CN1938421A - 新的木聚糖酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及属于糖苷水解酶家族8的具有木聚糖分解活性的新酶。本发明特别涉及从产生木聚糖酶的细菌嗜冷菌株分离的具有由SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33，37任一所标识的氨基酸序列或其变体的酶。本发明的另一方面涉及相应的基因。发现这些酶的许多应用并有利地用于例如饲料和食品应用中如焙烤。与常规木聚糖酶相比较，只需要少量的酶就能获得所需的效果，如增加面包体积和/或增加焙烤产品的表面切割宽度。

Description

新的木聚糖酶及其用途
发明领域
本发明涉及具有木聚糖分解活性的新酶及其相应的基因。特别地，本发明涉及从嗜冷微生物分离的和/或属于糖苷水解酶家族8的木聚糖酶。发现本发明的酶具有许多应用且高度适用于面包改良组合物中。
发明背景
木聚糖是形成植物生物量中半纤维素主要成分的杂多糖。这些多糖的主链由β-1，4-连接的吡喃木糖苷残基链构成。可以用各种侧链基团，包括乙酰基，阿拉伯糖基和/或葡糖醛酸基取代基将该主链取代至不同程度。此外，木聚糖链的交联中或/和木聚糖和木质素链的交联中也可能涉及酚化合物如阿魏酸或羟基肉桂酸，通过酯结合。
木聚糖内切酶(也称为内-β-1，4-木聚糖酶，戊聚糖酶或半纤维素酶)特异性地水解木聚糖的主链。然而，一些情况中，可以通过侧基在空间上来阻碍它们的活性。已经描述了不同类型的木聚糖酶及其对底物的特异性相互之间是不同的，例如一些对不溶的阿拉伯糖基木聚糖更有活性。此外，所产生的寡聚物长度还取决于所考虑的木聚糖酶类型。
基于序列同源性已经将糖苷水解酶归类为93个家族( http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)，并因此反映出结构和机械特征。因为蛋白的折叠比序列更保守，可将一些家族分组为“异种集团(clan)”(Henrissat B.1991，Biochem.J.Vol.280，p.309)。
通常将内-β-1，4-木聚糖酶归为家族10(之前为家族F)和家族11(之前为家族G)，并发现在其pI和分子量之间通常具有反比关系。家族10木聚糖酶(EXs10)通常比家族11木聚糖酶(EXs11)更大和更复杂。此外，这些家族在它们的结构和催化特征中呈现了显著差异。EXs10呈现(α/β)8桶状折叠，具有约40％的α-螺旋结构并属于异种集团GH-A(Dominguez等，1995，Nat.Struct.Biol.Vol.2，p.569)，而Exs11呈现了β-胶状卷形折叠，具有约3-5％的α-螺旋结构并属于异种集团GH-C(T_rr_nen等，1994，EMBO J.Vol.13，p.2493)。EXs10具有较小的底物结合部位和较低的底物特异性。此外，与EXs11相比较，它们通常具有葡聚糖内切酶活性并产生较小的寡糖(Biely等，1997，J.Biotechnol.Vol.57，p.151)。迄今为止所表征的这两个家族的木聚糖酶水解后保持着糖苷氧的异头构型，其中两个谷氨酸通常起催化残基作用(Jeffries，1997，Curr.Opin.Biotechnol.Vol.7，p.337)。
木聚糖酶用于各种工业部门中，包括用于食品，饲料和一些技术工业中。
食品工业中，木聚糖酶用于水果，蔬菜和植物加工，葡萄酒制造和酿造，焙烤，磨粉，糕点和糖果以及咖啡加工中。它们在这些工业中的作用是完全不同的。例如，在水果和植物加工中，它们促进了浸渍过程，汁液澄清，提取产量和过滤效率，因此提高了加工性能和产品质量。木聚糖酶还在啤酒制造中降低了麦芽汁的粘度，在葡萄酒制造中促进了葡萄皮浸渍和降低了成品的混浊度。在焙烤中，木聚糖酶提高了面团的弹性和强度，因此使得更容易操作，获得更大的面包体积和改善的面包质地。在咖啡加工中，木聚糖酶降低了咖啡提取物的粘度并改善了干燥/冻干过程。
木聚糖酶进一步用于单胃动物(猪和家禽)和反刍动物的饲料中。其中，它们降低了非淀粉多糖的含量，因此降低了肠粘度并提高了饲料中存在的蛋白质和淀粉的利用。木聚糖酶改善了动物的行为表现并提高了降解差的饲料如大麦和小麦的可消化性和营养价值。
在淀粉工业中，使用木聚糖酶改善了谷蛋白-淀粉分离过程。
在纸浆和纸张工业中，将木聚糖用于促进制浆处理和减少机械制浆方法的使用，因此降低了能量消耗。木聚糖酶还提高了纸浆的原纤维形成和透水性，因此提高了加工效率和纸张强度。它们还有助于脱墨处理和减少了这些过程中碱的使用。
木聚糖酶进一步用于纺织品(亚麻，黄麻，苎麻，大麻，...)的酶解沤麻中，并因此减少或替代化学沤麻方法。它们还用于生物整治中，用于处理农业和食品工业废物。例如一些生物转化过程如可发酵产物，可再生燃料(生物乙醇)或精细化学品的生产也可以借助于木聚糖酶来进行。
将来还可以获得木聚糖酶的更多应用。
在焙烤中使用木聚糖酶(也称为木聚糖内切酶，内-β-1，4-木聚糖酶，戊聚糖酶或半纤维素酶)已经公知很多年了。这些面团调节酶可以提高面团的可加工性和稳定性以及烘烤膨胀和面包瓤结构。酶的其他效果是较大的面包体积和较软的面包瓤。
木聚糖酶在面包制作中的作用机理仍然没有得到清楚地阐明。小麦粉含有约3至4％戊聚糖。这些戊聚糖可以吸收大量的水(高达30％)且这种水吸收有助于面团的特性以及成品的质量。通过戊聚糖酶将戊聚糖部分水解成水溶性的短链寡糖提高了水结合量。此外，戊聚糖与面粉的谷蛋白部分强烈地相互作用形成网络。戊聚糖酶可以帮助松弛这种强而坚硬的网络，因此使得通过由酵母形成的二氧化碳使面团更好的膨胀。
已经有多种半纤维素酶制剂用于上述的应用中，这些制剂是可购得的。使用各种微生物作为酶源通过微生物发酵来生产这些制剂。这些酶中的一些还可以通过遗传改变的微生物来产生。所有用文件证明的商业用途的木聚糖酶涉及属于糖苷水解酶家族10或家族11的木聚糖酶，如之前所定义的。
商业木聚糖酶的实例是来自芽孢杆菌属(Bacillus)菌种，木霉属(Trichoderma)菌种，腐殖菌属(Humicola)菌种和曲霉属(Aspergillus)菌种的木聚糖酶。
最近已经公开了描述木聚糖酶领域中技术现状的很多综述(参见，例如Shallom D & Shoham Y.2003，Curr.Opin.Microbiol.Vol.6，p.219-Subramaniyan S & Prema P.2002，Crit Rev Biotechnol.Vol22，p.33-Beg QK，Kapoor M，Mahajan L & Hoondal GS.2001，ApplMicrobil Biotechnol.Vol.56，p.326)。
最近已经描述了属于糖苷水解酶家族10和11以外家族的木聚糖酶(参见，例如  http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/，EC代码为木聚糖酶3.1.2.8.，综述)。其中，一个实例是来自Pseudoalteromonashaloplanktis TAH3a的属于已经表征的糖苷水解酶家族8的木聚糖酶，且为此已经克隆了相应的基因(Collins T.等，2002，J.Biol.Chem.Vol.277，p.35133；Collins T.等，2003，J.Mol.Biol.Vol 328，P.419；Van Petegem F.等，2003，J.Biol.Chem.Vol 278，p.7531)。这种酶是典型的嗜冷酶并在低温呈现高度催化活性。它与家族10或11木聚糖酶不同源，但是与糖苷水解酶家族8成员(之前称为家族D)具有20至30％的同一性，家族8是主要包括葡聚糖内切酶，以及地衣多糖酶和壳聚糖酶的家族。此外，使用InterPro扫描检索程序(Zdobnov和Apweiler，2001，Bioinformatics Vol.17，p.847)的针对PRINTS的指纹扫描(FingerPRINTScan)表明所分离的序列包含糖基水解酶家族8的指纹。此外，所分离的序列含有迄今所分析的53个家族8酶中严格保守的家族8残基。
与大多数EXs10和EXs11相反，这种家族8木聚糖酶(EXs8)具有高pI和高分子量。结构和催化特性不同于EXs10和EXs11的那些。EXs8木聚糖酶呈现变形的(α/α)6桶状折叠，带有13个α-螺旋和13个β-链并属于异种集团GH-M(Van Petegem等2003，J.Biol.Chem.Vol.278(9)，p7531-9)。这种酶不具有葡聚糖内切酶，壳聚糖酶或地衣多糖酶活性且似乎功能上与EXs11相似，对长链木聚糖-寡糖更有活性。
与其他表征的保留异头构型的EXs10和EXs11相反，家族8糖苷水解酶(Fierobe等，1993.，Eur.J.Biochem.Vol.217p557；http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/)易于水解糖苷氧异头构型倒位的底物。来自Pseudoalteromonas haloplanktis的嗜冷木聚糖酶已经表明了这一点(Collins，T.等，2002.J.Biol.Chem.Vol.277，p.35133)。此外，认为水解中所涉及的催化残基是谷氨酸和天冬氨酸。
存在评价酶制剂中木聚糖酶活性的多种方法。这类用于木聚糖酶活性测定的方法实例包括：测量还原糖从木聚糖的释放(Miller G.L.1959，Anal.Chem.Vol.31，p.426)，或测量有色化合物从改性底物的释放(例如，来自Megazyme的AzoWAX或Xylazyme AX)。然而，已经表明在各种酶制剂中发现的木聚糖分解活性和在特定应用中的效果之间没有直接相关性。例如在焙烤中，对于单个酶可以在某种程度上观察到剂量相关结果，但相同剂量的不同来源的两种木聚糖酶在面团或面包中没有产生相同的结果。有几个原因可以解释这一点：底物特异性的不同，最佳温度和pH的不同，催化效率的不同，...
