CN112778358A - 一种体外多酶体系制备的小分子化合物的分离提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外多酶体系制备的小分子化合物的分离提取方法，该方法采用多酶体系催化制备分子量小于800D的有机物，对催化反应所得的混合溶液进行除杂处理；所述除杂处理包括：对所述混合溶液进行微滤。本发明对所述混合溶液进行微滤后，还可以进行超滤、离子交换脱盐、纳滤中的任意一步、两步或三步。对于除杂处理后的溶液，还可以进行进一步的结晶。本发明提供的方法弥补了本领域对多酶体系催化制备分子量小于800D的有机物进行分离提取的空白，成本低、污染少、产率高，在分离小分子化学品时具有显著优势。
Description
技术领域
本发明属于小分子化合物的生产领域，具体涉及通过体外多酶催化将淀粉或纤维素以及它们的衍生物转化而成的小分子化合物的分离提取方法。
背景技术
随着基因工程、蛋白质工程、系统与合成生物学的发展，人们具备了改造修饰微生物以及利用其生产特定的、用于进行常温水相催化各种反应的酶，使其具有高效生产天然或非天然产品的能力。其中的体外合成体系由于具有副反应少、中间产物明确等特点而越来越受到重视。其主要特点在于将多种纯化或部分纯化的酶甚至是细胞裂解液、辅酶以及底物放入体外的一个反应容器中，通过酶的级联催化作用生产所需的产品。体外合成体系的产物得率较高，尤其是当反应不可逆转或者产物可以原位移除时，其得率通常接近于理论值。
目前，现有技术公开了一些利用体外多酶转化体系合成化合物的转利用。例如，专利文献CN106148425A针对肌醇提出了一种全新的利用淀粉类原料或者纤维素类原料的体外多酶体系的催化制备方法，但是未提出针对该工艺需要的肌醇分离提取工艺。再例如，PCT专利62/236,226也提出了利用多酶体系在体外利用淀粉质原料生产塔格糖的途径，等等。这些专利均没有给出针对体外多酶转化体系的分离提取方案。
因此，亟待开发一种和体外多酶转化体系相适应的低成本、低污染、高产率的分离小分子化学品的新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种低成本、低污染、高产率的分离小分子化学品的新方法。
具体而言，本发明提供了一种体外多酶体系制备的小分子化合物的分离提取方法，该方法采用多酶体系催化制备分子量小于800D的有机物，对催化反应所得的混合溶液进行除杂处理；所述除杂处理包括：对所述混合溶液进行微滤。
本发明提供的方法所针对的对象是采用多酶体系催化制备分子量小于800D的有机物，具体是指以淀粉、纤维素和/或其衍生物为原料经酶催化转化而形成的混合溶液。在实际应用时，一般是将多种纯化或部分纯化的酶甚至是细胞裂解液、辅酶以及底物放入体外的一个含有原料(或底物)反应容器中，通过酶的级联催化作用生产所需的产品。
当所述分子量小于800D的有机物选自单糖或其衍生物、双糖或其衍生物、氨基酸或其衍生物时，所述方法能够实现更好的分离提取效果。具体而言，待提取液中经酶催化转化而形成的分子量小于800D的有机化合物可以选自肌醇、塔格糖、甘露糖、苹果酸或氨基葡萄糖。
本发明采用微滤方式对多酶转化反应液进行预处理，去掉其中的大颗粒。所述微滤又称微孔过滤，是以多孔膜(微孔滤膜)为过滤介质，在压力推动下截留溶液中的大颗粒物质，而大量溶剂、小分子及少量大分子溶质都能透过膜的分离过程。微滤能截留0.1微米～1微米之间的颗粒，允许大分子有机物和无机盐等通过，但能阻挡住悬浮物、细菌、部分病毒及大尺度的胶体的透过。具体而言，本发明所述微滤可以采用中空纤维膜，优选为孔径为50nm～250nm的中空纤维膜；或采用陶瓷膜或金属膜，优选为孔径为20nm～200nm的陶瓷膜；或采用板框压滤机，优选为布孔径为200目～900目的板框压滤机。
