CN118086306A - 一种提高谷氨酸棒杆菌中支链氨基酸积累的非编码的sRNA及其应用 - Google Patents
一种提高谷氨酸棒杆菌中支链氨基酸积累的非编码的sRNA及其应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种提高谷氨酸棒杆菌中支链氨基酸积累的非编码sRNA及其应用，所述的非编码sRNA其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，或者与其高度同源；通过实验证明，在重组菌中过表达该非编码sRNA可以显著提升L‑亮氨酸、L‑异亮氨酸和L‑缬氨酸等支链氨基酸的产量和糖酸转化率，同时减少了副产物杂酸的生成。此创新技术通过设计新型非编码sRNA调控元件，既丰富了微生物代谢工程改造手段，也为实现支链氨基酸发酵生产的高效、可持续提升提供了重要的技术方向。本发明适用于发酵氨基酸生产的效率提升和组成优化，而且在食品工业、医药、日化、饲料添加剂、还包括在制备用于增强人体营养吸收、促进肌肉生长的氨基酸补充剂等多个领域有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高谷氨酸棒杆菌中支链氨基酸积累的非编码的sRNA及其应用。
背景技术
支链氨基酸具有多种生理功能，在食品、动物饲料、化妆品和医药等行业都具有非常广泛的应用。早期主要通过化学合成法生产，但是，化学合成法产量低，环境污染大，渐渐被淘汰，随之，微生物发酵法受到广泛关注。目前，用于支链氨基酸生产的菌株主要包括黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。支链氨基酸的生物合成途径冗长且具有复杂精密的自我调节机制，天然菌株中氨基酸的生物合成途径受到严格代谢控制，以保证氨基酸仅为细胞固有的需要而生产。因此，通过菌株改造生产支链氨基酸越来越引起重视。随着技术进步，代谢改造逐渐正成为氨基酸高产菌株获得的主要方式，但经过大量代谢改造的菌株在工业上的稳定性并不理想。虽然代谢工程改造能够一定程度上提高氨基酸产量，但作为初级代谢产物，一方面，副产物的合成路径的削弱以及增加合成模块所带来的代谢负担对于菌株生长有减弱作用，另一方面，合成路径上的关键酶多受到中间代谢物和终产物的反馈抑制，保证前体充足和缓和反馈抑制之间的平衡在工业生产中不能稳定地实现。总之，由于缺乏对微生物精细调控机制的深入理解与应用，导致在优化菌株性能、增强稳定性和进一步提升目标产物产率方面受限。
细菌非编码小RNA(small non-coding RNA，sRNA)是近年来在细菌等原核生物中发现的一类RNA调控子，它们不编码蛋白质，长度在50～500个核苷酸之间，广泛参与体内多种生命活动的调控。细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用。然而，针对非编码sRNA在调节氨基酸生物合成途径中的作用机制尚不清晰，且缺乏针对性设计和利用sRNA进行高效、精准调控的技术；总之，现有技术中存在很多问题亟待本领域技术人员解决。
发明内容
为了解决微生物发酵生产氨基酸过程中因传统诱变筛选效率低及代谢工程改造存在的一系列问题，并充分利用细菌非编码sRNA对微生物代谢网络的潜在调控能力；本发明公开了一种提高支链氨基酸积累的非编码的sRNA及其应用；通过表达这些sRNA序列，实现了显著提高氨基酸产率、优化氨基酸组成比例以及改善副产物生成等效果，从而增强了发酵菌株的工业竞争力。
首先，本发明公开一种能够提高谷氨酸棒杆菌中支链氨基酸产量的非编码sRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与提高支链氨基酸产量相关的其他非编码sRNA的核苷酸序列；更进一步的，同源性程度可分别达到95％、98％。
另一方面，本发明公开了含有上文所述的非编码sRNA基因的载体。
此外，本发明还公开了表达上文所述非编码sRNA基因的重组菌。
对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的重组菌，菌体选自谷氨酸棒杆菌。
对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的重组菌，所述的谷氨酸棒杆菌选自谷氨酸棒杆菌IBBH-15，谷氨酸棒杆菌IBCL-1，谷氨酸棒杆菌IBCVQ，谷氨酸棒杆菌CICC21756，谷氨酸棒杆菌ATCC13002中的一种或几种的混合物。
经本申请的多个实施例证实，该序列的表达能够提高主酸在总氨基酸中的比例、提高糖酸转化率、降低总杂酸；证实了该sRNA在不同生产菌株中的通用性及有效性。
此外，本发明还公开了上文所述的非编码sRNA的基因、所述的载体、所述的重组菌在发酵氨基酸中的应用。