有极大的兴趣来开发新的酶制剂，如，但不限于，用于具有新的或改进特性的面包改良组合物或改良剂的成分。这些特性之一是木聚糖酶含量尽可能地低(以获得特定结果所需要的酶重量计)。
发明目的
本发明的目的在于提供具有木聚糖分解活性的新酶和酶制剂。
本发明进一步的目的在于提供编码这些酶的氨基酸和核苷酸序列及其变体。
本发明的另一个目的是提供用于农业食品，饲料和许多其它技术方法中的酶和酶制剂。
本发明的再一个目的是提供具有木聚糖分解活性的酶和酶制剂，其中在特定应用中观察到特定效果所需要的量远远低于任何常规的商业酶。
仍然本发明的另一个目的是提供具有木聚糖分解活性的酶和酶制剂，其比本领域已知的酶明显更稳定，且优选同时更有效(通过获得给定效果所需要的量显著更低来反映)。
发明概述
本发明涉及新的木聚糖分解酶，优选属于糖苷水解酶家族8且优选是嗜冷酶，最优选是水解异头构型倒位的嗜冷酶，附带条件是所述的木聚糖分解酶不是由SEQ ID NO：1编码的。
有利地，本发明的酶当以1500至6000木聚糖酶单位/100kg面粉的浓度应用时，增加了焙烤产品的面包体积至少10％，和/或当以1500至6000木聚糖酶单位/100kg面粉的浓度应用时，增加了焙烤产品表面的切割宽度。本发明的酶可以有利地用于冷冻面团中和/或涉及低温醒发成形的应用中。
优选，酶包括对应于SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16或35中任一的氨基酸序列，或由该氨基酸序列构成。这些序列含有426个氨基酸(aa)，其中头21个构成信号肽。优选的序列是SEQ ID NO：4，表示从TAH 2a分离的木聚糖酶。
优选，所述的酶-由以上SEQ ID NO之一标识的-属于糖苷水解酶家族8并优选是嗜冷酶。
本发明的另一方面涉及以上任一种的成熟多肽，对应于以上任一序列的aa 22-426。根据本发明优选的氨基酸序列是SEQ ID NO：21，23，25，27，29，31，33和37和SEQ ID NO：20，22，24，26，28，30，32和36，编码这些成熟多肽的相应核苷酸序列。
本发明的酶还可以具有少于10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个aa不同于以上任一氨基酸序列(成熟蛋白或多肽)的氨基酸序列，或具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37任一高于50％，70％，更优选高于80％，85％，90％，最优选高于95％，97％，98％或甚至更优选99％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的酶优选从以下任一细菌菌株中分离：TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2或SP.23.2bis。这些菌株涉及本发明的另一个方面。
本发明的另一个方面涉及编码以上任一种木聚糖分解酶的核苷酸序列。
优选的这样的核苷酸序列是包括SEQ ID NO：19并编码由SEQ IDNO：4，6，8，10，12，14，21，23，25，27，29或31所标识的TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2或Sp.11.2木聚糖酶的序列。
其他优选的核苷酸序列是编码以上标识的前蛋白或成熟多肽之一的那些。这样的核苷酸序列实例包括SEQ ID NO：3，5，7，9，11，13，15，34，20，22，24，26，28，30，32和36。
本发明的再一方面涉及重组核苷酸序列，包括一个或多个以上核苷酸序列，可操作地连接一个或多个相邻的调控序列。本发明的另一方面涉及含有所述核苷酸序列的载体和用其转化的宿主细胞。
本发明的优选实施方案涉及掺入大肠杆菌(Escherichia coli)中的质粒，大肠杆菌具有选自LMBP 4860，LMBP 4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865和LMBP 4866的保藏号。优选LMBP4862。
本发明的酶可以是胞外表达的或胞内表达的。可以直接使用表达根据本发明的酶的细胞或细胞培养物和/或只使用其中分泌了酶的细胞培养物的上清液。或者，可以将细胞提取物和/或无细胞提取物用作本发明的酶源。最后，可以在纯化或部分纯化后(至少一个纯化步骤后)使用酶，也就是或多或少纯的形式。
本发明的木聚糖酶高度适用于涉及植物细胞壁成分降解的应用中。例如，它们有利地用于分解植物和水果，优选水果的方法中，豆汁，啤酒，纸张，淀粉，谷蛋白或植物油的制备过程中。其他应用包括它们在水果，蔬菜和植物加工，葡萄酒制造或酿造，咖啡加工，纸张或纺织品加工，生物转化过程，分解废物过程，优选用于分解农业废物或造纸厂废物，淀粉-谷蛋白分离过程，饲料制备，焙烤，磨粉，糕点和糖果加工中的用途。
本发明的酶特别适用于食品应用中。
对于一些应用，有利的是将上述细胞，上述细胞提取物的成分和/或根据本发明的具有木聚糖分解活性的一种或多种纯化酶固定于固体支持物上。
本发明的酶可以用于面包改良剂或面包改良组合物中。除了根据本发明的一种或多种木聚糖分解酶，所述的改良剂或改良组合物可以进一步含有至少一种其他的面包改良剂，这些其他的面包改良剂选自其他酶，乳化剂，氧化剂，奶粉，脂肪，糖，氨基酸，盐和蛋白质(谷蛋白，纤维素结合部位)或其混合物。所述的其他酶优选选自α-淀粉酶，β-淀粉酶，生成麦芽糖的淀粉酶，其他木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化-还原酶，葡聚糖酶，纤维素酶，转谷氨酰胺酶，异构酶，脂酶，磷脂酶，果胶酶或其混合物。所述的α-淀粉酶优选是从米曲霉(Aspergillus oryzae)获得的α-淀粉酶。
优选在面团混合过程中加入上述的面包改良组合物。
本发明的酶可以结合任何其他酶或配料并可以以例如干粉或颗粒尤其是无粉尘颗粒的形式来使用。或者，可以以液体形式来使用，优选和一种或多种稳定剂如多元醇，糖，有机酸或糖醇一起使用。
本发明的最后一方面涉及包括至少一种，优选至少两种或三种本发明的酶的组合物，可能结合Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a木聚糖酶，例如由SEQ ID NO：1编码的。
附图简述
图1a和b各自表示了Pseudoalteromonas haloplanktis TAH 3a木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
图2表示了TAH 2a(圆形，实线)，TAH 4a(方块，虚线)和TAH7a(三角形，短虚线)的木聚糖分解活性的温度相关性。
图3a和b各自表示了菌株TAH 2a木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
图4a和b各自表示了菌株TAH 4a木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
图5a和b各自表示了菌株TAH 7a木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
图6a和b各自表示了菌株Sp.10.1木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
图7a和b各自表示了菌株Sp.10.2木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
图8a和b各自表示了菌株Sp.11.2木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
图9a和b各自表示了菌株Sp.23.2木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
图10显示了菌株TAH 3a，TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1.，Sp.10.2.，Sp.11.2.，Sp.23.2 & Sp.23.2bis的木聚糖酶的核苷酸序列比对。在比对之下的符号*表示所列的所有序列中相同的核苷酸。
图11显示了菌株TAH 3a(xy13)，TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1.，Sp.10.2.，Sp.11.2.，Sp.23.2 & Sp.23.2bis的木聚糖酶的氨基酸序列比对。在比对之下的符号*表示所列的所有序列中相同的氨基酸。
图12显示了Sp.11.2，Sp.23.2bis，TAH 2a和TAH 7a纯化木聚糖酶的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。
图13显示了蛋白质(木聚糖酶)的相对含量和根据本发明的不同木聚糖酶在焙烤中性能之间的关系。
图14显示了优选的核苷酸序列：SEQ ID NO：19。
图15显示了本发明的木聚糖酶在焙烤测试中的体积-响应曲线。
图16a和b各自显示了菌株Sp.23.2bis木聚糖酶的核苷酸(a)和氨基酸(b)序列。
通过参考附图将在以下的实施例和实施方案中进一步详细地说明本发明。特定的实施方案和实施例不以任何方式来限制所要求的本发明的范围。
发明详述
A.根据本发明的产酶微生物的分离
本发明的第一方面涉及能够产生具有新特性的木聚糖酶的未鉴定的微生物的分离。
有利地，这些微生物是从南极和北极环境中采集的环境样品中分离的嗜冷微生物。文献中描述了关于从这样的样品中分离嗜冷微生物的方法(Collins T.等，2002，J.Biol.Chem.Vol.277，p.35133)。
通常这些方法包括将合适稀释度的样品涂布于各种组成的固体培养基上。通常在低温(约4至约20℃)下进行培养，使得嗜冷微生物生长。
根据本发明的优选实施方案，固体培养基含有木聚糖酶的底物如含有半纤维素的材料或木聚糖。
根据本发明的更优选实施方案，固体培养基含有木聚糖酶的衍生化底物，如例如，RBB-木聚糖(Remazol Brilliant Blue木聚糖，Sigma)。这种底物可以更好地、通常更灵敏地筛选阳性木聚糖酶产生微生物。
显而易见的是除了在此所述的那些，存在筛选木聚糖酶阳性微生物的其他技术。一种这样的技术涉及微生物的系统液体培养，例如使用含有木聚糖酶诱导剂如但不限于木聚糖，麦麸等的培养基，接着进行培养物上清液和/或细胞提取物的酶法分析。
根据本发明的另一实施方案，分离的木聚糖酶阳性微生物可以在或不在属或种的水平上得到鉴定。技术如脂肪酸分析或16S rDNA序列分析是公知鉴定技术的实例。
本发明更特别地涉及分离的菌株TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp10.1，Sp10.2，Sp11.2，Sp23.2和Sp23.2bis。
TAH2a，TAH4a和TAH7a是细菌菌株，更具体地是Pseudoalteromonas属的细菌菌株。
B.木聚糖酶编码基因的分离
本发明涉及从上述菌株分离木聚糖酶编码基因。
本领域技术人员公知几种技术可用于从微生物分离特定的基因。这样技术的实例包括从合适载体中的菌株的基因组DNA构建基因文库，接着通过目标基因的直接表达，或通过与推测的密切相关基因或与从所述酶的部分或完整氨基酸序列的逆转录设计的寡核苷酸杂交来筛选该文库。
