KR20010037359A - Ｌ62 리파제를 생산하는 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스 Ｌ62(ＫＣＴＣ 8957Ｐ) 및 형질전환된 대장균 ＢＬ21(ＤＥ3)/ｐＳＨＭＬ(ＫＣＴＣ 8956Ｐ)을 이용한 Ｌ62 리파제의 대량생산법 - Google Patents

Ｌ62 리파제를 생산하는 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스 Ｌ62(ＫＣＴＣ 8957Ｐ) 및 형질전환된 대장균 ＢＬ21(ＤＥ3)/ｐＳＨＭＬ(ＫＣＴＣ 8956Ｐ)을 이용한 Ｌ62 리파제의 대량생산법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리된 것으로 저온성 리파제활성능이 우수한 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus) L62(KCTC 8957P) 및 이러한 신균주로부터 생산된 것으로 비이온성 계면활성제에 의해 활성이 크게 증가하고 저온에서도 높은 활성을 가지는 L62 리파제 그리고, T7 프로모터를 이용하여 상기한 L62 리파제를 대량생산하는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML(KCTC 8956P) 및 리소스(Resource) Q 컬럼을 이용한 L62 리파제의 정제방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ62 리파제를 생산하는 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스 Ｌ62(ＫＣＴＣ 8957Ｐ) 및 형질전환된 대장균 ＢＬ21(ＤＥ3)/ｐＳＨＭＬ(ＫＣＴＣ 8956Ｐ)을 이용한 Ｌ62 리파제의 대량생산법{Discovery of Staphylococcus haemolyticus L62(KCTC 8957P) producing a novel lipase and development of its efficient production method using Escherichia coli BL21(DE3)/pSHML(KCTC 8956P)}
본 발명은 토양으로부터 분리된 것으로 저온성 리파제활성능이 우수한 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus) L62(KCTC 8957P) 및 이러한 신균주로부터 생산된 것으로 비이온성 계면활성제에 의해 활성이 크게 증가하고 저온에서도 높은 활성을 가지는 L62 리파제 그리고, T7 프로모터를 이용하여 상기한 L62 리파제를 대량생산하는 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML(KCTC 8956P) 및 리소스(Resource) Q 컬럼을 이용한 L62 리파제의 정제방법에 관한 것이다.
효소는 생체내의 각종 생화학 반응을 촉진시키는 촉매로서 널리 연구되어 왔다. 효소는 반응이 상온·상압에서 일어나고 고효율성 및 특이성 등의 장점에 기인하여 여러 가지 생물전환반응의 효소촉매로 이용되고 있으며, 기존의 화학합성법을 대체함으로써 점차 산업적 응용범위가 확대되는 중요한 분야이다.
또한, 에스테르화합물이 식품, 화학, 제약 및 환경소재 공업에 이용도가 높은 정밀화학제품에 많이 포함되어 있기 때문에, 에스테르결합의 합성관련 효소는 생물촉매분야의 40% 이상을 점유하는 매우 중요한 효소이다.
기존의 화학적인 방법으로 에스테르화합물을 합성하는 경우, 700 psi의 고압 및 250℃ 이상의 고온에서 합성되기 때문에 에너지가 많이 소모되며 품질에 나쁜 영향을 주는 여러 가지 부반응이 일어날 뿐 아니라, 전환율 및 광학순도가 낮아서 고 순도의 정밀화학제품 생산에 어려움이 있어 왔다.
따라서, 최근에 상기의 단점을 없애기 위해 이상계, 미수계, 비수계 및 역상계에서의 리파제를 이용한 효소촉매 반응계가 개발됨에 따라, 고부가가치의 정밀화학제품의 제조에 여러 가지 리파제가 효소촉매로 이용되기 시작하였다. 즉, 장시간의 효소 반응 공정에서 그 활성을 잃지 않으며, 저온, 고온, 알칼리, 유기용매 및 계면활성제 처리 등의 열악한 반응 환경에서도 큰 활성을 보이는 리파제의 탐색과 개발이 활발히 진행되고 있다. 특히, 세제첨가제로 사용되거나 고온에서 불안정한 물질의 합성을 위해서는 저온성 및 계면 활성제에 대한 내성 등의 특성을 갖는 리파제가 요구된다.
