA 설계로 형질감염된 SEC 원형질체의 3회의 생물학적 반복시험에 걸친 백만분율 (ppm) 단위의 평균 HR-유도 편집 빈도. "na"는 "적용가능하지 않음"을 나타냄.
Figure pct00009
AHAS 유전자에서 ZFN-매개 NHEJ-유도 편집을 검출하기 위한 데이터 분석
형질감염된 SEC 원형질체 및 미성숙 접합체 밀 배아의 소순판에 대해 제조된 샘플 라이브러리에 대한 일루미나 짧은 리드 서열 데이터의 생성 후에, 표적 ZFN 부위에서 ZFN-매개 NHEJ-유도 편집에 대한 분자학적 증거를 확인하기 위해 분석을 수행하였다.
NHEJ-유도 유전자 편집에 대한 분자학적 증거를 갖는 서열 리드를 확인하기 위해, 각각의 리드를 이들이 기원하는 샘플 및 서브-게놈에 할당하고 고품질 서열만이 후속 분석에 사용됨을 보장하기 위한 품질 필터링을 수행하기 위해 짧은 서열 리드를 상기 기재된 바와 같이 우선 컴퓨터에 의해 처리하였다. 이어서, 형질감염을 위해 사용된 공여자 DNA 분자 및 내인성 AHAS 유전자좌 둘 모두에 대한 서열을 함유하는 리드를 확인하기 위해서 맞춤 개발된 PERL 스크립트 및 마이크로소프트 엑셀 2010 (마이크로소프트 코포레이션)에서 수동 데이터 조작을 사용하였다. 편집 빈도 (1백만 리드당 부로 표현)는 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 대한 증거를 보인 서브-게놈-할당된 서열 리드의 비율로서 계산하였다.
각각의 선형 이중 가닥 DNA 공여자 설계에 대해 수행된 3회의 생물학적 반복시험의 결과로부터, 밀 내의 내인성 AHAS 유전자의 3개의 동조 카피에서 ZFN-매개 NHEJ-유도 편집을 보여주는 서열 리드의 풍부화에 대한 분자학적 증거를 얻었다 (표 7 및 표 8). pDAB109350 및 pDAS000152로 형질감염시킨 SEC 원형질체 및 미성숙 접합체 배아의 소순판 둘 모두의 샘플에서 ZFN 29732 및 29730에 의한 AHAS 유전자의 동조 카피의 절단에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴의 위치에서 선형 이중 가닥 41-bp 공여자 분자의 통합에 대한 강력한 분자학적 증거를 얻었다. 유사한 편집 효율이 이들 샘플 내의 3개의 밀 서브-게놈에 걸쳐 관찰되었다. 이와 달리, pDAB109350 및 pDAS000153으로 형질감염된 SEC 원형질체 및 미성숙 접합체 배아의 소순판의 샘플은 아마도 플라스미드 백본으로부터의 41-bp 공여자 서열의 식물체내 방출에 대한 전제 요건 때문에 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 대한 불량한 증거를 보였다. 내인성 AHAS 서열의 41-bp 공여자 분자로의 교체에 대한 분자학적 증거는 pDAB109350, pDAB109360 및 pDAS000149로 형질감염된 SEC 원형질체 및 미성숙 접합체 배아의 소순판 둘 모두에서 관찰되었다. 그러나, 편집 빈도는 아마도 내인성 AHAS 서열의 이중 ZFN 절단에 대한 요건 때문에 pDAB109350 및 pDAS000152를 사용하여 수행된 형질감염에 대해 관찰된 것보다 유의하게 더 낮았다. pDAB109350, pDAB109360 및 pDAS000150으로 형질감염시킨 SEC 원형질체 및 미성숙 접합체 배아의 소순판의 샘플에서 플라스미드 백본으로부터 식물체내 방출을 필요로 한 41-bp 공여자 서열로 내인성 AHAS 서열을 교체하는 것에 대한 제한된 증거가 얻어졌다.
표 7: 선형 이중 가닥 공여자 DNA 설계로 형질감염된 소순판의 3회의 생물학적 반복시험에 걸친 백만분율 (ppm) 단위의 평균 NHEJ 편집 빈도. "na"는 "적용가능하지 않음"을 나타냄.
Figure pct00010
Figure pct00011
표 8: 선형 이중 가닥 공여자 DNA 설계로 형질감염된 SEC 원형질체의 3회의 생물학적 반복시험에 걸친 백만분율 (ppm) 단위의 평균 NHEJ 편집 빈도. "na"는 "적용가능하지 않음"을 나타냄.
Figure pct00012
Figure pct00013
종합적으로, 결과는 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서 정확한 ZFN-매개 NHEJ-유도 편집에 대한 강력한 분자학적 증거를 제공한다. 이들 결과는 모든 3개의 서브-게놈이 단일 ZFN 및 공여자로 표적화될 수 있음을 보여준다. 결과는 플라스미드 공여자 DNA 설계에 비해 선형 공여자 DNA 설계에 대한 보다 높은 빈도의 편집을 분명하게 입증한다. 아마도, 이들 결과는 이들이 NHEJ-유도 DNA 복구에 참여할 수 있게 되기 전, 플라스미드 공여자 분자의 식물체내 선형화를 위한 전제 요건 때문이다. 결과는 또한 서브-게놈-특이적 매개 NHEJ-유도 유전자 편집이 이중 가닥 파괴에 의해 용이해짐을 나타낸다. 이중 가닥 DNA 파괴를 유도하도록 설계된 ZFN은 트리티쿰 아에스티붐 식물 세포에 공여자 DNA와 함께 전달될 때 서브-게놈-특이적 매개 NHEJ-유도 유전자 편집을 유도하였다.
실시예 5: AHAS 편집된 식물을 생산하기 위한 형질전환 시스템의 개발
밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌를, ZFN-매개 유전자 편집에 의해 유도된 정확한 게놈 변형을 갖는 식물을 생성하기 위한 형질전환 시스템을 개발하기 위한 모델 유전자좌로서 선택하였다. 내인성 AHAS 유전자는, 선택 표현형 (즉, 군 B 제초제, 또는 ALS 억제제 제초제 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아에 대한 내성)을 생성하는 그의 능력, 서브-게놈-특이적 유전자 코딩 서열의 필요 정보에 대한 지식, 및 AHAS 유전자에 화학적으로 유도된 돌연변이를 갖는 밀의 특성화로부터의 군 B 제초제 또는 ALS 억제제 제초제에 대한 내성을 부여하는 특이적인 돌연변이에 대한 지식 때문에 모델 유전자좌로서 선택되었다. 이미다졸리논 부류 제초제에 대한 내성을 부여하는 S653N 돌연변이는, 정확히 편집된 이벤트를 풍부화하기 위한 화학적 선택 시스템을 개발하기 위한 양성 대조군으로서 사용될 수 있는 S653N 돌연변이를 보유하는 상업적으로 시판되는 밀 품종의 이용가능성 때문에 ZFN-매개 유전자 편집을 위한 표적으로서 선택되었다.
트리티쿰 아에스티붐 재배종 클리어필드 얀츠(Clearfield Janz)의 분자학적 특성화
D-게놈에 S653N 돌연변이를 보유하는 상업적으로 시판되는 빵밀 품종인 트리티쿰 아에스티붐 재배종 클리어필드 얀츠를, ZFN-매개 유전자 편집에 의해 생산된 AHAS 편집된 밀 식물을 풍부화하기 위한 화학적 선택 전략을 개발하기 위한 양성 대조군으로서 사용하기 위해 선택하였다. 순수 유전자 원종을 생성하기 위해, 멀티플렉스-레디(Multiplex-Ready) PCR 기술 (Hayden et al., (2008) BMC Genomics 9;80)을 사용하여 96개의 미세위성 (SSR) 마커로 48개의 묘목을 스크리닝하였다. 동일한 SSR 반수체를 갖는 묘목을 후속적인 실험에서 사용된 종자를 생산하기 위해 사용하였다.
종자를 생산하기 위해 사용된 밀 식물이 S653N 돌연변이를 보유함을 보장하기 위해, 밀의 D-게놈으로부터의 돌연변이를 보유하는 AHAS 유전자의 영역을 증폭하기 위한 PCR 검정을 개발하였다. 서브-게놈-특이적 증폭은, AHAS 유전자의 동조 카피를 구별하는 뉴클레오티드 서열 변이 위에 끝에서 두 번째의 염기 (포스포로티오에이트 연결을 함유함)를 위치시키도록 설계된 프라이머 AHAS-PS-6DF2 및 AHAS-PS-6DR2 (서열 82 및 서열 83)를 사용하는 온-오프 PCR (Yang et al., (2005) Biochemical and Biophysical Research Communications 328:265-72)에 의해 수행하였다. PCR 프라이머는 길이가 18 내지 27개 뉴클레오티드이고 융점이 60 내지 65℃, 최적 63℃가 되도록 설계되었다. 증폭된 PCR 생성물을 퀴아퀵 미니일루트 PCR 정제 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 정제하고 직접 생거 서열분석 방법을 사용하여 서열분석하였다. 서열분석 생성물을 빅다이® v3.1 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈)에 따라 에탄올, 아세트산나트륨 및 EDTA로 정제하고, 전기영동을 ABI3730XL® 자동 모세관 전기영동 플랫폼 상에서 수행하였다.
시퀀처 v3.7™ (진코드스, 미시건주 앤 아버)을 사용한 증폭된 AHAS 유전자 서열의 분석을 통해 S653N 돌연변이에 대한 분리가 밝혀졌고, S653N 돌연변이에 대해 동형접합성 (N653/N653) 및 이형접합성 (N653/S653)이거나 또는 제초제-민감성 대립유전자에 대해 동형접합성 (S653/S653)인 식물을 확인할 수 있었다. 개별적인 식물로부터 종자의 수확은 재배종 클리어필드 얀츠 유전적 배경에서 S653N 돌연변이에 대해 상이한 수준의 접합성을 갖는 종자 공급원을 제공하였다.
이마자목스(IMAZAMOX)™를 기초로 한 화학적 선택 조건의 최적화
AHAS 편집된 밀 식물을 재생하기 위한 최적 선택 조건을 결정하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 이들 실험은 확립된 밀 형질전환 시스템의 캘러스 유도, 식물 재생 및 발근기에서의 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH (S653/S653 유전자형)의 이마자목스™에 대한 기초 내성에 대한 시험을 기초로 하였다. 상이한 수준의 S653N 돌연변이를 갖는 재배종 클리어필드 얀츠 유전자형; 즉, N653/N653 및 S653/S653 유전자형을 갖는 식물의 기초 내성 및 저항성을 결정하기 위해 유사한 실험을 수행하였다.
캘러스 유도기에 이마자목스®에 대한 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 기초 내성 및 재배종 클리어필드 얀츠 (N653/N653) 유전자형의 기초 저항성을 다음과 같이 결정하였다: 각각의 밀 식물주로부터의 미성숙 접합체 배아의 소순판을 상기 기재된 바와 같이 단리하고, 각각 0, 50, 100, 200, 300, 400 및 500 nM 이마자목스®로 보충된 CIM 배지가 담긴 10 cm 페트리™ 디쉬에 두었다. 20개의 소순판을 각각의 페트리™ 디쉬에 두었다. 각각의 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH 및 재배종 클리어필드 얀츠 유전자형으로부터 총 60개의 소순판을 각각의 이마자목스® 농도에서 각각 기초 내성 및 기초 저항성 반응에 대해 시험하였다. 24℃에서 암실에서 4주 동안 인큐베이션한 후, 각각의 이마자목스® 농도에서 체세포 배아발생 캘러스 형성 (SEC)의 양을 기록하였다. 결과는 재배종 밥화이트 MPB26RH에 대한 SEC 형성이 비처리된 샘플에 비해 100 nM 이마자목스®에서 약 70% 감소하였음을 보여주었다. 재배종 클리어필드 얀츠 유전자형의 캘러스 형성은 시험된 임의의 이마자목스® 농도에서 비처리된 대조군에 비해 영향을 받지 않았다.
식물 재생기에 이마자목스®에 대한 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 기초 내성을 다음과 같이 결정하였다: 공여자 식물주로부터의 미성숙 접합체 배아의 소순판을 상기 기재된 바와 같이 단리하고, CIM 배지가 담긴 10 cm 페트리™ 디쉬에 두었다. 24℃에서 암실에서 4주 동안 인큐베이션함으로써 체세포 배아발생 캘러스가 형성되도록 하였다. SEC를 각각 0, 100, 200, 300, 400, 500 및 1000 nM 이마자목스®로 보충된 DRM 배지가 담긴 10 cm 페트리™ 디쉬로 옮겼다. 20개의 CIM을 각각의 페트리™ 디쉬에 두었다. 총 60개의 CIM을 각각의 이마자목스® 농도에서 기초 내성 반응에 대해 시험하였다. 성장실에서 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 24℃에서 2주 동안 인큐베이션한 후, 재생 반응을 기록하였다. 결과는 식물 재생이 비처리된 샘플에 비해 200 nM 이마자목스®에서 약 80% 감소하였음을 보여주었다.
식물 재생기에 이마자목스®에 대한 재배종 클리어필드 얀츠 (S653/S653) 유전자형의 기초 내성 및 재배종 클리어필드 얀츠 (N653/N653) 유전자형의 기초 저항성은, 재배종 클리어필드 얀츠가 조직 배양에서 불량한 식물 재생 반응 (즉, 불량한 배아발생)을 갖는 것으로 관찰되었기 때문에 변형된 접근법을 사용하여 결정하였다. 각각의 재배종 클리어필드 얀츠 유전자형의 종자를 밀 엽육세포 원형질체를 생산하기 위해 상기 기재된 무균 접근법을 사용하여 발아시켰다. 발아된 묘목을 증식 배지에서 계대배양에 의해 시험관 내에서 증식시켰다. 증식 이후, 각각의 유전자형의 식물을 각각 0, 100, 300, 600, 900, 1200, 1500 및 3000 nM 이마자목스®로 보충된 식물 성장 배지 (MS + 10 μM BA + 0.8% 아가)가 담긴 10 cm 페트리™ 디쉬로 옮겼다. 10개의 식물을 각각의 페트리™ 디쉬에 두었다. 유전자형당 총 30개의 식물을 각각의 이마자목스® 농도에서 기초 반응에 대해 시험하였다. 성장실에서 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 24℃에서 3주 동안 인큐베이션한 후, 재생 반응을 기록하였다. 결과는 재배종 클리어필드 얀츠 (S653/S653) 유전자형의 식물 성장이 비처리된 샘플에 비해 적어도 200 nM 이마자목스®를 함유하는 배지에서 크게 저하되었음을 보여주었다. 상기 반응은 재배종 밥화이트 MPB26RH (S653/S653) 유전자형에서 관찰된 것과 유사하였다. 이와 달리, 재배종 클리어필드 얀츠 (N653/N653) 유전자형의 식물 성장은 이마자목스® 농도가 2,000 nM을 초과할 때까지 비처리된 샘플에 비해 강하게 억제되지 않았다.
식물 발근기에 이마자목스®에 대한 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 기초 내성을 다음과 같이 결정하였다: 공여자 밀 식물주로부터의 미성숙 접합체 배아의 소순판을 상기 기재된 바와 같이 단리하고, CIM 배지가 담긴 10 cm 페트리™ 디쉬에 두었다. 24℃에서 암실에서 4주 동안 인큐베이션함으로써 체세포 배아발생 캘러스가 형성되도록 하였다. SEC를 DRM 배지가 담긴 10 cm 페트리™ 디쉬로 옮기고, 16/8시간 (명/암) 광주기 하에 2주 동안 24℃에서 인큐베이션하여 식물 재생이 이루어지도록 하였다. 재생된 식물을 각각 0, 100, 200, 300, 400, 500 nM 이마자목스®로 보충된 RM 배지가 담긴 10 cm 페트리™ 디쉬로 옮겼다. 20개의 재생된 식물을 각각의 페트리™ 디쉬에 두었다. 총 60개의 재생된 식물을 각각의 이마자목스® 농도에서 기초 내성 반응에 대해 시험하였다. 성장실에서 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 24℃에서 3주 동안 인큐베이션한 후, 뿌리 형성 반응을 기록하였다. 결과는 뿌리 형성이 비처리된 샘플에 비해 이마자목스®의 시험한 모든 농도에서 심하게 제한됨을 보여주었다.
식물 발근기에 이마자목스®에 대한 재배종 클리어필드 얀츠 (S653/S653) 유전자형의 기초 내성 및 재배종 클리어필드 얀츠 (N653/N653) 유전자형의 기초 저항성은, 재배종 클리어필드 얀츠가 조직 배양에서 불량한 식물 재생 반응 (즉, 불량한 배아발생)을 갖는 것으로 관찰되었기 때문에 변형된 접근법을 사용하여 결정하였다. 각각의 재배종 클리어필드 얀츠 유전자형의 종자를 밀 엽육세포 원형질체를 생산하기 위해 상기 기재된 무균 접근법을 사용하여 발아시켰다. 발아된 묘목을 증식 배지에서 계대배양에 의해 시험관 내에서 증식시켰다. 증식 이후, 각각의 유전자형의 식물을 각각 0, 50, 100, 200 및 250 nM 이마자목스®로 보충된 식물 발근 배지 (1/2 MS, 0.5 mg/L NAA, 0.8% 아가)가 담긴 10 cm 페트리™ 디쉬로 옮겼다. 3개의 식물을 각각의 페트리™ 디쉬에 두었다. 유전자형당 총 6개의 식물을 각각의 이마자목스® 농도에서 기초 반응에 대해 시험하였다. 성장실에서 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 24℃에서 2주 동안 인큐베이션한 후, 뿌리 형성 반응을 기록하였다.
결과는 재배종 클리어필드 얀츠 (N653/N653) 유전자형의 뿌리 형성이 비처리된 샘플에 비해 250 nM 이마자목스®에서 제한되었음을 보여주었다. 뿌리 형성은 비처리된 샘플에 비해 이마자목스®의 시험한 모든 농도에서 재배종 클리어필드 얀츠 (S653/S653) 유전자형에서 심하게 제한되었다.
ZFN-매개 NHEJ-유도 AHAS 유전자 편집을 위한 공여자 DNA의 설계 및 합성
2가지 유형의 공여자 DNA 분자를 밀 내의 내인성 AHAS 유전자에서 정확한 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집을 촉진하도록 설계하였다. 공여자 설계 둘 다는 이미다졸리논 부류 제초제에 대한 내성을 부여하는 것으로 공지된 S653N 돌연변이의 도입을 허용하였다 (Li et al., (2008) Molecular Breeding 22:217-225).
제1 설계는 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의한 내인성 AHAS 유전자의 동조 카피의 절단에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴의 위치에서 95-bp 이중 가닥 공여자 분자의 통합을 기초로 하였다. 공여자 DNA 분자인 pDAS000267 (서열 84 및 서열 85)은 통합 공여자 폴리뉴클레오티드의 2개의 부분을 포함하였다. 5' 말단은 표적 ZFN 절단 부위로부터 출발하여 AHAS 정지 코돈에서 끝나는 D-게놈 상에 코딩된 내인성 AHAS 유전자와 거의 동일한 서열을 함유하였다. 6개의 의도적인 돌연변이를 상기 서열 내에 도입하였다: 2개의 돌연변이는 S653N 돌연변이 (AGC→AAT)를 코딩하고, 4개의 돌연변이는 동의 돌연변이이었다 (침묵 돌연변이가 공여자 서열 내에 통합됨). 공여자 분자의 3' 말단은 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집 이벤트를 검출하기 위해 진단적 PCR에 사용될 수 있는 특유한 서열을 함유하였다. ZFN-매개 NHEJ-유도 DNA 복구를 용이하게 하기 위한 라이게이션 오버행을 제공하도록 돌출된 5' 및 3' 말단을 갖는 공여자 분자가 설계되었다.