其他技术包括通过分子技术例如PCR技术来扩增基因，使用从推测的密切相关基因设计的简并或非简并寡核苷酸引物。
根据本发明的优选实施方案，用于设计这样的寡核苷酸引物的起始序列是从Pseudoalteromonas haloplanktis TAH 3a分离的木聚糖酶基因序列(EMBL登录号AJ427921，所包括的序列引入作为参考，还参见图1a或SEQ ID NO 1)。
本发明的一方面涉及分离的(和纯化的)编码根据本发明的酶的核苷酸序列SEQ ID NO：3，5，7，9，11，13，15，34，20，22，24，26，28，30，32，36或其变体。
在本情况下，“变体”定义为其中一个或几个核苷酸已经被其他核苷酸替代或其中一个或几个核苷酸已经被添加和/或缺失而编码的酶仍然呈现木聚糖分解活性的分离的核苷酸序列。
根据本发明优选的实施方案，变体的核苷酸序列呈现与分离的序列高于50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，优选高于97％，98％或甚至高于99％序列同一性。根据本发明更优选的实施方案，变体的核苷酸序列与SEQ ID NO：3，5，7，9，11，13，15，34，20，22，24，26，28，30，32或36相比较，呈现少于20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个修饰的核苷酸。
C.本发明的木聚糖酶的表征
本发明的另一方面涉及由上述任一核苷酸序列编码的具有木聚糖分解活性的酶。
根据本发明的优选实施方案，该酶的氨基酸序列选自SEQ IDNO：4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33，37或其变体。
在本情况下，“变体”定义为其中一个或几个氨基酸已经被一个或几个其他氨基酸替代的分离的氨基酸序列，或其中已经添加和/或缺失了一个或几个氨基酸而保留全部或大部分的木聚糖酶活性的分离的氨基酸序列。变体酶优选保留至少80％，更优选至少90％和最优选至少95％或甚至99％的由SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37表征的任一种酶的木聚糖分解活性。
根据本发明的优选实施方案，变体的氨基酸序列呈现与SEQ IDNO：4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37任一序列高于50％，70％，更优选高于80％，85％，90％，最优选高于95％，97％，98％或甚至高于99％序列同一性。根据本发明更优选的实施方案，变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37任一相比较，呈现少于4，3，2或1个修饰的氨基酸。
公知大多数分泌的酶，如本发明的酶，在其N末端具有驱动酶从细胞中分泌出来的小氨基酸序列。因此本发明的目的还将酶的成熟部分视为本发明的组成部分(参见，例如，SEQ ID NO：21，23，25，27，29，31，33或37)。然而，可以有利地使用含有信号序列修饰的变体，因为这些变体最终在重组宿主中能够得到更好的表达和/或更好的分泌。
对于由SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，14，16或35任一所标识的酶，成熟蛋白起始于第22位氨基酸。
表征蛋白和/或酶的另一种方法是研究它们与已知蛋白的同一性或相似性。第一步可以使用Blast程序，将所限定的序列与所有可获得的公开序列进行比较。该程序可以在以下URL( http://www.nebi.nlm.nih.gov/blast/)在线使用。为了确定和明确两个或多个蛋白之间的同一性/相似性的百分比，可以有利地使用程序Clustal( http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或Align( http://www2.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)
表征新蛋白和/或酶的另外的方法是分析它们的三维结构。一些情况中，这种三维结构是未知的。然而，通过与相关蛋白的其他可获得的结构相比较，本领域技术人员使用例如专门的软件可以推演该三维结构。此外，对于非常密切相关的蛋白质，例如具有高于90％同一性/相似性的蛋白质，可以预测由氨基酸序列中的特定修饰(例如，氨基酸替代)引起的特性改变。这样的改变可以是例如底物结合，蛋白质稳定化，...
本发明的另一方面涉及通过它们的生化特性如分子量，最佳温度或最佳pH来表征本发明的木聚糖酶。实际上，通过以下实施例，本发明所述的酶具有相对低温的最佳活性。此外，它们在低温保持了高的催化效率并因此被认为是嗜冷木聚糖酶。限定嗜冷酶的一种方法是考虑酶在5℃保持至少40％的其最大活性。其他特性也可以用来限定嗜冷酶(参见例如，Georlette D.等，2004，FERM Microbiol.Rev.Vol.28，p.25；D’Amico S.2002，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.Vol.357，p.917)。
然而，不排除存在具有上述序列特征但具有不同生化特性的酶。
D.酶的表达和/或纯化
本发明的另一方面涉及重组核苷酸序列，由可操作地连接一个或多个上述本发明的核苷酸序列的一个或多个相邻调控序列组成。
所述的相邻调控序列可以源自同源和/或异源微生物。
这些相邻调控序列是特定的序列，如但不限于启动子，调节基因，分泌信号和/或终止子。
本发明的另一方面涉及含有一个或多个本发明的核苷酸序列的载体，可能可操作地连接一个或多个源自同源或/和异源微生物的相邻调控序列。
本发明内容中，将“载体”定义为可以用于(通过转导，转染，转化，感染，接合等)将核苷酸序列引入细胞中的任何生化构建体。有利地，本发明所述的载体选自质粒，病毒，噬菌粒，染色体，转座子，脂质体，阳离子泡囊和/或其混合物。所述载体可以已经含有一个或多个上述的相邻调控序列(使其通过所述的微生物表达并翻译成相应的肽)。优选，所述载体是掺入大肠杆菌中的质粒并具有选自LMBP4860，LMBP 4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865和LMBP 4866的保藏号。
本发明还涉及用一个或多个上述的根据本发明的核苷酸序列和/或载体“转化的”宿主细胞，优选重组宿主细胞。
本发明内容中，将“由一个或多个根据本发明的核苷酸序列和/或载体转化的”“宿主细胞”定义为具有掺入的所述核苷酸序列和/或所述载体的细胞。转化的宿主细胞可以是其中通过遗传转化，优选通过同源重组，或通过另一种公知的产生/形成重组生物体的方法引入所述载体和/或所述核苷酸序列的细胞。
“宿主细胞”可以是转化之前没有天然(原始)含有所述核苷酸序列和/或所述载体的细胞。或者，“宿主细胞”还可以是已经含有本发明的核苷酸序列之一的原始细胞，且遗传上改变的(重组宿主细胞)超表达或更有效地表达所述酶(更好的pH或温度特征，更高的细胞外表达，...)。
优选，所述的宿主细胞能够超表达(比在原始或野生型微生物中观察到的表达更高的表达)所述核苷酸序列和/或所述载体，有利地使得由所述核苷酸序列和/或所述载体编码的氨基酸序列的高产量。可以将本发明所述的分离和纯化的核苷酸序列整合至选定宿主细胞的基因组中和/或可以存在于所述宿主细胞中的游离基因载体上。
有利地，本发明的重组宿主细胞选自微生物界，优选选自细菌或真菌，包括酵母。
更优选重组宿主细胞属于芽胞杆菌属。
优选，改变所述的重组宿主细胞来获得木聚糖酶的高水平表达。这可以通过使用能够指导重组宿主细胞内一个或多个本发明的核苷酸序列超表达的相邻调控序列或通过增加根据本发明的核苷酸序列的拷贝数目来获得。
以上已经描述了一些优选用于培养选定来表达本发明的木聚糖酶的宿主细胞的条件(培养基，温度和pH条件等)。为此，用设计来表达所述酶的DNA构建体转化的原始生产种和/或合适的宿主细胞存在于合适的生长培养基和/或表达培养基之内或之上。
根据本发明，所述具有木聚糖分解活性的蛋白可以通过以下方法获得：首先将菌株在适于表达木聚糖的培养基之中/之上培养菌株，接着进行一个或几个纯化步骤，如但不限于，离心，细胞破碎，微滤，超滤，沉淀，液相色谱，冻干等。所有这些技术描述于科学文献且是本领域技术人员公知的。
因此，根据本发明生产的具有木聚糖分解活性的酶可以直接用于本发明的目的之一和/或，另外，可以经受一个或多个如上所述的纯化和/或(进一步的)培养步骤。本发明的特定实施方案中，可以以纯的形式来使用本发明的酶。
本发明的酶的制备方法其中包括从摇瓶或发酵器中的重组或未重组微生物的培养物的制备和/或纯化，和从固定化培养物的制备或纯化，以及从活细胞(植物，...)的提取和/或纯化。
E.酶的应用
本发明的木聚糖酶可以用于不同类型的应用中。
本发明中所述的具有木聚糖分解活性的酶，纯化的或未纯化的，特别适宜用作面包改良剂或配方。面包改良剂或组合物是能够改善和/或提高质地，风味，保鲜效果，柔软度，存储时的面包瓤柔软度，新鲜度，面团可加工性和/或面团和/或最终焙烤产品体积的产品。优选，所述的具有木聚糖分解活性的酶改善了面团加工和/或增加了最终焙烤产品的比体积。
术语“焙烤产品”包括从面团制得的和焙烤面团后获得的任何产品，并特别包括酵母发酵的焙烤产品。从任何类型的面粉或粗粉(例如，基于小麦，黑麦，大麦，燕麦或玉米)获得面团。优选，用小麦和/或包括小麦的混合物制得面团。
本发明的一方面显示了本发明所述的具有木聚糖分解活性的酶可以有利地用于面包改良剂配方或面包改良组合物中。
这些具有木聚糖分解活性的酶有利地选自糖苷水解酶家族8的酶。
这些具有木聚糖分解活性的酶有利地是嗜冷酶。
结果显示了所述的酶增加了焙烤产品的面包体积。
进一步显示了在焙烤中获得特定结果需要的所述酶的量比用商业获得的酶操作时通常所用的/所需的量低得多。将这样的量另外称为足以获得所需结果的量和/或有效量。
另外的方面中，本发明涉及所述具有木聚糖分解活性的酶和其他酶，尤其是和α-淀粉酶，优选来自米曲霉的α-淀粉酶的相加效应。所述具有木聚糖分解活性的酶可以结合其他面包改良剂一起使用，这些改良剂如但不限于酶，乳化剂，氧化剂，奶粉，脂肪，糖，氨基酸，盐，蛋白质(谷蛋白，纤维素结合部位)，这样的改良剂是本领域技术人员公知的。这些酶的实例包括，但不限于，α-淀粉酶，β-淀粉酶，生成麦芽糖的淀粉酶，木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化-还原酶，葡聚糖酶，纤维素酶，转谷氨酰胺酶，异构酶，脂酶，磷脂酶，果胶酶等。
根据本发明，具有木聚糖分解活性的酶，纯化的或未纯化的，在细胞壁成分存在下显示出水解活性。特别地，所述酶降解小麦细胞壁成分。因此所述酶可以有利地用于分离植物细胞材料的成分，如谷类成分。特别地，所述酶可以用于提高通过所谓的洗面筋法将小麦分离成谷蛋白和淀粉。
根据本发明，具有木聚糖分解活性的酶，纯化的或未纯化的，可以用于食品加工中。它们可以用于水果，蔬菜和植物加工中。它们可以用于葡萄酒制造和酿造中以及用于咖啡加工中。
所述酶的另一种应用在于饲料，其中它们可以用于提高动物如家禽，猪或反刍动物的生长速率或饲料转化率。
另外其他的应用是本发明的木聚糖酶在制纸浆和造纸工业中(生物机械制纸浆，纤维的生物改性，生物脱墨，...)，纺织品加工中，生物整治中，生物转化过程中，...的用途。
