CN112029790A - 一种可合成2’-fl载体及其应用 - Google Patents

一种可合成2’-fl载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种2’‑FL载体及其制备方法和谷氨酸棒状杆菌上的应用。本发明构建了一个包含完整合成2’‑FL所需基因的载体，并对这些基因进行过表达设计；通过上述构建的载体可进行基因编辑，将所需基因整合到其它菌株中，包括谷氨酸棒状杆菌。本发明整合了一个可完整合成2’‑FL的载体。通过对上述载体上的基因进行整合，可较为简单地使其它菌株生产2’‑FL，为研发2’‑FL工业菌株提供了很大的便利。构建了合成2’‑FL的谷氨酸棒状杆菌Cory13032‑01，相比于大多数研究的大肠杆菌，安全性更高。本发明生产菌选择其中一种谷氨酸棒状杆菌是全球用于氨基酸发酵工业的主要生产菌，被广泛应用于食品、医药、化妆品以及饲料等领域。比此前2’‑FL合成所使用的大肠杆菌，实际应用方面的安全性更高。

Description

一种可合成2’-FL载体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及2’-FL合成。
背景技术
人乳寡糖(Human milk oligosaccharides，HMOs)是一类存在于母乳中的天然低聚糖，是公认的在营养学和生物医学应用领域具有很高潜力的天然分子。近年来，HMOs一直是国际生物技术领域备受关注的方向，合成这类功能性寡糖的研究显著增多，这归因于其在人体中所具有的多种生物学作用的不断揭示，其生理功能包括维护肠道的微生态平衡、抵御病原菌感染、调节免疫抑制炎症反应、促进大脑发育等。人母乳中最高可达22-23g/L，远高于其它哺乳动物但在婴儿出生后个月的时间内，其浓度将会稳定下降，在成熟乳中的含量将降至约12-13g/L。
目前，被批准用于婴幼儿配方食品中的人乳寡糖有两种：2-岩藻糖基乳糖(2’-FL)和乳糖-N-新四糖(Lacto-N-neotetraose)。其中2-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是HMO的主要成分之一，也是目前在国外被批准生产用于食品添加剂的成分之一。
目前对于人乳寡糖的合成方法主要分为化学合成法和生物合成法。生物合成法分为酶合成法和细胞发酵合成法。其中酶合成法的成本较高，且需要进行多种酶的纯化，导致工业化大规模生产的成本过高。生物合成的方法已成为HMO合成的最可能实现工业化生产的方法。
就已知的合成途径来说，对于2’-FL的生物合成途径，岩藻糖基转移酶的活性及其底物GDP-L-岩藻糖的量是关键所在。研究显示大肠杆菌能够内源合成GDP-L-岩藻糖。而GDP-L-岩藻糖生产的两个途径：从以葡萄糖为底物的从头合成途径，以及以L-岩藻糖为底物的补救合成途径。
同时，大多2’-FL的生物合成研究基于大肠杆菌，很少有研究现有工艺更成熟、应用更安全的食品相关菌株，使其完成2’-FL的合成任务。目前已有的基因编辑技术完全有可能将其他有益菌株改造拥有相应功能的工业菌。
CRISPR/Cas9是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA(guide RNA，gRNA)和Cas9蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA，被精确剪切。但是，CRISPR/Cas9的应用也有一些限制条件。首先，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(NGG)。其次，向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(向导RNA1，向导RNA2)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒(供体DNA分子)，这样细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。这样就可以实现基因的替换或者突变。
通过Gibson组装构建载体质粒是目前最常用的新兴克隆方案之一。在Gibson组装之前，需要对待克隆的DNA片段(包括载体)进行PCR扩增，添加15bp到30bp的短重叠序列。这些序列可以保证DNA片段按正确的顺序进行拼接。然后就可以将这些片段直接添入到50℃的克隆反应，DNA外切酶先从5’端降解核苷酸产生粘性末端，然后相邻片段之间的重叠序列退火，最后DNA聚合酶和DNA连接酶将序列填充，形成完整的双链DNA分子，实现无痕拼接。
2’-FL的从头合成途径，β-D-甘露糖-1-磷酸是由果糖-6-磷酸经过甘露糖-6-磷酸异构酶(Man A)和磷酸甘露糖突变酶(Man B)加工形成。甘露糖1磷酸鸟苷基转移酶(Man C)催化从GTP到α-D-甘露糖1磷酸的核苷酸转移产生了GDP甘露糖，然后将其分别由GDP-甘露糖6-脱氢酶(Gmd)和NADPH依赖性GDP-L-岩藻糖合酶(wcaG)催化分成两部转化为GDP-L-岩藻糖。在自然条件下，此路径合成的GDP-L-岩藻糖量较低，直接影响最终2’-FL的产量。另外GDP-L-岩藻糖也需要岩藻糖转移酶(Fucosyltransferase,FUT)才可生成最终的2’-FL。