제2 설계는 한 쌍의 ZFN 표적 부위 사이에 위치하는 내인성 AHAS 유전자의 79-bp 이중 가닥 공여자 분자로의 교체를 기초로 하였다. 구체적으로, 공여자는 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨) 및 ZFN 30012 및 30018 (플라스미드 pDAB109360 상에 코딩됨)에 의한 AHAS 유전자의 동조 카피의 이중 절단시에 염색질로부터 방출된 내인성 AHAS 유전자를 교체하도록 설계되었다. 공여자 분자인 pDAS000268 (서열 86 및 서열 87)은 ZFN 29732 및 29730에 대한 절단 부위로부터 출발하여 ZFN 30012 및 30018에 대한 절단 부위에서 끝나는 D-게놈 상에 코딩된 내인성 AHAS 유전자와 거의 동일한 서열을 함유하였다. 10개의 의도적인 돌연변이를 상기 서열 내에 도입하였다. 6개의 돌연변이는 공여자의 5' 말단에 위치하였다: 2개의 돌연변이는 S653N 돌연변이 (AGC→AAT)를 코딩하고, 4개의 돌연변이는 동의 돌연변이였다. 4개의 돌연변이는 공여자의 3' 말단에 위치하고, 비-코딩 서열에 위치하였다. ZFN-매개 NHEJ-유도 DNA 복구를 용이하게 하기 위한 라이게이션 오버행을 제공하도록 돌출된 5' 및 3' 말단을 갖는 공여자 분자가 설계되었다.
표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 이중 가닥 DNA 공여자 분자 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스)를 합성하였다. 각각의 공여자 분자에 대해, 식물체내 엔도뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공하기 위해 각각 그의 5' 말단에 2개의 포스포로티오에이트 연결을 갖는 한 쌍의 상보성 단일 가닥 DNA 올리고머를 합성하였다. 단일 가닥 DNA 올리고머를 전장 분자에 대해 풍부화하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하고, Na+ 교환을 사용하여 합성 단계로부터의 화학적 잔재물로부터 정제하였다. 이중 가닥 공여자 분자는 통상의 기술자에게 통상적으로 공지된 표준 방법을 사용하여 등몰량의 2개의 상보성 단일 가닥 DNA 올리고머를 어닐링함으로써 형성하였다. 트리티쿰 아에스티붐으로 전달하기 전에, 이중 가닥 DNA 분자를 요구되는 농도로 멸균수에 희석하였다.
AHAS (S653N)를 코딩하는 이원 벡터의 설계 및 생산
표준 클로닝 방법을 이원 벡터 pDAS000143 (서열 88) (도 10)의 구축에 사용하였다. AHAS (S653N) 유전자 발현 카세트는 제아 메이스로부터의 유비퀴틴 (Ubi) 유전자로부터의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (Toki et al., (1992) Plant Physiology 100; 1503-07), 이어서 아미노산 잔기 653에서 세린 (S)으로부터 아스파라긴 (N)으로의 아미노산 변화를 유도하기 위해서 CG로부터 AT로 돌연변이된 염기쌍 1880 및 1181을 갖는 티. 아에스티붐으로부터의 AHAS 유전자의 코딩 서열 (1935 bp)로 이루어졌다. AHAS 발현 카세트는 에이. 투메파시엔스 pTi15955로부터의 노팔린 신타제 유전자 (nos)의 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하였다 (Fraley et al., (1983) Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 80(15); 4803-4807). 선택 카세트는 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터의 액틴 1 (Act1) 유전자로부터의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (McElroy et al., (1990) The Plant Cell 2(2); 163-171), 이어서 포스피노트리신, 글루포시네이트 및 비알라포스를 포함하는 글루타민 신테타제의 억제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 스트렙토미세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터 단리된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자의 합성, 식물-최적화된 버전 (Wohlleben et al., (1988) Gene 70(1); 25-37)으로 구성되었다. 상기 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35S 유전자로부터의 3' UTR로 종결되었다 (Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101 (4); 1395-1396).
선택 카세트를 상업적 유전자 합성 업체 (진아트(GeneArt), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))에 의해 합성하고, RfA 게이트웨이 카세트가 제아 메이스로부터의 유비퀴틴 (Ubi) 유전자와 에이. 투메파시엔스 pTi15955로부터의 노팔린 신타제 유전자 (nos)의 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 영역 (UTR) 사이에 위치하는 게이트웨이-실행가능 이원 벡터 내로 클로닝하였다. AHAS(S653N) 코딩 서열을 플랭킹 attB 부위와 함께 증폭하고, pDONR221 내로 서브클로닝하였다. 생성되는 ENTRY 클론을 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 발현 카세트를 코딩하는 게이트웨이-실행가능 이원 벡터와 함께 LR CLONASE II™ (인비트로겐, 라이프 테크놀로지스) 반응에 사용하였다. 모든 라이게이션 반응물로 형질전환된 이. 콜라이 세포의 콜로니를 미니프렙 DNA의 제한 소화에 의해 초기에 스크리닝하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 및 프로메가로부터 입수하였다. 플라스미드 제조는 퀴아프렙 스핀(QIAPREP SPIN) 미니프렙 키트™ 또는 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템™ (프로메가 코포레이션, 위스콘신주)을 제조업체의 지침에 따라 사용하여 수행하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를, ABI 생거 서열분석 및 빅 다이 터미네이터(TERMINATOR) v3.1™ 사이클 서열분석 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)을 사용하여 서열분석하였다. 서열 데이터를 조립하고, 시퀀처™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션, 미시건주 앤 아버)를 사용하여 분석하였다.
AHAS 편집된 밀 식물을 생성하기 위한 바이오리스틱-매개 형질전환 시스템
공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 미성숙 접합체 배아의 약 23,000개의 소순판을 상기 기재된 바와 같은 바이오리스틱-매개 DNA 전달을 위해 제조하였다. DNA-코팅된 금 입자를 다음 제제를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 제조하였다. pDAS000267을 사용하여 수행된 형질감염을 위해, 공여자 DNA를 pDAB109350 (ZFN 29732 및 29730 코딩)의 플라스미드 DNA와 5:1 몰비로 혼합하였다. pDAS000268을 사용하여 수행된 형질감염을 위해, 공여자 DNA를 pDAB109350 (ZFN 29732 및 29730 코딩) 및 pDAB109360 (ZFN 30012 및 30018 코딩)의 플라스미드 DNA와 10:1:1 몰비로 혼합하였다. pDAS000143을 사용하여 수행된 형질감염은 pDAS000143의 플라스미드 DNA로만 코팅된 금 입자를 사용하여 수행하였다.
바이오리스틱-매개 형질감염을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 총 15,620개의 소순판을 pDAS000267을 함유하는 DNA로 코팅된 금 입자로 포격하고, 총 7,310개의 소순판을 pDAS000268을 함유하는 DNA로 코팅된 금 입자로 포격하고, 총 2,120개의 소순판을 pDAS000143으로 코팅된 금 입자로 포격하였다. 포격 후에, 형질감염된 소순판을 26℃에서 암실에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 캘러스 유도를 위해 배지에 옮겼다.
이마자목스®를 기초로 한 4개의 상이한 화학적 선택 전략을 사용하여 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 의해 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 동조 카피 내로 정확하게 통합된 S653N 돌연변이를 갖는 재생된 밀 식물을 풍부화하였다. 4개의 화학적 선택 전략을 표 9에 기재하였다. 각각의 전략을 위해, 소순판을 암실에서 캘러스 유도 배지 상에서 24℃에서 2주 동안 배양하였다. 생성된 캘러스를 신선한 캘러스 유도 배지에서 1회 계대배양하고, 동일한 조건에서 추가로 2주 동안 유지하였다. 체세포 배아발생 캘러스 (SEC)를 식물 재생 배지로 옮기고, 성장실에서 16/8시간 (명/암) 광주기 하에 2주 동안 24℃에서 배양하였다. 재생된 소식물체를 발근 배지로 옮기고, 동일한 조건 하에서 2-3주 동안 배양하였다. S653N 돌연변이를 갖는 재생된 식물의 선택을 위한 엄격도를 증가시키기 위해, 재생된 식물의 뿌리를 제거하고, 식물을 동일한 조건 하에 발근 배지에서 다시 계대배양하였다. 두번째로 발근하는 소식물체를 토양으로 옮기고, 온실 제한 조건 하에 성장시켰다. T1 종자를 개별 식물로부터 수확한 후, 이종교배를 방지하기 위해 개별적인 이삭을 자루에 넣었다.
pDAS000143으로 코팅된 금 입자로 포격된 소순판 체외이식편을 사용하여, AHAS S653N 돌연변이를 보유하는 밀 식물을 재생하기 위한 4개의 화학적 선택 전략에 걸친 선택 엄격성을 모니터링하였다. pDAS000143으로 형질전환된 식물을 상기 기재된 방법을 이용하여 재생하였다.
표 9: ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 의해 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 동조 카피 내로 정확하게 통합된 S653N 돌연변이를 갖는 밀 식물을 재생하기 위해 사용된 화학적 선택 전략. (IMI = 이마자목스™)
Figure pct00014
종합적으로, 14개의 추정되는 ZFN-매개 NHEJ-유도 AHAS 편집된 밀 식물이 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 미성숙 접합체 배아의 22,930개의 소순판의 형질감염으로부터 회수되었다. 추정되는 편집된 식물을 pDAS000267을 함유하는 DNA로 코팅된 금 입자로 포격된 소순판에 대한 모든 4개의 선택 전략으로부터 얻었다. 2개의 추정되는 편집된 식물을 pDAS000268을 함유하는 DNA로 코팅된 금 입자로 포격된 소순판에 대한 제2 선택 전략으로부터 얻었다. AHAS (S653N) 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 무작위로 통합된 카피를 보유하는 총 129개의 추정되는 형질전환된 밀 식물을 4개의 화학적 선택 전략에 걸쳐 회수하였다.
실시예 6: 편집된 밀 식물의 분자학적 특성화
S653N 돌연변이를 코딩하는 공여자 폴리뉴클레오티드를 사용한 포격으로부터 생성되는 밀 식물을 얻고, 게놈 이중 가닥 절단 부위에서 공여자 통합의 결과로서 발생하는 S653N 돌연변이의 통합을 포함하는 밀 서브-게놈을 확인하기 위해 분자학적으로 특성화하였다. 2 시리즈의 포격을 수행하였다. 제1 세트의 실험은 pDAS000143을 사용하여 수행하고, 제2 세트의 실험은 pDAS000267 및 pDAS000268을 사용하여 수행하였다. 개별적인 밀 식물을 두 세트의 실험으로부터 얻고, S653N 돌연변이를 코딩하는 AHAS 공여자 폴리뉴클레오티드의 통합된 카피를 함유하는 식물을 확인하기 위해 분자학적 방법을 통해 검정하였다.
pDAS000143으로 포격된 회수된 밀 식물이 S653N 돌연변이를 코딩하는 AHAS 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 무작위로 통합된 카피를 보유하는지 확인하기 위해, 정량적 PCR 분석을 위한 가수분해 프로브 검정 (택맨(TAQMAN)® 기반 검정과 유사)을 사용하였다. 생거 서열 분석을 통한 확인은 pDAS000267 및 pDAS000268을 사용하여 수행된 포격으로부터 회수된 밀 식물이 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 대해 예상된 위치에서 AHAS 유전자의 적어도 하나의 동조 카피에 S653N 공여자 폴리뉴클레오티드를 포함함을 보여주었다.
재생된 밀 식물로부터의 게놈 DNA 단리
게놈 DNA를 각각의 재생된 밀 식물으로부터 수확한 동결건조된 잎 조직으로부터 추출하였다. 새로 수확한 잎 조직을 액체 질소로 급속 냉동하고, -40℃ 및 133 x 10-3 mBar 압력에서 랍콘코 프리존 4.5® (랍콘코, 미주리주 캔자스 시티)에서 24시간 동안 동결 건조하였다. 동결건조된 물질을 제조업체의 지침에 따라 DNEASY® 식물 DNA 추출 미니 키트™ (퀴아젠)를 사용하여 DNA 추출에 적용하였다.
S653N 돌연변이를 코딩하는 AHAS 공여자 폴리뉴클레오티드의 무작위 통합을 확인하기 위한 PCR 검정
pDAS000143을 사용하여 수행된 포격으로부터 재생된 밀 식물이 S653N 돌연변이를 코딩하는 AHAS 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 무작위로 통합된 카피를 보유하는지 확인하기 위해, 듀플렉스 가수분해 프로브 qPCR 검정 (택맨®과 유사)을 사용하여, 내인성 단일 카피 유전자, 육배체 밀의 D 게놈으로부터의 퓨로인돌린-b (Pinb) (Gautier et al., (2000) Plant Science 153, 81-91; 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브 서열에 대해 각각 서열 89, 서열 90 및 서열 91) 및 pDAS000143에 존재하는 액틴 (Act1) 프로모터의 영역 (정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브 서열에 대해 각각 서열 92, 서열 93 및 서열 94)을 증폭하였다. 각각의 4개의 화학적 선택 전략으로부터 회수된 24개의 무작위 선택된 밀 식물에 대해 가수분해 프로브 qPCR 검정을 수행하였다. pDAS00143의 존재 및 추정된 카피수의 평가를 문헌 [Livak and Schmittgen (2001) Methods 25(4):402-8]에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
상기 결과로부터, S653N 돌연변이를 코딩하는 AHAS 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 카피의 시험된 각각의 밀 식물의 게놈 내로의 통합에 대한 확실한 증거를 얻었다. 이들 결과는 4개의 화학적 선택 전략이 S653N 돌연변이를 발현하는 식물의 회수를 위한 엄격한 선택을 제공함을 나타내었다.
ZFN-매개 AHAS 편집에 대한 게놈 DNA의 PCR 검정
회수된 밀 식물에서 서브-게놈 위치 및 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집의 결과를 특성화하기 위해, 프라이머 AHAS_3F1 및 AHAS_3R1 (서열 95 및 서열 96)을 사용한 PCR을 통해 AHAS 유전자의 동조 카피로부터 표적 영역을 증폭하였다. 생성되는 PCR 생성물을 플라스미드 벡터 내로 클로닝하고, ABI3730XL® 자동 모세관 전기영동 플랫폼에서 빅다이® v3.1 화학 (어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 생거 서열분석하였다. 내인성 AHAS 동조체에서 각각의 대립유전자가 서열분석됨을 보장하기 위해, 120개 이하의 독립적인 플라스미드 클론의 생거 서열분석을 수행하였다. 시퀀처 소프트웨어™를 사용하여 수행된 서열 분석을 이용하여, 각각의 회수된 밀 식물에서 AHAS 유전자의 3개의 동조 카피의 각각의 대립유전자에 대한 컨센서스 서열을 생성하고, 각각의 편집된 대립유전자에 대한 서브-게놈 기원 및 서열을 결정하였다.
결과로부터, 내인성 AHAS 유전자좌에서 정확한 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 대한 확실한 증거가, pDAB109350 및 pDAS000267을 사용하여 형질전환된 12개의 회수된 밀 식물 중 11개 (표 10), 및 pDAB109350, pDAB109360 및 pDAS000268을 사용하여 형질전환된 회수된 밀 식물 둘 모두 (표 11)에 대해 입증되었다. 다음을 비롯하여 다양한 편집 결과를 갖는 식물이 관찰되었다: (1) 완전한 서브-게놈-특이적 대립유전자 편집을 갖는 독립적인 이벤트; (2) A-게놈, B-게놈 및 D-게놈에 단일 완전한 편집을 갖는 이벤트; (3) 다중 서브-게놈에 동시 편집을 갖는 이벤트; 및 (4) 반접합성 및 동형접합성 서브-게놈-특이적 대립유전자 편집을 보이는 이벤트. 밀 식물의 모든 3개의 게놈 내의 유전자좌를 돌연변이시키기 위해 이용될 수 있는 방법이 처음으로 개시된다. S653N 돌연변이를 코딩하는 통합된 AHAS 공여자 폴리뉴클레오티드를 포함하는 밀 식물이 예시되고; 폴리뉴클레오티드 서열의 통합은 이미다졸리논 부류 제초제에 대한 내성을 제공한다. 밀의 내인성 유전자좌에서 ZFN-매개 게놈 편집의 이용은, 형질을 모든 3개의 서브-게놈 내로 유전자이입하기 위해 필요한 시간을 증가시킬 수 있는 역교배 및 유전자이입 단계를 필요로 하는 시간 소모적인 밀 육종 기술을 실시하지 않으면서 작물 형질의 도입 (돌연변이를 통한)을 허용한다. 편집된 밀 식물의 각각의 서브-게놈에 존재하는 대립유전자에 대한 컨센서스 생거 서열이 표 10 및 11에 서열 97-180으로서 제시된다.
표 10: pDAB109350 및 pDAS000267을 사용하여 형질전환된 밀 식물에 대한 ZFN-매개 NHEJ-유도 AHAS 편집 결과
Figure pct00015
표 11: pDAB109350, pDAB109360 및 pDAS000268을 사용하여 형질전환된 밀 식물에 대한 ZFN-매개 NHEJ-유도 AHAS 편집 결과
Figure pct00016
실시예 7: P197 아미노산 잔기를 코딩하는 AHAS 유전자 내의 영역에 특이적인 아연 핑거 결합 도메인의 설계
AHAS 유전자의 동조 카피의 DNA 서열에 대해 지시된 아연 핑거 단백질을 상기 기재된 바와 같이 설계하였다 (또한 실시예 2 참조). 예시적인 표적 서열 및 인식 나선을 표 12 (인식 나선 영역 설계) 및 표 13 (표적 부위)에 제시하였다. 표 13에서, ZFP 인식 나선이 접촉하는 표적 부위 내의 뉴클레오티드를 대문자로 나타내고; 비-접촉된 뉴클레오티드를 소문자로 나타낸다. 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 표적 부위는 프롤린 197 (P197) 아미노산 잔기를 코딩하는 AHAS 유전자 내의 영역의 상류 (2 내지 510개 뉴클레오티드 상류)에 위치하였다.
표 12: AHAS 아연 핑거 설계 (N/A는 "적용가능하지 않음"을 나타냄)
Figure pct00017
표 13: AHAS 아연 핑거의 표적 부위
Figure pct00018
AHAS 아연 핑거 설계를 아연 핑거 발현 벡터 내로 혼입하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 출아 효모 시스템을 사용하여 절단 활성에 대해 확인하였다. 추정 AHAS 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 결합하도록 설계, 생산 및 시험된 다수의 ZFN 중에서, 14종의 ZFN이 높은 수준의 생체내 활성을 갖는 것으로 확인되었고, 추가 실험을 위해 선택되었다. 14종의 모든 ZFN은 3개의 동조 AHAS에 결합하도록 설계되었고, 식물체내 특유한 AHAS 게놈 폴리뉴클레오티드 표적 부위에 효율적으로 결합하여 절단할 수 있는 것으로 특성화되었다.
실시예 8: 일과성 검정을 이용한 AHAS 유전자의 아연 핑거 뉴클레아제 절단의 평가
ZFN 구축물 조립
효모 시스템을 사용하여 절단 활성에 대해 확인된 ZFN 발현 구축물을 함유하는 플라스미드 벡터 (실시예 7에 기재된 바와 같음)를 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 설계하고 제작하였다. 생성된 14종의 플라스미드 구축물: pDAB111850 (ZFN 34456-2A-34457), pDAB111851 (ZFN 34458-2A-34459), pDAB111852 (ZFN 34460-2A-34461), pDAB111853 (ZFN 34462-2A-34463), pDAB111854 (ZFN 34464-2A-34465), pDAB111855 (ZFN 34470-2A-34471), pDAB111856 (ZFN 34472-2A-34473), pDAB111857 (ZFN 34474-2A-34475), pDAB111858 (ZFN 34476-2A-34477), pDAB111859 (ZFN 34478-2A-34479), pDAB111860 (ZFN 34480-2A-34481), pDAB111861 (ZFN 34482-2A-34483), pDAB111862 (ZFN 34484-2A-34485) 및 pDAB111863 (ZFN 34486-2A-34487)을 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.
