CN106701810A - 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，其具有较高的基因编辑效率。谷氨酸棒状杆菌中待编辑的目的基因具有5′‑（N₂₀）‑NGG‑3′结构，N为A、T、C或G，该基因编辑系统包括cas9表达载体和sgRNA表达载体；cas9表达载体包括cas9序列和SD序列，cas9序列如SEQ ID No.1所示，SD序列如SEQ ID No.2所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前；sgRNA表达载体的包含sgRNA序列和同源修复序列，sgRNA序列为crRNA与trancrRNA 连接形成的复合体序列，trancrRNA序列如SEQ ID No.3所示，crRNA序列为20bp的引导序列、与目的基因的N₂₀序列相同。

Description

一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统及其应用

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，具体涉及一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统及其应用。

背景技术

基因编辑技术出现自20世纪90年代，指外源DNA与受体细胞基因组通过重组方式对受体细胞基因组目标基因进行突变，从而产生目的突变株。基因编辑需要依赖于包括同源重组、特异位点重组和转座重组等DNA重组系统。

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/Cas系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统，通过RNA介导，特异性的切割外源遗传物质，用以对抗入侵的病毒和质粒。随着近两年的发展，该技术已经发展成为一套精确的打靶系统，通过CRISPR/Cas9 介导的打靶系统可以试验快速高效的基因敲除、基因敲入、基因沉默。目前该技术已成功应用到大肠杆菌、斑马鱼、拟南芥、酿酒酵母等物种中。

CRISPR/Cas 系统发挥基因编辑的作用是建立在由CRISPR 转录来的trancrRNA与crRNA 形成一个tracrRNA-crRNA 复合体，接着该复合体与Cas9 蛋白结合，并在crRNA的引导下识别靶位点；而对目的片段的切割是由crRNA 上长度为20 bp 的向导序列(Guiding sequence)与目的DNA上的特定序列互补来引导Cas9 蛋白对目的基因的切割；除此之外，在所识别的目的DNA 上还必须有一个3′碱基(NGG)组成的PAM (protospaceradjacent motif)区域，识别区域紧跟PAM 的5′端。

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium. glutamicum）是一种革兰氏阳性细菌，其DNA含有大约56%的GC。该菌在过去的50多年里被广泛用于氨基酸的生产，比如谷氨酸、赖氨酸等，还被用于食品工业、动物饲料和医药产品的生产。普遍认为C. glutamicum无致病性，不产生内毒素，因而是一种安全的医药蛋白表达宿主。

用于工业生产的谷氨酸棒状杆菌菌株主要通过传统诱变获得。随着，C.giutamicum ATCC 13032和C. giutamicum ATCC 14067全基因组的测序，通过基因工程手段定向改造谷氨酸棒状杆菌生产氨基酸越来越受到重视。

目前，只有pKl8mobsacB/pKl9mobsacB等少数几个用于谷氨酸棒状杆菌基因编辑的载体，但上述载体的基因编辑效率低下。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，其具有较高的基因编辑效率。

一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，所述谷氨酸棒状杆菌中待编辑的目的基因具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构，N为A、T、C或G，其特征在于：

所述基因编辑系统包括cas9表达载体和sgRNA表达载体；

所述cas9表达载体包括cas9序列和SD序列，所述cas9序列如SEQ ID No.1所示，所述SD序列如SEQ ID No.2所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前；

所述sgRNA表达载体的包含sgRNA序列和同源修复序列，所述sgRNA序列为crRNA与trancrRNA 连接形成的复合体序列，所述trancrRNA序列如SEQ ID No.3所示，所述crRNA序列为20bp的引导序列、与目的基因的N₂₀序列相同。

进一步的，所述cas9表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步的，所述cas9表达载体由以下方法制备得到：a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列，并在复合体序列的两端引入HindⅢ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列；b、将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接，得到所述cas9表达载体。

进一步的，所述同源修复序列由目的基因上游序列、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游序列依次连接形成，所述目的基因上游序列、目的基因下游序列长度为300bp~1500bp。

更进一步的，当所述目的基因编辑为敲除时，所述同源修复序列由目的基因上游序列和目的基因下游序列连接形成。

进一步的，所述sgRNA表达载体由以下方法制备得到：a、合成sgRNA序列，并在sgRNA两端引入EcoRⅠ酶切识别序列、XbaⅠ酶切识别序列；b、将带有酶切识别序列的sgRNA序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接，得到pFST-1载体；c、合成同源修复序列，并在同源修复序列两端引入BglⅡ酶切识别序列或者同源重组位点；d、将带有酶切识别序列的同源修复序列以及pFST-1载体分别酶切、纯化后进行连接或者同源重组组装，得到所述sgRNA表达载体。

上述基因编辑系统在谷氨酸棒状杆菌中的应用，所述应用包括基因敲除和基因替换。

上述应用的具体操作如下：

a、将cas9表达载体和sgRNA表达载体转化谷氨酸棒状杆菌；

b、培养、筛选，获得转化子。

本发明构建的基因编辑系统即利用crispr/cas9技术，利用人工设计的sgRNA结合cas9蛋白对基因组靶点位置切割，形成双链断裂缺口；同时提供同源修复序列，以达到基因敲除，基因插入和基因替换的目的；其中，SD序列的涉及使得cas9蛋白能够在谷氨酸棒杆菌中顺利表达。