对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的应用包括：在提高氨基酸生产效率，优化氨基酸组成比例以及降低副产物中的应用。
对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的应用中的氨基酸选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸中的一种。
对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的应用，还包括在食品工业、医药、日化或饲料添加剂等领域中的应用。
对于上文所述的技术方案，进一步优选的，所述的应用，还包括在制备用于增强人体营养吸收、促进肌肉生长的氨基酸补充剂中的应用。
相比现有技术本发明的有益效果
与其他非编码sRNA调控方法相比，本发明得到的sRNA无需额外表达其他RNA伴侣蛋白。
过表达菌IBCLQ-257的L-亮氨酸产量能够达到60.2g/L，相比于原始菌株提高了约20.5％，糖酸转化率提高了14.2％；过表达有益sRNA后，总杂酸下降了62.8％。
过表达菌IBCIL-253的菌株L-异亮氨酸产量达到66.4g/L，相比于原始菌提高了7.62％，糖酸转化率提高了5.23％，总杂酸降低了51.7％。
菌株IBCVQ-256的L-缬氨酸产量达到106.87±5.80g/L，相比于原始菌株提高了约23.8％，糖酸转化率提高了17.9％；副酸的产生降低了约3.54g/L，总杂酸下降了40.8％。
这表明，合适的非编码sRNA确实能够有效提升支链氨基酸的发酵浓度，同时降低杂酸的含量。
本发明通过设计并引入新型的非编码sRNA调控元件，不仅拓宽了微生物代谢工程改造的策略，还为高效、可持续地提高支链氨基酸产品的发酵生产水平提供了新的技术手段。
本发明通过设计并引入非编码sRNA调控元件，不仅拓宽了微生物代谢工程改造的策略，还为高效、可持续地提高支链氨基酸产品的发酵生产水平提供了新的技术手段。
附图说明
图1谷氨酸棒杆菌过表达不同非编码sRNA氨基酸产量积累情况；
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
实施例1工程棒杆菌sRNA调控系统的构建
将质粒pXMJ19以质粒引物Plsmid-F/R通过高保真酶进行扩增，将DNA片段s25(SEQID NO.1)用易错PCR引物Errp-F/R通过高保真酶进行扩增，将两片段经过纯化后同源重组连接，得到的载体转入到谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13002中，得到菌株C.g-pXMJ19-s25，记为s25。
所述DNA片段s25通过如下手段获得：
将质粒pXMJ19以质粒引物Plsmid-F/R通过高保真酶进行扩增，将DNA片段bn(SEQID NO.2)用易错PCR引物Errp-F/R通过高保真酶进行扩增，将两片段经过纯化后同源重组连接，得到的载体pXMJ19-bn。
以pXMJ-bn质粒作为模板，通过易错PCR酶扩增sRNA特异性部分，反应体系如表2所示，反应程序如表2所示，为提高突变率，以第一轮易错PCR结束后，消化质粒模板，以纯化产物为模板，再次进行易错PCR，循环三次。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，在蓝光实时观测仪下判断目的基因片段大小是否正确，条带大小正确则在体系中加入5μL DMT酶，37℃温育15min，消化结束后进行产物纯化回收。
以pXMJ-sRNAbn质粒为模板，高保真酶扩增剩余的片段，反应体系如表3所示，反应程序如表2所示，将两片段经过纯化后同源重组连接，得到的突变质粒转入后续所述的出发菌株中，发酵效果提升的则进行序列测定，其中只有一组(六组中选出)的效果较为明显的突变体序列如SEQ ID NO.1，命名为s25。此外，将质粒pXMJ19-bn转入到谷氨酸棒杆菌ATCC13002中，得到菌株C.g-pXMJ-bn，记为C.g-bn，作为后续实验的对照。用同样的转化方法将pXMJ19质粒转入谷氨酸棒杆菌中，记为C.g-p，作为后续实验的对照。
表1易错PCR反应体系
| 反应组分 | 体积(50μL) |
| 模板 | 1μL |
| 易错PCR引物F | 1.5μL |
| 易错PCR引物R | 1.5μL |
| 2xTaq DNA Polymerase mixture | 25μL |
| MnCl2(5mM) | 2μL |
| DMSO | 2μL |
| ddH2O | 17μL |
表2易错PCR反应程序
表3扩增pXMJ19-sRNAbn其他片段的PCR反应体系
质粒引物Plsmid-F：ggctgttttggcggatgagag；SEQ ID NO.3；