형질감염을 위한 ZFN 구축물로부터의 DNA의 제조
트리티쿰 아에스티붐 원형질체로의 전달 전에, 각각의 ZFN 구축물에 대한 플라스미드 DNA를 공급업체의 지침에 따라 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템® (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨) 또는 플라스미드 맥시 키트® (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 이. 콜라이의 배양물로부터 제조하였다.
밀 엽육세포 원형질체의 단리 및 형질감염
공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 엽육세포 원형질체를 제조하고, 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-매개 DNA 전달을 사용하여 형질감염시켰다.
ZFN 서열 절단을 위한 원형질체 게놈 DNA의 PCR 검정
게놈 DNA를 형질감염된 원형질체로부터 단리하고, 상기 실시예 3에 기재된 바와 같이 P197을 코딩하는 AHAS 유전자의 영역에 대한 설계된 ZFN의 절단 효율 및 표적 부위 특이성을 평가하기 위해 PCR 검정에 사용하였다. 별표 [*]로 표시된 포스포로티오에이트 연결을 함유하는 PCR 프라이머의 5개 세트를 사용하여 ZFN 표적 부위 유전자좌를 증폭하였다 (표 14). 각각의 프라이머 세트는 상기 실시예 3에 기재된 기준에 따라 설계하였다.
표 14: AHAS ZFN 절단 효능 및 표적 부위 특이성을 평가하기 위해 사용된 프라이머 서열
Figure pct00019
표적 ZFN 부위에서 NHEJ를 검출하기 위한 데이터 분석
형질감염된 엽육세포 원형질체에 대해 제조된 샘플 라이브러리에 대한 일루미나 짧은 리드 서열 데이터의 생성 후에, 표적 ZFN 부위에서 결실된 뉴클레오티드를 확인하기 위해 생물정보학적 분석 (상기 실시예 3에 기재된 바와 같음)을 수행하였다. 상기 결실은 비-상동 말단 연결 (NHEJ) DNA 복구에 의한 식물체내 ZFN 활성의 지표로 공지되어 있다.
2개의 접근법을 사용하여, 시험된 ZFN의 절단 효율 및 특이성을 평가하였다. 절단 효율은 ZFN 표적 부위에 NHEJ 결실을 함유하는 서브-게놈 할당된 서열의 비율로서 표현하였다 (1백만 리드당 부) (표 15). 그의 관찰된 절단 효율에 의한 ZFN의 순위 평가를 사용하여 서브-게놈-특이적 방식으로 AHAS 유전자의 표적 영역에 대한 최고의 절단 활성을 갖는 ZFN을 확인하였다. 시험된 모든 ZFN은 식물체내 ZFN 활성에 대해 예상된 것과 일치하는 NHEJ 결실 크기 분포를 보였다. 절단 특이성은 3개의 서브-게놈에 걸쳐 관찰된 절단 효율의 비율로서 표현하였다.
표 15: ZFN 절단 효능 (1백만개의 리드당 NHEJ 이벤트의 수로 표현) 및 표적 부위 특이성.
Figure pct00020
이들 결과로부터, 플라스미드 pDAB111855 상에 코딩된 (34470-2A-34471), pDAB111856 상에 코딩된 (34472-2A-34473) 및 pDAB111857 상에 코딩된 (34474-2A-34475) ZFN을 각각의 3개의 밀 서브-게놈에서의 그의 유의한 게놈 DNA 절단 활성의 특징을 고려하여 후속적인 실험에서 식물체내 표적화를 위해 선택하였다.
실시예 9: 정확한 게놈 변형의 특정 조합을 갖는 식물을 회수하기 위한 인공 교배 및 분자학적 분석
공여자 DNA 및 아연 핑거 뉴클레아제 구축물을 사용한 형질전환을 통해 생산된 밀 이벤트는 표적 내인성 유전자좌의 하나 이상의 카피에서 공여자 분자 서열의 통합을 생성한다. 상기 실시예 6에 제시된 바와 같이, ZFN-매개 게놈 변형은 다수의 서브-게놈에 걸친 다수의 대립유전자의 동시 편집을 유발한다. 후속적으로 형질전환 이벤트의 인공 교배를 이용하여 정확한 게놈 변형의 특이적인 조합을 선택할 수 있다. 예를 들어, S653N 돌연변이를 갖는 정확히 변형된 AHAS 유전자를 갖는, 실시예 5에서 생산된 형질전환 이벤트의 인공 교배를 이용하여 특정 서브-게놈, 다수의 서브-게놈의 임의의 조합, 또는 3개의 모든 서브-게놈에 S653N 돌연변이를 갖는 밀 식물을 생산할 수 있다.
유사하게, 후속으로, 표적 내인성 유전자좌의 다수의 카피에 게놈 변형을 갖는 형질전환 이벤트의 자가-수분을 이용하여 특정 서브-게놈에만 S653N 돌연변이를 갖는 밀 이벤트를 생산할 수 있다. 후속의 형질전환 이벤트의 자가-수분은 표적 내인성 유전자좌의 하나 이상의 카피에서의 불완전한 편집과 같은 이벤트로부터의 바람직하지 않은 게놈 변형을 제거하는데 특히 유용하다.
분자 및 표현형 검정, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 것들을 이용하여, 인공 교배 및 형질전환된 이벤트의 자가-수분으로부터 유래된 자손에서 특정 게놈 변형의 유전을 추적할 수 있다.
밀에서의 정밀 게놈 변형의 유전 및 발현
실시예 5에서 생성된 밀 형질전환 이벤트에 의해 보유된 S653N 돌연변이에 의해 부여된 AHAS 제초제 내성 표현형의 안정한 발현 및 유전을 검증하기 위해, 3개의 밀 이벤트로부터의 T1 종자를 분자 및 표현형 분석에 적용하였다. 3개의 독립적인 밀 이벤트는 각각 A-게놈 내에 위치한 AHAS 유전자에 통합된 S653N 돌연변이를 보유하였다.
T1 종자는 각각의 T0 이벤트의 자가-수분으로부터 유래되었다. 상기 기재된 바와 같이 종자를 표면 멸균하고, 증식 배지 상에서 멸균된 종자를 계대배양함으로써 시험관내에서 발아시켰다. 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 24℃에서 10일간 성장시킨 후, 발아된 묘목의 뿌리를 제거하고, 묘목을 200 nM 이마자목스® (이미다졸리논)를 함유하는 발근 배지 상으로 옮겼다. 묘목을 동일한 조건 하에 2-3주 동안 인큐베이션하고, 뿌리 재성장의 존재 또는 부재를 기록하였다. 각각의 묘목으로부터 수확한 잎 조직을 DNA 추출에 사용하고, 프라이머 AHAS_3F1 및 AHAS_3R1 (서열 95 및 서열 96)을 사용하여 변형된 AHAS 유전자의 존재에 대해 시험하기 위해 PCR 검정을 상기 기재된 바와 같이 완료하였다. 아가로스 겔 상의 생성된 PCR 생성물의 전기영동 분리를 이용하여 변형된 AHAS 유전자의 존재를 검출하였다. 단지 750-bp 단편 PCR 생성물만의 증폭은 변형된 AHAS 유전자의 부재를 나타낸다. 비교적으로, 단지 850-bp 단편만의 증폭은 동형접합 상태의 변형된 AHAS 유전자의 존재를 나타내었다. 또한, 750-bp 및 850-bp 단편 둘 다의 증폭은 반접합 상태의 변형된 AHAS 유전자의 존재를 나타내었다.
이후에, 카이-제곱 시험을 이용하여 단일 유전자 단위로서의 변형된 AHAS 유전자의 유전을 확인하였다. 예상된 멘델 유전이 각각의 3개의 밀 형질전환 이벤트에 대해 T1 생성에서 관찰되었다. 변형된 AHAS 유전자는, T1 묘목에서 우성 마커 (표 16)를 생산하는 PCR 시험에 대해 예상된 3:1 비로 분리되었다. 유사하게, T1 묘목에서 S653N 돌연변이에 의해 부여된 우성 AHAS 제초제 내성 표현형 (표 17)에 대해 예상된 바와 같이 이마자목스® 내성은 3:1 분리를 나타내었다.
표 16: 실시예 5로부터의 형질전환된 밀 식물의 자가-수분으로부터 유래된 T1 묘목에서의 변형된 AHAS 유전자의 분리.
Figure pct00021
표 17: 실시예 5로부터의 형질전환된 밀 식물의 자가-수분으로부터 유래된 T1 묘목에서의 이마자목스® 내성 표현형의 분리.
Figure pct00022
변형된 AHAS 유전자의 발현의 안정성을 AHAS 제초제 내성 표현형과의 그의 대응에 의해 검증하였다. 완전한 일치가 하나 이상의 카피의 변형된 AHAS 유전자의 존재와 이마자목스® 내성 사이에서 관찰되었다.
정확한 게놈 변형의 특정 조합을 갖는 식물을 회수하기 위한 자가-수분 및 인공 교배
실시예 5에서 생산된 밀 형질전환 이벤트 사이의 인공 교배를 이용하여 특정 서브-게놈, 다수의 서브-게놈 또는 3개의 모든 서브-게놈 상에 S653N 돌연변이를 갖는 밀 식물을 생성할 수 있다.
특정 서브-게놈 상에 S653N 돌연변이를 갖는 동형접합 밀 식물을 생성하기 위해, 실시예 5로부터의 3개의 밀 이벤트를 자가-수분시키고, T1 종자를 생산하였다. 3개의 이벤트; mb1k-7783-1-1, yw06-7762-2-1 및 yw06-7834-1-1은 각각 A-게놈, B-게놈 및 D-게놈 상에 반접합 AHAS 게놈 변형을 갖도록 선택하였다. 각각의 이벤트로부터의 약 15개의 T1 종자를 온실 제한 조건 하에 발아시키고 성장시켜 T2 종자를 생산하였다. 각각의 T1 식물로부터 수확한 잎 물질을 DNA 추출에 사용하고, PCR 검정을 완료하여 변형된 AHAS 유전자의 접합성을 결정하였다. 이 PCR 접합성 시험은, ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB190350 상에 코딩됨)에 대한 결합 부위를 함유하는 영역 내의 내인성 AHAS 유전자의 각각의 3개의 동조 카피로부터 단편을 증폭시키고 게놈 뉴클레오티드 서열 변이를 포함하도록 설계되었다. 충분한 게놈 뉴클레오티드 서열 변이를 포함시켜 AHAS 동조체 사이에 차별을 주어, 생성된 앰플리콘이 이들이 유래된 밀 서브-게놈에 대해 (서열 수준에서) 명백하게 추적될 수 있도록 하였다. 프라이머 쌍을 5' 말단에서 일루미나™ SP1 및 SP2 서열과 합성하여, 합성 화학에 의한 일루미나™ 서열분석과의 상용성을 제공하였다. 합성된 프라이머는 또한 끝에서 두 번째의 5' 및 3' 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 함유하였다. 5' 포스포로티오에이트 연결은 일루미나™ SP1 및 SP2 서열의 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공하였다. 마찬가지로, 3' 포스포로티오에이트 연결은 온-오프 PCR을 사용한 표적 AHAS 서열의 증폭에 대한 PCR 특이성을 개선하였다 (Yang et al., (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun., Mar. 4:328(1):265-72). 프라이머 쌍의 서열을 표 18에 제공하였다.
표 18: 실시예 5로부터의 트랜스제닉 밀 이벤트에서 변형된 AHAS 유전자의 접합성을 평가하기 위해 사용된 프라이머 서열.
Figure pct00023
생성된 PCR 앰플리콘을 상기 기재된 바와 같이 심층 서열분석을 위해 제조하고, 제조업체의 지침에 따라 일루미나 MiSEQ™ 기기 상에서 서열분석하여 250-bp 쌍형성-말단 서열 리드를 생성하였다. 생성된 서열 리드를 상기 기재된 바와 같이 컴퓨터에 의해 처리하여 각각의 리드를 샘플 (바코드 인덱스를 기초로 함) 및 이들이 유래된 서브-게놈 (AHAS 유전자의 동조 카피 사이에 차별을 주는 뉴클레오티드 변이를 기초로 함)에 할당하고, 고품질 서열만이 후속 분석에 사용되었음을 보장하기 위해 품질 필터링을 수행하였다. 맞춤 개발된 PERL 스크립트 및 마이크로소프트 엑셀 2010™ (마이크로소프트 코포레이션)에서의 수동 데이터 조작을 이용하여 데이터를 처리하고 각각의 T1 밀 이벤트에서 변형된 AHAS 유전자의 접합성을 결정하였다.
내인성 AHAS 유전자좌 내로의 pDAS000267의 통합은 야생형 (비변형됨) 및 생성된 트랜스제닉 (변형된) 대립유전자 사이에 단지 95-bp 크기 차이를 생성하였기 때문에, PCR 접합성 검정은 야생형 및 변형된 AHAS 유전자 둘 다를 증폭시킬 것으로 예상되었다. 따라서, 표적 게놈 변형에 대해 동형접합인 T1 식물은 변형된 AHAS 유전자좌에서의 트랜스제닉 대립유전자의 증폭으로부터 기원하는 단독 서열 리드를 생산할 것으로 예상되었다. 이들 대립유전자는 pDAS000267에서 AHAS 엑손 내로 의도적으로 도입된 6개의 돌연변이에 의해 서열 수준에서 구별가능하였다 (예를 들어, S653N 돌연변이를 코딩하는 2개의 돌연변이, 및 통합된 공여자의 재절단을 방지하는 ZFN 29732의 결합 부위에 걸쳐 위치된 4개의 코돈-최적화, 동의 돌연변이). 표적 게놈 변형에 대해 반접합인 T1 식물은 변형된 AHAS 유전자좌에 야생형 및 트랜스제닉 대립유전자 둘 다로부터 기원하는 서열 리드를 생산할 것으로 예상되었다. 반면에, 변형된 AHAS 유전자가 없는 T1 식물은 변형된 AHAS 유전자좌에 야생형 대립유전자로부터 기원하는 서열 리드만을 생산할 것으로 예상되었다. PCR 접합성 시험을 기초로 하여, 단지 A-게놈, B-게놈 또는 D-게놈에서의 S653N 돌연변이에 대해 동형접합인 T1 식물을 확인하였다 (표 19).
표 19: 실시예 5로부터의 트랜스제닉 밀 이벤트의 자가-수분으로부터 유래된 T1 식물에 대한 PCR 접합성 검정 결과.
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
통상의 기술자는 다수의 서브-게놈의 임의의 조합 (예를 들어, A-게놈 및 B-게놈, A-게놈 및 D-게놈, 또는 B-게놈 및 D-게놈), 또는 3개의 모든 서브-게놈 상에 S653N 돌연변이를 갖는 동형접합 밀 식물을 생산하기 위해, 후속 라운드의 다양한 밀 형질전환 이벤트 사이의 인공 교배를 기재된 PCR 접합성 시험과 조합하여 이용할 수 있다. 예를 들어, T1 식물 mb1k-7783-1-43 (즉, aaBBDD 유전자형)과 T1 식물 yw06-7762-2-25 (즉, AAbbDD 유전자형)의 인공 교배는 A-게놈 및 B-게놈에서 변형된 AHAS 유전자에 대해 반접합인, 즉 AaBbDD 유전자형을 갖는 T2 종자를 생산할 것이다. 후속의, T2 식물의 성장 및 자가-수분은 A- 및 B-게놈 상의 변형된 AHAS 유전자에 대해 동형접합 유전자형으로 분리된 T3 종자 (즉, aabbDD 유전자형)를 생산할 것이며, 이는 기재된 PCR 접합성 검정을 이용하여 확인될 수 있다.
실시예 10: 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 순차적, 외인성 트랜스진 스택킹을 위한 형질전환 시스템의 개발
동일한 게놈 위치에 정확히 위치하는 하나 이상의 트랜스진을 갖는 식물을 생성하기 위한 ZFN-매개, 외인성 형질전환 시스템을 개발하기 위한 모델 유전자좌로서 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌를 선택하였다. 상기 형질전환 시스템은 정확히 동일한 게놈 위치에서 병행 (하나 이상의 트랜스진의 동시 통합) 또는 순차적 스택킹 (하나 이상의 트랜스진의 연속적인 통합)을 가능하게 한다. 또한, 상기 형질전환 시스템은 다수의 서브-게놈에 걸친 다수의 대립유전자에서의 동시적 병행 또는 순차적 스택킹을 포함한다. 상기 전략은 군 B 제초제 (예를 들어, ALS 억제제 예컨대 이미다졸리논 또는 술포닐우레아)에 대한 내성을 부여하는 AHAS 유전자에 돌연변이를 혼입시키는 것을 이용한다.
야생형 (제초제 감수성) AHAS 유전자좌 내로의 공여자 DNA의 ZFN-매개 통합을 사용하여 트랜스진(들) 및 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 내인성 AHAS 유전자에 대한 돌연변이를 도입하였고, 이에 따라 이미다졸리논 선택제에 대한 내성을 보유하는, 정확하게 표적화된 식물을 재생할 수 있었다.
AHAS 유전자좌에서 제2 트랜스진(들)의 스택킹은, 하나 이상의 추가의 트랜스진을 도입하여 이미다졸리논에 대한 감수성, 그러나 술포닐우레아에 대한 내성을 부여하는 공여자 DNA의 통합에 의해 달성되며, 따라서 이는 술포닐우레아 선택제를 사용한 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다.
제3 트랜스진의 스택킹은, 추가의 트랜스진(들)을 도입하여 술포닐우레아에 대한 감수성 및 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 공여자 분자의 통합에 의해 달성되며, 따라서 이는 이미다졸리논 선택제를 사용한 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다.
따라서, 순차적 트랜스진 스택킹의 계속적 라운드는 이미다졸리논과 술포닐우레아 선택제 사이의 차등 순환을 위해 내인성 AHAS 유전자에 트랜스진(들) 및 돌연변이를 도입하는 공여자 DNA의 사용에 의해 가능하다. 트랜스진은 AHAS 유전자 내에 통합되고 NHEJ 및/또는 HDR 경로를 통해 스택킹될 수 있다. 바람직한 복구 및 재조합 경로는 공여자 트랜스진의 설계에 의해 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, AHAS 유전자 내에 통합되고 스택킹된 외인성 서열은 게놈 통합 부위, 즉 AHAS 유전자에 대한 상동성의 5' 및 3' 영역을 함유하도록 설계될 것이다. 상동성의 5' 및 3' 영역은 페이로드 (예를 들어, AHAS 돌연변이 및 관심 유전자)에 플랭킹될 것이다. 따라서, 상기 설계는 염색체 내의 공여자 폴리뉴클레오티드의 통합 및 스택킹을 위해 HDR 경로를 이용할 것이다. 후속 실시양태에서, AHAS 유전자 내에 통합되고 스택킹된 트랜스진은 페이로드 (예를 들어, AHAS 돌연변이 및 관심있는 유전자)에 플랭킹된 단일 또는 이중 절단 ZFN 부위를 함유하도록 설계될 것이다. 따라서, 상기 설계는 염색체 내의 공여자 폴리뉴클레오티드의 통합 및 스택킹을 위해 NHEJ 경로를 이용할 것이다.