为了更好得除去多酶催化反应液中由于原材料带入的粗颗粒以及其它由于蛋白质等有机物形成的可溶性杂质，从而降低杂质含量，并防止由于大颗粒造成后续的处理单元膜堵塞以及蛋白质变性沉淀而很快降低通量，利于后续步骤的高效分离提取，本发明优选对微滤处理后的溶液继续进行除杂处理，可以包括超滤、离子交换脱盐、纳滤中的任意一步，或者依次进行超滤、离子交换脱盐、纳滤中的任意两步，或者依次进行超滤、离子交换脱盐以及纳滤。
本发明通过大量实践发现，对于本发明针对的多酶体系催化后的反应液，由于其中有大量的酶、未彻底反应的底物以及盐类等大小、种类不同的杂质，当所述分子量小于800D的目标有机物原始浓度在10g/L～120g/L这一特定的范围内时，采用本发明提供的先进行微滤再进行所述继续除杂处理的多步除杂方法，不仅可以确保大部分杂质被有效去除，且效率极高，更重要的是，目标产物在上述特定浓度下即使经过多步骤连续处理，但损失很低，收率高。
具体而言，本发明优选对微滤后的溶液进行超滤处理。超滤是一种加压膜分离技术，以大分子与小分子分离为目的，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。超滤的操作静压差一般为0.1～0.5MPa，被分离组分的直径大约为0.01-0.1μm，这相当于光学显微镜的分辨极限，一般为分子量500-1000000的大分子和胶体粒子，这种液体的渗透压很小，可以忽略，所用膜常为非对称膜，膜孔径为10-10μm，膜表面有效截留层厚度较小(0.1-10μm)。具体而言，本发明所述超滤可以采用截留分子量为1kD～10kD的超滤膜，优选采用截留分子量为1kD、3kD、5kD或10kD的超滤膜。
本发明优选对微滤后的溶液直接进行脱盐操作，或对依次经过微滤、超滤处理后的溶液进行脱盐操作，以去掉其中的无机盐。本发明所述脱盐优选采用阳离子吸附树脂(如732树脂)、阴离子吸附树脂(如724树脂)、大孔树脂(如D717大孔树脂)中的一种或多种联用。作为一种具体实施方式，所述脱盐可以将滤液依次通过大孔树脂和阴离子交换树脂。
本发明优选对微滤后的溶液直接进行纳滤处理，或对依次经过微滤、超滤和/或脱盐处理后的溶液进行纳滤处理，以去除不包括目标化合物在内的小分子杂质。纳滤是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，纳滤膜的孔径范围一般在几个纳米左右，允许一些无机盐和某些溶剂透过膜，多用于将相对分子质量较小的杂质物质(如无机盐)从溶剂中分离出来。本发明优选所述纳滤采用截留分子量为300D～800D的纳滤膜。
为了提高产品的品质，去除其中的色素，本发明可以将前述步骤处理后所得的溶液进行脱色。所述脱色可以直接进行，也可以先将溶液浓缩1～8倍后再脱色。所述脱色可采用脱色剂，如活性炭、离子交换树脂、大孔树脂等。脱色后去掉脱色剂，收集清液即可。
除了可以直接以液体形式销售的产品外，本发明提供的方法还包括对所述除杂处理后的溶液进行结晶，以获得目标化合物。所述结晶可以根据分离物质溶解性特点采用现有的合适方法从浓缩液中析出，同时使大部分杂质、色素等包含在母液中而被除去。具体而言，所述结晶的方法可以采用降温、调节pH值、加入晶种中的一种或多种的结合。结晶后，进行离心分离，可获得目标小分子化合物的结晶和母液。
