ITGE20010097A1 - Processo per la produzione di trealosio da destrine ad alte temperature. - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo: "PROCESSO PER LA PRODUZIONE DI TREALOSIO DA DESTRINE AD ALTE TEMPERATURE"

La presente invenzione si riferisce alla produzione di trealosio ad elevate temperature a partire da amido e destrine, mediante l'impiego di enzimi.

II trealosio (cx-D-glucopiranosil-a-D-glucopiranoside) è un disaccaride non riducente, costituito da due molecole di glucosio unite tra di loro a livello dell'ossidrile emiacetalico. Negli ultimi anni questo disaccaride è stato oggetto di numerosi studi, in particolare in relazione alla capacità del trealosio di stabilizzare biomolecole, biostrutture e cellule, quando queste vengono completamente disidratate. In tali condizioni, il trealosio forma film vetrosi non igroscopici che ricoprono con continuità la superficie delle macromolecole, irrigidendole coniormazionalmente e proteggendole dai processi degradativi.

Il trealosio è altamente solubile, non igroscopico, non tossico, inodore, incolore, ha un basso potere dolcificante e non dà luogo, per la mancanza di funzioni riducenti libere, alla reazione di Maillard in presenza di proteine e peptidi .

Queste peculiari caratteristiche hanno suggerito la possibilità di un suo impiego in campo industriale, in particolare, nel settore chimicofarmaceutico per la stabilizzazione di enzimi, vaccini e farmaci e nel settore alimentare per la preparazione di cibi disidratati che mantengono inalterate le caratteristiche nutrizionali ed organolettiche tipiche del prodotto fresco.

Nonostante le ricerche di laboratorio e industriali abbiano ampiamente dimostrato la superiorità degli alimenti disidratati con la tecnologia del trealosio, non si è avuta una immediata diffusione di questi prodotti a causa degli elevati costi che tale zucchero aveva fino al 1998. Il trealosio, infatti, veniva originariamente ottenuto per via estrattiva dal lievito Saccharomyces cerevisiae con elevati costi di processo. La forte domanda del mercato ha spinto numerose industrie biotecnologiche a cercare processi di produzione del trealosio a basso costo, in modo da creare un reale mercato per questo disaccaride .

Partendo da una serie di ricerche di laboratorio, in poco meno di tre anni, una società biotecnologica giapponese, la Hayashibahara, ha sviluppato un processo di produzione del trealosio a partire da amido e destrine, grazie all'azione combinata di due enzimi (TDFE, Enzima formante le Trealosil Destrine; TFE, Enzima Formante Trealosio) isolati dal ceppo di Arthrobacter sp. Q36.(JP 362131/92; JP265416/93; JP156338/93; JP 340343/93; JP79291/94) .

Anche se quest'approccio biotecnologico è già fortemente competitivo rispetto alle tecnologie estrattive da lievito, vi è a livello industriale un forte interesse ad innovazioni nel processo di produzione del trealosio che consentano una ulteriore riduzione dei costi. La possibilità di realizzare un tale processo usando enzimi in grado di operare ad elevate temperature appare estremamente vantaggiosa.

Nei processi di bioconversione di matrici carboidratiche , infatti, la possibilità di operare ad alte temperature è auspicabile in relazione al contenimento della contaminazione microbica ed alla diminuzione della viscosità del mezzo di reazione. Quest'ultimo effetto rende le matrici polisaccaridiche più adatte all'attacco degli enzimi idrolitici e consente di operare in presenza di elevate concentrazioni di substrati aumentando di conseguenza la produttività. Ovviamente i batteri termofili hanno rappresentato la fonte ideale per uno screening mirato alla ricerca di enzimi termostabili per la produzione di trealosio da amido. Ulteriori proprietà di interesse applicativo degli enzimi da fonti estremofile sono l'intrinseca resistenza al pH, alla proteolisi e ai comuni agenti di denaturazione delle proteine, come solventi organici, tensioattivi e forza ionica.

Le applicazioni biotecnologiche che contemplano l'utilizzo di enzimi termofili responsabili della produzione di trealosio (TDFE, TFE) sono oggetto di recenti brevetti di seguito riportati: US06027918, US05976856, US05922578, US05856146 , US06150153, Italian Patent NA96000031, US05723327 , US05714368,.