实验证明，利用本发明构建的基因编辑系统对谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑，具有周期短，节省成本效率高等优点；并且使用该系统对谷氨酸棒状杆菌基因编辑效率能达到100%。

附图说明

图1为pXMJ19的质粒图谱。

图2为cas9表达载体的质粒图谱。

图3为pECXK-99的质粒图谱。

图4为sgRNA表达载体的质粒图谱。

图5为同源修复序列的设计示意图。

图6为porb基因敲除后基因型验证结果，其中，泳道M: marker DL10,000；泳道1-6: 敲除菌株基因型验证结果；泳道7: 阳性对照；泳道8: 阴性对照野生型菌株基因型。

具体实施方式

下述实施例或应用例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例或应用例中所用的材料、试剂，基因合成等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例或应用例中所用载体骨架pXMJ19及pECXK-99均购自Addgene。

下述实施例或应用例中所用大肠杆菌DH5α购买自TAKARA。

下述实施例或应用例中所用谷氨酸棒状杆菌C. glutamicum ATCC13032购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

下述实施例或应用例中所用连接液solution Ⅰ购买自TaKaRa公司，货号 D6020A。

下述实施例或应用例中所用Gibson Assembly Master Mix溶液购买自NEB( NewEngland Biolabs)公司，货号E2611S。

下述实施例或应用例中大肠杆菌的培养使用LB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，去离子水1L。

下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的培养使用LBB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，脑心浸液10g、去离子水1L。

实施例1：一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统

1、cas9表达载体

cas9表达载体，其制备过程如下：

a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列，并在复合体序列的两端引入HindⅢ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列，SD序列、cas9序列分别如SEQ ID No.2和SEQ IDNo.1所示。

b、将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接，得到cas9表达载体。

酶切、纯化连接体系如下：20μL反应体系中含有限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ各1μL，含有待酶切的复合体及pXMJ19载体0.8ng，pXMJ19的质粒图谱如图1所示，37℃反应30min；0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到酶切纯化后的复合体序列以及pXMJ19载体片段；纯化后的复合体序列和pXMJ19载体片段摩尔比3:1，连接液Solution I 5μL，无菌水补齐到10μL ，16℃反应1h，热击转化E.coli DH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为cas9表达载体。

2、sgRNA表达载体

sgRNA表达载体，其制备过程如下：

a、合成由crRNA序列和trancrRNA序列连接形成sgRNA序列，并在sgRNA序列两端引入EcoRⅠ、XbaⅠ酶切酶切识别序列，crRNA序列为20bp的引导序列、并与目的基因中5′-（N₂₀）-NGG-3′结构的N₂₀序列相同，trancrRNA序列如SEQ ID No.3所示。

b、将带有酶切识别序列的sgRNA序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接，得到pFST-1载体。

酶切纯化连接体系如下：20μL反应体系中含有限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ各1μL，含有待酶切的sgRNA片段及pECXK-99载体0.8ng，37℃反应30min；0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到酶切纯化后的sgRNA片段及pECXK-99载体片段；纯化后的sgRNA片段和pECXK-99载体片段摩尔比3:1，连接液Solution I 5μL，无菌水补齐到10μL ，16℃反应1h，热击转化E.coli DH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为pFST-1载体。

c、根据目的不同设计不同的同源修复序列，设计方法依据图5所示，若实现目的基因的敲除，构建由目的基因上游序列和目的基因下游序列融合连接形成的同源修复序列，目的基因上、下游序列长度为300bp~1500bp，并在同源修复序列两端引入BglⅡ酶切识别序列，其中，目的基因的原序列中具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构；将带有酶切识别序列的同源修复序列以及pFST-1载体分别酶切、纯化后进行连接，得到sgRNA表达载体，转化E.coli DH5α。

构建体系如下：根据目的基因基因组序列设计引物，分别扩增目的基因上游序列和目的基因下游序列，扩增片段长度为300bp~1500bp，两个片段的中间引物设计融合位点，可以通过融合pcr的方法融合两个片段，并在两端引物上引入BglⅡ酶切识别序列。20μL反应体系中含有限制性内切酶BglⅡ1μL，含有待酶切的同源修复序列片段及pFST-1载体0.8ng，37℃反应30min；0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到酶切纯化后的同源修复序列片段及pFST-1载体片段；纯化后的同源修复序列片段与pFST-1载体片段摩尔比3:1，连接液Solution I 5μL，无菌水补齐到10μL ，16℃反应1h，热击转化E.coli DH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为sgRNA表达载体。

d、若实现目的基因的替换，构建目的基因上游、目的基因编辑后形成的序列和目的基因下游序列连接形成的同源修复序列，目的基因上、下游序列长度为300bp~1500bp，并在同源修复序列两端引入载体pFST-1 位于BglⅡ酶切位点两端的同源序列，其中，目的基因的原序列中具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构。将同源修复序列以及pFST-1载体利用GibsonAssembly Master Mix溶液进行组装，得到sgRNA表达载体，转化E.coli DH5α。