质粒引物Plsmid-R：ttgttatccgctcacaattccac；SEQ ID NO.4；
易错PCR引物Errp-F：gtggaattgtgagcggataacaa；SEQ ID NO.5；
易错PCR引物Errp-R：ctctcatccgccaaaacagcc；SEQ ID NO.6；
实施例2谷氨酸棒杆菌中sRNA过表达菌株产酸性能测定
分别将谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13002(C.g)、过表达空载的C.g-p、过表达不同非编码RNA的谷氨酸棒杆菌C.g-bn、s21-s25接种于摇瓶培养基中，37℃，100rpm培养16h，此时OD562约在15左右，备用；按照9％(V/V)将培养液接种至摇瓶培养基中，37℃、120rpm振荡培养68h，在48h时分别加入1mM乳糖诱导质粒表达。68h发酵结束。
由蛛网图的产量结果可以看出，过表达空载和模板sRNA的菌株整体上的产量有所降低，其中空载的降低可能是由于载体复制的负担而导致的整体产酸能力下降，而模板sRNA则是对于产酸会产生不利的影响，从而导致产酸能力的下滑。对于其他5个获得的非编码sRNA，对氨基酸的生产能力产生了不同的影响。相比于空载，非编码sRNAs21的表达对于苏氨酸和赖氨酸的积累有提升作用，而减少了发酵液中天冬氨酸和支链氨基酸(BCAA)中的L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的积累；非编码sRNA s22的表达菌株中天冬氨酸明显增多，而苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的产量明显降低；非编码sRNA s23的表达菌株中天冬氨酸和苏氨酸的积累轻微波动，L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的产量明显提升，且赖氨酸的积累同样增加；非编码sRNA s24对于所检测的氨基酸的产量提升都没有明显助益；非编码sRNA s25的表达菌株中天冬氨酸和苏氨酸的积累有所降低，L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的产量明显提升，且赖氨酸的积累也有所下降，特别地，该有益效果也超越了质粒负担所带来的不利影响，L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的产量提升分别为模式菌株的1.32倍、1.17倍和1.24倍。
实施例3 L-亮氨酸生产菌株表达sRNAs25对产酸的影响
在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株IBBH-15，保藏于位于中国北京市的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15720，保藏日期为2018年05月02日)中表达上述实施例中的非编码sRNA s25，得到菌株IBBH-pXMJ19-s257，记为IBCLQ-257。在该生产菌中分别表达空载pXMJ19，记为IBBH-15-p；表达pXMJ-sRNAbn，记为IBBH-15-bn。
分别将一环L-亮氨酸生产菌IBBH-15、负载空质粒的菌IBBH-15-p、过表达菌IBBH-15-bn和过表达菌IBCLQ-257斜面菌苔接四环于3L摇瓶中，将其置于80rpm、30℃条件下培养至大约OD562＝15，得到摇瓶种子液，备用。按照10％(V/V)接种量将摇瓶种子液接入30L发酵罐发酵培养基中，在48h时分别加入1mM乳糖诱导质粒表达。初始温度为30℃，初始通风量为0.8L/min，然后通过控制搅拌转速和风量，使发酵过程的前24h溶解氧为10-20％，24h之后溶解氧为5-15％；通过自动流加氨水控制发酵过程的pH，初始控pH值为6.7，菌体OD562增长到20后pH提高至6.9，菌体OD562增长到25后pH提高至7.0，菌体OD562增长到36后pH提高到7.2；发酵过程中控制残糖浓度为20～30g/L。
表4
| 产量g/L | 糖酸转化率 | 副酸g/L | |
| IBBH-15 | 49.8±2.13 | 24.6％ | 2.58±0.35 |
| IBBH-15-p | 49.7±1.88 | 24.2％ | 2.68±0.33 |
| IBBH-15-bn | 43.2±2.23 | 21.0％ | 1.36±0.41 |
| IBCLQ-257 | 60.02±2.01 | 27.7％ | 0.96±0.15 |