根据本发明的具有木聚糖分解活性的酶可以在几种形式下使用。表达该酶的细胞，如酵母，真菌，古细菌或细菌，可以直接用于操作过程中。还可以以细胞提取物，无细胞提取物(即，已经经过一个或多个破碎，离心，提取和/或其他纯化步骤的宿主细胞的部分)或以纯化的蛋白来使用所述酶。上述任一种形式可以结合上述任一种形式的一种或多种酶来使用。这些完整的细胞，细胞提取物，无细胞提取物和/或纯化的酶可以通过任何常规方法固定于固体支持物上来保护酶，使底物连续水解和/或使酶制剂重复利用。所述的细胞，细胞提取物(包括粗的和部分纯化的提取物)，无细胞提取物和/或酶可以与不同的成分混合，并可以例如以干粉或颗粒，尤其是无粉尘颗粒的形式，以液体的形式来使用，例如根据公知的方法和如多元醇，糖，有机酸或糖醇的稳定剂一起使用。
实施例
实施例1：木聚糖酶产生微生物的分离和表征
从在南极洲Terre Adelie，Port Martin废弃的法国南极站(66°40’S；140°01’E)附近采集的木材样品或从在挪威斯瓦尔巴特群岛Spitzberg，Ny-Alesund附近采集的海水样品中分离木聚糖酶产生微生物。在补充了0.15％Remazol Brilliant Blue-木糖的marine琼脂(5g/l胰蛋白胨(Difco)，1g/l酵母提取物(Difco)，33g/l海盐(Wiegandt)，18g/l琼脂(Difco))上在4℃进行木聚糖酶活性的筛选。木聚糖酶产生微生物周围出现明显的晕圈，分离得到7个菌株。将从南极洲分离的微生物命名为TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，并将从Spitzberg分离的微生物命名为Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis。
已经测定了TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a菌株的细胞脂肪酸组成。这三个菌株最可能属于Pseudoalteromonas菌种。
实施例2：野生型木聚糖酶的产生
培养条件
将分离的木聚糖酶产生细菌菌株TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis在改良marine培养液(5g/升胰蛋白胨(Difco)，1g/升酵母提取物(Difco)，20g/升海盐(Wiegandt))中4℃培养72小时，所述的改良marine培养液(在TAH 2a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis的情况中)补充了15g/升桦木木聚糖(Sigma)或(在TAH 4a的情况中)补充了15g/升小麦半纤维素(Beldem)。
酶的制备
将上述培养物(参见以上的培养条件)在18,000×g和4℃离心1小时后，用80％硫酸铵沉淀来浓缩上清液，并重悬浮于pH8.0的20mMMOPS(3-(N-吗啉基)丙烷磺酸)中。将该悬浮液与TAH 4a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis木聚糖酶一起用于焙烤试验中。然而，在TAH 2a和TAH 7a的情况中，首先将重悬浮样品对含有300mM NaCl的20mM MOPS透析过夜并在18,000×g离心1小时。对于这些样品，将由此获得的可溶部分(上清液)和不溶部分用于焙烤试验中(参见实施例3)。
酶的表征
在各种温度下测定从菌株TAH 2a，TAH 7a(如上所述的可溶和不溶部分)获得的和从菌株TAH 4a获得的木聚糖酶的活性。该实验的结果呈现于图2中。木聚糖酶在20℃至40℃之间呈现了最大活性并在5℃保持高于40％的活性。
实施例3：焙烤试验
进行焙烤试验来证明实施例2中所获得的木聚糖酶在焙烤中的正面效果。通过与可购得的木聚糖酶相比较和与不含有任何这些酶的参照相比较的面包体积的增加来评价正面效果。
在比利时每天大量生产的比利时硬面包卷中来测试本发明的木聚糖酶。所述的程序是专业面包师公知的且使用其他方案或来自其他供应商的设备可以获得相同结果是本领域技术人员显而易见的。
所用的配料列于以下的表1中：
表1
配料(g)
面粉(Surbi-Molens van Deinze) 1500
水 915
新鲜酵母(Bruggeman-比利时) 90
氯化钠 30
Multec Data HP 20(Beldem-比利时) 3.9
抗坏血酸 0.12
木聚糖酶 参见表2
将配料在Diosna SP24混合机中低速混合2分钟，高速混合8分钟。成品面团温度以及静置和醒发温度为25℃。在25℃静置15分钟后，将面团重新用手揉捏并再静置10分钟。此后，加工成2kg的面团块并醒发10分钟。使用Eberhardt Optimat来分割2kg的面团块并成型。获得66g的圆形面团块。再静置5分钟后，通过压制来切割面团块并经过70分钟的最后醒发阶段。将面团块在使用蒸汽的MIWECondoTM烤炉(Michael Wenz-Arnstein-德国)中230℃焙烤。使用常用的油菜籽顶替方法来测量6个面包卷的体积。
焙烤试验的结果呈现于以下的表2中：
表2
 木聚糖酶样品 木聚糖酶单位/100kg面粉(*) 与没有用木聚糖酶的对照相比较的面包卷体积增加(％)
 Belase B210(Beldem-比利时) 1050  16
 TAH 2a可溶(**) 6000  15
 TAH 2a不溶 6000  12
 TAH 4a 6000  25
 TAH 7a可溶 6000  12
 TAH 7a不溶 6000  14
 Sp.10.1 6000  15
 Sp.10.2 6000  14
 Sp.11.2 6000  13
 Sp.23.2.bis 6000  20
(*)将一单位的Belase B210木聚糖酶定义为在30℃和pH4.5从桦木木聚糖释放1μmol还原糖(以木糖来表示)所需要的酶用量(Nelson-Somogyi方法)。将一单位的其他木聚糖酶定义为在25℃和pH6.5从桦木木聚糖释放1μmol还原糖(以木糖来表示)所需要的酶用量(二硝基水杨酸方法，Miller，G.1959，Anal.Chem.Vol.31，p.426)。
(**)可溶的意思是上清液中存在的(可溶)酶部分(参见上文)。
上述结果表明所测试的所有木聚糖酶对面包体积都具有正面效果。
实施例4：木聚糖酶基因的克隆
细菌菌株和培养条件
将实施例1中所述的TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis菌株在上述的改良Marine培养液中培养16小时(参见实施例2)。
基因组DNA的制备
用Wizard_基因组DNA纯化试剂盒(Promega)从在上述培养基中37℃培养16小时的培养物中提取和纯化基因组DNA。
木聚糖酶基因的克隆
使用VENT聚合酶(Biolabs)来PCR-扩增木聚糖酶基因，使用有义引物：5’-GGG CATATGAAAGTATTTTTTAAAATAACAACTT-3’SEQ ID NO：17，含有NdeI位点(带下划线的)和反义引物：5’-GGG CTCGAGTTAATTAAACGTGTTGTTATAAAA-3’SEQ ID NO：18，含有XhoI位点(带下划线的)和终止密码子(斜体)。所用的基因组DNA模板浓度对于每种来源的分离物是最佳化的。95℃初始变性3分钟后，使用Progene装置(Techne Cambrige，UK)进行25个循环的扩增。每个循环包括95℃变性1分钟，54℃杂交30秒，和72℃延伸1.5分钟。
使用由供应商推荐的程序将从每个分离物获得的片段克隆至PCRScript Amp SK(+)载体(Stratagene)中，并用于转化XL10-Gold_Kan超感受态细胞(Stratagene)。蓝-白选择使得可以选择带有PCR片段的白色集落。使用ALF DNA测序仪(Pharmacia Biotech)来测定插入片段的序列，使用纯化的质粒制剂(Nucleospin质粒，Macherey-Nagel)。
木聚糖酶基因的序列
TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.10.1，Sp.10.2，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis木聚糖酶基因的序列显示于图3-10a和16a中(SEQ IDNO：3，5，7，9，11，13，15，34)及其相应的氨基酸序列显示于图3-10b和16b中(SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16，35)。SEQ IDNO：20，22，24，26，28，30，32和36给出了编码成熟蛋白部分的序列。
这些序列相互之间高度相似且还与Pseudoalteromonashaloplanktis TAH 3a木聚糖酶基因的公开序列(EBML登录号AJ427921)同源。本发明中描述的所有酶都属于糖苷水解酶家族8。
使用缺省参数的Clustalw多序列比对( http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)的结果呈现于图10(核苷酸序列)和图11(氨基酸序列)中。
所有新的序列与已知的公开序列相差至少20个核苷酸或至少4个氨基酸(参见以下)。
所有上述标识的氨基酸序列中，成熟蛋白(酶)起始于第22位氨基酸。
通过使用缺省参数的Blast检索( http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/)鉴定的最密切相关的氨基酸序列是：
1/已经表征的来自Pseudoalteromonas haloplanktis TAH 3a的家族8木聚糖酶(92至98％序列同一性)。
2/来自哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)的具有C-末端OMP(外膜蛋白)结构域的未表征的1748个氨基酸长的蛋白质(在412个氨基酸跨度上33至34％的同一性)。
3/来自Bacillus halodurans的木聚糖酶Y(31至32％的同一性)
4/来自芽胞杆菌属菌种KKI的木聚糖酶Y(28至30％的同一性)。
已经鉴定了公开的Pseudoalteromonas haloplanktisTAH 3a木聚糖酶序列和本发明的木聚糖酶序列之间的氨基酸差异并列于以下的表3中。还显示了它们在结构中的各自位置，基于公开的结构(VanPetegem F.等，2003，J.Biol.Chem.Vol.278，p.7531)。
表3
TAH 3a木聚糖酶残基(成熟序列)         涉及的新木聚糖酶 新木聚糖酶(成熟序列)中的突变 TAH 3a木聚糖酶3D结构中的定位
Asn 4  Sp.10.2  Ser 4 环(N-端)
Ser 7  TAH 7a  Thr 7 环
Ala 11  TAH 7a  Pro 11 α螺旋样
Ser 14  TAH 7a  Leu 14 α螺旋样
Thr 16  Sp.10.1，Sp.10.2，Sp23.2bis  Ala 16 环
Asn 19  TAH 7a  Tyr 19 环/α螺旋
Met 24  TAH 7a  Leu 24 α螺旋
Gly 25  TAH 7a  Arg 25 α螺旋/环
Thr 27  TAH 7a  Arg 27 环
Asn 28  TAH 7a  Thr 28 环
Gln 30  TAH 7a  Arg 30 α螺旋
Lys 32  TAH 7a  Ser 32 α螺旋