NHEJ-유도 DNA 복구를 이용한 내인성 AHAS 유전자좌에서의 제1 순차적 트랜스진 스택킹을 위한 공여자 DNA의 설계 및 생산
제1 라운드의 트랜스진 스택킹을 위한 공여자 DNA를 ZFN-매개 NHEJ-유도 복구를 통한 내인성 AHAS 유전자좌에서의 정확한 공여자 통합을 촉진하도록 설계하였다. 설계는 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨, 도 1)에 의한 내인성 AHAS 유전자의 동조 카피의 절단에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴의 위치에서의 이중 가닥 공여자 분자의 통합을 기초로 한다.
pDAS000433 (서열 71; 도 12)의 공여자 분자 백본은 여러 폴리뉴클레오티드 서열 특징을 포함하였다. 5' 말단은 D-게놈에서 코딩된 내인성 AHAS 유전자와 거의 동일한 서열을 함유하였다. 이 서열은 표적 ZFN 절단 부위에 걸쳐 AHAS 정지 코돈에서 끝나는 단편으로 구성되었다. 또한 7개의 의도적인 돌연변이를 서열 내로 도입하였다: S653N 돌연변이를 코딩하는 2개의 돌연변이, 및 ZFN 29732의 결합 부위에 걸쳐 위치된 5개의 코돈-최적화, 동의 돌연변이. 5개의 코돈-최적화, 동의 돌연변이는 통합된 공여자의 재절단을 방지하기 위해 포함시켰다. 이후에, 정지 코돈 다음에 AHAS 동조체에 걸쳐 보존된 3' 비번역 영역 (3'UTR)에 상응하는 316-bp의 비-코딩 서열이 이어졌다. 또한, 3'UTR 서열 다음에는 ZFN 34480 및 34481 (플라스미드 pDAB111860 상에 코딩됨) 및 ZFN 34482 및 34483 (플라스미드 pDAB111861 상에 코딩됨)에 대한 아연 핑거 결합 부위가 이어졌다. 이들 아연 핑거 결합 부위는 제2 라운드의 트랜스진 스택킹 동안 내인성 유전자좌에서 통합된 공여자-유래 AHAS (코딩 및 3'UTR) 서열의 자가-절제를 허용한다. 자가-절제 아연 핑거 결합 부위에는 100-bp의 무작위 서열에 플랭킹된 2개의 추가의 아연 핑거 결합 부위가 이어졌다. 이들 2개의 추가의 아연-핑거 결합 부위에는 트랜스진 발현 카세트 (즉, 하기 기재된 바와 같은 PAT 발현 카세트)를 삽입하는데 사용된 한 쌍의 특유의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 바로 이어졌다. 100-bp의 무작위 서열에 다시 플랭킹된 추가의 2개의 아연 핑거 결합 부위가 2개의 특유의 제한 엔도뉴클레아제 부위 다음에 이어졌다. 4개의 추가의 아연 핑거 결합 부위의 포함은 순차적인 마커-미사용 트랜스진 스택킹, 또는 교대 스택킹 방법을 사용한 동일한 게놈 위치에서의 계속적인 순차적 트랜스진 스택킹에 의해 AHAS 유전자좌에서 통합된 트랜스진의 향후 절제를 가능하게 한다.
공여자 백본 카세트는, 내인성 AHAS 유전자좌의 절단시에 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의해 생성된 라이게이션 오버행과 상용성인 돌출된 5' 및 3' 말단을 갖는 공여자 분자의 생성을 가능하게 하기 위해, 5' 및 3' 말단에 추가의 플랭킹 서열의 짧은 스트레치를 갖도록 상업적인 유전자 서비스 업체 (예를 들어, 진아트, 라이프 사이언시스 등)에 의해 합성하였다.
PAT 발현 카세트를 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 2개의 특유의 제한 엔도뉴클레아제 부위 사이의 pDAS000433의 공여자 백본 카세트 내로 삽입함으로써 공여자 분자 카세트 "QA_pDAS000434" (서열 314; 도 19)를 생산하였다. PAT 선택 카세트는 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터의 액틴 (Act1) 유전자로부터의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (McElroy et al., (1990) The Plant Cell, 2(2): 163-171), 이어서 포스피노트리신, 글루포시네이트 및 비알라포스를 포함하는 글루타민 신테타제의 억제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 스트렙토미세스 비리디크로모게네스로부터 단리된 합성, 식물-최적화 버전의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자 (Wohlleben et al., (1988) Gene, 70(1): 25-37)로 구성되었다. 이 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35s 유전자로부터의 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' UTR로 종결되었다 (Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101 (4): 1395-1396). "QA_pDAS000434"에 대한 플라스미드 DNA를 제조업체의 지침에 따라 퓨어 일드 플라스미드 맥시프랩 시스템™ (프로메가 코포레이션, 위스콘신주)을 이용하여 제조하였다.
"QA_pDAS000434"의 PCR 증폭에 이어서 제한 엔도뉴클레아제 BbsI에 의한 소화를 이용하여 내인성 AHAS 유전자좌의 절단시에 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의해 생성된 라이게이션 오버행과 상용성인 돌출 5' 및 3' 말단을 갖는 선형 이중-가닥 DNA 공여자 분자를 생산하였다. PCR 증폭을 프라이머 AHAS_TSdnr1_F1 및 AHAS_TSdnr1_R1 (각각 서열 297 및 298)을 사용하여 수행하였으며, 이는 짧은 스트레치의 추가의 서열이 공여자 백본 카세트 "QA_pDAS000434"의 5' 및 3' 말단에 부가되도록 설계되었다. 생성된 앰플리콘을 아겐코트 암퓨어(Agencourt AMPure)TM XP-PCR 정제 키트 (베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 이용하여 정제하고, BbsI (뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))로 소화시켰다. 앰플리콘을 아겐코트 암퓨어TM XP-PCR 정제 키트 (베크만 쿨터)를 이용하여 두번째로 정제하고, 이어서 에탄올 침전시키고, 밀 형질전환에 적절한 DNA 농도로 멸균수 중에 재현탁시켰다. 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 선형 이중-가닥 DNA 공여자 분자를 제조하였다.
대조 이원 벡터 코딩 AHAS (S653N)의 생산
AHAS(S653N) 발현 및 PAT 선택 카세트를 함유하는 이원 벡터 pDAS000143 (서열 88, 도 10)을 상기 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 기능 및 기술을 이용하여 설계하고 조립하였다. 이원성을 위한 플라스미드 DNA를 퓨어 일드 플라스미드 맥시프랩 시스템™ (프로메가 코포레이션, 위스콘신주)을 이용하여 제조업체의 지침에 따라 제조하였다. 이원 벡터 pDAS000143을 대조군으로서 밀 세포 내로 형질전환시켰다.
NHEJ-유도 DNA 복구를 이용하여 내인성 AHAS 유전자좌에서 제1 순차적 트랜스진 스택을 갖는 밀 이벤트를 생성하기 위한 바이오리스틱-매개 형질전환
공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 미성숙 접합체 배아의 소순판 총 55,468개를 상기 기재된 바와 같이 바이오리스틱-매개 DNA 전달을 위해 제조하였다. DNA-코팅된 금 입자를 상기 기재된 바와 같은 제제를 사용하여 제조하였다. "QA_pDAS000434" 또는 pDAS000433으로부터 유래된 선형 이중-가닥 공여자 DNA를 사용하여 수행된 형질감염을 위해, 공여자 DNA를 pDAB109350 (ZFN 29732 및 29730 코딩)에 대한 플라스미드 DNA와 5:1 몰비로 혼합하였다. pDAS000143을 사용하여 수행된 형질감염은 pDAS000143의 플라스미드 DNA로만 코팅된 금 입자를 사용하여 수행하였다.
바이오리스틱-매개 형질감염을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 포격 후에, 형질감염된 소순판을 26℃에서 암실에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 캘러스 유도를 위해 배지에 옮겼다.
2가지 상이한 화학적 선택 전략을 이용하여 통합된 선형 이중-가닥 공여자 분자를 갖는 재생된 밀 식물을 풍부화시켰다. 이마자목스® 기반의 제1 전략을 이용하여, ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 의해 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 동조 카피 내로 정확하게 통합된 공여자 분자를 갖는 밀 이벤트를 회수하였다. 이러한 이벤트는 S653N 돌연변이에 의해 부여된 AHAS 제초제 내성 표현형을 갖는 것으로 예상된다. 바스타(BASTA)® (DL-포스피노트리신) 기반의 제2 전략을 이용하여 밀 게놈 내의 무작위 (비-표적화) 위치에 통합된, 또는 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 의해 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 동조 카피 내로 불완전하게 통합된 공여자 분자를 갖는 이벤트를 회수하였다. 이들 이벤트는 PAT 유전자에 의해 부여된 바스타® 제초제 내성 표현형을 나타내지만 S653N 돌연변이에 의해 부여된 AHAS 제초제 내성 표현형을 반드시 나타내지는 않을 것으로 예상된다. 제2 화학적 선택 전략의 목적은 정확한 (온-타겟) 공여자 통합 대 무작위 (오프-타겟) 공여자 통합의 빈도, 뿐만 아니라 내인성 AHAS 유전자좌에서의 완전한 및 불완전한 통합의 빈도의 정량화를 가능하게 하는 것이다. 2가지 화학적 선택 전략을 표 20에 기재하였다.
표 20: 통합된 공여자 분자를 갖는 밀 식물을 재생하는데 사용된 화학적 선택 전략 ("IMI"는 이마자목스®를 나타내고, "PPT"는 바스타® 선택을 나타냄).
Figure pct00027
총 34,546 및 23,550개의 형질감염된 소순판을 각각 이마자목스® 및 바스타® 선택에 적용하였다. 각각의 전략을 위해, 소순판을 암실에서 캘러스 유도 배지 상에서 24℃에서 2주 동안 배양하였다. 생성된 캘러스를 신선한 캘러스 유도 배지에서 1회 계대배양하고, 동일한 조건에서 추가로 2주 동안 유지하였다. 체세포 배아발생 캘러스 (SEC)를 식물 재생 배지로 옮기고, 성장실에서 16/8시간 (명/암) 광주기 하에 2주 동안 24℃에서 배양하였다. 재생된 소식물체를 발근 배지로 옮기고, 동일한 조건 하에서 2-3주 동안 배양하였다. 이마자목스® 선택을 위해, 재생된 식물을 발근 배지 상에서 총 3회 계대배양하였다. 각각의 라운드의 종료시, 재생된 식물의 뿌리를 제거하고, 식물을 동일한 조건 하에 발근 배지 상에서 다시 계대배양하였다. 뿌리를 갖는 소식물체를 토양으로 옮기고, 온실 제한 조건 하에 성장시켰다. T1 종자를 개별 식물로부터 수확한 후, 이종교배를 방지하기 위해 개별적인 이삭을 자루에 넣었다.
pDAS000143으로 코팅된 금 입자로 포격한 소순판 체외이식편을 사용하여 이마자목스® 및 바스타® 화학적 선택 전략 둘 다에 걸쳐 선택 엄격도를 모니터링하였다. pDAS000143으로 형질전환된 식물을 상기 기재된 방법을 이용하여 재생하였다.
총 36개의 밀 식물을 pDAS000143으로 형질감염된 소순판 체외이식편에 대한 각각의 화학적 선택 전략으로부터 회수하였다. 실시예 6에 기재된 가수분해 프로브 검정을 이용한 이들 이벤트의 분자 시험으로, 모든 회수된 밀 식물이 pDAS000143 삽입물의 적어도 하나의 무작위 통합된 카피를 보유하는 것이 확인되었다. 이들 결과는 이마자목스® 및 바스타® 선택 조건이 낮은 이탈 비율 (즉, 형질전환되지 않은 밀 식물의 회수)을 보장하기에 충분히 엄격하면서 각각 AHAS (S653N) 및 PAT 공여자 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 통합된 카피를 보유하는 이벤트의 회수를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
S653N 돌연변이에 의해 부여된 AHAS 제초제 내성 표현형을 갖는 밀 식물은 어느 것도 상기 기재된 특정한 선택 조건 하에 이마자목스® 선택으로부터 회수되지 않았다. 이마자목스® 선택은 동조 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피 내로의 공여자 분자의 정확한 통합을 갖는 밀 식물만을 회수할 것으로 예상되기 때문에, 이들 결과는 상기 화학적 선택 요법이 준최적이었으며 상기 조건이 내인성 AHAS 유전자좌에서의 pDAS000433 공여자의 정확한 ZFN-매개 NHEJ-유도 통합을 위해 변형되어야 하거나 또는 형질전환의 규모가 본 작업에 사용된 화학적 선택 조건에 적절하지 않았다는 것을 시사한다. 대조적으로, 1,652개의 밀 식물이 바스타® 선택으로부터 회수되었다. 바스타®는 표적화 및 비-표적화 (무작위) 공여자 통합 둘 다를 갖는 밀 식물을 회수할 것으로 예상되기 때문에, 이들 이벤트의 분자 특성화는 표적화 및 비-표적화 공여자 통합 사이의 구별이 가능하며, 이는 이마자목스® 선택 조건을 정밀화하기 위한 지침을 제공할 수 있다.
내인성 AHAS 유전자좌에서의 제1 트랜스진 스택킹의 증거를 위한 바스타®-선택된 밀 식물의 분자 특성화
바스타®-선택으로부터 회수된 총 1,162개의 밀 식물을 분자학적으로 특성화하여 내인성 AHAS 유전자좌에서의 표적화 및 오프-표적 (무작위) 공여자 통합의 빈도, 뿐만 아니라 표적화 완전 및 불완전 공여자 통합의 빈도를 평가하였다.
상기 기재된 바와 같이, 동결-건조된 잎 조직으로부터 DNEASY® 식물 DNA 추출 미니 키트™ (퀴아젠)로 추출한 게놈 DNA를 사용하여 각각의 밀 식물에 대해 3가지 분자 검정을 수행하였다.
제1 분자 시험을 이용하여, 재생된 밀 식물이 "QA_pDAS000434"로부터 유래된 선형 이중-가닥 DNA의 하나 이상의 통합된 카피를 보유한다는 것을 확인하였다. 이 시험은 "QA_pDAS000434" (정방향 및 역방향 프라이머에 대해 각각 서열 92 및 93)에 존재하는 액틴 (Act1) 프로모터의 영역을 증폭시키기 위한 PCR 검정, 이어서 아가로스 겔 상에서의 생성된 앰플리콘의 전기영동 분리를 포함하였다. 예상된 크기 (218-bp)의 PCR 단편의 존재는 공여자 분자의 하나 이상의 카피의 통합을 나타낸다. 1,162개의 밀 이벤트 중, 1,065개 (92%)가 예상된 크기의 PCR 단편을 생산하였다.
제2 분자 시험을 이용하여 내인성 AHAS 유전자좌의 하나 이상의 카피 내로 추정상 통합된 공여자 분자를 갖는 밀 식물을 확인하였다. 이 시험은 내인성 AHAS 유전자의 각각의 동조 카피 내의 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB190350 상에 코딩됨)에 대한 결합 부위의 영역 상류에 혼성화되도록 설계된 프라이머, 및 "QA_pDAS000434" (정방향 및 역방향 프라이머에 대해 각각 서열 299 및 300) 내의 ZFN 34480 및 34481 (플라스미드 pDAB111860 상에 코딩됨)에 대한 결합 부위에 플랭킹된 100-bp의 무작위 서열 내의 영역에 혼성화되도록 설계된 프라이머를 사용하는 온-오프 PCR 검정을 포함하였다. 각각의 프라이머를 끝에서 두번째의 염기에 위치한 포스포로티오에이트 연결을 갖도록 설계하여, PCR 증폭 동안 프라이머 연장에 대한 특이성을 최대화하였다. 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 분리되었을 때 300-bp 초과의 크기를 갖는 PCR 단편의 증폭을 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피 내로의 공여자 분자의 (적어도 부분) 표적화 통합에 대한 암시적 증거로서 간주하였다. 시험된 1,065개의 밀 이벤트 중, 543개 (51%)가 크기 300-bp 초과의 PCR 단편을 증폭시켰다.
제3 분자 검정을 이용하여 밀 식물을 추가로 특성화하였고, 이는 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피 내의 공여자 분자의 표적화된 통합에 대한 암시적 증거를 나타내었다. 이 시험은 내인성 AHAS 유전자의 3개의 동조 카피로부터의 256-bp 영역을 증폭시키도록 설계된 프라이머의 쌍을 사용하는 PCR 검정을 포함하였다. 이 영역은 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB190350 상에 코딩됨)에 대한 결합 부위를 함유하고, 게놈 뉴클레오티드 서열 변이를 포함하였다. 충분한 게놈 뉴클레오티드 서열 변이를 포함시켜 AHAS 동조체 사이에 차별을 주어, 생성된 앰플리콘이 이들이 유래된 밀 서브-게놈에 대해 (서열 수준에서) 명백하게 추적될 수 있도록 하였다. 프라이머 쌍을 5' 말단에서 각각 일루미나™ SP1 및 SP2 서열과 합성하여 합성 화학에 의한 일루미나™ 서열분석과의 상용성을 제공하였다. 합성된 프라이머는 또한 끝에서 두번째의 5' 및 3' 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 함유하였다. 5' 포스포로티오에이트 연결은 일루미나™ SP1 및 SP2 서열의 엑소뉴클레아제 분해에 대한 보호를 제공하였고, 3' 포스포로티오에이트 연결은 온-오프 PCR을 사용한 표적 AHAS 서열의 증폭에 대한 PCR 특이성을 개선하였다. 프라이머 쌍의 이들 서열을 표 21에 제공하였다.
표 21: 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피 내의 공여자 분자의 표적화된 통합에 대한 암시적 증거를 갖는 밀 식물을 추가로 특성화하기 위해 사용된 프라이머 서열.
Figure pct00028
추가 라운드의 PCR 수행에 의한 심층 서열분석을 위해, 제3 분자 검정에 의해 생산된 PCR 앰플리콘을 제조하여, 증폭된 DNA 단편 상에 일루미나™ P5 및 P7 서열, 뿐만 아니라 서열 리드를 이들이 기원하는 샘플에 대해 명백하게 추적하는데 사용될 수 있는 서열 바코드 인덱스를 도입하였다. 이것은 제1 증폭 라운드에 첨가된 SP1 및 SP2 서열에 부분적으로 상보성일 뿐만 아니라 샘플 인덱스 및 P5 및 P7 서열을 함유하는 프라이머를 사용하여 수행하였다. 증폭 후에, 생성된 생성물을 제조업체의 지침에 따라 일루미나 MiSEQ™ 기기 상에서 서열분석하여 250-bp 쌍형성 말단 서열 리드를 생성하였다.
생성된 쌍형성 말단 250-bp 서열 리드를 상기 기재된 바와 같이 컴퓨터에 의해 처리하여 각각의 리드를 샘플 (바코드 인덱스를 기초로 함) 및 이들이 유래된 서브-게놈 (AHAS 유전자의 동조 카피 사이에 차별을 주는 뉴클레오티드 변이를 기초로 함)에 할당하고, 고품질 서열만이 후속 분석에 사용되었음을 보장하기 위해 품질 필터링을 수행하였다. 하기 기재된 바와 같이, 맞춤 개발된 PERL 스크립트 및 마이크로소프트 엑셀 2010™ (마이크로소프트 코포레이션)에서의 수동 데이터 조작을 이용하여 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피 내로의 공여자의 표적화된 통합에 대한 증거를 함유하는 리드를 확인하였다.