Scopo della presente invenzione è fornire un processo di produzione di trealosio a partire da amido e destrine ad alte temperature che risulti più efficiente ed economicamente vantaggioso rispetto ai processi attualmente presenti nello stato dell'arte.

Il procedimento secondo l'invenzione è condotto a temperature di reazione comprese tra i 75 e gli 85°C, utilizzando come catalizzatori gli enzimi termostabili TDFE ed il TFE isolati da Sulfolobus solfataricus (MT4), un archeon termofilo della famiglia delle Sulfolobales.

Tali enzimi, infatti, consentono la trasformazione dell'amido e delle destrine in trealosio ad elevate temperature con un rendimento non inferiore a quello dei procedimenti noti in arte che utilizzano gli stessi enzimi isolati da fonti mesofile (Arthrobacter sp. Q36) e termofile (Sulfolobus acidocaldarius).

In una forma particolarmente preferita del procedimento secondo l'invenzione i biocatalizzatori per la produzione di trealosio sono costituiti da cellule esprimenti o l'uno o l'altro dei suddetti enzimi. Detti biocatalizzatori sono successivamente coimmobilizzati in una matrice polimerica che può essere ad esempio costituita da chitosano o preferibilmente da alginato di calcio, materiale che presenta il vantaggio di essere facilmente reperibile, non tossico, inerte e stabile alle alte temperature.

Costituisce inoltre oggetto dell'invenzione il procedimento di produzione di un tale catalizzatore, comprendente sia cellule esprimenti l'enzima formante le trealosil-destrine, che cellule contenenti l'enzima formante trealosio (preferibilmente isolati da microrganismi del tipo Sulfolobus, in particolare da S. soliataricus, e intrappolati in una matrice polimerica), comprendente le seguenti operazioni in successione:

<■ >permeabilizzazione di dette cellule mediante calore, con l'utilizzo anche di detergenti preferibilmente sotto agitazione;

<■ >miscelazione di dette cellule contenenti le due attività di interesse;

<■ >miscelazione di dette cellule permeabilizzate con una soluzione contenente detta matrice polimerica rigonfiata con opportuno solvente; <■ >polimerizzazione di detta miscela.

I biocatalizzatori così ottenuti vengono inseriti all'interno di un bioreattore a miscelazione o tubolare a letto impaccato.

Costituiscono dunque ulteriore oggetto dell'invenzione i catalizzatori della conversione di amido e destrine a trealosio basati su organismi ricombinanti immobilizzati, esprimenti enzimi termostabili .

Un vantaggio della presente invenzione è dato dal fatto che il processo per la produzione di trealosio può essere eseguito in continuo ad elevate temperature, consentendo di risolvere i problemi della contaminazione microbica e della viscosità del mezzo di reazione. Detto procedimento, infatti, utilizza in maniera più efficiente i catalizzatori, che vengono invece perduti in ogni ciclo produttivo nei processi batch attualmente utilizzati.

Vantaggiosamente, il procedimento secondo la presente invenzione consente:

di migliorare la qualità del prodotto per la ridotta contaminazione da proteine;

di migliorare le caratteristiche del processo, realizzato in impianti compatti, convenzionali , in grado di operare in continuo, con flussi costanti di materie prime, prodotti e reflui;

di ottimizzare l'impiego del biocatalizzatore in relazione alla trasformazione.

Inoltre, l'utilizzo come biocatalizzatore di cellule coimmobilizzate di organismi ricombinanti che esprimono a livello citosolico gli enzimi termostabili di interesse, permette una notevole semplificazione delle procedure di downstream e quindi una diminuzione dei costi dell'intero processo di produzione. In particolare, la relativa metodologia sviluppata consente di evitare i processi di purificazione dell'enzima, con il vantaggio di ridurre i tempi ed i costi di produzione del biocatalizzatore, di riutilizzare l'enzima per più cicli produttivi, di controllare meglio la reazione enzimatica ed ottenere il prodotto libero da proteine estranee.

Ulteriori caratteristiche e vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata che segue e dagli esempi di realizzazione forniti a titolo esplicativo e non limitativo .