为了提高结晶效率，提高结晶品质，可以在结晶前对溶液进行浓缩。本发明在实际生产中，浓缩可以选择单效、双效、三效等多效浓缩，多效蒸发器；根据实际生产中的能耗成本可以利用多效蒸发装置或蒸汽机械压缩装置(TVR或者MVR)来进行浓缩。多效蒸发装置在每次浓缩时产生的蒸汽可以循环利用，这比一次浓缩直接达到要求的浓缩倍数的方案要减少损耗的蒸汽量，另外节省了整个浓缩过程花费的时间；蒸汽机械压缩装置则可以更有效的利用蒸汽潜热，降低浓缩费用，在蒸汽价值较高的地区使用经济效益尤其明显。在实际操作中，本发明优选所述浓缩是指浓缩成固形物与液体比例为(0.3～0.75)：1的浓缩液，更优选为浓缩成固形物与液体比例为(0.5～0.7)：1的浓缩液，控制好浓缩后的固液比可以在后续步骤快速、高效地进行结晶。
对于结晶后的产物，可以采用本领域已知的干燥方法进行，本发明不做具体限定。
本发明提供的小分子化合物的分离提取方法填补了本领域的空白，且成本低、污染少、产率高，在分离小分子化学品时具有显著优势。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1
本实施例提供了一种利用多酶转化体系分离提取获得肌醇的方法。
待处理溶液采用如下方法获得：配制多酶催化体系，包括100mM磷酸缓冲液(pH7.2)，10mM氯化镁，糊精125g/L,IA用量为5U/ml，aGP，PGM，IPS，IMP用量均为10U/mL，经过恒温催化后，得到的反应液中肌醇含量为80g/L。
分离提取方法具体为：
(1)取多酶体系催化反应的反应液50L，其中肌醇含量80g/L，通过中空纤维膜进行过滤，中空纤维膜孔径为220nm，操作压力0.4MPa，跨膜压差0.05-0.15MPa，获得48L滤液，滤液与肌醇反应液的体积比为1∶25，滤液中肌醇含量78g/L；
(2)所得到的48L滤液再通过超滤膜进行过滤，超滤膜截留分子量为10kD，操作压0.4MPa，跨膜压力0.05MPa，得到48L超滤滤液，滤液中肌醇含量77g/L,超滤滤液与肌醇反应液的体积比为1：20；
(3)得到的肌醇超滤清液进入多效蒸发器进行初步浓缩，浓缩温度不超过75℃，最终得到浓缩液6.2L,浓缩液中的固形物和液体比例为0.6：1，然后进入结晶罐进行结晶，控制最终结晶温度15-25℃，搅拌转速10-80rpm，离心分离，得到肌醇晶体和母液。肌醇晶体干燥后获得肌醇结晶2400g，肌醇总收率60％。
用HPLC法对获得的肌醇产品进行含量检测，肌醇含量为99.5％，用灼烧法测定产品的灰分含量为0.05％。
实施例2
本实施例提供了一种利用多酶转化体系分离提取获得肌醇的方法。
待处理溶液采用如下方法获得：配制多酶催化体系，包括100mM磷酸缓冲液(pH7.2)，10mM氯化镁，糊精160g/L,IA用量为5U/ml，aGP，PGM，IPS,IMP用量均为10U/mL，经过恒温催化后，得到的反应液中肌醇含量为120g/L。
分离提取方法具体为：
(1)将多酶体系转化的转化液50L，其中肌醇含量120g/L,通过陶瓷膜进行过滤，陶瓷膜孔径为50nm，操作压力0.4MPa，跨膜压差0.05-0.15MPa，得到滤液50L，滤液中肌醇含量118g/L,截留液5L，滤液与肌醇反应液的体积比为1∶10；
(2)所得到的滤液再通过超滤膜进行过滤，超滤膜截留分子量为5kD，操作压0.4MPa，跨膜压力0.05MPa，得到超滤清液55L，肌醇含量106g/L,截留液1.8L,超滤滤液与陶瓷膜反应液的体积比为1：30；
(3)得到的肌醇超滤清液进入单效蒸发器进行初步浓缩，真空度控制在-0.092Mpa，温度70℃，得到浓缩液10L，浓缩液中固形物和液体比例约为0.58：1，然后进入结晶罐进行结晶，控制最终结晶温度15-25℃，搅拌转速10-80rpm，离心分离，得到肌醇晶体和母液。肌醇晶体分离干燥后得到成品4700g，肌醇总收率78％。
用HPLC法对获得的产品进行含量检测，肌醇含量为99.4％，用灼烧法测定产品的灰分含量为0.04％。
实施例3