프라이머 AHASs653ZFN.R3에 대한 혼성화 부위 (표 21)가 "QA_pDAS000434" 내의 AHAS 3' 비번역 영역 (UTR)에도 존재하였기 때문에, 제3 분자 검정은 표적화된 공여자 통합과 무작위 공여자 통합 사이의 구별, 뿐만 아니라 내인성 AHAS 유전자좌의 하나 이상의 카피에서의 완전 공여자 통합과 불완전 공여자 통합 사이의 구별을 가능하게 하였다. 완전한 반접합 온-타겟 편집을 갖는 밀 식물은 각각의 변형된 AHAS 유전자좌에서 야생형 (비편집) 및 편집된 대립유전자 둘 다의 증폭으로부터 기원하는 서열 리드를 생산할 것으로 예상된다. 이들 대립유전자는 "QA_pDAS000434" 내의 AHAS 엑손 내로 도입된 7개의 의도적인 돌연변이 (즉, S653N 돌연변이를 코딩하는 2개의 돌연변이, 및 통합된 공여자의 재절단을 방지하기 위해 혼입된 ZFN 29732의 결합 부위에 걸쳐 위치된 5개의 코돈-최적화, 동의 돌연변이)에 의해 서열 수준에서 구별가능하였다. 이론적으로, 야생형 및 편집된 대립유전자에 상응하는 리드의 빈도는 완전 반접합 편집을 갖는 각각의 내인성 AHAS 유전자좌에 대해 1:1 비로 발생해야 한다. 대조적으로, 완전한 동형접합 온-타겟 편집을 갖는 밀 식물은 각각의 변형된 내인성 AHAS 유전자좌에서 편집된 대립유전자의 쌍으로부터 기원하는 서열 리드만을 생성할 것으로 예상된다. 제3 분자 검정에 사용된 프라이머 쌍은 AHAS 유전자의 3개의 모든 동조 카피를 증폭시키도록 설계되었기 때문에, 3개의 모든 밀 서브-게놈으로부터 기원하는 리드의 예상된 생성은 또한 온-타겟 불완전 공여자 통합 (예를 들어, 부분적인 공여자 단편의 통합, 또는 틀린 배향으로의 공여자 단편의 통합)을 검출하는데 사용될 수 있다. 불완전 온-타겟 공여자 통합은, 보다 짧은 야생형 단편의 증폭에 유리한 PCR 경쟁으로 인해 각각의 변형된 내인성 AHAS 유전자좌로부터 단지 야생형 (비편집) 대립유전자의 증폭만을 일으킬 것으로 예상된다. 따라서, 반접합 온-타겟 불완전 공여자 통합은 비편집 서브-게놈과 비교하여 통합이 일어난 서브-게놈으로부터 기원하는 리드를 대략 절반 생성할 것으로 예상된다. 동형접합 온-타겟 불완전한 공여자 통합의 경우, 통합이 일어난 서브-게놈으로부터 기원하는 리드가 없을 것으로 예상된다. 따라서, 오프-표적 (무작위) 공여자 통합은 AHAS 유전자의 3개의 모든 동조 카피로부터 기원하는 동일 비율의 서열 리드를 생성할 것으로 예상된다.
시험된 543 개의 밀 식물의 서열 분석은 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피 내의 온-타겟 공여자 통합에 대한 분자학적 증거를 갖는 38개의 이벤트를 나타내었다. 이벤트 di01-9632-1-1은 B-게놈에 위치한 AHAS 유전자좌에서의 완전 반접합 공여자 통합을 가졌다. 이들 결과는 B-게놈으로부터 기원하는 야생형 및 완전하게 편집된 리드, 및 A- 및 D-게놈으로부터 기원하는 단지 야생형 대립유전자 둘 다의 존재에 의해 나타났다 (표 22). 2개의 이벤트는 각각 A- 및 D-게놈 상의 AHAS 유전자좌 내에 불완전 반접합 공여자 통합을 가졌다. 이벤트 yl02-9453-1-2는 D-게놈으로부터 기원하는 야생형 및 완전하게 편집된 리드, 및 A- 및 B-게놈으로부터 기원하는 단지 야생형 대립유전자 둘 다를 가졌다. 비교하여, 이벤트 yl02-9552-21-1은 A-게놈으로부터 기원하는 야생형 및 완전하게 편집된 리드, 및 다른 서브-게놈으로부터 기원하는 단지 야생형 대립유전자 둘 다를 가졌다.
나머지 35개의 이벤트는 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피 내로의 불완전한 공여자 통합에 대한 분자학적 증거를 나타내었으며, 여기서 공여자 분자는 말단절단되었거나 또는 틀린 배향으로 통합되었을 수 있다 (표 22). 이들 이벤트는 밀 서브-게놈 중 하나 이상으로부터 기원하는 리드의 예상된 빈도보다 더 낮은 빈도를 특징으로 하였다. 예를 들어, 이벤트 yl02-9552-7-1은 B-게놈으로부터 기원하는 야생형 AHAS 리드의 빈도가 비편집된 유전자좌에 대해 예상되는 것보다 통계학적으로 유의하게 더 낮았다. 나머지 453개의 이벤트는 밀 게놈 내의 다른 곳에서의 공여자의 무작위 통합에 대한 증거만을 나타내었으며, 이는 제2 분자 검정으로부터의 증폭 생성물이 필시 PCR 키메라 현상으로 인해 발생하였다는 것을 나타낸다. 밀 이벤트 di01-9632-1-1, yl02-9453-1-2 및 yl02-9552-21-1의 B, D 및 A 서브-게놈에 존재하는 편집된 대립유전자에 대한 컨센서스 서열은 각각 서열 303, 304 및 305로서 제공된다.
표 22: 내인성 AHAS 유전자좌의 하나 이상의 동조 카피 내로의 QA_pDAS000434의 통합에 대한 분자학적 증거.
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Figure pct00032
종합하여, 바스타®-선택된 밀 이벤트 중 3% (38/1,162)가 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 동조 카피 내로의 표적화된 공여자 통합에 대한 분자학적 증거를 나타내었다.
실시예 11: 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 순차적, 외인성 마커-미사용 트랜스진 스택킹을 위한 형질전환 시스템의 개발
S653N 돌연변이를 도입하기 위해 AHAS 유전자좌 내에 공여자 통합된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 밀 식물을 상기 기재된 방법을 통해 생산하였다. 예를 들어, 밀의 B-게놈 내의 "QA_pDAS000434"의 완전 반접합 통합에 대한 분자학적 증거를 나타내는 이벤트 di01-9632-1-1의 재생 (표 23)은, 공여자 DNA 및 아연 핑거 뉴클레아제 구축물이 밀 내의 표적 내인성 AHAS 유전자좌의 하나 이상의 카피에서의 공여자 분자 서열의 통합에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 임의의 추가의 트랜스제닉 선택 마커 없이 이러한 이벤트를 생산하는 것은 밀의 게놈 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 공여자 폴리뉴클레오티드의 순차적, 외인성 트랜스제닉 선택 마커-미사용 스택킹을 위한 개시 작용이다. 편집된 식물 이벤트를 상기 실시예 10에 기재된 바와 같은 대안적 선택 조건을 통해 수득하였다.
상기 기재된 선택 조건은 다수의 방법론에 의해 변형될 수 있다. 다른 접근법을 실행하여, 트랜스제닉 선택 마커의 사용 없이 내인성 AHAS 유전자좌의 하나 이상의 카피 내로의 S653N 돌연변이 ("QA_pDAS000434" 또는 pDAS000433 상에 코딩됨)의 정확한 통합을 갖는 밀 식물의 회수를 증진시킬 수 있다.
2개의 추가의 접근법을 실행하여, 트랜스제닉 선택 마커의 사용 없이 내인성 AHAS 유전자좌의 하나 이상의 카피 내로의 S653N 돌연변이의 정확한 통합을 갖는 밀 식물의 회수를 증진시킬 수 있다.
예를 들어, 이마자목스® 선택 조건을 변형시켜, 상이한 배양 단계에서의 선택 및/또는 제초제의 더 낮은 농도를 포함시킨다. 따라서, 식물 재생 단계에서의 선택이 식물 재생 배지에 첨가된 이마자목스®의 농도를 낮춤으로써 감소되거나, 또는 또 다른 대안으로서 이 식물 재생 단계에서의 제초제의 사용이 완전히 제거된다. 이로써, 재생된 소식물체의 보다 강한 성장이 관찰되고, 발근 배지로 계대배양시에 조직 손상에 대해 덜 감수성인, 보다 큰 소식물체가 보장된다. 게다가, 소식물체는 이들이 기원하는 배아발생 캘러스로부터의 절개를 필요로 할 수 있다. 보다 작은 소식물체는 조직 손상에 대해 보다 감수성이며, 이는 계대배양 동안 형질전환된 소식물체의 조직 괴사 및 잠재적 손실로 인한 것일 수 있다. 캘러스 유도 단계에서의 이마자목스® 선택의 유지는 비형질전환 세포로부터의 배아발생이 제한되도록 돕는 반면, 발근 단계에서의 그의 유지는 S653N 돌연변이에 의해 부여된 AHAS 제초제 내성 표현형을 생산하는데 필요한, 내인성 AHAS 유전자좌의 하나 이상의 카피에서의 pDAS000433의 정확한 통합을 갖는 소식물체에 대한 강한 선택을 제공할 것이다. 정확하게 편집된 밀 식물을 생성하기 위한 이러한 이마자목스® 선택 전략의 성공은 실시예 5에서 입증되었다.
또 다른 예에서, 상이한 형질전환 시스템을 이용하여 정확하게 통합된 공여자 DNA를 갖는 밀 식물을 생성하였다. 예를 들어, 원형질체-기반 형질전환을 이용하여 개별 캘러스를 생산할 수 있고, 여기서 각각의 캘러스는 단세포로부터 유래된다. 원형질체-유도된 캘러스는 미성숙 접합체 배아의 바이오리스틱-포격된 소순판으로부터 유래된 캘러스에 비해 몇몇 이점을 제공한다. 형질전환 및 비형질전환 세포 둘 다에 대해 키메라인, 바이오리스틱-포격으로부터 유래된 캘러스와 달리, 원형질체-유래된 캘러스는 클로날이다. 따라서, 정확한 pDAS000433 통합이 일어난 형질전환 원형질체로부터 유래된 캘러스에서의 세포 생존은 이마자목스® 선택에 적용시 이웃 비형질전환 세포의 존재에 의해 손상될 수 없다. 바이오리스틱-포격으로부터 유래된 캘러스의 경우에, 캘러스의 키메라 조성물은 정확하게 형질전환된 것의 생존이 이마자목스® 선택에 적용시에 비형질전환 세포 주위의 사멸에 의해 손상될 수 있다는 것을 의미한다. 원형질체-기반 형질전환 시스템은 또한, 주어진 양의 노력에 대해 보다 많은 세포가 형질전환될 수 있고 이로써 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피 내에 pDAS000433의 정확한 통합을 갖는 밀 식물을 회수하는데 있어서 보다 높은 개연성을 제공할 수 있기 때문에, 바이오리스틱 포격과 비교하여 확장성의 이점을 제공한다. 밀에 대한 몇몇 원형질체-기반 형질전환 시스템이 발표된 과학 문헌에 기재된 바 있다 (Qiao et al. (1992) Plant Cell Reports 11:262-265; Ahmed and Sagi (1993) Plant Cell Reports 12:175-179; Pauk et al.(1994) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 38: 1-10; He et al. (1994) Plant Cell Reports 14: 92-196; Gu and Lang (1997) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 50: 139-145; 및 Li et al. (1999) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58: 119-125).
일련의 실험을 수행하여, 상기 기재된 것들과 같은 원형질체-기반 형질전환 시스템으로부터 이마자목스®에 대한 내성을 부여하는 AHAS(S653N) 돌연변이를 발현하는 밀 식물을 재생하기 위한 최적의 선택 조건을 결정하였다.
밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 체세포 배아발생 캘러스 (SEC)-유래된 세포 현탁액 배양물로부터 유래된 원형질체를 사용하여 이마자목스® 선택 조건을 최적화하였다. 밥화이트 MPB26RH로부터 유래된 원형질체는 비-전능적인 반면 (즉, 전체 식물을 재생하는데 사용될 수 없음), AHAS(653N) 돌연변이를 발현하는 이벤트에 대해 풍부화되도록 확립된 선택 조건은 통상의 기술자가 인지하는 전능 밀 유전자형을 기초로 하는 임의의 원형질체-기반 형질전환 시스템에 전달가능할 것으로 예상된다. 수행된 실험은 이마자목스®에 대한 야생형 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH (이미다졸리논에 대한 감수성을 부여하는 S653/S653 유전자형)의 기초 내성을 확립하였다. 기초 내성보다 강한 이마자목스® 선택 조건의 사용은 AHAS(S653N) 돌연변이를 발현하는 형질전환된 세포를 강하게 풍부화시킬 것이다.
추가의 형질전환 방법이 적용가능하다. 예를 들어 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH에 대한 세포 현탁액 배양물을 확립할 수 있다. 체세포 배아발생 캘러스 (SEC)를 상기 기재된 바와 같이 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 미성숙 접합체 배아로부터 유도하였다. 캘러스 유도 배지 상에서의 6 사이클의 계대배양 후에 빠르게 성장하는 캘러스 식물주를 선택하였다. 계대배양의 각각의 사이클에 대해, 빠르게-성장하는 캘러스를 새로운 캘러스 유도 배지 상으로 옮기고, 26℃에서 14일 동안 암실에서 배양하였다.
빠르게-성장하는 캘러스 식물주의 1그램 캘러스를 20 ml 액체 성장 배지를 함유하는 플라스크로 옮기고 암실에서 90 rpm의 선회 진탕기 상에서 25℃에서 배양함으로써 세포 현탁액 배양을 개시하였다. 7일마다, 세포 현탁액 배양물을 깨끗한 거즈를 통해 통과시켜 직경 2 mm 초과의 세포괴를 제거하고 배양 배지의 2/3을 새로운 배지로 교체함으로써 세포 현탁액 배양물을 계대배양하였다. 반복된 여과 및 계대배양 3개월 후, 빠르게-성장하는 SEC-유래된 세포 현탁액 배양물을 확립하였다.
이후에 원형질체를 SEC-유래된 세포 현탁액 배양물로부터 단리하였다. 7일된 SEC-유래된 세포 현탁액 배양물을 깨끗한-메쉬를 통해 통과시켜 약 4 그램 생중량의 세포괴를 수득하였다. 세포괴를 상기 기재된 바와 같이 밀 캘러스 소화 믹스 중에서 소화시켜 원형질체를 방출시켰다. SEC-유래된 세포 현탁액 배양물 원형질체의 수율을 노이바우어™ 혈구계를 사용하여 추정하였다. 에반스 블루 염색을 이용하여 회수된 살아있는 세포의 비율을 결정하였다.
제초제 이마자목스®를 사용한 원형질체 배양물 선택 조건을 선택하였다. 아가로스 비드-유형 배양 시스템 원형질체 배양에 사용하였다. 완만한 원심분리에 의해 약 1 x 106개의 원형질체가 침전되었고, 상청액을 제거하였다. 원형질체를 용융된 1.2% 씨-플라크(Sea-Plaque)™ 아가로스 1 ml 중에서 완만하게 교반하여 재현탁시키고, 40℃로 냉각시키고, 3.5 cm 페트리 디쉬로 옮겼다. 아가로스 응고 후, 1 ml 배양 배지를 페트리 디쉬에 첨가하고, 플레이트를 25℃에서 암실에서 1주일 동안 인큐베이션하였다. 아가로스 플러그를 10 ml 배양 배지를 함유하는 20 cm 페트리 디쉬 내로 옮기고, 25℃에서 암실에서 90 rpm 선회 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 14일마다, 배양 배지를 신선한 배지로 교체하였다. 원형질체 세포 분열은 전형적으로 아가로스 중 포매 3일 후에 관찰되었고, 다수의 세포의 세포괴가 7일 후에 가시화되었다.
0, 50, 100, 200, 400 및 600 nM 이마자목스®로 보충된 배지에서 아가로스 비드-유형 배양물을 인큐베이션하고 2주 후에 캘러스 성장 속도를 평가함으로써, 이마자목스®에 대한 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 기초 내성을 결정하였다. 200 nM 초과의 이마자목스® 농도는 캘러스 발달을 방해하였으며, 이는 200 nM 이상의 농도가 AHAS (S653N) 돌연변이를 갖는 밀 세포의 풍부화 및 선택에 최적임을 나타낸다.
AHAS 유전자좌 내에 S653N 돌연변이를 일으키는 공여자 통합된 단편을 갖는 트랜스제닉 식물을 수득하기 위한 조직 배양 선택 조건이 확립되었다. 편집된 식물 이벤트를 이용하여 제2 라운드의 형질감염을 위한 체외이식편 물질 (예를 들어, 원형질체 또는 미성숙 접합체 배아의 소순판)을 생성하였다. 다음의 실시예에 기재된 바와 같이, 체외이식편 물질을 후속적으로 공여자 DNA 분자, 및 P197 아미노산 잔기를 코딩하는 영역의 AHAS 유전자 상류에 위치하는 아연 핑거 결합 부위를 표적화하도록 설계된 ZFN을 코딩하는 플라스미드로 동시-형질감염시켰다.
실시예 12: 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 순차적, 외인성 마커-미사용 트랜스진 스택킹을 위한 대안적 형질전환 시스템
재생된 밀 식물 이벤트 di01-9632-1-1에 대해 실시예 10에 제공된 분자학적 증거는 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 순차적, 외인성 마커-미사용 트랜스진 스택킹에 대한 기술적 실행가능성을 입증한다. 이마자목스® 선택 조건의 정밀화 또는 상이한 형질전환 시스템의 사용은 내인성 AHAS 유전자좌에 순차적으로 스택킹된 트랜스진을 갖는 밀 식물의 생산를 가능하게 한다. 본 실시예는 다양한 선택제 (예를 들어, 이미다졸리딘 및 술포닐우레아)와 상응하는 AHAS 돌연변이 (예를 들어, S653N 및 P197S) 사이의 교대에 의해 내인성 AHAS 유전자좌에서 외인성 마커-미사용 순차적 트랜스진 스택킹을 달성하기 위한 접근법을 기재한다. 먼저, 술포닐우레아에 대한 선택 조건을 결정하였다.
화학적 선택 조건의 최적화; AHAS(P197S) 발현 구축물을 갖는 저-카피, 무작위 통합된 T-DNA 밀 식물의 생성
AHAS(P197S) 발현 및 PAT 선택 카세트를 함유하는 이원 벡터 pDAS000164 (서열 289, 도 11)를 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 기능 및 기술을 사용하여 설계하고, 조립하였다. AHAS (P197S) 발현 카세트는 제아 메이스로부터의 유비퀴틴 (Ubi) 유전자로부터의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (Toki et al., (1992) Plant Physiology, 100: 1503-07), 이어서 프롤린 (P)에서 세린 (S)으로의 아미노산 변화를 유도하기 위해 C에서 T로 돌연변이된 뉴클레오티드 511을 갖는 티. 아에스티붐 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 AHAS 유전자의 코딩 서열 (1,935 bp)로 이루어졌다. AHAS 발현 카세트는 에이. 투메파시엔스 pTi15955로부터의 노팔린 신타제 유전자 (nos)의 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함하였다 (Fraley et al., (1983) Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 80(15): 4803-4807). 선택 카세트는 오리자 사티바로부터의 액틴 (Act1) 유전자로부터의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (McElroy et al., (1990) The Plant Cell 2(2): 163-171), 이어서 포스피노트리신, 글루포시네이트 및 비알라포스를 포함하는 글루타민 신테타제의 억제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 스트렙토미세스 비리도크로모게네스로부터 단리된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자의 합성, 식물-최적화된 버전 (Wohlleben et al., (1988) Gene, 70(1): 25-37)으로 구성되었다. 상기 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35s 유전자로부터의 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' UTR로 종결되었다 (Chenault et al., (1993) Plant Physiology, 101 (4): 1395-1396).