Asp 38  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Asn 38 α螺旋
Tyr 43  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Ser 43 环(表面)
Gln 47  TAH 7a  Leu 47 环(表面)
Gln 48  TAH 7a  His 48 环(表面)
Leu 49  TAH 7a  Pro 49 β-折叠(N-端)
Tyr 51  TAH 2a  Thr 51 β-折叠
Thr 54  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Ser 54 β-折叠
Gly 57  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Asp 57 环
Val 58  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Ala 58 β-折叠(N-端)
Ala 61  TAH 4a  Thr 61 β-折叠
Val 88  Sp.23.2，Sp23.2bis  Ile 88 α螺旋
Asn 91  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Tyr 91 环
Asp 111  TAH 7a  Ala 111 环(表面)
Ala 116  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.23.2，sp23.2bis  Val 116 环(表面)
Asn 167  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Asp 167 α螺旋/环
Asn 170  TAH2a，TAH4a，TAH7a  Ala 170 α螺旋
Thr 174  Sp.10.1，Sp.10.2  Ile 174 α螺旋
Glu 185  Sp.10.1  Asp 185 β-折叠(C-端)
Glu 185  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Gln 185 β-折叠(C-端)
Ile 195  Sp.11.2  Leu 195 环
Lys 222  Sp.10.1  Gln 222 α螺旋
Asn 223  Sp.23.2，Sp.11.2，Sp.10.1，sp23.2bis  Thr 223 α螺旋
Ser 244  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Asn 244 环
Gly 245  Sp.10.1，Sp.10.2，TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Asp 245 环
Ser 246  Sp.10.1，Sp.10.2，TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Asn 246 环
Gly 270  Sp.11.2  Asp 270 环(接近活性位点)
Trp 283  Sp.23.2  Cys 283 α螺旋(接近活性位点)
Ile 286  Sp.23.2  Phe 286 α螺旋
Asp 292  Sp.23.2，Sp23.2bis  Glu 292 α螺旋
Leu 295  Sp.23.2  Phe 295 α螺旋(C-端)
Ser 304  TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a  Asn 304 α螺旋
Asn 323  Sp.10.1  Tyr 323 环(表面)
Arg 337  Sp.11.2，Sp.10.1，Sp.10.2，TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp23.2bis  Lys 337 环
Ala 358  TAH 4a，TAH 7a  Thr 358 α螺旋(N-端)
Glu 367  TAH 4a，TAH 7a  Asp 367 α螺旋
Asp 377  Sp.11.2，Sp.10.1，TAH 2a  Ser 377 环
Asp 377  Sp.10.2，Sp23.2bis  Asn 377 环
实施例5：木聚糖酶的纯化
分离的木聚糖酶的超表达
用NdeI和XhoI从PCRScript Amp SK(+)(参见以上的实施例4)切除木聚糖酶基因片段并连接至pET 22b(+)表达载体(Novagen)。将所得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Stratagene)中。
将质粒pXYP4至pXYP10转化至大肠杆菌JM109(LMBP 4860至LMBP4866)中。
将含有菌株TAH 4a木聚糖酶基因的质粒标记为pXYP4(参见LMBP4860)。
将含有菌株TAH 7a木聚糖酶基因的质粒标记为pXYP5(参见LMBP4861)。
将含有菌株TAH 2a木聚糖酶基因的质粒标记为pXYP6(参见LMBP4862)。
将含有菌株Sp.10.1木聚糖酶基因的质粒标记为pXYP7(参见LMBP4863)。
将含有菌株Sp.10.2木聚糖酶基因的质粒标记为pXYP8(参见LMBP4864)。
将含有菌株Sp.11.2木聚糖酶基因的质粒标记为pXYP9(参见LMBP4865)。
将含有菌株Sp.23.2bis木聚糖酶基因的质粒标记为pXYP10(参见LMBP 4866)。
木聚糖酶的纯化
如所述的(Collins等，2002，参见上文)从重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株的液体培养物纯化TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp10.1，Sp10.2，Sp11.2，Sp23.2和Sp.23.2bis菌株的木聚糖酶。将表达实施例2的克隆基因之一的5ml大肠杆菌重组菌株的过夜预培养物(18℃)在10,000×g离心1分钟并将沉淀重悬浮于3升摇瓶的300ml含有200μg/ml氨苄青霉素的Terrific培养液(12g/l Bacto胰蛋白胨(Difco)，24g/l酵母提取物(Difco)，4ml/l甘油，12.54g/lK2HPO4，2.31g/lKH2PO4)中。将培养物在18℃和250rpm培养直至550nm处的吸光度达到3至4，随之用1mM异丙基-1-硫代-β-吡喃半乳糖苷来诱导酶的表达。
在18℃进一步培养20小时后，通过在4℃18,000×g离心30分钟来收集细胞，重悬浮于缓冲液A(50mM BICINE，pH8.5)中，在预冷的细胞破碎器(Constant Systems Ltd.)中在28K磅/平方英寸破碎，在40.000×g离心，并对缓冲液A进行透析。将透析液装载于在相同缓冲液中平衡的Q-Sepharose快速流动(Amersham Biosciences)柱(50×2.5cm)上，收集流出物。在TAH 2a(SEQ ID NO：4)，TAH 4a(SEQ ID NO：6)，TAH 7a(SEQ ID NO：8)，Sp.11.2(SEQ ID NO：14)，Sp.23.2(SEQ ID NO：16)和Sp.23.2bis(SEQ ID NO：35)木聚糖酶的情况中，将该溶液立即装载于S-Sepharose快速流动(AmershamBiosciences)柱(50×2.5cm)上，也在上述缓冲液中平衡，而在Sp10.1(SEQ ID NO：10)和Sp10.2(SEQ ID NO：12)木聚糖酶的情况中，在装载于在pH7.6的50mM BICINE中平衡的S-Sepharose快速流动(Amersham Biosciences)柱(50×2.5cm)上之前，首先将该溶液的pH调节至pH7.6。用线性NaCl梯度(350ml中0-100mM)来洗脱结合的蛋白质，并合并活性级分，通过超滤(Millipore PBGC 10,000NMWL)来浓缩。将该溶液与菌株Sp.10.1和Sp.10.2木聚糖酶一起用于焙烤试验中，而将TAH 2a，TAH 4a，TAH 7a，Sp.11.2，Sp.23.2和Sp.23.2bis菌株的木聚糖酶首先在20mM MOPS，100mM NaCl，pH7.5中平衡的Sephacryl S-100(Amersham Biosciences)柱(90×2.5cm)上进一步纯化，1ml/分钟。
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了酶的纯度。其结果呈现于图12中。
实施例6：重组木聚糖酶在小型焙烤测试中的效果
进行焙烤试验来证明本发明的重组木聚糖酶在焙烤中的相似正面效果。通过与可购得的木聚糖酶相比较和与不含有这些酶中任何一种的参照相比较的面包体积的增加来评价正面效果。
在包括用100g面粉制备面团的小型焙烤测试中来评价实施例5的纯化的或部分纯化的木聚糖酶。
所述的程序是本领域技术人员公知的并且使用其他方案或来自其他供应商的设备可以获得相同结果是显而易见的。
所用的配料列于以下的表4中：
表4
配料(g) 配方
面粉(Surbi-Molens van Deinze) 100
水 57
新鲜酵母(Bruggeman-比利时) 5
氯化钠 2
葡萄糖 2
抗坏血酸(g/100g面粉) 4
木聚糖酶 参见表5
将配料在National混合机中混合4.5分钟。称取150g的面团块，并在塑料盒中25℃静置20分钟。将面团再次揉捏并再静置20分钟。最后的醒发时间为36℃50分钟。然后将面团块在225℃焙烤20分钟。使用常用的油菜籽顶替方法来测量面包的体积。
使用重组酶的焙烤试验的结果呈现于以下的表5中：
表5
木聚糖酶样品 木聚糖酶单位/100kg面粉(*) 与没有用木聚糖酶相比较的面包卷的体积增加(％)
Belase B210(Beldem-比利时)  1050  18(1)
TAH  2a  6000  23(2)
TAH  4a  6000  21
TAH  7a  6000  23
Sp.10.1.  6000  27
Sp.10.2.  6000  21
Sp.11.2.  6000  20
Sp.23.2.bis.  6000  17
(*)将一单位的Belase B210木聚糖酶定义为在30℃和pH4.5从桦木木聚糖释放1μmol还原糖(以木糖表示)所需要的酶用量(Nelson-Somogyi方法)。将一单位的其他木聚糖酶定义为在25℃和pH6.5从桦木木聚糖释放1μmol还原糖(以木糖表示)所需要的酶用量(二硝基水杨酸方法，Miller，G.1959，Anal.Chem.Vol.31，p.426)。
(1)三个独立试验的平均值
(2)两个独立试验的平均值
上述结果表明通过重组宿主细胞产生的木聚糖酶与野生型酶相比较对面包体积具有相似的正面效果。
实施例7：焙烤中所用家族8木聚糖酶的体积响应测试
进行焙烤试验来证明本发明的重组木聚糖酶在焙烤中的相似正面效果并测定加入的木聚糖酶的量的效果。通过面包体积的增加来评价正面效果。
以下的表6中呈现了使用重组酶的焙烤试验的结果。按照实施例3中所述的方案：
表6：
随加入的木聚糖酶单位而变化的面包体积
