CN118086307A - 提高大肠杆菌中支链氨基酸积累的非编码sRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高大肠杆菌中支链氨基酸积累的非编码的sRNA及其应用,所述的非编码sRNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1,或者与其高度同源;通过实验证明,在重组菌中过表达该非编码sRNA可以显著提升L‑亮氨酸、L‑异亮氨酸和L‑缬氨酸等支链氨基酸的产量和糖酸转化率,同时减少了副产物杂酸的生成。此创新技术通过设计新型非编码sRNA调控元件,既丰富了微生物代谢工程改造手段,也为实现支链氨基酸发酵生产的高效、可持续提升提供了重要的技术方向。本发明适用于发酵氨基酸生产的效率提升和组成优化,而且在食品工业、医药、日化、饲料添加剂、还包括在制备用于增强人体营养吸收、促进肌肉生长的氨基酸补充剂等多个领域有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域具体涉及一种提高大肠杆菌中支链氨基酸积累的非编码sRNA及其应用。
背景技术
支链氨基酸具有多种生理功能,在食品、动物饲料、化妆品和医药等行业都具有非常广泛的应用。早期主要通过化学合成法生产,但是,化学合成法产量低,环境污染大,渐渐被淘汰,随之,微生物发酵法受到广泛关注。目前,用于支链氨基酸生产的菌株主要包括黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、大肠杆菌(Escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。支链氨基酸的生物合成途径冗长且具有复杂精密的自我调节机制,天然菌株中氨基酸的生物合成途径受到严格代谢控制,以保证氨基酸仅为细胞固有的需要而生产。因此,通过菌株改造生产支链氨基酸越来越引起重视。随着技术进步,代谢改造逐渐正成为氨基酸高产菌株获得的主要方式,但经过大量代谢改造的菌株在工业上的稳定性并不理想。虽然代谢工程改造能够一定程度上提高氨基酸产量,但作为初级代谢产物,一方面,副产物的合成路径的削弱以及增加合成模块所带来的代谢负担对于菌株生长有减弱作用,另一方面,合成路径上的关键酶多受到中间代谢物和终产物的反馈抑制,保证前体充足和缓和反馈抑制之间的平衡在工业生产中不能稳定地实现。总之,由于缺乏对微生物精细调控机制的深入理解与应用,导致在优化菌株性能、增强稳定性和进一步提升目标产物产率方面受限。
细菌非编码小RNA(small non-coding RNA,sRNA)是近年来在细菌等原核生物中发现的一类RNA调控子,它们不编码蛋白质,长度在50~500个核苷酸之间,广泛参与体内多种生命活动的调控。细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子,在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用。然而,针对非编码sRNA在调节氨基酸生物合成途径中的作用机制尚不清晰,且缺乏针对性设计和利用sRNA进行高效、精准调控的技术;总之,现有技术中存在很多问题亟待本领域技术人员解决。
发明内容
为了解决微生物发酵生产氨基酸过程中因传统诱变筛选效率低及代谢工程改造存在的一系列问题,并充分利用细菌非编码sRNA对微生物代谢网络的潜在调控能力;本发明公开了一种提高支链氨基酸积累的非编码的sRNA及其应用;通过过表达这些sRNA序列,实现了显著提高氨基酸产率、优化氨基酸组成比例以及改善副产物生成等效果,从而增强了发酵菌株的工业竞争力。
首先,本发明公开一种能够提高大肠杆菌中支链氨基酸产量的非编码sRNA,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;或,与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与提高支链氨基酸产量相关的其他非编码sRNA的核苷酸序列;更进一步的,同源性程度可分别达到95%、98%。
另一方面,本发明公开了含有上文所述的非编码sRNA基因的载体。
此外,本发明还公开了表达上文所述非编码sRNA基因的重组菌。
对于上文所述的技术方案,进一步优选的,所述的重组菌,菌体选自重组菌的菌体选自大肠杆菌。