선택 카세트를 상업적 유전자 합성 업체 (진아트, 라이프 테크놀로지스)에 의해 합성하고, RfA 게이트웨이 카세트가 제아 메이스로부터의 유비퀴틴 (Ubi) 유전자와 에이. 투메파시엔스 pTi15955로부터의 노팔린 신타제 유전자 (nos)의 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 영역 (UTR) 사이에 위치하는 게이트웨이®-실행가능 이원 벡터 내로 클로닝하였다. AHAS (P197S) 코딩 서열을 플랭킹 attB 부위와 함께 증폭하고, pDONR221 내로 서브클로닝하였다. 생성되는 ENTRY 클론을 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 발현 카세트를 코딩하는 게이트웨이-실행가능 이원 벡터와 함께 LR CLONASE II® (인비트로겐, 라이프 테크놀로지스) 반응에 사용하였다. 먼저 모든 조립된 플라스미드의 콜로니를 미니프렙 DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (NEB, 매사추세츠주 입스위치) 및 프로메가 (프로메가 코포레이션, 위스콘신주)로부터 입수하였다. 플라스미드 제조는 공급업체의 지침에 따라 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트® (퀴아젠, 힐덴) 또는 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템® (프로메가 코포레이션, 위스콘신주)을 사용하여 수행하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를, ABI 생거 서열분석 및 빅 다이 터미네이터 V3.1® 사이클 서열분석 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)을 사용하여 서열분석하였다. 서열 데이터를 시퀀처™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션, 미시간주 앤 아버)를 이용하여 조립하고 분석하였다.
생성된 이원 발현 클론 pDAS000164를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 내로 형질전환시켰다. 무작위로 통합된 T-DNA를 갖는 트랜스제닉 밀 식물은 문헌 [Wu et al. (2008) Transgenic Research 17:425-436]과 유사한 프로토콜에 따라 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH를 사용한 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 생성하였다. AHAS (P197) 발현 구축물을 발현하는 추정 T0 트랜스제닉 이벤트를 PAT 트랜스제닉 선택 마커에 의해 부여된 표현형인 포스피노트리신 (PPT) 내성에 대해 선택하고, 토양으로 옮겼다. T0 식물을 온실 제한 조건 하에 성장시키고, T1 종자를 생산하였다.
각각의 T0 식물로부터의 게놈 DNA를 상기 실시예 6에 기재된 바와 같은 프로토콜을 이용하여 잎 조직으로부터 추출하고, 잔재물 아그로박테리움 투메파시엔스 균주의 존재 또는 부재, 및 AHAS(P197S)를 코딩하는 T-DNA의 통합된 카피의 수에 대해 시험하였다. 에이. 투메파시엔스 균주의 존재 또는 부재를 듀플렉스 가수분해 프로브 qPCR 검정 (택맨™과 유사)을 이용하여 수행함으로써 밀 게놈으로부터의 내인성 유비퀴틴 유전자 (정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브 서열에 대해 각각 서열 290, 서열 291 및 서열 292), 및 pTiBo542로부터의 virC (정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브 서열에 대해 각각 서열 293, 서열 294 및 서열 70)를 증폭시켰다. 통합된 T-DNA 카피의 수를 상기 실시예 6에 기재된 바와 같이 육배체 밀의 D 게놈으로부터의 퓨로인돌린-b (Pinb) 및 pDAS000164 상에 존재하는 액틴 (Act1) 프로모터의 영역을 기초로 한 듀플렉스 가수분해 프로브 qPCR 검정을 이용하여 추정하였다. 종합적으로, T-DNA의 3개 미만의 무작위로 통합된 카피를 갖는 35개의 독립적인 T0 이벤트가 생성되었다.
화학적 선택 조건의 최적화; 술포메투론 메틸에 대해 밀 식물을 재생하기 위한 조건
술포닐우레아 부류 제초제에 대한 내성을 부여하는 AHAS (P197S) 돌연변이를 발현하는 밀 식물을 재생하기 위한 최적 선택 조건을 결정하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 이들 실험은 확립된 밀 형질전환 시스템의 캘러스 유도, 식물 재생 및 발근 단계에서의 야생형 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH (술포닐우레아에 대한 감수성을 부여하는 P197/P197 유전자형)의 기초 내성을 시험하는 것을 기초로 하였다. 유사한 실험을 수행하여, 술포닐우레아 선택제에 대한 내성을 부여하는 AHAS (P197S) 돌연변이를 발현하는 무작위 통합된 T-DNA를 갖는 트랜스제닉 재배종 밥화이트 MPB26RH 이벤트의 기초 내성을 결정하였다.
캘러스 유도기에 술포메투론 메틸에 대한 야생형 공여자 밀 식물주의 기초 내성을 다음과 같이 결정하였다: 미성숙 접합체 배아의 소순판을 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 단리하고, 각각 0, 100, 500, 1000, 1500 및 2000 nM 술포메투론 메틸로 보충된 CIM 배지가 담긴 10 cm 페트리 디쉬에 두었다. 20개의 소순판을 각각의 페트리 디쉬에 두었다. 총 60개의 소순판을 각각의 술포메투론 메틸 농도에서 시험하였다. 24℃에서 암실에서 4주 동안 인큐베이션한 후, 각각의 술포메투론 메틸 농도에서 체세포 배아발생 캘러스 형성 (SEC)의 양을 기록하였다. 결과는 재배종 밥화이트 MPB26RH에 대한 SEC 형성이 비처리 샘플에 비해 100 nM 술포메투론 메틸에서 약 70% 감소하였음을 보여주었다.
식물 재생기에 술포메투론 메틸에 대한 야생형 공여자 밀 식물주의 기초 내성을 다음과 같이 결정하였다: 공여자 밀 식물주로부터의 미성숙 접합체 배아의 소순판을 단리하고, CIM 배지가 담긴 10 cm 페트리 디쉬에 두었다. 이어서, 24℃에서 암실에서 4주 동안 인큐베이션함으로써 SEC가 형성되도록 하였다. SEC를 각각 0, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 및 3000 nM 술포메투론 메틸로 보충된 DRM 배지가 담긴 10 cm 페트리 디쉬로 옮겼다. 20개의 CIM을 각각의 페트리 디쉬에 두었다. 총 60개의 CIM을 각각의 술포메투론 메틸 농도에서 기초 내성 반응에 대해 시험하였다. 성장실에서 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 24℃에서 2주 동안 인큐베이션한 후, 재생 반응을 기록하였다. 결과는 식물 재생이 비처리된 샘플에 비해 2000 nM 술포메투론 메틸에서 약 80% 감소하였음을 보여주었다.
식물 발근기에 술포메투론 메틸에 대한 야생형 공여자 밀 식물주의 기초 내성을 다음과 같이 결정하였다: 미성숙 접합체 배아의 소순판을 단리하고, CIM 배지가 담긴 10 cm 페트리 디쉬에 두었다. 24℃에서 암실에서 4주 동안 인큐베이션함으로써 SEC가 형성되도록 하였다. SEC를 DRM 배지가 담긴 10 cm 페트리 디쉬로 옮기고, 16/8시간 (명/암) 광주기 하에 2주 동안 24℃에서 인큐베이션하여 식물 재생이 이루어지도록 하였다. 재생된 식물을 각각 0, 100, 200, 250, 300, 400, 500, 1000 및 2000 nM 술포메투론 메틸로 보충된 RM 배지가 담긴 10 cm 페트리 디쉬로 옮겼다. 10개의 재생된 식물을 각각의 페트리 디쉬에 두었다. 총 30개의 재생된 식물을 각각의 술포메투론 메틸 농도에서 기초 내성 반응에 대해 시험하였다. 성장실에서 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 24℃에서 3주 동안 인큐베이션한 후, 뿌리 형성 반응을 기록하였다. 결과는 뿌리 형성이 비처리된 샘플에 비해 술포메투론 메틸의 농도가 400 nM보다 높을 때 심하게 억제됨을 보여주었다.
식물 발근기에 pDAS000164로부터 술포메투론 메틸에 대한 AHAS(P197S) 돌연변이를 발현하는 무작위 통합된 저카피 (≤3) T-DNA를 갖는 트랜스제닉 밀 이벤트의 기초 내성을 다음과 같이 결정하였다: 4개의 독립적인 트랜스제닉 이벤트를 무작위로 선택하고, 증식 배지에서 계대배양에 의해 시험관 내에서 증식시켰다. 증식 이후, 각각의 이벤트의 식물을 각각 0, 400, 450, 500, 550 및 600 nM 술포메투론 메틸로 보충된 RM 배지가 담긴 10 cm 페트리 디쉬로 옮겼다. 4개의 식물 (4개의 각각의 이벤트로부터 하나씩)을 각각의 페트리 디쉬에 두었다. 이벤트당 총 3개의 식물을 각각의 술포메투론 메틸 농도에서 기초 내성에 대해 시험하였다. 성장실에서 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 24℃에서 2주 동안 인큐베이션한 후, 뿌리 형성 반응을 기록하였다. 결과는 뿌리 형성이 시험된 임의의 농도에서 비처리된 대조군에 비해 제한되지 않았음을 보여주었고, 이것은 AHAS(P197S) 돌연변이가 술포메투론 메틸에 대한 높은 내성을 부여한 것을 나타낸다.
NHEJ-유도 DNA 복구를 사용한 내인성 AHAS 유전자좌에서의 제1 순차적 트랜스진 스택킹을 위한 공여자 DNA의 설계 및 합성
제1 라운드의 트랜스진 스택킹을 위한 pDAS000433 구축물 (도 12)의 공여자 DNA를, ZFN-매개, NHEJ-유도 복구를 통한 내인성 AHAS 유전자좌에서의 정확한 공여자 통합 (S653N 돌연변이 함유)을 촉진하도록 실시예 10 및 11에 기재된 바와 같이 설계 및 합성하였다. 이마자목스®에 저항성인 전체 식물을 수득하고 제2 라운드의 표적화를 위해 제조하여 도입시켰다.
NHEJ-유도 DNA 복구를 사용한 내인성 AHAS 유전자좌에서의 제2 순차적 트랜스진 스택킹을 위한 공여자 DNA의 설계 및 합성
제2 라운드의 트랜스진 스택킹을 위한 P197S 돌연변이를 함유하는 공여자 DNA (pDAS000434; 도 13; 서열 72)를 ZFN-매개 NHEJ-유도 복구를 통한 제1 트랜스진 스택에서 표적화된 동일한 AHAS 유전자좌에서의 정확한 공여자 통합을 촉진하도록 설계하였다. 설계는 ZFN 34480 및 34481 (플라스미드 pDAB111860 상에 코딩됨) 또는 ZFN 34482 및 34483 (플라스미드 pDAB111861 상에 코딩됨)에 의한 제1 스택킹된 트랜스진을 함유하는 AHAS 유전자 카피의 절단에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴에서의 이중 가닥 공여자 분자의 통합을 기초로 하였다. pDAS000434 공여자 분자는 폴리뉴클레오티드 서열의 몇몇 부분을 포함하였다. 5' 말단은 표적 ZFN 절단 부위로부터 출발하여 AHAS 정지 코돈에서 끝나는 D-게놈에 코딩된 내인성 AHAS 유전자와 거의 동일한 서열을 함유하였다. 몇몇의 의도적인 돌연변이를 상기 서열 내에 도입하였다: P197S 돌연변이를 코딩하는 돌연변이 및 통합된 공여자의 재-절단을 방지하기 위해 ZFN 34481 및 34483의 결합 부위에 걸쳐 위치하는 코돈-최적화된, 동의 돌연변이. 정지 코돈 다음에 AHAS 동조체에서 보존된 3' 비번역 영역 (3'UTR)에 상응하는 316-bp의 비-코딩 서열이 이어진다. 3'UTR 서열 다음에는 ZFN 34474 및 34475 (플라스미드 pDAB111857 상에 코딩됨) 및 ZFN 34476 및 34477 (플라스미드 pDAB111858 상에 코딩됨)에 대한 아연 핑거 결합 부위가 이어진다. 이들 아연 핑거 결합 부위는 다음 라운드의 트랜스진 스택킹에서 내인성 유전자좌에서 통합된 공여자-유래 AHAS (코딩 및 3'UTR) 서열의 자가-절제를 허용한다. 자가-절제 아연 핑거 결합 부위 다음에는 특유한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위에 플랭킹된, 트랜스진 발현 카세트 (예를 들어 미국 특허 공개 번호 20130205440에 기재된 바와 같은 DGT-28 발현 카세트)의 삽입을 가능하게 하는 몇몇의 추가의 아연 핑거 결합 부위 (각각 100-bp의 무작위 서열에 의해 분리됨)가 이어진다. 추가의 아연 핑거 결합 부위는 순차적인 마커-미사용 트랜스진 스택킹, 또는 교대 스택킹 방법을 사용한 동일한 게놈 위치에서의 계속적인 순차적 트랜스진 스택킹에 의해 AHAS 유전자좌에서 통합될 수 있는 트랜스진의 향후 절제를 가능하게 한다. 공여자 카세트는, 내인성 AHAS 유전자좌의 절단시에 ZFN 34474 및 34475 (플라스미드 pDAB111857 상에 코딩됨) 또는 ZFN 34476 및 34477 (플라스미드 pDAB111858 상에 코딩됨)에 의해 생성된 라이게이션 오버행과 상용성인 돌출된 5' 및 3' 말단을 갖는 공여자 분자의 생성을 가능하게 하기 위해, 5' 및 3' 말단에 추가의 플랭킹 서열의 짧은 스트레치를 갖도록 상업적인 유전자 서비스 업체 (예를 들어, 진아트, 라이프 사이언시스 등)에 의해 합성하였다.
돌출 5' 및 3' 말단을 갖는 공여자 분자는 통상의 기술자에게 공지된 표준 방법에 의해 제한 엔도뉴클레아제 BbsI를 사용하여, 공여자 분자를 함유하는 플라스미드 DNA를 소화시키거나 또는 "QA_pDAS000434" 및/또는 pDAS000433에 대해 기재된 바와 같이 PCR 증폭시켜 생성하였다.
NHEJ-유도 DNA 복구를 사용한 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 외인성 마커-미사용, 순차적 트랜스진 스택킹을 위한 형질전환 시스템
동일한 내인성 AHAS 유전자좌에서 스택킹된 다수의 트랜스진을 갖는 트랜스제닉 밀 이벤트를, 공여자 pDAS000433 및 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)을 사용한 형질전환을 통한 외인성 마커-미사용, 순차적 트랜스진 스택킹에 의해 생산하였다. 정확한 ZFN-매개, NHEJ-유도 공여자 통합은 제1 트랜스진 및 AHAS 유전자좌에서 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 S653N 돌연변이를 도입하고, 따라서 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 선택제로서 이마자목스®를 사용하여 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다. 도 14a는 통합을 도시한다. 공여자 pDAS000434 및 ZFN 34480 및 34481 (플라스미드 pDAB111860 상에 코딩됨)을 갖는 제1 트랜스진 스택킹된 이벤트로부터 유래된 밀 세포의 후속적인 형질전환은, P197의 상류에 위치하는 ZFN 결합 부위 사이에 및 제1 트랜스진 스택 동안 통합된 자가-절제 부위에 위치한 내인성 염색질의 공여자 분자로의 교체를 유도한다. 이것은 제2 트랜스진 및 술포닐우레아에 대한 내성을 부여하는 P197S 돌연변이의 통합을 유도하고, 따라서 술포메투론 메틸을 선택제로서 사용한 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다. 동시에, 제2 공여자의 통합은 S653N 돌연변이를 제거하고, 따라서 이미다졸리논에 대한 감수성을 회수한다 (도 14b). 통상의 기술자는 제3 트랜스진의 스택킹이 적절한 아연 핑거 뉴클레아제, 및 추가의 트랜스진을 함유하고 술포닐우레아에 대한 감수성 및 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 공여자를 사용한 형질전환에 의해 달성될 수 있으며, 따라서 이마자목스®를 선택제로서 사용한 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 순차적 트랜스진 스택킹의 계속적 라운드는 이미다졸리논과 술포닐우레아 선택제 사이의 차등 순환을 위해 내인성 AHAS 유전자에 트랜스진 및 돌연변이를 도입하는 공여자를 사용한 형질전환을 통해 가능하다.
내인성 AHAS 유전자좌에 순차적으로 스택킹된 트랜스진을 갖는 밀 식물을 재생하는데 사용된 형질전환 시스템은 미성숙 접합체 밀 배아의 소순판으로의 바이오리스틱-매개 DNA 전달에 대해 상기 기재된 접근법, 또는 통상의 기술자에게 공지된 접근법을 이용하는 밀 원형질체로의 직접적 DNA 전달을 기초로 하며; 예를 들어 문헌 [He et al. (1994) Plant Cell Reports 14: 92-196]의 방법 또는 실시예 11에 기재된 임의의 방법을 이용한다.
HDR-유도 DNA 복구를 사용한 내인성 AHAS 유전자좌에서의 제1 순차적 트랜스진 스택킹을 위한 공여자 DNA의 설계 및 합성
제1 라운드의 트랜스진 스택킹을 위한 공여자 DNA를 ZFN-매개, HDR-유도 상동성 복구를 통해 내인성 AHAS 유전자좌에서의 정확한 공여자 통합을 촉진하도록 설계하였다. 설계는 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의한 내인성 AHAS 유전자의 동조 카피의 절단에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴의 위치에서의 이중 가닥 공여자 분자의 통합을 기초로 하였다. 공여자 분자 (pDAS000435; 도 16; 서열 295)는 pDAS000433 (도 12)에 대한 서열과 동일하다.
각각의 말단에 750-bp 상동성 아암을 갖는 공여자 카세트를 상업적 유전자 서비스 판매업체 (예를 들어, 진아트, 라이프 사이언시스 등)에 의해 합성하였다. 공여자의 5' 및 3' 말단에서의 상동성 아암은 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 절단의 바로 상류 및 하류의 내인성 AHAS 서열에 상응한다.
HDR-유도 DNA 복구를 이용한 내인성 AHAS 유전자좌에서의 제2 순차적 트랜스진 스택킹을 위한 공여자 DNA의 설계 및 합성
제2 라운드의 트랜스진 스택킹을 위한 공여자 DNA를 ZFN-매개 HDR-유도 상동성 복구를 통한 제1 트랜스진 스택에서 표적화된 동일한 AHAS 유전자좌에서의 정확한 공여자 통합을 촉진하도록 설계하였다. 설계는 ZFN 34480 및 34481 (플라스미드 pDAB111860 상에 코딩됨) 또는 ZFN 34482 및 34483 (플라스미드 pDAB111861 상에 코딩됨)에 의한 제1 스택킹된 트랜스진을 함유하는 AHAS 유전자 카피의 절단에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴에서의 이중 가닥 공여자 분자의 통합을 기초로 하였다. 공여자 분자 (pDAS000436; 도 17; 서열 296)는 pDAS000434 (도 13)에 대한 서열과 동일하다.
각각의 말단에 750-bp 상동성 아암을 갖는 공여자 카세트를 상업적 유전자 서비스 판매업체 (예를 들어, 진아트, 라이프 사이언시스 등)에 의해 합성하였다. 공여자의 5' 말단에서의 상동성 아암은 ZFN 34480 및 34481 (플라스미드 pDAB111860 상에 코딩됨)에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 절단의 바로 상류의 내인성 AHAS 서열에 상응한다. 공여자의 3' 말단에서의 상동성 아암은 제1 트랜스진 스택에서 통합된 공여자 DNA에서 ZFN 34480 및 34481에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 절단에 인접한 GOI-1 서열에 상응한다.