그러나, 현재까지 개발된 대부분 리파제의 경우, 저온(4℃)에서 효소의 활성이 매우 약하며, 비이온성 계면활성제에 의해 효소의 활성이 대부분 없어진다.
이에, 본 발명자들은 계면활성제에 의해 활성화되고, 저온에서도 효소의 활성이 우수한 리파제를 생산하는 균주를 탐색하고, 이러한 리파제를 대량생산하는 시스템을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 비이온성 계면활성제에 의해 리파제의 활성이 안정 및 증가되는 특성과 상온에서 불안정한 고가의 불포화 지방산의 에스테르화합물의 합성을 위해 저온에서 활성이 높으며 1,3-위치 특이성을 갖는 신규 리파제를 대량으로 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 온도에 따른 L62 리파제의 가수분해활성과 칼슘 또는 EDTA의 존재하에서 효소를 30분간 방치한 후의 L62 리파제의 잔존활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 온도에 따른 L62 리파제의 활성화 에너지와 불활성화 에너지를 나타내는 그래프이다.
도 3은 머추어(mature) 리파아제가 삽입된 재조합 플라스미드 pBSII SK의 모식도이다.
도 4는 L62 리파제의 대량발현 벡터인 pSHML의 제조과정을 보여주는 모식도이다.
도 5a는 pSHML벡터로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML으로부터 L62 리파제가 대량 발현됨을 SDS-PAGE로 확인한 사진이고, 도 5b는 도 5a의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML(KCTC 8956P)로부터 대량생산된 L62 리파제가 리소스(Resource) Q 컬럼을 통해 순수 분리됨을 나타내는 사진이다.
도 7은 L62 리파제가 트리올레인을 1,3-위치 특이적으로 가수분해함을 보여주는 사진이다.
도 8은 트윈 80이 처리된 L62 리파제 및 무처리된 L62 리파제에 의한 여러 가지 천연 지방질의 가수분해 활성을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus) L62(KCTC 8957P) 및 이로부터 생산되고 비이온성 계면활성제에 의해 활성이 증가되는 저온성 L62 리파제를 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 L62 리파제의 대량생산을 위해 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML(KCTC 8956P) 및 이로부터 생산된 리파제를 정제하는 방법을 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서는 리파제 생산균주를 토양 샘플에서 분리한 후, 이를 액체 배양하여 배양 상등액의 리파제 활성이 우수한 균주를 최종적으로 선별하여, 선별된 균주의 형태학적 및 생화학적 특성 조사를 통해 균주 동정을 실시하였다[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology].
상기 신균주는 형태학적으로 운동성이 없고 그람양성 구균형태이다. 또한, 신균주는 45℃에서 성장가능하고, 탄소원으로 글루코스, 슈크로스 및 트리할로스(trehalose)를 이용하였다. 또한, 신균주는 알기닌 다이하이드롤라제(arginine dihydrolase)의 활성은 있지만, 우레아제(urease), 베타 β-갈락토시다제 및 β-글루코시다제의 활성이 없는 것으로 밝혀졌다.
상기한 바와 같이, 신균주의 형태학적 및 생화학적 특성을 살펴본 바에 의하면, 본 발명에 따른 신균주는 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus)의 전형적인 특성을 가진다.
한편, 상기 신균주로부터 생산되는 리파제를 암호화하는 약 4.2 kb의 DNA를 클로닝하고, 이러한 DNA로부터 아미노산 서열을 분석한 결과, 이는 60개의 아미노산으로 이루어진 신호서열(signal sequence), 259개의 아미노산으로 이루어진 프로펩타이드(propeptide) 및 392개의 아미노산으로 이루어진 머추어(mature) 리파제로 구성된 프리프로리파제(preprolipase) 형태로 생산되는 것을 확인하였으며, 기존의 스타필로코커스 속의 다른 균주에 의해 생산되는 리파제와 아미노산 상동성이 67%이하인 신규 리파제임을 확인하였다.