从表4中的数据可知，过表达sRNA s25的菌株IBCLQ-257相比于对照菌株IBBH-15的L-亮氨酸产量提高了约20.5％，副酸明显降低，而菌株IBBH-15-bn产酸和副酸相对于原始的出发菌株和空载体对照IBBH-15-p，都可见地降低。说明非编码sRNA在代谢产酸的调控过程中带来的影响与其序列相关。
发酵罐初始培养基：
葡萄糖100g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆10mL/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，硫酸锰0.01g/L，生物素100μg/L，维生素B1300μg/L，L-蛋氨酸0.1g/L，L-L-异亮氨酸0.1g/L，L-谷氨酸0.1g/L，植物油1mL/L，pH7.0～7.2。
补料糖液：400g/L葡萄糖、硫酸镁0.5g/L。
实施例4 L-异亮氨酸生产菌株表达sRNAs25对产酸的影响
在L-异亮氨酸生产菌(谷氨酸棒杆菌IBCL-1(Corynebacterium glutamicum)，保藏编号为CCTCC NO:M 2022764，于2022年05月30日保藏)中表达实施例2中的非编码sRNAs25，得到菌株IBCL-pXMJ19-s253，记为IBCIL-253。在该生产菌中分别表达空载pXMJ19，记为IBCL-1-p；表达pXMJ-sRNAbn，记为IBCL-1-bn。
分别将一环L-异亮氨酸生产菌IBCL-1、负载空质粒的菌IBCL-1-p、过表达菌IBCL-1-bn和过表达菌IBCIL-253斜面菌苔接两环于3L摇瓶中，将其置于30℃，90rpm，振荡培养16h，至大约OD562＝15，得到摇瓶种子液，备用。按照10％(V/V)接种量将摇瓶种子液接入30L发酵罐发酵培养基中，在18h时分别加入1mM乳糖诱导质粒表达。初始温度为30℃，pH 6.8，发酵过程中不断调整通气与转速控制溶氧在10％左右，在48h时分别加入1mM乳糖诱导质粒表达。待发酵液中菌种OD562生长至40左右，pH调至7.0左右；待发酵液残糖降至6％时，开始通过流加无机盐补料液控制其发酵液渗透压在700mosm/L左右；残糖低于1％时，通过流加补料糖液控制发酵液的残糖在1％左右，同时继续流加无机盐补料液控制其发酵液渗透压在900mosm/L左右，约30h糖耗完发酵结束。发酵产量如表5所示。
表5
| 产量g/L | 糖酸转化率 | 副酸g/L | |
| IBCL-1 | 61.7±1.40 | 36.3％ | 1.74±0.40 |
| IBCL-1-p | 60.7±2.88 | 35.7％ | 1.93±0.50 |
| IBCL-1-bn | 56.6±5.86 | 33.3％ | 1.64±0.37 |
| IBCIL-253 | 66.4±3.20 | 38.2％ | 0.84±0.12 |
由表5可看出，过表达sRNA s25的菌株IBCIL-253相比于对照菌株IBCL-1的L-L-异亮氨酸产量提高了约7.6％，副酸降低了51.7％，相反地，菌株IBCL-1-bn产酸和副酸相对于原始的出发菌株IBCL-1都明显降低，说明非编码sRNA在代谢产酸的调控过程中带来的影响与其序列相关。
种子培养基：
葡萄糖30g/L，玉米浆干粉10g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，碳酸钙10g/L，pH6.7-7.2；分装500毫升/5000毫升；灭菌条件121℃/20min；
发酵培养基：
葡萄糖100g/L，玉米浆干粉8g/L，硫酸铵5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L；
补料糖液：400g/L葡萄糖、磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L；
无机盐补料液：硫酸铵100g/L
实施例5 L-缬氨酸生产菌株表达sRNAs25对产酸的影响
在模式菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13002(可在多家生物试剂公司购买到其感受态细胞产品)的基础上，按照常规的基因改造方案，进行如下改造获得谷氨酸棒杆菌IBCVQ，即：敲除模式菌株基因组上的ldh、brnQ基因，将ilvE替换为球形赖氨酸芽孢杆菌中的NADH依赖型亮氨酸脱氢酶(LeuDH)；合成ilvN突变体ilvNM(G20E，I21E，I22F，G156E)合成ilvC突变体ilvCM(S34G、L48E和R49F)并且在alaT位点用PgapA启动子表达ilvBNMCM；在ppc位点用Ptac启动子表达pfkA基因；在pta位点用Ptac启动子表达pyk基因。
在L-缬氨酸生产菌IBCVQ中表达实施例2中的非编码sRNA s25，得到菌株IBCVQ-pXMJ19-s256，记为IBCLQ-256。在该生产菌中分别表达空载pXMJ19，记为IBCVQ-p；表达pXMJ-sRNAbn，记为IBCVQ-bn。