在GDP-L-岩藻糖补救合成的途径中，通过岩藻糖1-激酶和岩藻糖-1-P鸟苷基转移酶的连续作用，将胞质L-岩藻糖转化为GDP-L-岩藻糖。但是此途径需要的L-岩藻糖相比于成本更低的葡萄糖，较不利于工业大规模生产，因此从头合成途径更适用于工业菌株的开发。
目前常用的方法是用质粒载体对以上所提到相关的基因进行补充表达和过表达，但研究较多的本底菌株是大肠杆菌，但是大肠杆菌本身会生产如内毒素等较难纯化的副产物。此外有文献通过构建包含上述基因的载体导入到谷氨酸棒状杆菌等常见发酵菌生产2’-FL，但也存在一定缺陷：一是通过载体生产2’-FL必须保证载体在细胞内不被丢失，往往需要加入抗生素来保持细菌内的载体，不利于最终产品的的纯化；二是通过质粒载体表达产量远没有细菌基因组本身表达稳定。
发明内容
本发明将2’-FL合成途径中相关的完整基因构建到一个的载体中，以此载体为基础使用基因编辑技术将可合成2’-FL的基因整合到发酵工艺成熟的谷氨酸棒状杆菌中，过表达相关基因使得2’-FL大量生物合成。本发明中涉及序列皆为5’至3’方向。
本发明构建包含目的基因的载体，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将目的基因整合到适用于食品发酵的菌株基因组上，然后诱导消除导入的载体质粒，最终使细菌通过自身基因组生产2’-FL。这样既可以选择合适的有益菌株生产2’-FL，又通过基因组整合使得产量更加稳定，同时也避免引入依靠质粒表达而加入的抗生素。
本发明构建了一个包含完整合成2’-FL所需基因的载体，并对这些基因进行过表达设计；通过上述构建的载体可进行基因编辑，将所需基因整合到其它菌株中，包括谷氨酸棒状杆菌。
本发明提供了一种可合成2’-FL的载体的制备方法，该方法包含如下步骤：
步骤(1)获取futc基因：所述futc基因表达α-1,2-岩藻糖基转移酶，来源于幽门螺杆菌；步骤(2)获取manA、manB、manC、gmd-wcaG基因，以上4个基因序列皆来源于JM109菌株基因组；
步骤(3)连接所述manA、manB、manC、gmd-wcaG基因和futc基因片段得manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc片段；
步骤(4)选定目标基因的插入位点，从谷氨酸棒状杆菌基因组(ATCC 13032，序列来源于NCBI)上确定相应的PAM序列(NGG)；扩增同源模板；扩增同源模板1得到HR-1；扩增同源模板2得到HR-2；构建gRNA质粒；扩增gRF1得到线性gRF1；扩增gRF2得到线性gRF2；分别扩增后得到线性质粒后将线性质粒连成环状；
步骤(5)构建含目的基因片段的gRT质粒：将两个gRF质粒上的gRNA合并到一个质粒，同时插入所要替换的manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc片段。
进一步的本发明可合成2’-FL的载体的制备方法中将步骤(5)中产物转化至DH5α感受态细胞中以壮观霉素筛选,挑选单克隆进行PCR鉴定，以MOD-GRNA2-F/MANA-R为鉴定引物，从鉴定出的菌株中提取可合成2’-FL的载体质粒命名为gRT。
进一步的本发明可合成2’-FL的载体的制备方法，步骤(1)中获取futc基因设计以下引物来对该基因进行扩增：
下游引物SEQ ID No.1：FUTC-F
上游引物SEQ ID No.2：FUTC-R
进一步的本发明可合成2’-FL的载体的制备方法，步骤(2)获取manA、manB、manC、gmd-wcaG基因中：
扩增manA引物序列为
上游引物SEQ ID No.3：MANA-F
下游引物SEQ ID No.4：MANA-R
扩增manB引物序列为
上游引物SEQ ID No.5：MANB-F
下游引物SEQ ID No.6：MANB-R
扩增manC引物序列为
上游引物SEQ ID No.7：MANC-F
下游引物SEQ ID No.8：MANC-R
扩增gmd-wcaG引物序列为
上游引物SEQ ID No.9：GMD-WCAG-F
下游引物SEQ ID No.10：GMD-WCAG-R。
进一步的本发明可合成2’-FL的载体的制备方法中步骤(4)所述扩增同源模板中序列1如SEQ ID No.11序列2如SEQ ID No.12；
扩增同源模板1
上游引物SEQ ID No.13：HR-L-F
下游引物SEQ ID No.14：HR-L-R
扩增同源模板2
上游引物SEQ ID No.15：HR-R-F
下游引物SEQ ID No.16：HR-R-R
扩增gRF1
上游引物SEQ ID No.17：GRF1-F
下游引物SEQ ID No.18：GRF1-R
扩增gRF2
上游引物SEQ ID No.19：GRF2-F
下游引物SEQ ID No.20：GRF2-R
进一步的本发明合成2’-FL的载体的制备方法中步骤(5)构建含目的基因片段的gRT质粒还包含如下步骤：
扩增gRF2质粒上的gRNA部分
上游引物SEQ ID No.21：MOD-GRNA2-F
下游引物SEQ ID No.22：MOD-GRNA2-R
扩增用于Gibson组装的GRF1质粒
上游引物SEQ ID No.23：GIB-GRF1-F
下游引物SEQ ID No.24：GIB-GRF1-R；
Gibson Assembly Master Mix连接。