Descrizione dettagliata dell'invenzione L'invenzione comprende un processo per la conversione ad alte temperature delle destrine a trealosio, che utilizza come biocatalizzatori due enzimi termofili e termostabili da microrganismi del tipo Sulfolobus, ed in particolare Sulfolobus solfataricus MT4.

Tali enzimi sono il TDFE (enzima formante le trealosil-destrine) ed il TFE (enzima formante trealosio) . Il primo enzima, TDFE, attua una transglicosilazione intramolecolare che, convertendo il legame glicosidico a,1-4 dell'estremità non riducente in a,1-1, forma le trealosildestrine . Il secondo enzima, TFE, idrolizza in maniera specifica il legame a,1-4 adiacente al legame a,1-1 delle trealosildestrine, formando una miscela equimolecolare di trealosio e destrine a più basso peso molecolare. Cicli ripetitivi dell'azione concertata dei due enzimi consentono di convertire quantitativamente l'amido e le destrine in trealosio.

Sebbene siano naturalmente prodotti dai microrganismi sopra indicati, questi possono essere ottenuti con tecniche di ingegneria genetica, consentendo la loro espressione in microrganismi ospiti più adatti ad una produzione industriale su larga scala. Il sistema di espressione può essere un batterio o una cellula eucariota, in particolare un lievito.

Alcune proprietà dell'enzima TDFE saranno di seguito elencate:

(1) Azione

<■ >Formazione di destrine non riducenti, contenenti una unità di trealosio all'estremità non riducente, quando reagisce con amido parzialmente idrolizzato o destrine aventi un grado di polimerizzazione superiore a 3;

(2) Peso molecolare

<■ >Compreso tra 69.000 e 79.000 daltons su elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE); (3) Punto isoelettrico

<■ >Compreso tra 5,4 e 6,4 su isoelettroforesi in presenza di anfoliti;

(4) Temperatura ottimale

<■ >75°C, quando incubato a pH 5,5.

(5) pH ottimale

<■ >5.5, quando incubato a 75°C;

(6) Termostabilità

mantiene il 95% della sua attività iniziale alla temperatura di 85°C, quando incubato a pH 5.5 per 2 ore; il valore dell'half-lite a 75°C è di 96 ore;

(7) Stabilità al pH

<■ >Mantiene il 100% della sua attività iniziale nell'intervallo di pH compreso tra 3.5 e 10,5.

Alcune proprietà dell'enzima TFE saranno di seguito elencate:

(1) Azione

<■ >Idrolizza in maniera specifica il legame tra l'unità di trealosio e l'adiacente unità di glucosio nelle destrine non riducenti aventi un grado di polimerizzazione superiore a 3;

(2) Peso molecolare

<■ >Compreso tra 54.000 e 64.000 daltons su elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE); (3) Punto isoelettrico

<■ >Compreso tra 5,6 e 6,6 su isoelettroforesi in presenza di anfoliti;

(4) Temperatura ottimale

<■ >85°C, quando incubato a pH 5,5.

(5) pH ottimale

<■ >5.5 , quando incubato a 85°C e 75 °C;

(6) Termostabilità

<■ >mantiene il 95% della sua attività iniziale alla temperatura di 85°C, quando incubato a pH 5.5 per 2 ore; il valore dell'half-life a 75°C è di 72 ore;

(7) Stabilità al pH

<■ >Mantiene il 100% della sua attività iniziale nell'intervallo di pH compreso tra 3.5 e 10,5.

Secondo la presente invenzione i due enzimi responsabili della formazione di trealosio da S. solfataricus sono impiegati in forma immobilizzata, sicché le stesse cellule, ricombinanti o meno, opportunamente trattate, sono utilizzate come biocatalizzatore con il vantaggio di ridurre i tempi ed i costi di produzione e di consentire l'esecuzione in continuo del procedimento di idrolisi dell'amido e delle destrine a trealosio.

Le cellule ricombinanti sono coimmobilizzate su una matrice polimerica formata preferibilmente da Ca-alginato, un supporto di facile reperibilità, non tossico, inerte e stabile alle alte temperature .