分别将一环L-缬氨酸生产菌IBCVQ、负载空质粒的菌IBCVQ-p、过表达菌IBCVQ-bn和过表达菌IBCLQ-256斜面菌苔接两环于3L摇瓶中，将其置于120rpm、30℃条件下培养16-18h至OD562＝15左右，得到摇瓶种子液，备用。按照10％(V/V)接种量将摇瓶种子液接入30L发酵罐发酵培养基中，0h-20h培养条件为：温度30℃，罐压0.02～0.03Mpa，溶氧自然下降至20％左右后，通过调整转速和通气，控制溶解氧不低于20％；20h-48h培养条件为：温度31℃，罐压0.04～0.08Mpa，通过调整转速和通气，控制溶解氧为1％±0.1％。发酵过程中控制残糖浓度为20～30g/L。
发酵进行48h后，L-缬氨酸产量、转化率以及杂酸含量如表6所示。
表6
| 产量g/L | 糖酸转化率 | 副酸g/L | |
| IBCVQ | 86.3±3.40 | 44.8％ | 8.67±2.14 |
| IBCVQ-p | 82.5±2.31 | 42.8％ | 8.12±1.79 |
| IBCVQ-bn | 81.2±3.25 | 42.2％ | 7.2±1.49 |
| IBCVQ-256 | 106.87±5.80 | 52.8％ | 5.13±0.72 |
由表6可看出过表达sRNA s25的菌株IBCVQ-256相比于对照菌株IBCVQL-缬氨酸产量提高了23.8％，总杂酸下降了40.8％，菌株IBCVQ-bn产酸和副酸相对于原始的出发菌株IBCVQ都有所降低，说明非编码sRNA在代谢产酸的调控过程中带来的影响与其序列相关。
斜面培养基：2.5g/L尿素，5g/L(NH4)2SO4，0.5g/L KH2PO4，0.5g/L K2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，1.8g/L酵母浸出粉，5g/L蛋白胨，6mg/L FeSO4·7H2O，4mg/L MnSO4·H2O，0.2mg/L生物素，0.2mg/L维生素B1，40g/L葡萄糖，15g/L琼脂粉。
发酵培养基：8g/L(NH4)2SO4，1g/L KH2PO4，1g/L K2HPO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，3.5g/L酵母粉，10mg/L FeSO4·7H2O，4mg/L MnSO4·H2O，0.02mg/L生物素，2mg/L维生素B1，30mg/L维生素B3，8mg/L维生素B6，90g/L葡萄糖，植物油40mL/L。
补料培养基：400g/L葡萄糖。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种提高谷氨酸棒杆菌中支链氨基酸产量的非编码sRNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
或，与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并与提高支链氨基酸产量相关的其他非编码sRNA的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的非编码sRNA基因的载体。
3.表达权利要求1所述非编码sRNA基因的重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，重组菌的菌体选自谷氨酸棒杆菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述的谷氨酸棒杆菌选自谷氨酸棒杆菌IBBH-15，谷氨酸棒杆菌IBCL-1，谷氨酸棒杆菌IBCVQ，谷氨酸棒杆菌CICC21756，谷氨酸棒杆菌ATCC13002中的一种或几种的混合。
6.如权利要求1所述的非编码sRNA的基因、权利要求2所述的载体、权利要求3所述的重组菌在发酵氨基酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用包括：在提高氨基酸生产效率，优化氨基酸组成比例以及降低副产物中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述氨基酸选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸中的一种。
9.如权利要求6所述的应用，还包括在食品工业、医药、日化或饲料添加剂等领域中的应用。
10.如权利要求6所述的应用，还包括在制备用于增强人体营养吸收、促进肌肉生长的氨基酸补充剂中的应用。
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