构建体系如下：根据目的基因基因组序列设计引物，分别扩增目的基因上游片段、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游片段，目的基因上、下游片段长度为300bp~1500bp，每两个片段中间设计同源位点，可以通过Gibson Assembly Master Mix溶液进行组装，其中组装后片段两端要包含pFST-1位于 BglⅡ酶切位点两端的同源序列，以便于将片段组装到载体pFST-1上。20μL反应体系中含有限制性内切酶BglⅡ1μL，含有待酶切的pFST-1载体0.8ng，37℃反应30min；0.7%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，胶回收试剂盒纯化，即得到酶切纯化后pFST-1载体片段；纯化后的pFST-1载体片段、目的基因上游片段、目的基因编辑后形成序列、目的基因下游片段摩尔比1:3:3:3:3， Gibson Assembly Master Mix溶液 10μL，无菌水补齐到20μL ，50℃反应1h；热击转化E.coli DH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为sgRNA表达载体。

3、基因编辑

基因编辑过程如下：

a、提取cas9表达载体和sgRNA表达载体，并转化谷氨酸棒状杆菌；b、培养、筛选，获得转化子。

基因编辑具体包括基因敲除和基因替换，如图5所示，其中B为待编辑的目的基因，A、C为待编辑的目的基因两端的同源片段，D为替换后的基因。

应用例1：porb基因的敲除

一种谷氨酸棒状杆菌的porb基因敲除系统，包括cas9表达载体和sgRNA表达载体。

1、cas9表达载体

cas9表达载体的制备方法如实施例1中所示。

cas9表达载体的质粒图谱如图2所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其中9359-10678位的核苷酸序列为乳糖操作子，9359-10330位的核苷酸序列为乳糖操纵子中的lacIq基因，10514-10678位的核苷酸为乳糖操纵子中的tac启动子；11-25位核苷酸序列为促进翻译的SD序列； 26-4132位核苷酸序列cas9序列，即针对谷氨酸棒状杆菌密码子优化过的cas9编码基因；4144-4569位核苷酸序列为调控cas9基因转录的终止子rrnb ；8487-9306位核苷酸序列为氯霉素抗性基因；5044-5616位核苷酸序列为大肠杆菌复制子oriPUC；5801-8355位核苷酸序列为谷氨酸棒状杆菌复制子PBL1。

2、sgRNA表达载体

sgRNA表达载体，其制备方法如下：

a、制备pFST-1

根据谷氨酸棒状杆菌基因组序列（NCBI Reference Sequence: NC_003450.3），针对porb基因寻找5′-（N₂₀）-NGG-3′结构， porb基因正义链的靶点序列、以及针对靶点序列设计的crRNA、sgRNA序列分别如下所示：

靶点序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTCGG；

crRNA序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGT，对应序列表中SEQ ID No.5；

sgRNA序列为：

GGAGGATAGGTTTGCGAAGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT，对应序列表中SEQ ID No.6；

其中，sgRNA交由基因公司合成，同时在sgRNA序列两端引入EcoRⅠ和XbaⅠ酶切识别序列，sgRNA片段和pECXK-99分别EcoRⅠ、XbaⅠ酶切，然后纯化、连接，pECXK-99的质粒图谱如图3所示，获得pFST-1，转化E.coli DH5α。

b、制备带有酶切识别序列的同源修复序列

根据porb基因序列设计带有酶切识别序列的同源修复序列porb LR，同源修复序列porb LR由porb基因的上游同源片段porb-L、下游同源片段porb-R依次连接组成，其中porb-L、porb-R分别引入BglⅡ酶切识别序列。

上游同源片段porb-L的引物为：

porb L-F:5’GAGAGATCTGGAGTGGACAAGTCACGAT 3’；

porb L-R:5’TTGGAGGACATGCCACTGTGATGCCTGCGGTTGCT 3’。

下游同源片段porb-R的引物为：

porb R-F:5’ CACAGTGGCATGTCCTCCAACTTCTCTTCCTAAAA 3’ ；

porb R-R:5’GGCAGATCTGGGTGAACCTGTTTCTATC 3’。

分别扩增porb-L和porb-R，然后采用融合pcr的方法融合形成porb LR， porb LR长度为2068bp，融合后序列如SEQ ID No.7所示。

c、制备sgRNA表达载体

将带有酶切识别序列的同源修复序列以及pFST-1载体分别BglⅡ酶切，然后纯化、连接，得到sgRNA表达载体，转化E.coli DH5α。

sgRNA表达载体的质粒图谱如图4所示、其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，其中7777-9161位核苷酸序列为乳糖操纵子，7777-8859位核苷酸序列为乳糖操纵子中的lacIq基因，8916-9161位核苷酸序列为乳糖操纵子中的trc启动子；7-108位核苷酸序列为trancrRNA 与crRNA 形成一个tracrRNA-crRNA 复合体，即sgRNA序列；344-546位核苷酸序列为调控sgRNA转录终止的终止子T1和T2；3604-5671位核苷酸序列为同源修复模板；5705-6499位核苷酸序列为卡那霉素抗性基因；6664-7339位核苷酸序列为大肠杆菌复制子ori；1644-3107位核苷酸序列为谷氨酸棒状杆菌复制子repA。