DXU/100kg面粉(*)     SP11.2(x1000)     SP10.2(x1000)     TaH3a(x1000)     TaH2a(x1000)     SP23.2.bis(x1000)
    0     1350     1350     1350     1350     1350
    685     1525
    960     1575
    1370     1600
    1410     1600
    1465     1575
    1500     1625
    1920     1600
    2055     1600
    2150     1675
    2740     1625
    2820     1675
    2880     1625
    2930     1575
    3000     1650
    3840     1675
    4230     1650
    4300     1700
    4395     1575
    4500     1750     1750
    5000
    5640     1750
    5860     1650
    6000     1725     1850
    6450     1700
    8600     1725
(*)将一单位的其他木聚糖酶定义为在25℃和pH6.5从桦木木聚糖释放1μmol还原糖(以木糖表示)所需要的酶用量(二硝基水杨酸方法，Miller，G.1959，Anal.Chem.Vol.31，p.426)。
图15中以图解表示了结果。
实施例8：焙烤中所用木聚糖酶的绝对用量
上述实施例中所述的在比利时硬面包卷试验中获得限定的体积效果所需的木聚糖酶的相对用量，已经与常用的商业细菌木聚糖酶(Bel’ase B210-Beldem-比利时)进行了比较。
通过在280nm处的吸光度测量来测定纯化木聚糖酶的蛋白质浓度，使用以下的消光系数：92，860(在TAH 2a的情况中)，94，140(在TAH 4a和Sp.11.2的情况中)，89，730(在TAH 4a和Sp.23.2的情况中)，95，420(在Sp.10.1的情况中)和94，140(在Sp.10.2的情况中)M-1cm-1和/或按照制造商所述的来使用Bradford蛋白质测定试剂盒(Pierce)。
根据实施例6中所述的方法进行了几个焙烤试验，使用不同量的实施例5中所述的纯化酶。
图13显示了作为不同酶的相对用量函数的面包体积的增加。对于Bel’ase B210木聚糖酶(约本发明酶的一半大小)，结果是三个独立试验的平均值。对于TAH 2a木聚糖酶，结果是两个独立试验的平均值。
图13清楚地显示了与商业酶相比较，本发明的木聚糖酶的“inpano”比活性(即，以 ml表示的面包体积/以mg表示的蛋白质用量)明显更高。
申请人已经在2004年3月4日将根据本发明的微生物大肠杆菌JM109(pXYP4)，大肠杆菌JM109(pXYP5)，大肠杆菌JM109(pXYP6)，大肠杆菌JM109(pXYP7)，大肠杆菌JM109(pXYP8)，大肠杆菌JM109(pXYP9)，大肠杆菌JM109(pXYP10)培养物保藏于BCCM/LMBP培养物保藏中心(Laboratorium voor Moleculaire Biologie，Universiteit Ghent(根特大学)，‘Fiers-Schell-Van Montagu’building Technologiepark 927 B-9052 Gent-Zwijnaarde Belgium(根特，比利时))。这些保藏物接到的保藏号各自为LMBP 4860，LMBP 4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865和LMBP4866。
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用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约在下一页的底部标示的由国际保藏机构BCCMTM/LMBP根据细则7.1
             出具的原始保藏证明
         国际表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-01
至：保藏人的名字  PURATOS NV
地址：Industrialaan，25
B-1702 Groot-Bijgaarden
Belgium(比利时)
I.微生物的标识
I.1.保藏人给予的标识参考号
大肠杆菌JM109(pXYP4)
I.2.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4860
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II.科学描述和/或建议的分类学命名
以上I中标识的微生物伴有
                       (用叉标记适用的格子)
-科学描述                 是         否
-建议的分类学命名          
Figure A20058001015500363
        否
III.收到和受理
国际保藏机构接受以上I中标识的微生物，其接收于(原始保藏日期)：2004年3月4日
IV.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大学)
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
                                       Martine Vanhoucke
                                         BCCM/LMBP管理人
日期：2004年3月10日
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            10.2出具的存活报告
        国际表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-01
至：出具存活报告的当事人
姓名：Dr Thierry DAUVRIN
地址：Rue Bourrie，12
      B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字：PURATOS NV
I.2.地址：Industrialaan，25
         B-1702 Groot-Bijgaarden
         Belgium(比利时)
II.微生物的标识
II.1.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4860
II.2.原始保藏日期(或已进行了新的保藏或转移时，最近的相关日期)：2004年3月4日
III.存活报告
以上II标识的微生物的存活测试于：2004年3月10日
(给予的日期。在细则10.2(a)和(iii)中所提及的情况下，指的是最近的存活测试)。
在当日，所述的微生物是：(用叉标记适用的格子)
存活
Figure A20058001015500372
不再存活
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IV.已经进行的存活测试的条件：
(如果有需要的信息和如果测试结果是阴性的请填写)
Figure A20058001015500381
V.国际保藏机构
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                                      Martine Vanhoucke
                                         BEEM/LMBP管理人
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I.微生物的标识
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II.科学描述和/或建议的分类学命名
以上I中标识的微生物伴有
                              (用叉标记适用的格子)
-科学描述                        是
Figure A20058001015500401
         否
-建议的分类学命名                 是
Figure A20058001015500403
         否
III.收到和受理
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(给予的日期。在细则10.2(a)和(iii)中所提及的情况下，指的是最近的存活测试)。
在当日，所述的微生物是：(用叉标记适用的格子)
存活
Figure A20058001015500412
不再存活
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-科学描述                          是
Figure A20058001015500441
         否
-建议的分类学命名                   是          否
Figure A20058001015500444
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(给予的日期。细则10.2(a)和(iii)中所提及的情况下，指的是最近的存活测试)。
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Figure A20058001015500451
存活
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II.科学描述和/或建议的分类学命名
以上I中标识的微生物伴有
                              (用叉标记适用的格子)
-科学描述                        是          否
Figure A20058001015500482
-建议的分类学命名                 是
Figure A20058001015500483
         否 
III.收到和受理
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I.1.名字：PURATOS NV
I.2.地址：Industrialaan，25
          B-1702 Groot-Bijgaarden
          Belgium(比利时)
II.微生物的标识
II.1.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4863
II.2.原始保藏日期(或已进行了新的保藏或转移时，最近的相关日期)：2004年3月4日
III.存活报告
以上II标识的微生物的存活测试于：2004年3月10日
(给予的日期。在细则10.2(a)和(iii)中所提及的情况下，指的是最近的存活测试)。
在当日，所述的微生物是：(用叉标记适用的格子)