Secondo l'invenzione le cellule mesofile contenenti l'enzima ricombinante sono permeabilizzate al calore (75°C) per almeno un'ora preferibilmente sotto agitazione, anche in presenza di detergenti. In seguito a tale trattamento le resting cells, contenenti il 100% delle rispettive attività enzimatiche, sono mescolate e, successivamente, aggiunte ad una soluzione di acido alginico precedentemente rigonfiato in acqua bidistillata (rapporto 1:1 v/v). La preparazione del biocatalizzatore, contenente entrambe le attività enzimatiche di interesse, in forma di piccole sfere (1-3 mm di diametro) di alginato di calcio, è realizzata con un semplice ed economico processo in continuo, in cui la sospensione delle cellule in acido alginico è fatta gocciolare in una soluzione di sali di calcio.

Con tale procedura sperimentale le cellule diventano semplici contenitori permeabili in cui gli enzimi d'interesse svolgono la loro attività catalitica senza alcuna interferenza. Le sfere contenenti le cellule ricombinanti coimmobilizzate conservano il 70-75% dell'attività riscontrata nella sospensione cellulare di partenza. Tali sfere possono essere infine utilizzate per impaccare un reattore tubolare termostatato, al fine di ottenere la conversione in continuo di destrine in trealosio .

Con l'aiuto dei seguenti esempi, verrà fornita una descrizione più dettagliata delle specifiche forme di realizzazione della presente invenzione, finalizzate a far meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalità operative.

ESEMPI

Esempio 1: Preparazione degli enzimi termofili TDFE e TFE.

Gli enzimi d'interesse nella produzione di derivati dell'amido ad alto valore aggiunto sono isolati dal microrganismo Sulfolobus solfataricus MT4. Le condizioni di crescita operando in un fermentatore da 100 L sono: temperatura 87°C, ossigenazione realizzata con un flusso d'aria di circa 20-40 L/min; agitazione realizzata con una girante operante a circa 100 rpm. Il medium colturale standard impiegato per la crescita della biomassa contiene come fonti saline: KH2P04 (3.0 g/L), (NH4)S04 (2.25 g/L), MgS04X7H20 (0.2 g/L), CaCl2x2H20 (0.25 g/L), MnCl2x4H20 (1.8 mg/L), Na2B4O7xl0H2O (4.5 mg/L), ZnS04x7H20 (0.22 mg/L), CuC12x2H20 (0.05 mg/L), Na2Mo04x2H20 (0.03 mg/L), V0S04x2H20 (0.03 mg/L), CoS04x7H20 (0.01 mg/L). Glucosio (3g/L) oppure estratto di lievito e casaminoacidi (1+1 g/L) possono essere impiegati come fonte di carbonio. Il pH del terreno di coltura è aggiustato a 3.5 con 0.1 M H2S04 II ciclo fermentativo, operando in queste condizioni è completo in 4 giorni.

Essendo i due enzimi proteine citosoliche, in una procedura standard 100 g di cellule umide, raccolte in fase stazionaria, sono sospese in 40 mL di tampone 10 mM tris-HCl pH 7.5 e frantumate in presenza di sabbia in un rapporto di 1:1. Le due attività sono riscontrate nel surnatante dopo centrifugazione a 1600 x g per 10 min. La purificazione ad omogeneità dei entrambi suddetti enzimi mediante tecniche cromatografiche, ha consentito la loro caratterizzazione cinetica e chimico-fisica (Di Lernia et al., Extremophiles 2:409-416, 1998).

Esempio 2: Preparazione dell'enzima ricombinante TDFE.

Isolamento, caratterizzazione e clonaggio del gene. - L'enzima formante le trealosildestrine (TDFE) parzialmente purificato (220 μg) e ottenuto secondo quanto riportato nell'esempio 1 è stato sottoposto ad elettroforesi su gel di poliacrilammide al 10% ed il gel trasferito elettricamente su un filtro di PVDF per 90 min a 120 V e a 4°C. Dopo colorazione con Coomassie, la banda corrispondente al peso molecolare della proteina è stata ritagliata e sequenziata con il metodo di Edman. In tal modo si è potuta evidenziare sul filtro una banda di circa 80 kDa, corrispondente alla proteina d'interesse. E' stata così ottenuta la sequenza dei primi 20 amminoacidi: MIIGTYRLQLNKKFTFYDVI . La sequenza amminoterminaie è stata utilizzata per analizzare la banca dati del genoma di Sulfolobus solfataricus. Il gene del TDFE è costituito da 2.243 bp e codifica per un polipeptide di 732 amminoacidi con un peso molecolare di 86,5 kDa, valore simile a quello determinato sperimentalmente sulla proteina purificata .