3、porb基因的敲除具体操作流程：

a、将cas9表达载体和sgRNA表达载体质粒从E.coli中提出，各取1μg DNA共转化谷氨酸棒状杆菌感受态，电击转化条件为1800v，50ms，恢复培养后涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LBB固体培养基，30℃培养36h。

b、挑取平板上的单菌落，利用cas9基因引物；

cas9-F:5’ACAACTAATGGATAAAAAGTATTC 3’；

cas9-R:5’ TATGAATTCTTAGTCGCCACCCA 3’；

验证cas9表达载体是否正确转入；

用同源片段引物porb L-F 和porb R-R验证sgRNA表达载体质粒是否正确转入。

c、挑选正确的转化子，接种于LBB液体培养基中30℃培养到OD≈1，加入0.1mmIPTG诱导。

d、继续培养12h，将培养物划线与含有卡那霉素、氯霉素以及IPTG的固体培养基中，30℃培养24h。

e、挑取平板上的单菌落用同源片段引物porb L-F 和porb R-R pcr验证获得目的菌株，同时把扩增出来的片段进行测序验证，最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及porb基因敲除菌株，基因型验证结果如图6所示。

实验证明，利用本发明构建的crispr/cas9基因编辑系统对谷氨酸棒状杆菌基因组进行编辑，具有周期短，节省成本效率高等优点，使用该系统对谷氨酸棒状杆菌基因编辑效率能达到100%。

质粒的除去，把挑选出的敲除菌株在不加抗生素的培养基中培养，质粒cas9表达载体和sgRNA表达载体即可除去。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggataaaa agtattccat tggcctggac atcggcacca attctgtggg ttgggcagtc 60

atcaccgacg aatacaaggt cccatccaag aagttcaagg tgctcggtaa taccgatcgc 120

cactctatca agaaaaacct gatcggcgcc ctgctcttcg actccggcga aaccgcagaa 180

gcaacccgtc tcaagcgtac cgcacgtcgc cgctacaccc gccgtaagaa tcgcatctgc 240

tacctccagg aaatcttctc taatgagatg gcaaaggtgg atgactcctt tttccaccgc 300

ctcgaagagt ccttcctggt ggaagaggac aagaaacacg agcgccatcc tatcttcggc 360

aatattgtcg atgaagtcgc atatcatgaa aaatacccaa ccatttacca tctccgtaaa 420

aaactcgtcg attccaccga taaggcagat ctccgcctga tctatctggc actggcccac 480

atgatcaagt ttcgtggcca cttcctgatc gaaggtgacc tcaatccaga caattccgac 540

gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcaa acctacaacc agctctttga ggaaaaccca 600

atcaacgcat ctggcgtcga cgcaaaagcc atcctgtccg cccgtctctc caagtctcgt 660

cgcctcgaaa acctcattgc ccagctccct ggcgagaaga aaaacggtct gttcggcaat 720

ctgatcgccc tgtctctggg tctgacccca aatttcaaat ccaactttga tctcgcagaa 780

gatgccaagc tgcagctctc taaggacacc tacgatgatg acctggataa cctcctcgcc 840

cagatcggcg accagtacgc cgatctcttc ctcgcagcca agaacctctc tgacgcaatt 900

ctgctgtccg acatcctgcg cgtgaacacc gaaatcacta aggcaccact ctctgcctcc 960

atgattaagc gctacgacga gcatcatcag gatctcactc tcctcaaagc cctggtccgc 1020

cagcagctcc cagagaagta caaggaaatc tttttcgacc aatccaaaaa cggctacgca 1080

ggttacatcg atggcggcgc ctctcaggaa gagttttaca aattcattaa gccaatcctc 1140

gaaaagatgg acggcaccga ggaactgctg gtgaaactca accgtgaaga tctcctgcgc 1200

aaacagcgca ccttcgacaa cggttccatt cctcaccaga tccacctggg cgaactgcac 1260

gcaatcctcc gccgtcaaga ggacttctac ccattcctga aggacaaccg tgaaaagatc 1320

gaaaagattc tcaccttccg catcccttac tacgtgggtc ctctcgcccg tggcaattcc 1380

cgcttcgcct ggatgactcg caaatctgaa gagaccatca ccccttggaa ctttgaggaa 1440

gtcgtcgata aaggcgcctc tgcccaatcc ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500

aacctcccaa acgagaaagt gctgcctaag cattccctcc tgtacgagta ctttactgtc 1560

tacaatgagc tgactaaggt gaagtatgtc actgaaggca tgcgtaagcc agcctttctc 1620

tccggcgagc agaaaaaggc aatcgtcgac ctcctgttta aaaccaaccg caaagtgact 1680

gtgaaacagc tcaaggaaga ttactttaaa aaaatcgaat gcttcgattc tgtggaaatc 1740

tccggcgtgg aggatcgttt caacgcctcc ctgggtacct atcacgacct cctgaagatt 1800

atcaaggaca aagattttct ggataacgag gaaaacgagg acattctcga ggacattgtg 1860

ctgaccctga ccctcttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctgaa gacctatgcc 1920