存活
不再存活
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-04表格的第2页。存活报告
IV.已经进行的存活测试的条件：
(如果有需要的信息和如果测试结果是阴性的请填写)
V.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大学)
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
                                      Martine Vanhoucke
                                        BEEM/LMBP管理人
日期：2004年3月10日
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-05表格的第1页。原始保藏证明
用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约在下一页的底部标示的由国际保藏机构BCCMTM/LMBP根据细则7.1
             出具的原始保藏证明
         国际表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-05
至：保藏人的名字  PURATOS NV
地址：Industrialaan，25
      B-1702 Groot-Bijgaarden
      Belgium(比利时)
I.微生物的标识
I.1.保藏人给予的标识参考号
    大肠杆菌JM109(pXYP8)
I.2.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4864
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-05表格的第2页。原始保藏证明
II.科学描述和/或建议的分类学命名
以上I中标识的微生物伴有
                               (用叉标记适用的格子)
-科学描述                         是
Figure A20058001015500521
         否
Figure A20058001015500522
-建议的分类学命名                  是
Figure A20058001015500523
         否
Figure A20058001015500524
III.收到和受理
国际保藏机构接受以上I中标识的微生物，其接收于(原始保藏日期)：2004年3月4日
IV.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大学)
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
                                      Martine Vanhoucke
                                        BCCM/LMBP管理人
日期：2004年3月10日
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-05表格的第1页。存活报告
用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约在下一页的底部标示的由国际保藏机构BCCMTM/LMBP根据细则
           10.2出具的存活报告
      国际表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-05
至：出具存活报告的当事人
姓名：Dr Thierry DAUVRIN
地址：Rue Bourrie，12
      B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字：PURATOS NV
I.2.地址：Industrialaan，25
          B-1702 Groot-Bijgaarden
          Belgium(比利时)
II.微生物的标识
II.1.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4864
II.2.原始保藏日期(或已进行了新的保藏或转移时，最近的相关日期)：2004年3月4日
III.存活报告
以上II标识的微生物的存活测试于：2004年3月10日
(给予的日期。在细则10.2(a)和(iii)中所提及的情况下，指的是最近的存活测试)。
在当日，所述的微生物是：(用叉标记适用的格子)
Figure A20058001015500531
存活
Figure A20058001015500532
不再存活
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-05表格的第2页。存活报告
IV.已经进行的存活测试的条件：
(如果有需要的信息和如果测试结果是阴性的请填写)
V.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大学)
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
                                     Martine Vanhoucke
                                       BEEM/LMBP管理人
日期：2004年3月10日
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-06表格的第1页。原始保藏证明
用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约在下一页的底部标示的由国际保藏机构BCCMTM/LMBP根据细则7.1
           出具的原始保藏证明
       国际表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-06
至：保藏人的名字  PURATOS NV
地址：Industrialaan，25
      B-1702 Groot-Bijgaarden
      Belgium(比利时)
I.微生物的标识
I.1.保藏人给予的标识参考号
    大肠杆菌JM109(pXYP9)
I.2.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4865
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-06表格的第2页。原始保藏证明
II.科学描述和/或建议的分类学命名
以上I中标识的微生物伴有
                                   (用叉标记适用的格子)
-科学描述                             是
Figure A20058001015500561
         否
Figure A20058001015500562
-建议的分类学命名                      是           否
III.收到和受理
国际保藏机构接受以上I中标识的微生物，其接收于(原始保藏日期)：2004年3月4日
IV.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大学)
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
                                      Martine Vanhoucke
                                        BCCM/LMBP管理人
日期：2004年3月10日
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-06表格的第1页。存活报告
用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约在下一页的底部标示的由国际保藏机构BCCMTM/LMBP根据细则
            10.2出具的存活报告
        国际表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-06
至：出具存活报告的当事人
姓名：Dr Thierry DAUVRIN
地址：Rue Bourrie，12
      B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字：PURATOS NV
I.2.地址：Industrialaan，25
          B-1702 Groot-Bijgaarden
          Belgium(比利时)
II.微生物的标识
II.1.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4865
II.2.原始保藏日期(或已进行了新的保藏或转移时，最近的相关日期)：2004年3月4日
III.存活报告
以上II标识的微生物的存活测试于：2004年3月10日
(给予的日期。在细则10.2(a)和(iii)中所提及的情况下，指的是最近的存活测试)。
在当日，所述的微生物是：(用叉标记适用的格子)
Figure A20058001015500571
存活
Figure A20058001015500572
不再存活
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-06表格的第2页。存活报告
IV.已经进行的存活测试的条件：
(如果有需要的信息和如果测试结果是阴性的请填写)
Figure A20058001015500581
V.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大学)
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
                                       Martine Vanhoucke
                                         BEEM/LMBP管理人
日期：2004年3月10日
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-07表格的第1页。原始保藏证明
用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约在下一页的底部标示的由国际保藏机构BCCMTM/LMBP根据细则7.1
            出具的原始保藏证明
        国际表格BCCMTM/LMBP/BP/4/04-07
至：保藏人的名字  PURATOS NV
地址：Industrialaan，25
      B-1702 Groot-Bijgaarden