Una volta ottenuta la sequenza del gene codificante il TDFE, sono stati disegnati due oligonucleotidi specifici da utilizzare per l'amplificazione. La miscela di reazione della PCR conteneva in 50 μL finali: 100 ng di DNA totale di S. solfataricus , 5U di Pfu DNA polimerasi proofreading (Stratagene), 12 nmoli di deossiribonucleotidi trifosfato, 30 pmoli degli oligonucleotidi 5<1 >-GGCCCATGGTAATAGGTACGTATAGG-3' e 5'-CCGCTCGAGTATAGGTAGTTCACCCAC -3' contenenti rispettivamente un sito di riconoscimento per gli enzimi di restrizione Nco e Xho alle estremità 5' e 3’ del gene. Il programma di amplificazione usato era il seguente: hot start 5' a 95°C, annealing 2' a 48°C, extension 4' a 72°C, denaturation 45" a 95°C per 10 cicli; annealing 1' a 58°C, extension 4' a 72°C, denaturation 45" a 95°C per 20 cicli; final extension 10' a 72°C. Il frammento ottenuto in questo modo di circa 1.200 bp è stato purificato da gel e sottoposto a digestione con i suddetti enzimi ed quindi inserito nel vettore pTrc99A (30 ng) preventivamente linearizzato con Nco e Xho utilizzando la ligasi T4 (BioLabs). La miscela della reazione di ligasi è stata utilizzata per trasformare mediante elettroporazione cellule competenti di E. coli del ceppo TG2. I cloni contenenti il costrutto desiderato sono stati identificati mediante minipreparazione di DNA plasmidico e digestioni con enzimi di restrizione opportuni. Sono state quindi preparate quantità del plasmide tali da consentire il sequenziamento dell'intero gene per controllare eventuali errori del processo di amplificazione. Il plasmide pTrc-TDFE è stato usato quindi per trasformare il ceppo di E. coli Rb791 la cui espressione è inducibile con IPTG.

Esempio 3: Preparazione dell'enzima ricombinante TFE.

Isolamento, caratterizzazione e clonaggio del gene. - L'enzima formante trealosio (TFE) parzialmente purificato (200 μg) e ottenuto secondo quanto riportato nell'esempio 1 è stato sottoposto ad elettroforesi su gel di poliacrilammide al 10% ed il gel trasferito elettricamente su un filtro di PVDF per 90 min a 120 V e a 4°C. Dopo colorazione con Coomassie, la banda corrispondente al peso molecolare della proteina è stata ritagliata e sequenziata con il metodo di Edman.

In tal modo si è potuta evidenziare sul filtro una banda di circa 65 kDa, corrispondente alla proteina d'interesse. E' stata così ottenuta la sequenza dei primi 20 amminoacidi:

MTFAYKIDEDGVTFNLWAPY . La sequenza amminoterminaie è stata utilizzata per analizzare la banca dati del genoma di Sulfolobus solfataricus. Il gene del TDFE è costituito da 1.686 bp e codifica per un polipeptide di 561 amminoacidi con un peso molecolare di 64,4 kDa, valore simile a quello determinato sperimentalmente sulla proteina purificata .