本实施例提供了一种利用多酶转化体系分离提取获得塔格糖的方法。
待处理溶液采用如下方法获得：在一个含有30mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)，5mM的二价镁离子的多酶转化体系中，加入α-葡聚糖磷酸化酶的用量为15U/mL，葡萄糖磷酸变位酶的用量为15U/mL，葡萄糖磷酸异构酶的用量为15U/mL，6-磷酸塔格糖差向异构酶的用量为15U/mL，6-磷酸塔格糖磷酸酶的用量为15U/mL，以及1U/mL的异淀粉酶，1U/mL的麦芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，1U/ml的葡聚糖转移酶，10mM聚磷酸钠，150g/L的麦芽糊精，经过催化反应后，转化液中的塔格糖含量为105g/L。
分离提取方法具体为：
(1)将经多酶体系转化后得到含塔格糖105g/L的转化液20L，通过滤布孔径为800目的板框压滤机进行过滤，水洗滤渣并合并滤清液得到滤液25L,截留液2L，滤液中塔格糖含量为83g/L,截留液与塔格糖反应液的体积比为1∶10；
(2)所得到的滤液再通过超滤膜进行过滤，超滤膜截留分子量为3kD，操作压0.3MPa，跨膜压力0.05MPa，收集得到超滤清液28L，滤清液中塔格糖含量73.4g/L；
(3)将超滤清液通过填入D717大孔树脂和724树脂脱盐后的液体利用旋转蒸发仪浓缩至2.5L后降温至15℃结晶，结晶过程维持旋转蒸发仪转速20-60rpm，将晶体抽滤去掉母液后进行干燥，获得含量97％的塔格糖晶体1250g，塔格糖总收率59.5％。
实施例4
本实施例提供了一种利用多酶转化体系分离提取获得甘露糖的方法。
待处理溶液采用如下方法获得：配制多酶催化体系中，包括30mM磷酸缓冲液(pH7.0)，5mM氯化镁，5mM ATP,250mM25聚磷酸，所述蔗糖的浓度为100g/L,蔗糖磷酸化酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸变位酶用量为10U/mL，葡萄糖磷酸异构酶用量为10U/mL，甘露糖6-磷酸异构酶用量为10U/mL，甘露糖6-磷酸磷酸酶用量为10U/mL，葡萄糖异构酶用量为10U/mL，葡萄糖激酶用量为10U/mL，聚磷酸激酶用量为10U/mL，经过恒温催化24小时后，得到的反应液中甘露糖含量为82g/L。
分离提取方法具体为：
(1)将经多酶体系转化后得到含甘露糖80g/L的转化液20L，通过孔径50nm的中空纤维膜进行过滤，操作压力0.4MPa，跨膜压差0.05-0.15MPa，水洗截留液并合并滤清液得到滤液26L,截留液2L，滤液中甘露糖含量为61g/L,截留液与甘露糖反应液的体积比为1∶10；
(2)将所得的滤液经过1KD超滤膜和截留分子量为300的纳滤膜后，得到透过液33L，透过液甘露糖含量47.5g/L；
(3)所得透过液再通过活性炭柱后进行减压浓缩，最终获得浓缩液2.2L，浓缩液经过降温结晶，分离的晶体干燥后得到含量96.7％的甘露糖880g，甘露糖总提取收率55％。
实施例5
本实施例提供了一种利用多酶转化体系分离提取获得苹果酸的方法。
待处理溶液采用如下方法获得：配制多酶催化体系，包括200mM磷酸缓冲液(pH7.5)，10mM氯化镁，10mM ATP,5Mm NAD，1mM氯化锰，300mM碳酸氢钠，以及25mM多聚磷酸，淀粉的浓度为100g/L,aGP,PGM,PGI,PFK,ALD,TIM,GAPDH,PGK,GAPN,PGAN,ENO,PEPC,MDH的酶用量为50-70U/ml，IA,4GT,PPGK用量为4U/ml，经过转化后，最终反应液中的苹果酸含量为40g/L。