이에, 상기 신규 리파제를 생산하는 신균주를 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus; 이하 'S. haemolyticus'로 약함) L62로 명명하고, 이를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 8월 18일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 8957P를 부여받았다.
또한, 상기 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스(S. haemolyticus) L62에 의해 생산되는 리파제(이하 'L62 리파제'로 약함)의 특성을 조사한 결과, 효소의 활성은 55℃까지 안정하며, 바람직한 가수분해 활성 온도는 28℃이다. 또한, L62 리파제의 활성은 pH 5∼11.5의 범위에서 안정하며, 바람직한 pH는 8.5이다.
본 발명의 L62 리파제는 트리올레인의 1,3-위치를 특이적으로 분해하는 1,3-위치 특이성을 갖고 있을 뿐만 아니라, 저온(4℃)에서도 높은 활성을 가진다. 또한, L62 리파제는 대부분의 비이온성 계면활성제에 대해 안정하였으며, 오히려 이러한 계면활성제에 의해 효소의 활성이 증가되었을 뿐만 아니라, 효소의 기질특이성, 최적 작용 pH와 온도 및 분자량이 변화되는 현상을 확인하였다.
예를 들면, 트윈 80을 L62 리파제에 처리한 경우, 대부분의 기질에 대한 L62 리파제의 가수분해 활성이 증가하였으며, 특히 불포화 지방산이 함유된 기질에 대한 활성이 10배 가량 증가하였다. 또한, 리파제의 바람직한 pH가 원래 8.5인데 비해서, 트윈 80이 처리된 리파제는 pH가 7.5∼10인 넓은 범위에서 최적 작용을 하였다.
따라서, L62 리파아제의 작용 온도 및 pH를 용도에 따라 조절할 수 있기 때문에 다양한 반응 조건에서 유용한 지방산을 생산할 수 있는 장점을 가지며, 공정 과정 동안 L62 리파아제가 계면활성제에 의해서 불활성화되지 않기 때문에 매우 유용하다.
예를 들면, L62 리파아제는 고온에서 불안정한 불포화 지방산이 다량 함유된 편유(linseed oil) 및 맥아유(wheat germ oil)에 대한 높은 효소활성을 가지므로, 트랜스 에스테르화 반응을 이용한 고가의 고급유지의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
한편, L62 리파제의 산업적 이용을 위해 리파제 DNA를 포함하는 대량생산용 재조합 플라스미드(pSHML)를 제조한 후, 이러한 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML을 제조하여, 이를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 8월 18일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 8956P를 부여받았다.
상기 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML을 이용하여 L62 리파제의 고발현 실험을 수행한 결과, 원균주인 스타필로코커스 헤모리티커스(S. haemolyticus) L62 보다 L62 리파제의 생산량이 8.2배 증가되고, 활성 리파제가 전체 단백질의 약 30 중량%인 80,000 U/ℓ까지 생산되었다. 다른 대부분의 균주에 의해 생산된 리파제가 효소의 활성이 없는 불용성 단백질로 생산되는데 반해, L62 리파제의 대부분은 활성을 보이는 단백질로 생산되었다.
또한, 본 발명은 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML으로부터 대량생산된 리파제의 효과적인 분리정제법을 확립하였다. 즉, 높은 등전점을 갖는 L62 리파제의 특성을 이용하여 음이온 교환수지인 리소스(Resourse) Q 컬럼을 통해 정제분리시켰다. 정제된 L62 리파제는 비활성이 600 U/mg이고, 약 40%의 회수율을 보였다.
현재 에스테르 관련 효소촉매인 리파제 및 에스터라제의 경우, 화학촉매에 비해서 가격이 높기 때문에 일부 고부가가치의 물질전환을 제외하고는 사용하기 어려운 실정을 고려하면, 상기의 형질전환된 대장균주를 이용한 대량발현 시스템의 리파제의 고발현을 통하여 효소를 대량생산함으로써 가격 경쟁력을 확보할 수 있게 되었다.