本发明还提供了一种可合成2’-FL的载体，该合成2’-FL的载体为质粒，该载体包含上述合成2’-FL的载体的制备方法中manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc片段序列。
进一步的本发明合成2’-FL的载体，该合成2’-FL的载体使用上述合成2’-FL的载体的制备方法中的任意一种方法制备。
上述可合成2’-FL的载体的应用，上述合成2’-FL的载体应用于细菌，通过基因编辑将所述载体包含的manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc基因序列整合到细菌基因组，制备可合成2’-FL的菌株。即可制备出合成2’-FL的菌株作为生产菌，构建成功的菌株基因组含有manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc序列。
进一步的上述可合成2’-FL的载体的应用，上述细菌一种选择为谷氨酸棒状杆菌，导入含有manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc片段序列的载体，即含有gRT的谷氨酸棒状杆菌。
上述可合成2’-FL的载体的应用，通过基因编辑将所述载体包含的manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc基因序列整合到细菌基因组，制备可合成2’-FL的菌株。
进一步的上述可合成2’-FL的载体的应用中所用的细菌为谷氨酸棒状杆菌。
本发明至少具有如下效果
1、本发明整合了一个可完整合成2’-FL的载体。
2、通过基因编辑技术对上述载体上目的基因进行整合，可较为简单地使其它菌株生产2’-FL，为研发2’-FL工业菌株提供了很大的便利。
3、经过基因编辑使细菌(一种选择为谷氨酸棒状杆菌)基因组含有manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc序列，可合成2’-FL。
本发明构建完成的菌株不需要加入抗生素和诱导剂。加入的抗生素在生产下游过程中需要额外的步骤纯化处理，也增加了生产成本。本发明构建载体目的在于整合目标基因到细菌基因组上，以细菌基因组来生产2’-FL，而不依赖导入载体。
附图说明
图1为本发明一实施例中Gibson组装后菌落PCR鉴定照片；
图2为本发明一实施例中构建成功的gRT质粒图谱；
图3为本发明一实施例中基因整合PCR鉴定。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照设备、试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.获取futc基因：futc基因表达α-1,2-岩藻糖基转移酶，来源于幽门螺杆菌，通过NCBI数据库提供的基因序列委托通用生物系统(安徽)有限公司合成。再设计以下引物来对该基因进行扩增：
下游引物SEQ ID No.1：FUTC-F
CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGCTGCAGACTAGTCTTAAGCGTTATACTTTTGGG
上游引物SEQ ID No.2：FUTC-R
ATGGCTTTTAAGGTGGTGCA
本发明中PCR所选用的试剂为TaKaRa公司的PrimeSTAR Max Premix，根据试剂说明书设置反应体系。扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸反应10s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。
2.获取manA、manB、manC、gmd-wcaG基因，以上基因序列皆来源于JM109菌株基因组。
2.1扩增manA
上游引物SEQ ID No.3：MANA-F
ATGCAAAAACTCATTAACTCAG
下游引物SEQ ID No.4：MANA-R
CAGGTTAATTTTTTCATCTAGTACTTTCCTGTGTGACTCTAGATTACAGCTTGTTGTAAACAC
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸反应10s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。
2.2扩增manB
上游引物SEQ ID No.5：MANB-F
ATGAAAAAATTAACCTGCTTTAAA
下游引物SEQ ID No.6：MANB-R
AGTTTCGACTGCGCCATCTAGTATTTCTCCTCTTTAATCTCTAGATTACTCGTTCAGCAACGTCA
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，53℃退火15s，72℃延伸反应10s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。
2.3扩增manC
上游引物SEQ ID No.7：MANC-F
ATGGCGCAGTCGAAACTCTA
下游引物SEQ ID No.8：MANC-R
AGAGCGACTTTTGACATCTAGTATTTCTCCTCTTTAATCTCTAGATTACACCCGTCCGTAGCGAT