cacctctttg acgacaaggt catgaagcaa ctcaagcgcc gccgctatac cggttggggc 1980

cgtctctccc gtaagctcat caatggtatc cgcgacaagc aatccggcaa gactatcctg 2040

gactttctga agtctgacgg cttcgccaac cgcaatttta tgcaactgat ccacgacgat 2100

tccctgacct tcaaagagga catccagaaa gcccaagtgt ccggtcaagg cgactccctg 2160

cacgaacaca tcgccaatct ggcaggttcc ccagcaatca agaagggcat cctgcagacc 2220

gtcaaggtgg tggacgaact cgtcaaagtg atgggtcgcc acaaaccaga aaacatcgtc 2280

atcgagatgg cccgtgagaa ccagaccacc cagaaaggcc agaaaaactc ccgtgagcgc 2340

atgaagcgca ttgaagaagg cattaaagag ctcggctctc agatcctgaa agagcatcct 2400

gtcgagaaca cccaactgca gaatgagaag ctgtatctgt attatctcca gaacggccgc 2460

gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aaccgtctct ctgattacga tgtggaccat 2520

atcgtccctc agtctttcct gaaagacgac tctattgaca acaaagtcct cacccgctcc 2580

gacaagaacc gcggcaagtc cgataacgtg ccatccgagg aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aactactggc gccagctgct caacgccaag ctgatcactc agcgcaagtt cgataacctg 2700

accaaggccg aacgtggtgg tctctccgag ctcgacaagg caggctttat caagcgccaa 2760

ctcgtggaga ctcgccaaat cactaaacac gtcgcccaga tcctcgactc ccgcatgaat 2820

accaagtacg atgaaaatga caagctcatc cgcgaagtga aagtcattac cctgaagtcc 2880

aaactggtct ctgactttcg caaggatttc cagttctaca aggtccgcga gattaataac 2940

tatcatcatg cacacgatgc atacctcaac gcagtcgtgg gtaccgcact gatcaagaag 3000

taccctaaac tggagtccga gttcgtctat ggcgactaca aggtgtacga cgtccgcaaa 3060

atgattgcca agtccgagca ggagatcggc aaagcaactg ccaaatattt cttttactcc 3120

aacatcatga acttcttcaa gaccgaaatc accctcgcca acggtgaaat ccgcaaacgt 3180

ccactcatcg agactaatgg tgaaaccggc gagatcgtct gggacaaggg ccgtgacttc 3240

gcaaccgtcc gcaaggtcct ctccatgcca caggtcaaca tcgtgaaaaa gaccgaggtg 3300

caaaccggcg gcttctccaa ggagtctatc ctgcctaaac gcaattccga taagctcatt 3360

gcacgcaaaa aggactggga ccctaaaaaa tacggcggtt tcgactcccc aactgtcgca 3420

tattctgtgc tcgtggtcgc caaagtggaa aagggcaaat ccaaaaagct caagtccgtc 3480

aaggaactcc tgggtatcac catcatggaa cgctcctcct ttgagaagaa ccctatcgat 3540

ttcctcgaag caaaaggtta caaggaggtg aagaaagatc tgatcatcaa gctccctaaa 3600

tactccctct tcgagctcga gaacggccgc aagcgtatgc tggcctccgc aggtgaactg 3660

caaaaaggta acgagctggc actcccatcc aagtatgtca actttctcta cctggcctcc 3720

cactacgaaa agctgaaagg ttccccagaa gacaacgagc agaaacagct gttcgtggag 3780

cagcacaagc actacctgga cgaaatcatc gagcagatct ccgagttctc taaacgcgtc 3840

attctggccg atgccaacct cgataaagtg ctctccgcct acaataagca tcgtgataag 3900

ccaatccgtg agcaggcaga gaacatcatt cacctgttca ctctcaccaa cctgggtgca 3960

ccagccgcct ttaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctatac ctccactaag 4020

gaggtgctcg atgcaaccct gatccaccag tctatcaccg gcctctacga gactcgcatc 4080

gatctctccc agctgggtgg cgactaa 4107

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaggaggac aacta 15

<210> 3

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt tt 82

<210> 4

<211> 10678

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aattaagctt aaaggaggac aactaatgga taaaaagtat tccattggcc tggacatcgg 60

caccaattct gtgggttggg cagtcatcac cgacgaatac aaggtcccat ccaagaagtt 120

caaggtgctc ggtaataccg atcgccactc tatcaagaaa aacctgatcg gcgccctgct 180

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cacccgccgt aagaatcgca tctgctacct ccaggaaatc ttctctaatg agatggcaaa 300

ggtggatgac tcctttttcc accgcctcga agagtccttc ctggtggaag aggacaagaa 360

acacgagcgc catcctatct tcggcaatat tgtcgatgaa gtcgcatatc atgaaaaata 420

cccaaccatt taccatctcc gtaaaaaact cgtcgattcc accgataagg cagatctccg 480

cctgatctat ctggcactgg cccacatgat caagtttcgt ggccacttcc tgatcgaagg 540

tgacctcaat ccagacaatt ccgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcaaaccta 600

caaccagctc tttgaggaaa acccaatcaa cgcatctggc gtcgacgcaa aagccatcct 660

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cactaaggca ccactctctg cctccatgat taagcgctac gacgagcatc atcaggatct 1020

cactctcctc aaagccctgg tccgccagca gctcccagag aagtacaagg aaatcttttt 1080

cgaccaatcc aaaaacggct acgcaggtta catcgatggc ggcgcctctc aggaagagtt 1140

ttacaaattc attaagccaa tcctcgaaaa gatggacggc accgaggaac tgctggtgaa 1200

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cctgaaggac aaccgtgaaa agatcgaaaa gattctcacc ttccgcatcc cttactacgt 1380