对于上文所述的技术方案,进一步优选的,所述的大肠杆菌选自突变菌株IBELQ,突变菌株IBEIQ,突变菌株IBEVQ,大肠杆菌W3110,大肠埃希菌Nissle1917,大肠杆菌BL21,大肠杆菌HB101,大肠杆菌JM109,大肠杆菌DH10B或大肠杆菌MG1655中的一种或几种的混合。
经本申请的多个实施例证实,该序列的表达能够提高主酸在总氨基酸中的比例、提高糖酸转化率、降低总杂酸;证实了该sRNA在不同生产菌株中的通用性及有效性。
此外,本发明还公开了上文所述的非编码sRNA的基因、所述的载体、所述的重组菌在发酵氨基酸中的应用。
对于上文所述的技术方案,进一步优选的,所述的应用包括:在提高氨基酸生产效率,优化氨基酸组成比例以及降低副产物中的应用。
对于上文所述的技术方案,进一步优选的,所述的应用中的氨基酸选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸中的一种。
对于上文所述的技术方案,进一步优选的,所述的应用,还包括在食品工业、医药、日化或饲料添加剂等领域中的应用。
对于上文所述的技术方案,进一步优选的,所述的应用,还包括在制备用于增强人体营养吸收、促进肌肉生长的氨基酸补充剂中的应用。
相比现有技术本发明的有益效果
L-亮氨酸生产菌株IBELQ-324的L-亮氨酸产量能够达到58.87g/L,相比于出发菌株提高了约8.4%,糖酸转化率提高了8.5%,过表达有益sRNA后,杂酸量减少41.1%。
L-异亮氨酸生产菌株IBEIL-329的菌株L-异亮氨酸摇瓶产量达到46.11g/L,相比于原始菌提高了22.7%,糖酸转化率提高了15.5%,总杂酸降低了28.6%。
L-缬氨酸生产菌株IBEVQ-326的L-缬氨酸产量达到101.3g/L,相比于对照菌株IBEVQL的L-缬氨酸产量提高了23.8%,糖酸转化率提高了11.4%,总杂酸下降了38.6%
这表明,合适的非编码sRNA确实能够有效提升支链氨基酸的发酵浓度,同时降低杂酸的含量。
本发明通过设计并引入新型的非编码sRNA调控元件,不仅拓宽了微生物代谢工程改造的策略,还为高效、可持续地提高支链氨基酸产品的发酵生产水平提供了新的技术手段。
本发明通过设计并引入非编码sRNA调控元件,不仅拓宽了微生物代谢工程改造的策略,还为高效、可持续地提高支链氨基酸产品的发酵生产水平提供了新的技术手段。
附图说明
图1大肠杆菌过表达不同非编码sRNA氨基酸产量积累情况;
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细地描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中,如无特殊说明,所使用的实验方法均为常规方法,所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
实施例1大肠杆菌中sRNA调控系统的构建
将质粒pET30a以质粒引物p-F/R通过高保真酶进行扩增,将DNA片段s32(SEQ IDNO.1)用引物Ep-F/R通过高保真酶进行扩增,将两片段经过纯化后同源重组连接,得到的载体转入到大肠杆菌模式菌株W3110(DE3)中,得到菌株W-pET30a-s32,记为s32。
所述DNA片段s32通过如下手段获得:
将合成的DNA片段bn(SEQ ID NO.2)插入质粒pET30a中XbaI和XhoI位点之间,得到的载体pET30a-bn。以pET30a-bn质粒作为模板,通过易错PCR酶扩增sRNA特异性部分,反应体系如表2所示,反应程序如表2所示,为提高突变率,以第一轮易错PCR结束后,消化质粒模板,以纯化产物为模板,再次进行易错PCR,循环三次。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳,在蓝光实时观测仪下判断目的基因片段大小是否正确,条带大小正确则在体系中加入5μLDMT酶,37℃温育15min,消化结束后进行产物纯化回收。
以pET30a-bn质粒为模板,高保真酶扩增剩余的片段,反应体系如表3所示,反应程序如表2所示,将两片段经过纯化后同源重组连接,得到的突变质粒转入后续所述的出发菌株中,发酵效果提升的则进行序列测定,其中只有一组(六组突变体中选出)的效果较为明显的突变体序列如SEQ ID NO.1,命名为s32。此外,将质粒pET30a-bn转入到大肠杆菌模式菌株W3110(DE3)中,得到菌株W-pET30a-bn,记为W-bn,作为后续实验的阳性对照。