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，57℃退火5s，72℃延伸反应10s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。
扩增gmd-wcaG
上游引物SEQ ID No.9：GMD-WCAG-F
ATGTCAAAAGTCGCTCTCAT
下游引物SEQ ID No.10：GMD-WCAG-R
ACCACCTTAAAAGCCATCTAGTATTTCTCCTCTTTCTCTAGATTACCCCCGAAAGCGGTCTTG
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸反应12s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。
3.2.4Gibson Assembly Master Mix(NEB公司)连接manA、manB、manC、gmd-wcaG、futc片段
Gibson连接体系：
Figure BDA0002675926500000081
配制体系完成后混匀，于50℃水浴60min。之后以该连接产物作为模板，以MANA-F/GMD-FCI-R作为引物，进行PCR扩增。扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸反应40s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。回收得到片段manA-Fu大小为7203bp，即为manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc全长。
3.3选定合适目标基因的插入位点，从谷氨酸棒状杆菌基因组(ATCC 13032，序列来源于NCBI)上确定相应的PAM序列(NGG)，然后扩增同源模板
序列1SEQ ID No.11：CCG GTGGGAATGTCACCTCGTTA
序列2SEQ ID No.12：CCC TCACACGGCATCCCAACAAG
3.3.1扩增同源模板1
上游引物SEQ ID No.13：HR-L-F
GTCGGTGCTTTTTTTGACTGCATCGTGCAGAAAACGG
下游引物SEQ ID No.14：HR-L-R
GTCGTATTAATTTCGCGATGGTTGCGATGAAATACAACGTCG
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸反应10s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。回收得到HR-1。
3.3.2扩增同源模板2
上游引物SEQ ID No.15：HR-R-F
TCTTGAGGGGTTTTTTGCTAGCCTTCGGCGCGGAGGA
下游引物SEQ ID No.16：HR-R-R
GGGTAATAGATCTAAGCCGTTGTCGCAGGTGGCTTCG
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸反应10s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。回收得到HR-2。
构建gRNA质粒：通过将原本的pTargetF质粒sgRNA前面的20个碱基序列替换成所需要的PAM序列(NGG)前20个碱基序列，需要设计引物进行PCR，最后用的Gibson AssemblyMaster Mix试剂进行环状连接。
3.3.3扩增gRF 1
上游引物SEQ ID No.17：GRF1-F
GGAATGTCACCTCGTTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
下游引物SEQ ID No.18：GRF1-R
TAACGAGGTGACATTCCCACACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCT
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸反应15s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。回收得到线性GRF1。
扩增gRF 2
上游引物SEQ ID No.19：GRF2-F
CACGGCATCCCAACAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTA
下游引物SEQ ID No.20：GRF2-R
CTTGTTGGGATGCCGTGTGAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCT
扩增条件为SEQ ID No.20：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸反应15s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。回收得到线性gRF2。