Una volta ottenuta la sequenza del gene codificante il TFE, sono stati disegnati due oligonucleotidi specifici da utilizzare per l'amplificazione. La miscela di reazione della PCR conteneva in 50 μL finali: 100 ng di DNA totale di S. solfataricus , 5U di Pfu DNA polimerasi proofreading (Stratagene), 12 nmoli di deossiribonucleot idi trifosfato, 30 pmoli degli oligonucleotidi 5'-GCGTTCATGACGTTTGCTTATAAAATAG-3' e 5'-CCCGGATCCTAAAGTTTATATAAAGCA-3' contenenti rispettivamente un sito di riconoscimento per gli enzimi di restrizione Rcal e Barn HI alle estremità 5' e 3' del gene. Il programma di amplificazione usato era il seguente: hot start 5' a 95°C, annealing 2' a 48°C, extension 4' a 72°C, denaturation 45" a 95°C per 10 cicli; annealing 1' a 58°C, extension 4' a 72°C, denaturation 45" a 95°C per 20 cicli; final extension 10' a 72°C. Il frammento ottenuto in questo modo di circa 1.200 bp è stato purificato da gel e sottoposto a digestione con i suddetti enzimi ed quindi inserito nel vettore pTrc99A (30 ng) preventivamente linearizzato con Rcal e Barn HI utilizzando la ligasi T4 (BioLabs). La miscela della reazione di ligasi è stata utilizzata per trasformare mediante elettroporazione cellule competenti di E. coli del ceppo TG2. I cloni contenenti il costrutto desiderato sono stati identificati mediante minipreparazione di DNA plasmidico e digestioni con enzimi di restrizione opportuni. Sono state quindi preparate quantità del plasmide tali da consentire il sequenziamento dell'intero gene per controllare eventuali errori del processo di amplificazione. Il plasmide pTrc-TDFE è stato usato quindi per trasformare il ceppo di E. coli Rb791 la cui espressione è inducibile con IPTG.

Esempio 4: Crescita di E. coli ricombinante contenente il TDFE o il TFE.

Le cellule di E. coli Rb791 trasformate con pTrc-TDFE o con pTrc-TFE sono state cresciute fino a una densità ottica di 1,0 a 600 nm in 100 mL di terreno Luria-Bertani (LB) contenente: triptone (10 g/L), estratto di lievito (5 g/L), NaCl (10 g/L) e ampicillina (0,1 g/L) a 37°C. Esse venivano impiegate successivamente per inoculare 4 beute da 2 L contenenti 500 mL di terreno fresco LB ed ampicillina. Al fine di ottenere una quantità di cellule sufficienti per il trasferimento su scala pilota del processo di impiego industriale della proteina prodotta, il microrganismo ricombinante è stato cresciuto in colture dell'ordine del litro e successivamente in un fermentatore da 100 L. Le condizioni di crescita sull'impianto pilota erano 37°C, con un flusso d'aria di circa 10 L/min, ed una agitazione realizzata mediante una girante operante a 180 rpm/min. Operando in queste condizioni, il ciclo fermentativo, veniva completato in 24 ore. Il medium colturale impiegato per la crescita della biomassa, (Super Broth, SB) era costituito da due soluzioni A e B da sterilizzare separatamente. La soluzione A conteneva: triptone (12 g/L), estratto di lievito (24 g/L), glicerolo (5 mL/L), acqua fino a 900 mL, mentre la soluzione B (concentrata 10 x) conteneva: KH2P04 (1,7 g/L), K2HP04x3H20 (20 g/L), oppure K2HP04 anidro (15,26 g/L), acqua fino a 100 mL. L'ampicillina precedentemente sterilizzata per filtrazione veniva aggiunta al terreno in concentrazione di 0,1 g/L. La crescita delle cellule veniva seguita spettrofotometricamente a 600 nm e quando le OD raggiungevano il valore di 3.0, al terreno di coltura veniva aggiunto 1'induttore isopropil-p-D-tiogalattopiranoside (IPTG 1 mM) sterilizzato precedentemente per filtrazione. L'attività del TDFE e del TFE sono state riscontrate nel citoplasma. Lo studio comparativo dei parametri cinetici ha confermato le proprietà dei corispondenti enzimi termofili.

Esempio 5: Permeabilizzazione e coimmobilizzazione delle cellule mesofile.