이하, 비이온성 계면활성제에 의해 활성화되는 저온성 L62 리파제를 생산하는 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스(S. haemolyticus) L62, L62 리파제를 암호화하는 유전자, 이러한 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML 및 대량생산된 L62 리파제의 정제방법에 관하여 다음의 실시예를 통하여 구체적으로 설명하는 바, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: L62 리파제의 생산 및 특성
신균주 스타필로코커스 헤모리티커스(S. haemolyticus) L62을 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출액 및 0.5% 소금)를 사용하여 37℃에서 20시간 배양한 후, 배양 상등액에서 L62 리파제 9,800 U/ℓ를 얻었다. 이러한 결과는 다른 균주로부터 생산되는 리파제 3,000 U/ℓ의 약 3배에 해당되는 양이다.
1.2ℓ의 배양액을 원심 분리하여 균체를 제거한 후, 황산암모늄 침전, DEAE와 CM-세파로스(Sepharose) CL-6B 컬럼 및 리소스(Resource) S 컬럼을 사용하여 L62 리파제를 정제분리하고, 다음과 같이 L62 리파제의 특성을 조사하였다.
1) L62 리파제의 분자량 및 N-말단 아미노산 서열 분석
L62 리파제의 분자량을 검토하기 위하여 12% SDS-PAGE를 수행한 결과, 분자량 45,000 위치의 단일 밴드로 나타났다. 이러한 L62 리파제의 단백질 밴드를 겔상에서 추출한 후, N-말단의 아미노산을 분석한 결과, 표 1과 같은 아미노산 서열로 나타났는데, 스타필로코커스 속의 다른 균주에 의해 생산되는 리파제와 상당히 다른 신규 효소임을 알 수 있다.
리파제 생산균주 N-말단 아미노산 서열
스타필로코커스 헤모리티커스(S. haemolyticus) L62 ATIK SNQYKNKYPV VLVHGFLGLV
스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) PS54 RPLKAN QVQPLNKYPV VFVHGFLGLV
스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) NCTC8530 DQTNKVAK QGQYKNQDPI VLVHGFNGFT
스타필로코커스 에피덜미디스(S. epidermidis) K QKQYKNNDPI ILVHGFNGFT
스타필로코커스 하이쿠스(S. hyicus) VKAAPEAVQN PENPKNKDPF VFVHGFTGFV
주)굵은 글씨는 N-말단 아미노산 서열의 동일한 부분을 나타낸 것이다.
2) L62 리파제의 활성
L62 리파제 활성에 대한 pH의 영향을 조사한 결과, pH 8.5에서 최대의 활성을 나타내었고, 정제된 효소의 pH 안정성을 조사한 결과, pH 5.0∼11.5 범위에서 안정한 효소 활성을 보였다.
한편, L62 리파제 활성에 미치는 온도의 영향을 조사한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 28℃에서 최적활성을 보였고, 4℃에서도 최대활성의 30%의 활성을 보이는 것으로 나타났다.
L62 리파제의 활성화 에너지는 도 2에 나타낸 바와 같이 8.63 kcal/mol로 저온성 효소의 전형적인 특성을 나타낸다. 또한, L62 리파제의 열에 대한 안정성을 검토한 결과, 50℃에서 30분 동안 안정되었고, 이것으로 L62 리파제는 비교적 고온에서도 안정한 효소임을 알 수 있다.
실시예 2: L62 리파제 DNA의 클로닝 및 아미노산 서열결정
스타필로코커스 해모리티커스(S. haemolyticus) L62의 DNA를 제한효소 ClaI 및 EcoRV로 완전히 자른 후, 동일한 제한효소로 자른 플라스미드 pBluescriptII SK와 연결(ligation)하고 대장균 XL1 Blue로 형질전환을 수행하여 리파제 기질이 함유된 배지에서 활성을 보이는 5개의 콜로니(colony)을 얻었다.
상기 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리한 결과, 모두 2.9 kb 벡터 DNA에 4.2 kb의 외래 DNA가 삽입되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 4.2 kb의 외래 DNA를 갖는 재조합 플라스미드를 pSHL로 명명하였다. 상기 콜로니의 L62 리파제 생산능은 2,500 U/ℓ이므로 4.2 kb 단편 안에 완전한 리파제 유전자가 존재함을 확인할 수 있었다.