分别扩增得到线性质粒gRF后，将PCR产物用Dpn I酶(TaKaRa公司)37℃消化1小时后除去模板，再纯化回收PCR产物。最后用Gibson Assembly Master Mix试剂将线性质粒连成环状，转化后涂板，挑选单克隆测序验证即可。
3.4构建含目的基因片段的gRT质粒：将两个gRF质粒上的gRNA合并到一个质粒，同时插入所要替换的manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc(即manA-Fu)片段。
3.4.1扩增gRF2质粒上的promoter-gRNA部分
上游引物SEQ ID No.21：MOD-GRNA2-F
CTCTAGAGTCGACCTGCTCACACCGCATATGCTGGAT
下游引物SEQ ID No.22：MOD-GRNA2-R
TCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸反应5s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。回收得到MOD-gRNA2。
3.4.2扩增用于Gibson组装的gRF1质粒
上游引物SEQ ID No.23：GIB-GRF1-F
GCTTAGATCTATTACCCTGTTATCCC
下游引物SEQ ID No.24：GIB-GRF1-R
GCAGGTCGACTCTAGAGAAT
扩增条件为：98℃预变性2min后开始以下循环：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸反应15s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。回收得到GIB-GRF1。
3.4.3Gibson Assembly Master Mix连接
Figure BDA0002675926500000101
配制体系完成后混匀，于50℃水浴60min。连接完成后将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，以壮观霉素筛选,挑选单克隆进行PCR鉴定，以MOD-GRNA2-F/MANA-R为鉴定引物，连接成功则有2456bp的条带。扩增条件为：98℃预变性3min后开始以下循环：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸反应15s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。挑选1-6号单克隆的电泳结果如图1。选择其中6号菌株，并提取质粒，命名为gRT，图谱见图2。
3.5制备谷氨酸棒状杆菌电转感受态细胞，电转入pCas质粒后于卡那霉素抗性培养基培养。之后再电转入gRT质粒，涂卡那霉素与壮观霉素双抗性板后30℃培养过夜。之后挑选单克隆进行PCR鉴定，鉴定阳性的菌株为成功替换菌株。引物扩增序列来源于谷氨酸棒状杆菌被替换的部分，因此替换成功的单菌落无PCR产物，未替换成功则有322bp的条带。
上游鉴定引物SEQ ID No.25：JD-F
GTATGACCAGGTGAAGAGCC
下游鉴定引物SEQ ID No.26：JD-R
GAAGAGAAGAGATTCATCGATC
扩增条件为：98℃预变性3min后开始以下循环：98℃变性10s，52℃退火15s，72℃延伸反应5s，进行30个循环，最后72℃反应5min，4℃保温。结果见图3。
图3基因整合PCR鉴定
3.6将鉴定正确的含有pCas和gRT的克隆接种于含有卡那霉素(50μg/mL)和IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，0.5mmol/L)的2mL液体LB培养基中，培养8到16h后涂布到含有卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂上。然后以克隆对壮观霉素(50μg/mL)的敏感性确认gRT已经被消除。将克隆在43℃培养过夜以消除pCas质粒。将获得菌株Cory13032-01，保存备用。
3.7谷氨酸棒状杆菌Cory13032-01的发酵并鉴定2’-FL
3.7.1配置200ml谷氨酸棒状杆菌发酵液灭菌待用；
3.7.2预培养
将Cory13032-01菌株接种于100ml发酵液中，30℃，220rpm摇瓶培养16小时；
3.7.3正式发酵
将预培养的菌体称重，按照3.6g/L的细胞干重接种与200ml发酵液中，25℃300rpm摇瓶发酵72小时；
将发酵液离心后收取培养上清，过无菌滤膜后取样，送质谱分析，检测到菌株成功合成产物2’-FL。
谷氨酸棒状杆菌是全球用于氨基酸发酵工业的主要生产菌，被广泛应用于食品、医药、化妆品以及饲料等领域。相比于此前研究2’-FL合成所使用的大肠杆菌，实际应用方面的安全性更高。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
<110> 苏州一兮生物科技有限公司
<120> 一种可合成2’-FL载体及其应用
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctagct gcagactagt 60
cttaagcgtt atacttttgg g 81