用同样的转化方法将pET30a质粒转入大肠杆菌W3110(DE3)中,记为W-P,作为后续实验的阴性对照。
易错PCR引物Ep-F:ggTAATACGACTCACTATAGGggatcc;SEQ ID NO.3;
易错PCR引物Ep-R:gcaatggcccaacagaaaataaaat;SEQ ID NO.4;
质粒引物p-F:attttattttctgttgggccattgc;SEQ ID NO.5;
质粒引物p-R:CCTATAGTGAGTCGTATTAcccggg;SEQ ID NO.6;
表1易错PCR反应体系
表2易错PCR反应程序
表3扩增pET30a-sRNA其他片段的PCR反应体系
实施例2工程棒杆菌sRNA过表达菌株产酸性能测定
分别将大肠杆菌W3110(DE3)、过表达空载的W-P、过表达不同非编码RNA的大肠杆菌W-bn、s31-s36接种于LB培养基中(含有KanR抗生素),37℃,160rpm培养16h,备用;按照1%(V/V)将培养液接种至LB培养基中(含有KanR抗生素),37℃、180rpm振荡培养24h,在6~8h时分别加入1mM IPTG诱导质粒表达。
由蛛网图的产量结果可以看出,过表达空载和模板sRNA的菌株整体上的产量有所降低,其中空载的降低可能是由于载体复制的负担而导致的整体产酸能力下降,而模板sRNA则是对于产酸会产生不利的影响,从而导致产酸能力的下滑。对于其他6个获得的非编码sRNA,对氨基酸的生产能力产生了不同的影响。
相比于空载,非编码sRNAs31的表达对于赖氨酸的积累有可观的提高;非编码sRNAs32的表达菌株中天冬氨酸和苏氨酸明显降低,其代谢下游的L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸的积累明显提高,赖氨酸的含量轻微波动;非编码sRNA s33的表达菌株中天冬氨酸、苏氨酸和L-异亮氨酸的积累轻微降低,L-缬氨酸、L-亮氨酸和赖氨酸的产量明显提升;非编码sRNA s34和sRNA s36对于所检测的氨基酸的产量提升都没有提高;非编码sRNA s35的表达菌株中天冬氨酸和苏氨酸的积累有所降低,L-缬氨酸和L-亮氨酸以及赖氨酸的产量略有波动,L-异亮氨酸的产量明显提升。特别地,非编码sRNA s32的有益效果也超越了质粒负担所带来的不利影响,L-缬氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸的产量提升分别为模式菌株的1.44倍、1.42倍和1.48倍。
实施例3L-亮氨酸生产菌株表达sRNAs25对产酸的影响
在大肠杆菌IBELQ中表达上述实施例中的非编码sRNA s32,得到菌株IBELQ-pET30a-s324,记为IBELQ-324。在该生产菌中分别表达空载pET30a,记为IBELQ-P;表达pET30a-bn,记为IBELQ-bn。
所述的出发菌株大肠杆菌IBELQ为模式菌株W3110(DE3)经由常规的改造手段进行改造,将ilvC基因(ID:12934337)突变为ilvCL67E/R68F/K75E;将ilvE基因(ID:12932278)替换为Bacillus glycinifermentans来源的bcd基因(GeneID:82853870)和大肠杆菌来源的leuE基因(Gene ID:7393115);在lldh基因(ID:7439211)的编码区表达枯草芽孢杆菌来源的rocG基因(Gene ID:14771491);在ackA(ID:12932696)的编码区表达Bifdobacteriumadolescentis来源的fxpk基因(ID:56674686)和自身的pta基因(ID:12932506);在metA基因(ID:12930295)的编码区表达lrp基因(ID:949051);在pflB(GeneID:12931841)的基因编码区表达谷氨酸棒杆菌来源的leuA基因(ID:47939659)并突变为leuAG380A/A589G/G1586A/G1682A;在poxB(Gene ID:12933107)的基因编码区表达谷氨酸棒杆菌来源的ilvBN基因簇(NZ_CP025533.1,Gene ID:47940655),并将ilvB突变为ilvBK30Q /G128S/A226S/G235S/Y252H/T362S。