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catcacccct tggaactttg aggaagtcgt cgataaaggc gcctctgccc aatccttcat 1500

cgagcgcatg accaacttcg acaagaacct cccaaacgag aaagtgctgc ctaagcattc 1560

cctcctgtac gagtacttta ctgtctacaa tgagctgact aaggtgaagt atgtcactga 1620

aggcatgcgt aagccagcct ttctctccgg cgagcagaaa aaggcaatcg tcgacctcct 1680

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cgaggacatt ctcgaggaca ttgtgctgac cctgaccctc ttcgaggacc gcgagatgat 1920

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caacatcgtg aaaaagaccg aggtgcaaac cggcggcttc tccaaggagt ctatcctgcc 3360

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cggtttcgac tccccaactg tcgcatattc tgtgctcgtg gtcgccaaag tggaaaaggg 3480

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cgcctacaat aagcatcgtg ataagccaat ccgtgagcag gcagagaaca tcattcacct 3960

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cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc 4200

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catttgggcg gtgatctggt ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat 6060

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tatgtcatgc gcatgcgtag caaacattgt cctgcaactc attcattatg tgcagtgctc 6480

ctgttactag tcgtacatac tcatatttac ctagtctgca tgcagtgcat gcacatgcag 6540

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tggtctgctg gtgtggttaa ggccggtatg gacgcgccac tgcgtgagca cggggtcaaa 7620

cttgatcagg tgtctacctg gggtggagac gctgcgaaaa tggcaaccta cctcgctaag 7680

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<212> DNA

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<400> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggagtggaca agtcacgatc gttggaacac aacaggtttg cggcactcaa tgctgcgtca 60

tcaatttggt tggggtccgc taccccatca ccgtttgcat ccaatcccat aagtcgccac 120

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<211> 9167

<212> DNA

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<400> 8

gaattcggag gataggtttg cgaagtgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 60

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gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag 420

gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc 480

aggacgcccg ccataaactg ccaggcatca aattaagcag aaggccatcc tgacggatgg 540

cctttttgcg tttctacaaa ctctttttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 600