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggctttta aggtggtgca 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgcaaaaac tcattaactc ag 22
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caggttaatt ttttcatcta gtactttcct gtgtgactct agattacagc ttgttgtaaa 60
cac 63
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgaaaaaat taacctgctt taaa 24
<210> 6
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agtttcgact gcgccatcta gtatttctcc tctttaatct ctagattact cgttcagcaa 60
cgtca 65
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
atggcgcagt cgaaactcta 20
<210> 8
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
agagcgactt ttgacatcta gtatttctcc tctttaatct ctagattaca cccgtccgta 60
gcgat 65
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atgtcaaaag tcgctctcat 20
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
accaccttaa aagccatcta gtatttctcc tctttctcta gattaccccc gaaagcggtc 60
ttg 63
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ccggtgggaa tgtcacctcg tta 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ccctcacacg gcatcccaac aag 23
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gtcggtgctt tttttgactg catcgtgcag aaaacgg 37
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
gtcgtattaa tttcgcgatg gttgcgatga aatacaacgt cg 42
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tcttgagggg ttttttgcta gccttcggcg cggagga 37
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gggtaataga tctaagccgt tgtcgcaggt ggcttcg 37
<210> 17
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ggaatgtcac ctcgttagtt ttagagctag aaatagcaag tta 43
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
taacgaggtg acattcccac actagtatta tacctaggac tgagctagct 50
<210> 19
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
cacggcatcc caacaaggtt ttagagctag aaatagcaag tta 43
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
cttgttggga tgccgtgtga actagtatta tacctaggac tgagctagct 50
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
ctctagagtc gacctgctca caccgcatat gctggat 37
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
tcaaaaaaag caccgactcg gtgccactt 29
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gcttagatct attaccctgt tatccc 26
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
gcaggtcgac tctagagaat 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gtatgaccag gtgaagagcc 20