分别将大肠杆菌IBELQ、负载空质粒的菌IBELQ-P、过表达菌IBELQ-bn和过表达菌IBELQ-324接种于LB培养基中(含有KanR抗生素),37℃,160rpm培养16h,以体积比10%的接种量接入发酵罐中,维持温度在37℃±0.5℃,流加25%(W/V)的氨水控制pH为6.7±0.1,通过调节通气量(20-100L·h-1)和搅拌转速(100-600rpm)来将溶氧控制在10%-40%,接种8h后0.2mMIPTG诱导质粒表达,发酵过程中控制残糖浓度为20~30g/L。发酵24h结束后检测产酸水平。
表4
各个菌株的生产水平见表4。过表达sRNAs32的菌株IBELQ-324相比于对照菌株IBELQ的L-亮氨酸产量提高了约8.4%,副酸明显降低,而菌株IBELQ-bn产酸和副酸相对于原始的出发菌株IBELQ和空载体对照IBELQ-bn都可见地降低。说明非编码sRNA在代谢产酸的调控过程中带来的影响与其序列相关。
种子培养基:葡萄糖12g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉3g/L,磷酸二氢钾2g/L,硫酸镁1g/L,硫酸亚铁0.01g/L,pH7.0,121℃灭菌15min。
发酵培养基:葡萄糖15g/L,酵母粉3g/L,蛋白胨4g/L,磷酸二氢钾3g/L,硫酸铵20g/L,硫酸镁1.5g/L,硫酸亚铁0.01g/L。
补料培养基:葡萄糖500g/L。
实施例4 L-异亮氨酸生产菌株表达sRNAs32对产酸的影响
大肠杆菌IBEIQ中表达实施例2中的非编码sRNA s32,得到菌株大肠杆菌IBEIQ-pET30a-s329,记为IBEIQ-329。在该生产菌中分别表达空载pET30a,记为IBEIQ-p;表达pET30a-sRNAbn,记为IBEIQ-bn。
所述出发菌株大肠杆菌IBEIQ为模式菌株W3110(DE3)经由常规的改造手段,将菌株中的ilvA基因突变为ilvAC290T,1339T,G1341T,C1351A,T1352C,将thrA突变为thrAC1034T,将lysC突变为lysCC1055T,之后在alaT基因的编码区表达ygaZH基因,在tdh基因的编码区表达thrABC基因簇,在ilcR的编码区表达ilvC基因,在ppc基因编码区表达ilvEDA基因簇,在metA基因的编码区表达lrp基因。
分别将大肠杆菌IBEIQ、负载空质粒的菌IBEIQ-p、过表达菌IBEIQ-bn和过表达菌IBEIQ-329接种于LB培养基(含有KanR抗生素)中,37℃,160rpm培养16h,以体积比10%的接种量接入发酵培养基中,维持温度在37℃±0.5℃,流加25%(W/V)的氨水控制pH6.8-7.2,通过调节通气量(20-100L·h-1)和搅拌转速(100-600rpm)将溶氧维持在20-40%,流葡萄糖浓溶液维持残糖浓度为10~15g/L;接种12h后0.2mM IPTG诱导质粒表达,约40h发酵结束后,发酵产量如表5所示。
表5
由表5可看出,过表达sRNAs329的菌株IBEIQ-329相比于对照菌株IBEIQ的L-异亮氨酸产量提高了约22.7%,副酸降低了28.6%,相反地,菌株IBEIQ-bn产酸和副酸相对于原始的出发菌株IBEIQ和对照菌株IBEIQ-p都明显降低,说明非编码sRNA在代谢产酸的调控过程中带来的影响与其序列相关。
种子培养基:葡萄糖12g/L,蛋白胨5g/L,酵母粉3g/L,磷酸二氢钾2g/L,硫酸镁1g/L,硫酸亚铁0.01g/L,硫酸锰0.01g/L,pH7.0,121℃灭菌15min。
发酵培养基:葡萄糖25g/L,蔗糖20g/L,磷酸二氢钾3g/L,蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,硫酸铵20g/L,硫酸亚铁0.01g/L,硫酸镁2.5g/L,硫酸锰0.01g/L,pH 7.0,121℃灭菌15min。
补料培养基:葡萄糖500g/L。
实施例5 L-缬氨酸生产菌株表达sRNAs32对产酸的影响
在L-缬氨酸生产菌IBEVQ中表达实施例2中的非编码sRNA s32,得到菌株IBEVQ-pET30a-s326,记为IBEVQ-326。在该生产菌中分别表达空载pET30a,记为IBEVQ-p;表达pET30a-sRNA-bn,记为IBEVQ-bn。