HDR-유도 DNA 복구를 이용한 밀 내의 내인성 AHAS 유전자좌에서의 외인성 마커-미사용, 순차적 트랜스진 스택킹을 위한 형질전환 시스템
동일한 내인성 AHAS 유전자좌에서 스택킹된 다수의 트랜스진을 갖는 트랜스제닉 밀 이벤트를 공여자 pDAS000435 및 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)을 사용한 형질전환을 통한 형질을 코딩하는 트랜스진의 외인성 트랜스제닉 마커-미사용, 순차적 스택킹 (트랜스제닉 마커를 사용하지 않음)에 의해 생산하였다. 정확한 ZFN-매개, HDR-유도 공여자 통합은 제1 트랜스진 및 AHAS 유전자좌에서 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 S653N 돌연변이를 도입하고, 따라서 상기 실시예 5에 기재된 바와 같이 선택제로서 이마자목스®를 사용하여 정확하게 표적화된 식물의 재생을 허용한다. 도 15a는 통합을 도시한다. 공여자 pDAS000436 및 ZFN 34480 및 34481 (플라스미드 pDAB111860 상에 코딩됨)을 갖는 제1 트랜스진 스택킹된 이벤트로부터 유래된 밀 세포의 후속적인 형질전환은, P197의 상류에 위치하는 ZFN 결합 부위 사이에 및 제1 트랜스진 스택 동안 통합된 자가-절제 부위에 위치한 내인성 염색질의 공여자 분자로의 교체를 유도한다. 이것은 제2 트랜스진 및 술포닐우레아에 대한 내성을 부여하는 P197S 돌연변이의 통합을 유도한다. 후속으로, 제2 트랜스진의 통합은 술포메투론 메틸을 선택제로서 사용한 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다. 이와 동시에, 제2 공여자의 통합은 S653N 돌연변이를 제거하고, 따라서 이미다졸리논에 대한 감수성을 회수한다 (도 15b). 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 제3 트랜스진의 스택킹은 적절한 아연 핑거 뉴클레아제, 및 추가의 트랜스진을 함유하고 술포닐우레아에 대한 감수성 및 이미다졸리논에 대한 내성을 부여하는 공여자를 사용한 형질전환에 의해 달성될 수 있으며, 따라서 이마자목스®를 선택제로서 사용한 정확하게 표적화된 식물의 재생을 가능하게 한다. 따라서, 순차적 트랜스진 스택킹의 계속적 라운드는 이미다졸리논과 술포닐우레아 선택제 사이의 차등 순환을 위해 내인성 AHAS 유전자에 트랜스진 및 돌연변이를 도입하는 공여자를 사용한 형질전환을 통해 가능하다.
내인성 AHAS 유전자좌에 순차적으로 스택킹된 트랜스진을 갖는 밀 식물을 재생하는데 사용된 형질전환 시스템은 미성숙 접합체 밀 배아의 소순판으로의 바이오리스틱-매개 DNA 전달에 대해 상기 기재된 접근법, 또는 통상의 기술자에게 공지된 접근법을 이용하는 밀 원형질체로의 직접적 DNA 전달을 기초로 하며; 예를 들어 문헌 [He et al. (1994) Plant Cell Reports 14: 92-196]의 방법 또는 실시예 11에 기재된 임의의 방법을 이용한다.
실시예 13: 밀 내의 비-선택 형질 유전자좌에서의 외인성 마커-미사용 게놈 편집을 위한 형질전환 시스템의 개발
내인성 유전자좌의 정밀 게놈 변형은 형질 발현을 변형시키기 위한 효과적인 접근법을 제공한다. 하나 이상의 비-선택 내인성 형질 유전자좌에 정확한 게놈 변형을 갖는 외인성 마커-미사용 형질전환 이벤트의 생성은 작물 개선을 위한 새롭고 신규한 높은-가치의 대립유전자를 생성하기 위한 기회를 제공한다. 여기서, 본 발명자들은 통합 및 비-통합 형질 변형 둘 다에 적합화될 수 있는 밀 내의 비-선택 형질 유전자좌에서의 ZFN-매개, 외인성 마커-미사용, 정밀 게놈 편집을 위한 형질전환 시스템의 개발을 기재한다.
형질전환 시스템은 2-단계 과정을 기초로 한다. 제1 단계에서, ZFN-매개 정밀 게놈 변형을 이용하여 식물 게놈 내의 2개의 독립적 유전자좌를 동시에 변형시키며; 하나의 유전자좌는 선택 마커에 대한 내성을 부여하도록 변형되고, 다른 것은 관심 대상의 비-선택 형질에 대한 발현을 변경하도록 변형된다. 도입된 외인성 선택 마커를 선택함으로써 두 유전자좌 모두에서 공동-편집된 형질전환 T0 이벤트를 생성하였다. 제2 단계에서, 단지 변형된 형질 유전자좌만을 갖는 마커-미사용 이벤트를 T1 식물을 분리하는 PCR 스크리닝에 의해 회수하였다. 상기 접근법은 비-선택 내인성 유전자의 절제 또는 비-선택 내인성 유전자의 뉴클레오티드 서열의 재작성 (편집)을 일으키는 비-통합 정밀 게놈 변형에 적합화될 수 있다. 대안적으로, 상기 접근법은 비-선택 내인성 유전자의 기능이 변경된 통합 정밀 게놈 변형에 적합화될 수 있다. 보다 넓게, 상기 접근법은 상기 통합된 외인성 DNA, 예를 들어 트랜스진이 절제된 비-통합 정밀 게놈 변형에 적합화될 수 있다.
밀 내의 내인성 AHAS 유전자를 모델 유전자좌로 선택하여, 밀 내의 비-선택 형질 유전자좌에서의 외인성 마커-미사용 정밀 게놈 편집을 위한 형질전환 시스템을 확립하고 검증하였다.
ZFN-매개 NHEJ-유도 AHAS 유전자 편집을 위한 공여자 DNA의 제조
공여자 DNA 분자, pDAS000267 (서열 84 및 서열 85)을 실시예 6에 기재된 바와 같이 설계하고 합성하였다. 간략하게, 공여자 DNA는 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB109350 상에 코딩됨)에 의한 내인성 AHAS 유전자의 동조 카피의 절단에 의해 생성된 이중 가닥 DNA 파괴의 위치에 통합되도록 설계된 95-bp 이중 가닥 분자로 이루어졌다. pDAS000267 구축물은 2개의 부분으로 이루어졌다. 5' 말단은 표적 ZFN 절단 부위로부터 출발하여 AHAS 정지 코돈에서 끝나는 D-게놈에 코딩된 내인성 AHAS 유전자와 거의 동일한 서열을 함유하였다. 6개의 의도적인 돌연변이를 상기 서열 내로 도입하였다: S653N 돌연변이 (AGC→AAT)를 코딩하는 2개의 돌연변이, 및 4개의 동의 돌연변이 (침묵 돌연변이가 공여자 서열 내로 통합됨). 공여자 분자의 3' 말단은 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집 이벤트를 검출하기 위해 진단적 PCR에 사용될 수 있는 특유한 서열을 함유하였다. ZFN-매개 NHEJ-유도 DNA 복구를 용이하게 하기 위한 라이게이션 오버행을 제공하도록 돌출된 5' 및 3' 말단을 갖는 공여자 분자를 설계하였다.
ZFN 구축물 DNA의 제조
ZFN 29732 및 29730을 코딩하는 pDAB109350 (도 1)에 대한 플라스미드 DNA를 제조업체의 지침에 따라 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템® (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨)을 이용하여 이. 콜라이의 배양물로부터 제조하였다.
PAT 선택 카세트를 코딩하는 이원 벡터의 설계 및 생산
표준 클로닝 방법을 이용하여 이원 벡터 pDAS000004 (서열 303; 도 18)를 구축하였다. PAT 선택 카세트는 오리자 사티바로부터의 액틴 (Act1) 유전자로부터의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (McElroy et al., (1990) The Plant Cell 2(2): 163-171), 이어서 포스피노트리신, 글루포시네이트 및 비알라포스를 포함하는 글루타민 신테타제의 억제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩하는 스트렙토미세스 비리디크로모게네스로부터 단리된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자의 합성, 식물-최적화된 버전 (Wohlleben et al., (1988) Gene, 70(1): 25-37)으로 이루어졌다. 상기 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)의 35s 유전자로부터의 전사 종결인자 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' UTR로 종결되었다 (Chenault et al., (1993) Plant Physiology 101 (4): 1395-1396).
선택 카세트를 상업적 유전자 합성 판매업체 (진아트, 라이프 테크놀로지스)에 의해 합성하고, 게이트웨이에서 이용가능한 이원 벡터 내로 클로닝하였다. 조립된 플라스미드의 콜로니를 뉴잉글랜드 바이오랩스 및 프로메가로부터 입수한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 미니프렙 DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 플라스미드 제조를 제조업체의 지침에 따라 퀴아프렙 스핀 미니 프렙 키트™를 이용하여 수행하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 ABI 생어 서열분석 및 빅 다이 터미네이터 v3.1™ 사이클 서열분석 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)을 이용하여 서열분석하였다. 서열 데이터를 시퀀처™ 소프트웨어 (진 코드스 코포레이션, 미시간주 앤 아버)를 이용하여 조립하고 분석하였다. 형질감염에 사용된 플라스미드 DNA를 제조업체의 지침에 따라 퓨어 일드 플라스미드 맥시프렙 시스템® (프로메가 코포레이션, 위스콘신주 매디슨)을 이용하여 이. 콜라이의 배양물로부터 제조하였다.
비-선택 내인성 형질 유전자좌에 정확한 게놈 변형을 갖는 외인성 마커-미사용 밀 식물을 생성하기 위한 바이오리스틱-매개 형질 전환 시스템
공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 미성숙 접합체 배아의 소순판 총 2,320개를 상기 기재된 바와 같이 바이오리스틱-매개 DNA 전달을 위해 제조하였다. DNA-코팅된 금 입자를 2.5 μg의 공여자 pDAS000267 및 플라스미드 pDAB109350 (각각 7:1의 몰비) 및 2.5 μg의 플라스미드 pDAS000004를 포함하는 DNA 혼합물을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 제조하였다.
포격 후에, 형질감염된 소순판을 26℃에서 암실에서 16시간 동안 인큐베이션한 후, 캘러스 유도를 위해 배지에 옮겼다. 소순판을 암실에서 캘러스 유도 배지 상에서 24℃에서 2주 동안 배양하였다. 생성된 캘러스를 신선한 캘러스 유도 배지에서 1회 계대배양하고, 동일한 조건에서 추가로 2주 동안 유지하였다. SEC를 5 mg/ml 바스타®를 함유하는 식물 재생 배지로 옮기고, 성장실에서 16/8 시간 (명/암) 광주기 하에 2주 동안 24℃에서 배양하였다. 재생된 소식물체를 5 mg/ml 바스타®를 함유하는 발근 배지로 옮기고, 동일한 조건 하에서 2-3주 동안 배양하였다. 뿌리를 생산하는 재생된 소식물체는 식물 게놈 내로 무작위 삽입된 PAT 선택 카세트의 하나 이상 카피를 갖는 것으로 예상되었다. 이들 소식물체의 뿌리를 제거하고, 식물을 200 nM 이마자목스®를 함유하는 발근 배지 상에서 동일한 조건 하에 2-3 주 동안 다시 계대배양하였다. 재성장된 뿌리를 갖는 식물은 내인성 AHAS 유전자의 하나 이상의 카피에 S653N 돌연변이 (pDAS000267의 정확한 통합으로부터 발생)를 갖는 것으로 예상되었다.
바스타®를 함유하는 발근 배지 상에서 강한 뿌리 성장을 생산하는 총 170개의 밀 식물을 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH로부터의 미성숙 접합체 배아의 2,320개의 소순판의 형질감염으로부터 수득하였다. 이들 중, 2개의 밀 식물은 이마자목스®를 함유하는 발근 배지로 옮겼을 때 뿌리를 생산하였다. 이들 식물을 토양으로 옮기고, 온실 제한 조건 하에 성장시켜 T1 종자를 생산하였다.
밀 원형질체-기반 형질전환 시스템에서 형질전환된 이벤트의 풍부화를 위한 바스타® 화학적 선택의 최적화
일련의 실험을 수행하여 문헌 [Qiao et al. (1992) Plant Cell Reports 11:262-265; Ahmed and Sagi (1993) Plant Cell Reports 12:175-179; Pauk et al.(1994) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 38: 1-10; He et al. (1994) Plant Cell Reports 14: 92-196; Gu and Lang (1997) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 50: 139-145; 및 Li et al. (1999) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58: 119-125]에 기재된 것들과 같은 원형질체-기반 형질전환 시스템으로부터 바스타®에 대한 내성을 부여하는 PAT 유전자를 발현하는 밀 식물을 재생하기 위한 최적의 선택 조건을 결정하였다.
밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 체세포 배아발생 캘러스 (SEC)-유래된 세포 현탁액 배양물로부터 유래된 원형질체를 사용하여 바스타® 선택 조건을 최적화하였다. 밥화이트 MPB26RH로부터 유래된 원형질체는 비-전능적인 반면 (즉, 전체 식물을 재생하는데 사용될 수 없음), PAT 유전자를 발현하는 이벤트를 풍부화하도록 확립된 선택 조건은 전능 밀 유전자형을 기초로 하는 임의의 원형질체-기반 형질전환 시스템에 전달가능할 것으로 예상된다. 실험을 수행하고, 바스타®에 대한 야생형 공여자 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 기초 내성을 확립하였다. 기초 내성보다 강한 바스타® 선택 조건의 사용은 PAT 유전자를 발현하는 형질전환된 세포를 선택하기 위해 확인 및 사용된다.
아가로스 비드-유형 배양 및 바스타® 선택 조건의 확립
상기 기재된 바와 같이, 원형질체를 확립된 SEC-유래 세포 현탁액 배양물로부터 단리하고 아가로스 비드-유형 배양물을 확립하기 위해 사용하였다. 0, 0.5, 2.5, 5, 7.5, 10, 20, 30, 40 및 50 mg/L 바스타®로 보충된 배지에서 아가로스 비드-유형 배양물을 인큐베이션하고 2주 후에 캘러스 성장의 비율을 평가함으로써, 바스타®에 대한 밀 식물주 재배종 밥화이트 MPB26RH의 기초 내성을 결정하였다. 캘러스 발생을 심각하게 방해하는 바스타® 농도 (예를 들어, 20 mg/L 초과)가 PAT 유전자를 갖는 밀 세포의 풍부화 및 선택에 최적이었다.
바스타® 및 이마자목스® 내성 표현형을 갖는 형질전환된 밀 식물의 분자학적 특성화
바스타® 및 이마자목스® 제초제 내성 표현형 둘 다를 갖는 2개의 밀 식물을 분자학적으로 특성화하여, pDAB109350 상에 코딩된 ZFN 29732 및 29730에 의해 생성된 게놈 이중 절단 부위에서의 pDAS000267 공여자의 통합으로부터 발생한 S653N 돌연변이를 함유하는 내인성 AHAS 유전자를 확인하였다.
상기 기재된 바와 같이, 동결-건조된 잎 조직으로부터 DNEASY® 식물 DNA 추출 미니 키트™ (퀴아젠)로 추출된 게놈 DNA를 사용하여 각각의 밀 식물에 대해 2가지 분자 검정을 수행하였다.
제1 분자 시험을 이용하여 재생된 밀 식물이 PAT 유전자의 하나 이상의 무작위 통합된 카피를 갖는다는 것을 확인하였다. 듀플렉스 가수분해 프로브 qPCR 검정 (택맨®과 유사)을 이용하여, 육배체 밀의 D 게놈으로부터의 내인성 단일 카피 유전자, 퓨로인돌린-b (Pinb) 유전자 (문헌 [Gautier et al., (2000) Plant Science 153, 81-91]; 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브 서열에 대해 각각 서열 89, 서열 90 및 서열 91) 및 pDAS000004에 존재하는 액틴 (Act1) 프로모터의 영역 (정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브 서열에 대해 각각 서열 92, 서열 93 및 서열 94)을 증폭시켰다. pDAS000004의 존재 및 추정된 카피 수의 평가를 문헌 [Livak and Schmittgen (2001) Methods 25(4):402-8]에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 그 결과로부터, 밀 식물 이벤트 yc06-9110-1 및 yr00-9311-1 각각의 게놈 내로의 PAT 폴리뉴클레오티드 서열의 통합에 대한 증거를 수득하였다.
제2분자 시험을 이용하여 서브-게놈 위치, 및 내인성 AHAS 유전자에서의 ZFN-매개 NHEJ-유도 공여자 통합에 대한 결과를 특성화하였다. 프라이머 AHASs653ZFN.F2 및 AHASs653ZFN.R1 (서열 301 및 302; 표 18)을 사용한 PCR을 이용하여 내인성 AHAS 유전자의 각각의 3개의 동조 카피로부터 DNA 단편을 증폭시켰다. 증폭된 단편은 ZFN 29732 및 29730 (플라스미드 pDAB190350 상에 코딩됨)에 대한 결합 부위를 함유하는 영역을 함유하였고, 게놈 뉴클레오티드 서열 변이를 포함하였다. 충분한 게놈 뉴클레오티드 서열 변이를 포함시켜 AHAS 동조체 사이에 차별을 주어, 생성된 앰플리콘이 이들이 유래된 밀 서브-게놈에 대해 (서열 수준에서) 명백하게 추적될 수 있도록 하였다. 생성된 앰플리콘을 실시예 12에 기재된 바와 같이 심층 서열분석을 위해 제조하고, 제조업체의 지침에 따라 일루미나 MiSEQ™ 기기 상에서 서열분석하여 250-bp 쌍형성-말단 서열 리드를 생성하였다. 생성된 서열 리드를 상기 기재된 바와 같이 컴퓨터에 의해 처리하여 각각의 리드를 샘플 (바코드 인덱스를 기초로 함) 및 이들이 유래된 서브-게놈 (AHAS 유전자의 동조 카피 사이에 차별을 주는 뉴클레오티드 변이를 기초로 함)에 할당하였다. 실시예 9에 기재된 바와 같이, 내인성 AHAS 유전자좌 내로의 pDAS000267의 통합은 야생형 (비변형) 및 생성된 트랜스제닉 (변형) 대립유전자 사이에 95-bp 크기 차이를 생성하였다. 따라서, 야생형 및 변형된 AHAS 유전자좌 둘 다의 PCR 증폭이 예상된다. 맞춤 개발된 PERL 스크립트 및 마이크로소프트 엑셀 2010™ (마이크로소프트 코포레이션)에서의 수동 데이터 조작을 이용하여 서브-게놈 위치, 및 내인성 AHAS 유전자 내로의 공여자 통합에 대한 결과를 특성화하였다.
제2분자 검정의 결과로부터, 내인성 AHAS 유전자좌에서의 정확한 ZFN-매개 NHEJ-유도 유전자 편집에 대한 확실한 증거가 밀 식물 둘 다에 대해 입증되었다. 이벤트 yc06-9110-1은 B-게놈에서 완전한 반접합 공여자 통합을 가졌다 (표 24). 이벤트 yr00-9311-1은 다수의 서브-게놈 내로의 동시 공여자 통합을 가졌다. A-게놈에서, 내인성 AHAS 유전자좌 둘 다의 독립적 편집이 관찰되었다. 하나의 대립유전자는 AHAS 제초제 내성 표현형의 발현을 위한 S653N 돌연변이의 기대 통합을 일으키는 부분적 공여자 통합을 가졌다. 그러나, 24-bp 뉴클레오티드에 걸친 단편은 공여자 분자의 3' 말단으로부터 결실되었다. 다른 대립유전자는 공지되지 않는 기원의 51-bp 폴리뉴클레오티드 서열의 통합을 가졌다. B-게놈으로부터 기원하는 서열 리드는 수득되지 않았으며, 이는 각각의 내인성 AHAS 유전자좌 내로의 대형 폴리뉴클레오티드 서열의 독립적 통합을 시사한다 (표 24). 2개의 재생된 밀 식물에 대해 각각의 서브-게놈에 존재하는 대립유전자에 대한 컨센서스 서열은 서열 304-313으로서 제공된다. 밀 식물 이벤트 둘 다에서 pDAS0000004로부터 기원하는 서열의 증거 부재는 바스타®에 대한 내성을 부여하는 PAT 유전자가 식물 게놈 내의 다양한 유전자좌 내로 무작위 통합되었음을 나타낸다.