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
gaagagaaga gattcatcga tc 22

Claims (10)

1.可合成2’-FL的载体的制备方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
步骤(1)获取futc基因：所述futc基因表达α-1,2-岩藻糖基转移酶，来源于幽门螺杆菌；步骤(2)获取manA、manB、manC、gmd-wcaG基因，以上4个基因序列皆来源于JM109菌株基因组；
步骤(3)连接所述manA、manB、manC、gmd-wcaG基因和futc基因片段得manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc片段；
步骤(4)选定目标基因的插入位点，从谷氨酸棒状杆菌基因组(ATCC 13032，序列来源于NCBI)上确定相应的PAM序列(NGG)；扩增同源模板；扩增同源模板1得到HR-1；扩增同源模板2得到HR-2；构建gRNA质粒；扩增gRF1得到线性gRF1；扩增gRF2得到线性gRF2；分别扩增后得到线性质粒后将线性质粒连成环状；
步骤(5)构建含目的基因片段的gRT质粒：将两个gRF质粒上的gRNA合并到一个质粒，同时插入所要替换的manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc片段。
2.根据权利要求1所述可合成2’-FL的载体的制备方法，其特征在于，将所述步骤(5)中产物转化至DH5α感受态细胞中以壮观霉素筛选,挑选单克隆进行PCR鉴定，以MOD-GRNA2-F/MANA-R为鉴定引物，从鉴定出的菌株中提取可合成2’-FL的载体质粒命名为gRT。
3.根据权利要求1所述可合成2’-FL的载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中获取futc基因设计以下引物来对该基因进行扩增：
下游引物SEQ ID No.1：FUTC-F
上游引物SEQ ID No.2：FUTC-R。
4.根据权利要求1所述可合成2’-FL的载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)获取manA、manB、manC、gmd-wcaG基因中：
扩增manA引物序列为
上游引物SEQ ID No.3：MANA-F
下游引物SEQ ID No.4：MANA-R
扩增manB引物序列为
上游引物SEQ ID No.5：MANB-F
下游引物SEQ ID No.6：MANB-R
扩增manC引物序列为
上游引物SEQ ID No.7：MANC-F
下游引物SEQ ID No.8：MANC-R
扩增gmd-wcaG引物序列为
上游引物SEQ ID No.9：GMD-WCAG-F
下游引物SEQ ID No.10：GMD-WCAG-R。
5.根据权利要求1所述可合成2’-FL的载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)
所述扩增同源模板中序列1如SEQ ID No.11序列2如SEQ ID No.12；
所述扩增同源模板1
上游引物SEQ ID No.13：HR-L-F
下游引物SEQ ID No.14：HR-L-R
所述扩增同源模板2
上游引物SEQ ID No.15：HR-R-F
下游引物SEQ ID No.16：HR-R-R
所述扩增gRF1
上游引物SEQ ID No.17：gRF1-F
下游引物SEQ ID No.18：gRF1-R
所述扩增gRF2
上游引物SEQ ID No.19：gRF2-F
下游引物SEQ ID No.20：gRF2-R 。
6.根据权利要求1所述可合成2’-FL的载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)构建含目的基因片段的gRT质粒还包含如下步骤：
扩增gRF2质粒上的gRNA部分
上游引物SEQ ID No.21：MOD-GRNA2-F
下游引物SEQ ID No.22：MOD-GRNA2-R
扩增用于Gibson组装的gRF1质粒
上游引物SEQ ID No.23：GIB-GRF1-F
下游引物SEQ ID No.24：GIB-GRF1-R；
Gibson Assembly Master Mix连接。
7.一种可合成2’-FL的载体，其特征在于，所述可合成2’-FL的载体为质粒，所述载体包含权利要求1所述manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc片段序列。
8.根据权利要求7所述的可合成2’-FL的载体，其特征在于，所述可合成2’-FL的载体使用权利要求1至6中任意一种方法制备。
9.权利要求7或8任意一种可合成2’-FL的载体的应用，其特征在于，通过基因编辑将所述载体包含的manA-manB-manC-gmd-wcaG-futc基因序列整合到细菌基因组，制备可合成2’-FL的菌株。
10.权利要求9一种可合成2’-FL的载体的应用，其特征在于，所述细菌为谷氨酸棒状杆菌。
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