分离提取方法具体为：
将经多酶体系转化后得到含苹果酸40g/L的转化液10L，通过经过离心机离心后，将上清液再通过截留分子量为800的纳滤膜进行过滤，所得到的滤液总固形物含量40g/L，其中苹果酸含量为38.6g/L，然后经过脱色，浓缩，结晶后即可获得高含量苹果酸液体或者苹果酸干粉。
实施例6
本实施例提供了一种利用多酶转化体系分离提取获得氨基葡萄糖的方法。
待处理溶液采用如下方法获得：将含有50g/L经异淀粉酶处理的可溶性淀粉、10mM氯化镁、20mM磷酸二氢钾、1000mM氯化铵、10U/mLαGP、10U/mL PGM、15U/mL PGI、10U/mLGlmD、10U/mL GlmP以及5U/mL的4GT，进行反应，最终获得氨基葡萄糖含量为30g/L。
分离提取方法具体为：
将经多酶体系转化后得到的上述氨基葡萄糖转化液50L，通过孔径20nm陶瓷膜进行过滤，滤液再经过截留分子量1kd的纳滤膜过滤，所得滤液调PH到8.5以上，经过由724树脂和732树脂组成的混合树脂床脱盐后，进行浓缩，将浓缩液按照氨基葡萄糖和盐酸比例为4:1的量加入盐酸，再加入2倍体积乙醇后，降温结晶并经过干燥获得氨基葡萄糖。所得盐酸氨基葡萄糖含量99.5％，总收率85％。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种体外多酶体系制备的小分子化合物的分离提取方法，其特征在于，采用多酶体系催化制备分子量小于800D的有机物，对催化反应所得的混合溶液进行除杂处理；
所述除杂处理包括：对所述混合溶液进行微滤。
2.根据权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，所述微滤采用孔径为50nm～250nm的中空纤维膜，或孔径为20nm～200nm的陶瓷膜，或孔径为200目～900目的板框压滤机。
3.根据权利要求1或2所述的分离提取方法，其特征在于，所述除杂处理还包括：对所述混合溶液进行微滤后，进行超滤、离子交换脱盐、纳滤中的任意一步；
或者，依次进行超滤、离子交换脱盐、纳滤中的任意两步；
或者，依次进行超滤、离子交换脱盐以及纳滤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超滤采用截留分子量为1kD～10kD的超滤膜。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述脱盐采用阳离子吸附树脂、阴离子吸附树脂、大孔树脂中的一种或多种联用；
优选地，所述脱盐为将滤液依次通过大孔树脂和阳离子交换树脂，或依次通过阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述纳滤采用截留分子量为300D～800D的纳滤膜。
7.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述除杂处理还包括脱色。
8.根据权利要求1、3或7所述的方法，其特征在于，对所述除杂处理后的溶液进行结晶，收集所述分子量小于500的有机物的晶体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述结晶的方法采用降温、调节pH值、加入晶种中的一种或多种的结合。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述结晶前先进行浓缩，优选将所述除杂处理后的溶液浓缩成固形物与液体比例为(0.3～0.75)：1的浓缩液。
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