표 24: 밀 식물 yc06-9110-1 및 yr00-9311-1에 대한 ZFN-매개 NHEJ-유도 AHAS 편집 결과
Figure pct00033
이들 결과는 하나 이상의 비-선택 형질 유전자좌에 정확한 게놈 변형을 갖는 외인성 마커-미사용 밀 식물을 생성하는데 이용될 수 있는 형질전환 방법을 처음으로 개시한다. 이미다졸리논 부류 제초제에 대한 내성을 부여하는 S653N 돌연변이를 코딩하는 통합된 AHAS 공여자 폴리뉴클레오티드를 포함하는 밀 식물이 예시된다. 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, 외인성 트랜스제닉 선택 마커 (예를 들어, PAT)를 함유하지 않는 밀 식물은 PAT 또는 변형된 AHAS 유전자에 특이적인 PCR 검정을 이용하여 이들 이벤트로부터 유래된 T1 식물을 스크리닝함으로써 회수될 수 있다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
명료한 이해를 위해 설명 및 예의 방식으로 개시내용이 다소 상세하게 제공되었지만, 본 개시내용의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 실행될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기 기재 및 예는 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Sangamo BioSciences, Inc. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR INTEGRATION OF AN EXOGENOUS SEQUENCE WITHIN THE GENOME OF PLANTS <130> 72287-US-NP <160> 314 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AHAS homoeologous gene sequence <220> <221> misc_feature <222> (2207)..(2207) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (2210)..(2210) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 tcgcccaaac cctcgccgcc gccatggccg cagccacctc ccccgccgtc gcattctcgg 60 gcgccaccgc cgccgccatg cccaaacccg cccgccatcc tctcccgcgc caccagcccg 120 tctcgcgccg cgcgctcccc gcccgcgtcg tcaggtgttg cgccgcgtcc cccgccgcca 180 cctccgccgc gcctcccgca accgcgctcc ggccatgggg cccgtccgag ccccgcaagg 240 gcgccgacat cctcgtcgag gcgctcgagc gctgcggcat cgtcgacgtc ttcgcctacc 300 ccggcggcgc ctccatggag atccaccagg cgctgacgcg ctcgcccgtc atcaccaacc 360 acctcttccg ccacgagcag ggggaggcgt tcgcggcgtc cggctacgcc cgcgcgtccg 420 gccgcgtcgg cgtctgcgtc gccacctccg gcccgggggc caccaacctc gtctccgcgc 480 tcgccgacgc cctcctcgac tccatcccca tggtcgccat cacgggccag gtcccccgcc 540 gcatgatcgg cacggacgcg ttccaggaga cgcccatagt ggaggtcacg cgctccatca 600 ccaagcacaa ctacctggtc cttgacgtgg aggatatccc ccgcgtcatc caggaagcct 660 tcttccttgc atcctctggc cgcccggggc cggtgctagt tgatatcccc aaggacatcc 720 agcagcagat ggctgtgccc gtctgggaca ctccaatgag tttgccaggg tacatcgccc 780 gcctgcccaa gccaccatct actgaatcgc ttgagcaggt cctgcgtctg gttggcgagt 840 cacggcgccc aattctgtat gttggtggtg gctgcgctgc gtctggcgag gagttgcgcc 900 gctttgttga gcttactggg attccagtta caactactct gatgggcctt ggcaacttcc 960 ccagcgacga cccactgtct ctgcgcatgc ttgggatgca tggcactgtg tatgcaaatt 1020 atgcagtaga taaggctgac ctgttgctcg catttggtgt gcggtttgat gatcgtgtga 1080 ctgggaaaat cgaggctttt gcaagcaggt ccaagattga gcacattgac attgacccag 1140 ctgagattgg cagaacaagc agccacatgt ctccatttgt gcagatgtta agcttgcttt 1200 acaggggttg aatgatctat taaatgggag caaagcacaa cagggtctgg attttggtcc 1260 atggcacaag gagttggatc agcagaagag ggagtttcct 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aaaaagagaa 360 aaaacattga aaatcaaaga agaaaaaaac ataaagaaaa gaaaaccgaa aaatactggc 420 aaaaacacac aaaaaatgaa aagaaaaaat aaagaaaacc ggactttacc aatcgaacgg 480 agcgatcgga cacgaatgag cgaaggcatg catcgagcaa caccgctaat tgaccggccc 540 gtagtcgttc gcccgtagac cattcataag aatcggtatc ggagagacat aggggttctt 600 tggtttctaa ccatatcttg tcacacttta ccatacatca ccttagtcaa atctgatcaa 660 attaggtgag tatttggttc tagccacatc taaggcaaga tttgtttttc tgagcagtga 720 accccatatg tcatagacag aaaaattgtg aaaagattcc tttagacggt caaagcgtgg 780 ttaacaattt aatcaactca agtaagataa atgcgataaa tgtgacaaaa ataatgtgtt 840 atagaagtat gacaaaaata atcacaatcc aaacagtctg atagcttggc gagtgcaaaa 900 tagatacgaa atctctggtg atatcacacg ggtccaaaat aattgcttgt ttgagcatca 960 gcctttctgc acaaaaaaag ctagcccaaa caaacgagtg gcgtcccatc tgaaccacac 1020 gctcacccgc cgcgtgacag cgccaaagac aaaaccatca cccctcccca attccaaccc 1080 tctctccgcc tcacagaaat ctctcccctc gcccaaaccc tcgccgccgc catggccgcc 1140 gccacctccc ccgccgtcgc attctccggc gccgccgccg ccgccgccgc catgcccaag 1200 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ctacatgttt gttgagccta 120 taaatcttca taaaataatt gagattaatg cggtttgtgc aaaaatatgg ggttggtcat 180 gtttctacat atttctattt gcatttcgtt aactggtgct tgttattttt gtacataatg 240 catatctcat tgttattatt tttaaccttt tgagatggta acgaagatcc aaacatgcat 300 agatgattct ccggatgatt ttttgtagcc tgcactagga actcccaaga gccagaaggt 360 tgggtttgta caagataaca tttgtttgaa cacactcata acctgcatgt gacatacatg 420 acgtaactta tagtgatgat tcgacaaatg tctctttgtc caattttgtt atatatcccg 480 tggcaacgca cgggcattcg actagtatat gtaaagatat caatgtgacg agtccccatg 540 gtcgttgcgc ttgtccacta ccggctcgct agaggcgact ctcacctaga agtcgctacg 600 agcaatacat agtcgttctg ggcgcagcta tgttctgcct tttgcgacgc tcaggcacgg 660 cttgcctaca gcctgagggt cgggctagga accactaatt gtgtcatgct gatgtcacaa 720 tgacatcatg catattttta ttttcgtttt tcgctttctc tttaatttta tttgtatttc 780 aaaatatttt atatattttt tgaatttttt caatgttgta tttgaaaaat gttaaacctg 840 tatagagaaa aatatttttg atatatataa aagtatataa catgaatgaa aaatgtataa 900 atgttaatta tgtgtaccaa aaatgttgat aacaattagc agtctcacat 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cttgagaccc cagggccata cttgttggat atcattgtcc cgcatcagga 780 gcacgtgctg cctatgatcc caaatggtgg tgcttttaag gacatgatca tggagggtga 840 tggcaggacc tcgtactgaa atttcgacct acaagaccta caagtgtgac atgcgcaatc 900 agcatgatac ctgcgtgttg tatcaactac tgggggttca actgtgaacc atgcgttttc 960 tagtttgctt gtttcattca tataagcttg tgttacttag ttccgaaccg tgtagttttg 1020 tagtctctgt tctcttttgt agggatgtgc tgtcataaga tatcatgcaa gtttcttgtc 1080 ctacatatca ataataagca cttccatgga ataattctca gttctgtttt gaatttcaca 1140 tcttctcacg aacagtgtgc tggttccttt ctgttacttt acatgcctgc cgtgtcaggt 1200 tatgacataa cgaccgatgg aggattggag ggtggtcggc tggttttaga cggggaattg 1260 aaacattttt ctggaagaaa tctgaataca gttgggaggg gaaatggaag catatattta 1320 tcgagcccgc tatccaggct aatttatcaa gcactagaca gtgtagggtg ttggcattct 1380 tctcttcctt gatatccggc ttgagaggag agattgaggc ttcggctgtg ttggttgctg 1440 atttctacag cattttgaga gagagagaga gatgttgcaa ctgtgttttg tcttggttgc 1500 ttgtacagag aaagagatga catttagaga tatgcagatc gtttaccagt tgtgctgcgt 1560 ttattcgtac tg 1572 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wheat <400> 110 accagatgtg ggcggctcag tattacactt acaagcggcc acggcagtgg ctgtcttcgt 60 ctggttgggg gcaatgggat ttgggttacc agctgcagct ggcgctgctg tggccaaccc 120 aggtgttaca gttgttgaca ttgatggaga tggtagtttc ctcatgaaca ttcaggagtt 180 ggcattgatc cgtattgaga acctccctgt gaaggtgatg atattgaaca accagcatct 240 gggaatggtg gtgcaatggg aggataggtt ttacaaggcc aatcgggcgc acacatacct 300 tggcaaccca gaaaatgaga gtgagatata tccagatttt gtgacgattg ctaaaggatt 360 caacgttccg gcagttcgtg tgacgaagaa gagcgaagtc actgcagcaa tcaagaagat 420 gcttgagacc ccagggccat acttgttgga tatcatcgtc ccgcatcagg agcacgtgct 480 gcctatgatc ccaagcggtg gtgctttcaa ggacatgatc atggagggtg atggcaggac 540 ctcgtactga aatttcgacc tacaagacct acaagtgtga catgcgcaat cagcatggtg 600 cccgcgtgtt gtatcaacta ctaggggttc aactgtgaac catgcgtttt ctagtttgct 660 tgtttcattc atataagctt gtgttactta gttccgaacc ctgtagcttt gtagtctatg 720 ctctcttttg tagggatgtg ctgtcataag atatcatgca agtttcttgt cctacatatc 780 <210> 111 <211> 781 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Donor 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cctcgtactg aaatttcgac ctacaagacc tacaagtgtg acatgcgcaa tcagcatgat 600 acctgcgtgt tgtatcaact actgggggtt caactgtgaa ccatgcgttt tctagtttgc 660 ttgtttcatt catataagct tgtgttactt agttccgaac cgtgtagttt tgtagtctct 720 gttctctttt gtagggatgt gctgtcataa gatatcatgc aagtttcttg tcctacatat 780 c 781 <210> 179 <211> 781 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Donor insertion results from amplified region of AHAS gene of wheat <400> 179 accagatgtg ggcggctcag tattacactt acaagcggcc acggcagtgg ctgtcttcgt 60 ctggtttggg ggcaatggga tttgggttac cagctgcagc tggcgctgct gtggccaacc 120 caggtgttac agttgttgac attgatggtg atggtagttt cctcatgaac attcaggagt 180 tggcgttgat ccgcattgag aacctcccag tgaaggtgat gatattgaac aaccagcatc 240 tgggaatggt ggtgcagtgg gaggataggt tttacaaggc caatcgggcg cacacatacc 300 ttggcaaccc agaaaatgag agtgagatat atccagattt tgtgacgatt gctaaaggat 360 tcaacgttcc agcagttcga gtgacgaaga agagcgaagt cactgcagca atcaagaaga 420 tgcttgagac cccagggcca tacttgttgg atatcatagt cccgcatcag gagcacgtgc 480 tgcctatgat cccaagcggt ggtgctttca aggacatgat catggagggt gatggcagga 540 cctcgtactg aaatttcgac ctacaagacc tacaagtgtg acatgcgcaa tcagcatgat 600 gcccgcgtgt tgtatcaact actaggggtt caactgtgag ccatgcgttt tctagtttgc 660 ttgtttcatt catataagct tgtattactt agttccgaac cctgtagttt tgtagtctat 720 gttctctttt gtagggatgt gctgtcataa gatgtcatgc aagtttcttg tcctacatat 780 c 781 <210> 180 <211> 781 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Donor insertion results from amplified region of AHAS gene of wheat <400> 180 accagatgtg ggcggctcag tattacactt acaagcggcc acggcagtgg ctgtcttcgt 60 ctggtttggg ggcaatggga tttgggttac cagctgcagc tggcgctgct gtggccaacc 120 caggtgttac agttgttgac attgatggtg atggtagttt cctcatgaac attcaggagt 180 tggcgttgat ccgcattgag aacctcccag tgaaggtgat gatattgaac aaccagcatc 240 tgggaatggt ggtgcagtgg gaggataggt tttacaaggc caatcgggcg cacacatacc 300 ttggcaaccc agaaaatgag agtgagatat atccagattt tgtgacgatt gctaaaggat 360 tcaacgttcc agcagttcga gtgacgaaga agagcgaagt cactgcagca atcaagaaga 420 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Claims (41)

  1. 식물 세포 내의 내인성 유전자의 하나 이상의 대립유전자에 대한 표적화된 게놈 변형을 포함하며, 여기서 게놈 변형은 부위 특이적 뉴클레아제에 의한 절단을 따르고 게놈 변형은 내인성 유전자가 제초제 내성 식물 세포를 발생시키는 생성물을 생산하도록 내인성 유전자에서 돌연변이를 생산하는 것인 식물 세포.
  2. 제1항에 있어서, 게놈 변형이 하나 이상의 외인성 서열의 통합을 포함하는 것인 식물 세포.
  3. 제1항에 있어서, 게놈 변형이 내인성 유전자의 발현을 교란시키는 하나 이상의 indel의 도입을 포함하는 것인 식물 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 변형을 갖는 내인성 유전자가 술포닐우레아 제초제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 것인 식물 세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈 변형을 갖는 내인성 유전자가 이미다졸리논 제초제에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 것인 식물 세포.
  6. 제2항에 있어서, 외인성 서열이 트랜스제닉 선택 마커를 코딩하지 않는 것인 식물 세포.
  7. 제2항에 있어서, 외인성 서열이 작물 수확량을 증가시키는 단백질, 질병 저항성을 코딩하는 단백질, 성장을 증가시키는 단백질, 곤충 저항성을 코딩하는 단백질, 제초제 내성을 코딩하는 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것인 식물 세포.
  8. 제7항에 있어서, 증가된 작물 수확량이 과일 수확량, 곡물 수확량, 바이오매스, 과육 함량, 크기, 건조 중량, 고형분 함량, 중량, 색상 강도, 색상 균일성, 변경된 화학적 특성 또는 이들의 조합에서의 증가를 포함하는 것인 식물 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 유전자가 내인성 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자인 식물 세포.
  10. 제2항에 있어서, 2개 이상 외인성 서열이 내인성 유전자 내로 통합된 것인 식물 세포.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다배수체 식물 세포인 식물 세포.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 FokI 절단 도메인을 포함하는 것인 식물 세포.
  13. 제12항에 있어서, 아연 핑거 DNA-결합 도메인이 서열 35-56 및 263-278로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 부위에 결합하는 단백질을 코딩하는 것인 식물 세포.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 밀, 대두, 옥수수, 감자, 알팔파, 벼, 보리, 해바라기, 토마토, 아라비돕시스(Arabidopsis), 목화, 브라시카(Brassica) 종 및 티모시 그래스로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 식물 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 하나 이상의 식물 세포를 포함하는 식물, 식물 부분, 종자 또는 과일.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 유전자와 상이한 하나 이상의 유전자좌에서 식물 세포의 게놈 내로 통합된 하나 이상의 트랜스진을 추가로 포함하는 식물 세포.
  17. 식물 세포에서 하나 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 발현시키는 단계; 및
    다배수체 식물 세포의 다수의 게놈에 걸쳐 내인성 유전자의 하나 이상의 대립유전자를 변형시키는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 식물 세포를 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 내인성 유전자가 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 변형이 내인성 유전자의 발현을 교란시키는 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 변형이 내인성 유전자의 하나 이상의 대립유전자 내로의 하나 이상의 외인성 서열의 통합을 포함하는 것인 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 하나 이상의 식물 세포를 포함하는 식물, 식물 부분, 종자 또는 과일.
  22. 서열 35-56 및 263-278로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 부위에 결합하는 아연 핑거 단백질.
  23. 제22항에 있어서, 표 2 또는 표 12의 단일 열에 나타낸 인식 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 단백질.
  24. a) 식물 세포에서 하나 이상의 부위 특이적 뉴클레아제를 발현시키고, 여기서 하나 이상의 뉴클레아제는 하나 이상의 내인성 유전자좌의 염색체 DNA를 표적화하고 절단하는 것인 단계;
    b) 하나 이상의 외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내의 하나 이상의 내인성 유전자좌 내로 통합시키고, 여기서 하나 이상의 내인성 유전자좌는 내인성 유전자가 돌연변이되어 식물 세포에서 선택 표현형을 발생시키는 생성물을 발현하도록 변형되는 것인 단계;
    c) 선택 표현형을 발현하는 식물 세포를 선택하고, 여기서 하나 이상의 외인성 서열이 도입된 식물 세포를 선택하는 것인 단계
    를 포함하는, 하나 이상의 외인성 서열을 식물 세포의 게놈 내로 통합시키는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열이 공여자 폴리뉴클레오티드, 트랜스진 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열을 통합시키는 것이 상동 재조합 또는 비-상동 말단 연결에 의해 일어나는 것인 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열이 하나 이상의 내인성 유전자좌 내로 동시에 또는 순차적으로 혼입되는 것인 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 내인성 유전자좌가 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 유전자를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, AHAS 유전자가 다배수 게놈의 A, B 또는 D 게놈 상에 위치하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열이 AHAS 유전자 내로 통합된 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열이 S653N AHAS 돌연변이를 코딩하는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열이 P197S AHAS 돌연변이를 코딩하는 것인 방법.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 아연 핑거 뉴클레아제, TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제 및 Crispr/Cas 단일 가이드 RNA 뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 부위 특이적 뉴클레아제가 아연 핑거 DNA-결합 도메인 및 FokI 절단 도메인을 포함하는 것인 방법.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열이 트랜스진을 코딩하거나 또는 RNA 분자를 생산하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 트랜스진이 작물 수확량을 증가시키는 단백질, 질병 저항성을 코딩하는 단백질, 성장을 증가시키는 단백질, 곤충 저항성을 코딩하는 단백질, 제초제 내성을 코딩하는 단백질, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 트랜스진의 통합이, 하나 이상의 내인성 유전자좌의 발현을 교란시키고 선택 표현형을 생산하는 하나 이상의 indel의 도입을 추가로 포함하는 것인 방법.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    d) 하나 이상의 외인성 서열을 포함하는 선택된 식물 세포를 배양하는 단계; 및
    e) 식물 게놈의 하나 이상의 내인성 유전자좌 내에 통합된 하나 이상의 외인성 서열을 포함하는 전체 식물을 수득하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 선택제를 포함하는 선택제가 식물 세포를 선택하는데 사용되는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 식물 게놈의 하나 이상의 내인성 유전자좌 내에 통합된 하나 이상의 외인성 서열을 포함하는 전체 식물이 식물 게놈의 내인성 유전자좌 내에 추가의 외인성 서열을 도입시키기 위해 추가로 변형되는 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 하나 이상의 외인성 서열이 트랜스제닉 선택 마커를 코딩하지 않은 것인 방법.
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