其中,出发菌株IBEVQ是在大肠杆菌W3110的基因组中进行了一系列改造而得,具体为:敲除fecE基因,表达谷氨酸棒杆菌来源的brnFE基因,敲除lacI基因,将ilvC、ilvDE的天然启动子替换为强启动子PJ23119,在yeeL位点用强启动子PJ23119过表达PdhR因子,将brnQ替换为RpoS基因,在trpR基因位点表达用强启动子PJ23119过表达edd-eda基因。
将IBEVQ、IBEVQ-p、IBEVQ-bn和IBEVQ-326分别接种到含有100mL种子培养基的500mL摇瓶中,并在37℃、220rpm的条件下培养12-16h,OD600值为11-13时,以体积比12%的接种量接入3L发酵罐培养基中,维持温度在37℃±0.5℃,发酵过程中通过流加氨水控制pH6.8±0.2,0-24h通过调节转速和风量,控制溶解氧不低于20%。24-48h,隔绝空气厌氧发酵。接种8-10h后0.2mMIPTG诱导质粒表达。初糖耗尽之后,通过蠕动泵加入补料培养基,使得发酵过程中控制残糖浓度在3g/L附近波动。约48h发酵结束后,L-缬氨酸产量、转化率以及杂酸含量如表6所示。
表6
由表6可看出,过表达sRNAs32的菌株IBEVQ-326相比于对照菌株IBEVQL-缬氨酸产量提高了23.1%,糖酸转化率提高了11.4%,总杂酸下降了38.6%,而菌株IBEVQ-bn产酸和副酸相对于原始的出发菌株IBEVQ和空载对照都有所降低,说明非编码sRNA在代谢产酸的调控过程中带来的影响与其序列相关。
种子培养基:
5g/L蛋白胨,10g/L酵母提取物,1.2g/LKH2PO4,0.5g/L硫酸镁,10mg/L硫酸亚铁;10mg/L硫酸锰,1mg/L维生素B1,0.2mg/L维生素H,90g/L葡萄糖,植物油20mL/L。
发酵培养基:
2g/L酵母提取物,2g/L柠檬酸,7g/LKH2PO4,3g/L(NH4)2SO4,10mg/L硫酸锰,30mg/L硫酸亚铁,1mg/L硫酸镁,0.5mg/L维生素B1,1mg/L维生素H,0.5mg/L维生素B3,0.5mg/L维生素B6,0.5mg/L维生素B12,30mL/L植物油,10g/L葡萄糖。
补料培养基:600g/L葡萄糖。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (10)
1.提高大肠杆菌中支链氨基酸产量的非编码sRNA,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的所示;
或,与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与提高支链氨基酸产量相关的其他非编码sRNA的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的非编码sRNA基因的载体。
3.表达权利要求1所述非编码sRNA基因的重组菌。
4.根据权利要求3所述的重组菌,其特征在于,重组菌的菌体选自大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的重组菌,其特征在于,所述的大肠杆菌选自所述的大肠杆菌包括突变菌株IBELQ,突变菌株IBEIQ,突变菌株IBEVQ,大肠杆菌W3110,大肠埃希菌Nissle1917,大肠杆菌BL21,大肠杆菌HB101,大肠杆菌JM109,大肠杆菌DH10B或大肠杆菌MG1655中的一种或几种的混合。
6.如权利要求1所述的非编码sRNA的基因、权利要求2所述的载体、权利要求3所述的重组菌在发酵氨基酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的应用包括:在提高氨基酸生产效率,优化氨基酸组成比例以及降低副产物中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述氨基酸选自L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸中的一种。
9.如权利要求6所述的应用,还包括在食品工业、医药、日化或饲料添加剂等领域中的应用。
10.如权利要求6所述的应用,还包括在制备用于增强人体营养吸收、促进肌肉生长的氨基酸补充剂中的应用。
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