750 g di cellule di E. coli contenenti l'enzima TDFE vengono mescolate con 250 g di cellule di E. coli contenenti l'enzima TFE, in base al differente livello di espressione dei due enzimi. Alla sospensione cellulare ottenuta vengono aggiunti 400 mL di tampone sodio acetato 50 mM pH 5.5 (volume finale 1000 mL), dopo di che le cellule sono sottoposte al processo di permeabilizzazione per 1 ora a 75°C sotto agitazione, anche in presenza di detergenti quali Triton X-100 o SDS (0,1-0,5% v/v). Dopo tale trattamento le soluzioni delle resting cells vengono unite e portate a volume di 2.500 mL con lo stesso tampone impiegato per la permeabilizzazione. Alla soluzione ottenuta viene aggiunta, in un rapporto di 1:1 v/v, una soluzione di acido alginico al 4 % (p/v) precedentemente rigonfiata in acqua bidistillata . Per la preparazione del biocatalizzatore, contenente entrambe le attività di interesse, sotto forma di sfere del diametro di 1-3 mm, è stato assemblato un sistema in grado di operare in continuo, costituito da una pompa peristaltica collegata ad una siringa. La soluzione da immobilizzare viene fatta passare attraverso un ago e cadendo goccia a goccia in una soluzione di cloruro di calcio 0.1 M (volume 3 L) forma le sfere di calcio-alginato contenenti le resting cells. Fotografie al microscopio elettronico dimostrano che il processo di permeabilizzazione ad alta temperatura non distrugge la membrana piasmatica ma la rende soltanto permeabile.

Tale risultato dimostra che le cellule diventano semplici contenitori permeabili in cui l'enzima d'interesse svolge la sua attività catalitica senza alcuna interferenza. Dopo l'immobilizzazione le sfere mostrano il 70-75% dell'attività riscontrata nella sospensione cellulare di partenza.

Esempio 6: Conversione delle destrine a trelosio con un bioreattore a colonna.

In una procedura standard da 1.000 g di biomassa catalitica umida permeabilizzata si ottengono 1250 g di sfere di biocatalizzatore immobilizzato. Con questo materiale si riempie un bioreattore tubolare in vetro del volume di due litri. Il letto catalitico è disposto preferenzialmente in posizione orizzontale, per minimizzare la pressione idraulica lungo la sezione trasversale. Poiché il processo avviene ad alte temperature, per ottenere uno scambio termico ottimale, il bioreattore è rivestito di una camicia esterna collegata ad un bagno termostatico, con una capacità in volume di 4 volte superiore rispetto al volume del letto impaccato. Il processo di trasformazione è condotto ad 75°C, a pH 5.5 utilizzando come substrato una soluzione di destrine al 30-40% p/v che viene fatta passare attraverso il letto catalitico con un flusso pari a 50 mL/min, corrispondente ad una velocità lineare di 30 cm/min. In queste condizioni la produttività del bioreattore è di 127 mg di trealosio prodotto per ora per grammo di supporto. Il sistema può lavorare alla massima efficienza per 7-10 giorni.

Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Catalizzatore della conversione di amido e destrine a trealosio basato su organismi ricombinanti immobilizzati, esprimenti enzimi termostabili .
2. 2. Catalizzatore di cui alla rivendicazione 1, in cui detti enzimi sono l'enzima formante le trealosildestrine (TDFE) e l'enzima formante il trealosio (TFE) da microrganismi del tipo Sulfolobus .
3. 3. Catalizzatore secondo le rivendicazioni 1 e 2 in cui detti TDFE e TFE sono da S. Solfataricus.
4. 4. Catalizzatore secondo le rivendicazioni 1-3, in cui l'organismo ricombinante è scelto tra individui unicellulari procarioti e/o eucarioti.
5. 5. Catalizzatore secondo le rivendicazioni 1-4 in cui gli organismi ricombinanti esprimenti i due enzimi sono separatamente immobilizzati.
6. 6. Catalizzatore secondo le rivendicazioni 1-4 in cui gli organismi ricombinanti esprimenti i due enzimi sono mescolati e coimmobilizzati nella stessa matrice polimerica.
7. 7. Catalizzatore secondo le rivendicazioni 1-6 in cui gli organismi ricombinanti sono coimmobilizzati in una matrice polimerica di alginato di calcio.
8. 8. Processo per la produzione di trealosio caratterizzato dal fatto di essere condotto ad una temperatura di reazione compresa tra i 75 e gli 85 °C utilizzando i catalizzatori secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti.
9. 9. Processo secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto di essere condotto ad un pH di reazione compreso tra 4.5 e 6.5.
10. 10. Processo secondo le rivendicazioni 8 e 9, in cui il catalizzatore è utilizzato in un reattore a miscelazione o tubolare impaccato, di preferenza operato con flusso a pistone (Plug Flow Reactor), per la produzione in continuo di trealosio.