ccgctcatga attaattccg ctagatgacg tgcggcttcg acctcctggg cgtggcgctt 660

gttggcgcgc tcgcggctgg ctgcggcacg acacgcgtct gagcagtatt ttgcgcgccg 720

tcctcgtggg tcaggccggg gtgggatcag gccaccgcag taggcgcagc tgatgcgatc 780

ctccactact gcgcgtcctc ctggcgctgc cgagcacgca gctcgtcggc cagctcttca 840

aggtcggcca caagcgtttc taggtcgctc gcggcacttg cccagtcgcg tgatgctggc 900

gcgtctgtcg tatcgagggc gcggaaaaat ccgatcaccg tttttaaatc gacggcggca 960

tcgagtgcgt cggactccag cgcgacatcg gagagatcca ccgctgatgc ttcaggccag 1020

ttttggtact tcgtcgtgaa ggtcatgaca ccattataac gaacgttcgt taaaaattct 1080

agccccaatt ctgataattt cttccggcac tcctgcgaaa acctgcgaga cttcttgccc 1140

agaaaaaacg ccaagcgcag cggttaccgc actttttttc caggtgattt caccctgacc 1200

agcgaagcgg cactttagtg catgaggtgt gcccctggtt tcccctcttt ggagggttca 1260

acccaaaaaa gcacacaagc aaaaatgaaa atcatcatga gcaagttggt gcgaagcagc 1320

aacgcgctag ctccaaaaag gtctccagga tctcgaggag atttttgagg gggagggagt 1380

cgaggaagag ccagagcaga aggcggggaa ccgttctctg ccgacagcgt gagcccccct 1440

taaaaatcag gccggggagg aaccggggag ggatcagagc taggagcgag acaccctaaa 1500

gggggggaac cgttttctgc tgacggtgtt tcgtttatta gttttcagcc cgtggatagc 1560

ggagggtgag ggcaagtgag agccagagca aggacgggac ccctaaaggg gggaaccgtt 1620

ttctgctgac ggtgtttcgt ttattagttt tcagcccgtg gacggccgcg tttagcttcc 1680

attccaagtg cctttctgac ttgttggatg cgcctttcac tgacacctag ttcgcctgca 1740

agctcacgag tcgagggatc agcaaccgat tgagaacggg catccaggat cgcagttttg 1800

acgcgaagtt cgagcaactc gcctgtcatt tctcggcgtt tgtttgcttc cgctaatcgc 1860

tgtcgcgtct cctgcgcata cttactttct gggtcagccc atctgcgtgc attcgatgta 1920

gctgcgcccc gtcgccccat cgtcgctaga gctttccgcc ctcggctgct ctgcgtttcc 1980

acccgacgag cagggacgac tggctggcct ttagccacgt agccgcgcac acgacgcgcc 2040

atcgtcaggc gatcacgcat ggcgggaaga tccggctccc ggccgtctgc accgaccgcc 2100

tgggcaacgt tgtacgccac ttcatacgcg tcgatgatct tggcatcttt taggcgctca 2160

ccagcagctt tgagctggta tcccacggtc aacgcgtggc gaaacgcggt ctcgtcgcgc 2220

gctcgctctg gatttgtcca gagcactcgc acgccgtcga tcaggtcgcc ggacgcgtcc 2280

agggcgctcg gcaggctcgc gtccaaaatc gctagcgcct tggcttctgc ggtggcgcgt 2340

tgtgccgctt caatgcgggc gcgtccgctg gaaaagtcct gctcaatgta ctttttcggc 2400

ttctgtgatc cggtcatcgt tcgagcaatc tccattaggt cggccagccg atccacacga 2460

tcatgctggc agtgccattt ataggctgtc ggatcgtctg agacgtgcag cggccaccgg 2520

ctcagcctat gcgaaaaagc ctggtcagcg ccgaaaacac gagtcatttc ttccgtcgtt 2580

gcagccagca ggcgcatatt tgggctggtt ttacctgctg cggcatacac cgggtcaatg 2640

agccagatga gctggcattt cccgctcagc ggattcacgc cgatccaagc cggcgctttt 2700

tctaggcgtg cccatttctc taaaatcgcg tagacctgcg ggtttacgtg ctcaatcttc 2760

ccgccggcct ggtggctggg cacatcgatg tcaagcacga tcaccgcggc atgttgcgcg 2820

tgcgtcagcg caacgtactg gcaccgcgtc agcgcttttg agccagcccg gtagagcttt 2880

ggttgggttt cgccggtatc cgggttttta atccaggcgc tcgcgaaatc tcttgtcttg 2940

ctgccctgga agctttcgcg tcccaggtga gcgagcagtt cgcggcgatc ttctgccgtc 3000

cagccgcgtg agccgcagcg catagcttcg gggtgggtgt cgaacagatc ggcggacaat 3060

ttccacgcgc tagctgtgac tgtgtcctgc ggatcggcta gagtcatgtc ttgagtgctt 3120

tctcccagct gatgactggg ggttagccga cgccctgtga gttcccgctc acggggcgtt 3180

caactttttc aggtatttgt gcagcttatc gtgttttctt cgtaaatgaa cgcttaacta 3240

ccttgttaaa cgtggcaaat aggcaggatt gatggggatc tagcttcacg ctgccgcaag 3300

cactcagggc gcaagggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 3360

cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 3420

gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 3480

ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 3540

ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 3600

agaggagtgg acaagtcacg atcgttggaa cacaacaggt ttgcggcact caatgctgcg 3660

tcatcaattt ggttggggtc cgctacccca tcaccgtttg catccaatcc cataagtcgc 3720

cacgtttccg gaatgaactg catgggacct accgcgcgat catattcagt atcgccatct 3780

aattccccac catcagtgtc gggaatttcc gcaaaccccg gtgaaccatc aagtggaacg 3840

ccgatgattg gaggggttgc aactccattt tcatccaggg aactgccccc gaacattttg 3900

ccgttgtagg taccgtgacg ggtttccacc tggccgatac ctgccaaggt attccacccc 3960

agattgcagc cagaccacgc agtactcgca atgagctctg cgtttccata agccgcaatc 4020

gcttgagcgg acacaccagt atcttgagca attggttccg cccaaaaacg caaatggtcg 4080

gatgtgcgtc catctgcccc tgtatcaatt tgcggaactt ctacaccacg cgccggcgga 4140

acatcttcag ggatttgctg gagttggcga ataggtgccg ttccatccat gaagctaagc 4200

gcccatccaa caaatgagat caccatgatg acggccaaaa ccgaaccgca tccaaatccc 4260

attgcttttc taacccctga actcatgagg gtcgatgtta ccggctcgtt ttagaactct 4320

cgcattggct agaaaaacct gattacttca cgcctcttta agtaaaaaat cctgtgtctt 4380

tctaaccaaa agacccaaaa agacacgcta aatcagcctc ctatgcaatt agtagagcat 4440

tcacatacac cgtgccaaga cctaatttcc acgactgaaa cttcaccaaa tccgcaggta 4500

gaaactttga tgatctacat cacaaattta caatgtgtga tgagttgttc atataaccca 4560

aggacttgaa ccttaaaagg agccttagaa tcatgaagct ttcacaccgc atcgcagcaa 4620

tggcagcaac cgcaggcatc acagtggcat gtcctccaac ttctcttcct aaaaggttcg 4680

ggggtaaccc caaaaatcac ttaagccaca acagtcacat aaatcacttc agtaacgtac 4740

gattttggac tgttgtggct tttgccatat ttatttcatt tccatctcag tgatctctta 4800

aggaaaccca tgaagaaact acgtttcgcc accatcgcgg ccgctaccgt tgccctgact 4860

gcgagccttt ccctctcagc ttccgcacag gacttcaacc aaatcatcga caactttgat 4920

tgtggcatcc tccagaccgc tatctacacc accggtctgg ctcacgagaa ctccactcgc 4980

tcagagctcg ctgctaatct gcgcaactcc gcagctgtcg gccaactaga cttcccattg 5040

aatatcgcgg ctaccggcta ctccgagcgc atcgctaacc gcgcactgac ctgcggaatc 5100

gtgaaggaag atccacagga cttcctctcc cagctgcagc ttctgtcctc taacctatct 5160

tcttccttct tcactgctta gtttctcttg ggcttttcct tgagcccaca gccgttgctg 5220

ctcgacggtg tccacaattc cggtggagcc gtcgaacagg ttcggcgaac gagattgcat 5280

cttggctacg aaactcgccg ccacgtcaaa aatgtcgaat cgaccctgac gggcggcgat 5340

ttctgcatga aaaagcacct gcagcaaaac atcccccagt gcgcttttca tgtgctcatc 5400