      Belgium(比利时)
I.微生物的标识
I.1.保藏人给予的标识参考号
    大肠杆菌JM109(pXYP10)
I.2.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4866
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/4/04-07表格的第2页。原始保藏证明
II.科学描述和/或建议的分类学命名
以上I中标识的微生物伴有
                           (用叉标记适用的格子)
-科学描述                    是
Figure A20058001015500601
          否
Figure A20058001015500602
-建议的分类学命名             是
Figure A20058001015500603
          否
Figure A20058001015500604
III.收到和受理
国际保藏机构接受以上I中标识的微生物，其接收于(原始保藏日期)：2004年3月4日
IV.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大学)
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
                                     Martine Vanhoucke
                                       BCCM/LMBP管理人
日期：2004年3月10日
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-07表格的第1页。存活报告
用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约在下一页的底部标示的由国际保藏机构BCCMTM/LMBP根据细则
            10.2出具的存活报告
       国际表格BCCMTM/LMBP/BP/9/04-07
至：出具存活报告的当事人
姓名：Dr Thierry DAUVRIN
地址：Rue Bourrie，12
      B-5300 ANDENNE
I.保藏人
I.1.名字：PURATOS NV
I.2.地址：Industrialaan，25
           B-1702 Groot-Bijgaarden
           Belgium(比利时)
II.微生物的标识
II.1.国际保藏机构给予的保藏号
    LMBP 4866
II.2.原始保藏日期(或已进行了新的保藏或转移时，最近的相关日期)：2004年3月4日
III.存活报告
以上II标识的微生物的存活测试于：2004年3月10日
(给予的日期。在细则10.2(a)和(iii)中所提及的情况下，指的是最近的存活测试)。
在当日，所述的微生物是：(用叉标记适用的格子)
Figure A20058001015500611
存活
不再存活
比利时微生物协调保藏中心-BCCMTM
LMBP-保藏
BCCMTM/LMBP/BP/9/04-07表格的第2页。存活报告
IV.已经进行的存活测试的条件：
(如果有需要的信息和如果测试结果是阴性的请填写)
V.国际保藏机构
比利时微生物协调保藏中心(BCGMTM)
Laboratorium voor Molecularire Biologie-Plasmidencollectie(LMBP)
Universiteit Gent(根特大学)
Technologiepark 927
B-9052 Gent-Zwijnaarde，Belgium(比利时)
具有代表国际保藏机构权力的人员或授权官员的签名：
                                      Martine Vanhoucke
                                        BEEM/LMBP管理人
日期：2004年3月10日

Claims (31)

1.属于糖苷水解酶家族8的具有木聚糖分解活性的分离并纯化的酶，其特征在于所述酶是嗜冷酶，附带条件是所述的木聚糖分解酶不是由SEQ ID NO：1编码的，并包括对应于以下的氨基酸序列
-SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16或35任一的aa1至aa 426；
-SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16或35任一的aa 22至aa 426；
或其变体
-包括少于4个氨基酸不同于以上任一序列的氨基酸序列，或
-包括具有与上述任一序列高于50％，70％，更优选高于80％，85％，90％，最优选高于95％，97％，98％或再更优选高于99％序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的酶，其特征在于当以1500至6000木聚糖酶单位/100kg面粉的浓度加入面团时，它使焙烤产品的体积增加至少10％和/或使所述焙烤产品的切割宽度增加。
3.根据权利要求1或2的具有木聚糖分解活性的分离并纯化的酶，由对应于以下的氨基酸序列组成
-SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16或35任一的aa 1至aa 426；
-SEQ ID NO：4，6，8，10，，12，14，16或35任一的aa 22至aa 426；
或其变体
-由少于4个氨基酸不同于以上任一序列的氨基酸序列组成，或
-由具有与上述任一序列高于50％，70％，更优选高于80％，85％，90％，最优选高于95％，97％，98％或再更优选高于99％序列同一性的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1的酶，其从保藏号为LMBP 4860，LMBP 4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865或LMBP 4866的细菌菌株可获得。
5.编码根据权利要求1至4任一项酶的分离并纯化的核苷酸序列。
6.根据权利要求5的核苷酸序列，包括SEQ ID NO：19。
7.根据权利要求5的核苷酸序列，包括对应于以下的核苷酸序列
-SEQ ID NO：3，5，7，9，11，13，15或34任一的nt 1至nt 1281；
-SEQ ID NO：3，5，7，9，11，13，15或34任一的nt 64至nt 1281；
-或以上的任一变体，具有少于20个核苷酸不同于以上任一序列的核苷酸序列。
8.根据权利要求5的核苷酸序列，由对应于以下的核苷酸序列组成
-SEQ ID NO：3，5，7，9，11，13，15或34任一的nt 1至nt 1281；
-SEQ ID NO：3，5，7，9，11，13，15或34任一的nt 64至nt 1281；或
或以上的任一变体，具有少于20个核苷酸不同于以上任一序列的核苷酸序列。
9.重组核苷酸序列，包括可操作地连接一个或多个根据权利要求6至8任一项的核苷酸序列的一个或多个相邻调控序列。
10.包括权利要求5至9任一项的核苷酸序列的载体。
11.根据权利要求10的载体，是掺入具有选自LMBP 4860，LMBP4861，LMBP 4862，LMBP 4863，LMBP 4864，LMBP 4865和LMBP 4866保藏号的大肠杆菌中的质粒。
12.用根据权利要求5至9任一项的核苷酸或根据权利要求11或12的载体转化的重组宿主细胞。
13.根据权利要求12的重组宿主细胞，其特征在于它选自细菌或真菌，包括酵母。
14.根据权利要求1至4任一项的酶，其特征在于它是由权利要求12或13的重组宿主细胞胞外表达的。
15.权利要求1至4任一项的酶，其特征在于它是由根据权利要求12或13的重组宿主细胞胞内表达的。
16.固定要素的固体支持物，该要素选自根据权利要求12或13的细胞，根据权利要求12或13的细胞含有根据权利要求1至4，14或15任一项的具有木聚糖分解活性酶的细胞提取物，和/或至少一种根据权利要求1至4，14或15任一项的具有木聚糖分解活性的分离并纯化的酶。
17.面包改良组合物，包括至少一种根据权利要求1至4，14或15任一项的酶。
18.根据权利要求17的面包改良组合物，进一步包括另一种面包改良剂，该改良剂选自其它酶，乳化剂，氧化剂，奶粉，脂肪，糖，氨基酸，盐和蛋白质(谷蛋白，纤维素结合部位)或其混合物。
19.根据权利要求18的面包改良组合物，其中所述其它酶选自α-淀粉酶，β-淀粉酶，生成麦芽糖的淀粉酶，其他木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化还原酶，葡聚糖酶，纤维素酶，转谷氨酰胺酶，异构酶，脂酶，磷脂酶，果胶酶或其混合物。
20.权利要求19的面包改良组合物，其中所述α-淀粉酶是从米曲霉获得的α-淀粉酶。
21.根据权利要求12或13的重组宿主细胞或根据权利要求1至4，14或15任一项的具有木聚糖分解活性的酶用于降解植物细胞壁成分的用途。
22.根据权利要求21的用途，用于分解植物和水果，优选水果的方法中，豆汁，啤酒，纸张，淀粉，谷蛋白或植物油的制备过程中。
23.根据权利要求21的用途，用于水果，蔬菜和植物加工，葡萄酒制造或酿造，咖啡加工，纸张或纺织品加工，生物转化过程，分解废物方法，优选用于分解农业废物或造纸厂的废物，淀粉-谷蛋白分离方法，饲料制备。
24.根据权利要求12或13的重组宿主细胞，根据权利要求1至4，14或15任一项的具有木聚糖分解活性的酶或根据权利要求17至20任一项的面包改良组合物在焙烤，磨粉，糕点和糖果加工中的用途，尤其是用于增加焙烤产品的体积和/或用于增加所述焙烤产品表面的切割宽度。
25.根据权利要求21至24任一项的用途，其中所述的根据权利要求12或13的宿主细胞，或所述的根据权利要求1至4，14或15任一项的酶可以结合另一种酶来使用。
26.根据权利要求25的用途，其中所述的其它酶选自α-淀粉酶，β-淀粉酶，生成麦芽糖的淀粉酶，其他木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化-还原酶，葡聚糖酶，纤维素酶，转谷氨酰胺酶，异构酶，脂酶，磷脂酶，果胶酶或其混合物。
27.根据权利要求25或26的用途，其中将所述的宿主细胞或酶掺入根据权利要求17至20任一项的面包改良组合物中。
28.根据权利要求27的用途，其中在面团混合过程中加入面包改良组合物。
29.根据权利要求21至28任一项的用途，其中如权利要求1至4，14或15任一项所限定的所述具有木聚糖分解活性的酶以细胞提取物，无细胞提取物存在或以纯化的蛋白质来使用。
30.根据权利要求21至30任一项的用途，其中如权利要求1至4，14或15任一项所限定的所述具有木聚糖分解活性的酶以干粉或颗粒形式，尤其是无粉尘颗粒，或以液体形式和其他配料混合，尤其是和一种或多种稳定剂混合，如多元醇，糖，有机酸或糖醇。
31.一种组合物，包括至少一种由SEQ ID NO：4，6，8，10，12，14，16，35，21，23，25，27，29，31，33或37任一所标识的酶，可能结合由SEQ ID NO：2所标识的酶或其成熟部分。
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