atcgccacca tgaatcgctt caataaactc ctgcgattct tcttccagat acggaatcaa 5460

actctcatgg gtttgcgtgc gttcccactc gccgcggccc acggccgccc gcatgacgcc 5520

gacggcctca tgcaaagggt tgaggggcgc gtcgataagc agcgtgcttt gcggttttgc 5580

ggtgataaac caggaggcgc ttgtcgacgt cttgatcccc catttttcaa tatcaaatgg 5640

aaaatcggga tcgatagaaa caggttcacc ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt 5700

tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct 5760

attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct 5820

gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga 5880

actccaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc 5940

tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg 6000

gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc 6060

aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca 6120

tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga 6180

cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcggatgcc 6240

cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga 6300

aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca 6360

ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg 6420

cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct 6480

tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgcgg aatcatgacc aaaatccctt 6540

aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt 6600

gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag 6660

cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca 6720

gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca 6780

agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg 6840

ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg 6900

cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct 6960

acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga 7020

gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc 7080

ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg 7140

agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg 7200

cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt 7260

tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc 7320

gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc 7380

ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta 7440

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 7500

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 7560

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 7620

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagcagatc aattcgcgcg cgaaggcgaa 7680

gcggcatgca tttacgttga caccatcgaa tggtgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga 7740

tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat 7800

gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc 7860

cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct gaattacatt 7920

cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc 7980

tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat 8040

caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa 8100

gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg 8160

gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc gttatttctt 8220

gatgtctctg accagacacc catcaacagt attattttct cccatgaaga cggtacgcga 8280

ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca 8340

ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct cactcgcaat 8400

caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa 8460

accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt cccactgcga tgctggttgc caacgatcag 8520

atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc 8580

tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc gtcaaccacc 8640

atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct gcaactctct 8700

cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc 8760

accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 8820

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 8880

ttagcgcgaa ttgatctggt ttgacagctt atcatcgact gcacggtgca ccaatgcttc 8940

tggcgtcagg cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata 9000

attcgtgtcg ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa 9060

cggttctggc aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg 9120

tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gaccatg 9167

Claims (8)

1.一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，所述谷氨酸棒状杆菌中待编辑的目的基因具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构，N为A、T、C或G，其特征在于：

所述基因编辑系统包括cas9表达载体和sgRNA表达载体；

所述cas9表达载体包括cas9序列和SD序列，所述cas9序列如SEQ ID No.1所示，所述SD序列如SEQ ID No.2所示、并连接在cas9序列的始密码子ATG前；

所述sgRNA表达载体的包含sgRNA序列和同源修复序列，所述sgRNA序列为crRNA与trancrRNA 连接形成的复合体序列，所述trancrRNA序列如SEQ ID No.3所示，所述crRNA序列为20bp的引导序列、与目的基因的N₂₀序列相同。

2.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，其特征在于：所述cas9表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求2所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，其特征在于：所述cas9表达载体由以下方法制备得到：

a、合成由SD序列和cas9序列连接形成的复合体序列，并在复合体序列的两端引入HindⅢ酶切识别序列、EcoRⅠ酶切识别序列；

b、将带有酶切识别序列的复合体序列以及pXMJ19载体分别酶切、纯化后进行连接，得到所述cas9表达载体。

4.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，其特征在于：所述同源修复序列由目的基因上游序列、目的基因编辑后形成的序列、目的基因下游序列依次连接形成，所述目的基因上游序列、目的基因下游序列长度为300bp~1500bp。

5.根据权利要求4所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，其特征在于：当所述目的基因编辑为敲除时，所述同源修复序列由目的基因上游序列和目的基因下游序列连接形成。

6.根据权利要求4所述的一种谷氨酸棒状杆菌的基因编辑系统，其特征在于：所述sgRNA表达载体由以下方法制备得到：

a、合成sgRNA序列，并在sgRNA两端引入EcoRⅠ酶切识别序列、XbaⅠ酶切识别序列；

b、将带有酶切识别序列的sgRNA序列以及pECXK-99载体分别酶切、纯化后进行连接，得到pFST-1载体；

c、构建同源修复序列，并在同源修复序列两端引入BglⅡ酶切识别序列或者引入pFST-1载体位于BglⅡ酶切位点两端的同源序列；

d、将带有酶切识别序列的同源修复序列以及pFST-1载体分别酶切、纯化后进行连接或者同源重组组装，得到所述sgRNA表达载体。

7.如权利要求1~6中任一所述的基因编辑系统在谷氨酸棒状杆菌中的应用，所述应用包括基因敲除和基因替换。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用的具体操作如下：

a、将cas9表达载体和sgRNA表达载体转化谷氨酸棒状杆菌；

b、培养、筛选，获得转化子。