L62 리파제의 DNA 단편을 삽입한 재조합 플라스미드 pSHL의 서열분석을 통하여 2,133 bp의 ORF(open reading frame)를 확인하였다. 이러한 ORF는 711개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량이 약 80 kDa으로 추정되는 프리프로리파제(preprolipase)를 암호화하고 있는 것으로 나타났다.
L62 리파아제의 프리프로리파제는 실시예 1의 N-말단 아미노산 서열을 근거로 60개의 아미노산으로 이루어진 신호서열(signal sequence), 259개의 아미노산으로 이루어진 프로펩타이드 및 392개의 아미노산으로 이루어진 머추어(mature) 리파제로 구성되어 있음을 추정할 수 있다(도3).
스타필로코커스 해모리티커스(S. haemolyticus) L62으로부터 생산되는 리파제는 스타필로코커스 속의 다른 균주들이 생산하는 다른 리파제와 어느 정도 유사하였으나, 단백질 수준에서 다음 표 2와 같이 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 스타필로코커스 에피덜미디스(S. epidermidis) 및 스타필로코커스 하이쿠스(S. hyicus)가 생산하는 리파제와 각각 약 67%, 55% 및 51%의 유사성을 가지므로 신규 효소로 판정되었다.
리파아제 생산균주 스타필로코커스 해모리티커스 스타필로코커스 아우레우스 스타필로코커스 에피덜미디스 스타필로코커스 하이쿠스
스타필로코커스 해모리티커스 100 67.1a(45.2)b 54.5a(37.9)b 51.3a(35.3)b
스타필로코커스 아우레우스 - 100 55.6a(38.1)b 53.1a(36.2)b
스타필로코커스 에피덜미디스 - - 100 55.8a(36.2)b
스타필로코커스 하이쿠스 - - - 100
주)a; 머추어(mature) 부분의 상동성, b; 프리프로리파제의 상동성
실시예 3: L62 리파제의 대량생산을 위한 재조합 플라스미드의 제조
PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 리파제 유전자 중 신호서열(signal sequence) 및 프로펩타이드(propeptide)를 제외한 머추어(mature) 리파제 DNA의 증폭을 위해 서열 3에 기재된 머추어(mature) 리파제의 DNA 염기 서열로부터 서열 1 및 서열 2에 기재된 프라이머 P1 및 P2를 제작한 후, PCR을 수행하여 1.15 kb의 머추어(mature) 리파제 유전자를 증폭하였다.
그런 다음, 도 4에 나타낸 바와 같이 T7 프로모터를 함유하는 pET22-b(+) 발현 벡터에 증폭된 리파제 유전자를 삽입하고, 이러한 재조합 플라스미드를 pSHML로 명명하였다.
실시예 4: L62 리파제가 대량생산되는 형질전환된 대장균의 제조
T7 RNA 중합효소를 갖고 있는 대장균 BL21(DE3)을 숙주세포로 하여 실시예 3에서 제조한 플라스미드 pSHML을 도입시켰다. 형질 전환된 대장균을 100 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 함유된 LB배지를 사용하여 37℃에서 배양하였다. 그런 다음, OD 600 nm에서 흡광도가 0.6에 도달하였을 때, IPTG를 최종 농도 1 mM 되도록 첨가하여 리파제 발현을 유도하고, 1시간 간격으로 샘플을 취하여 원심 분리하였다.
원심분리하여 얻은 균체를 초음파로 분쇄하여 원심 분리한 후, 용해성 단백질에 대해 12% SDS-PAGE을 행한 결과(도 5a), 전체 단백질 중 리파제의 함량이 약 30%까지 생산되고, IPTG 첨가한지 4시간 이후의 L62 리파제 활성이 80,000 U/ℓ로 최대 활성을 보였다(도 5b).
상기 결과는 대장균 XL1 Blue/pSHL의 L62 리파제 생산량에 비하여 32배정도 증가된 생산 양이며, 스타필로코커스 해모리티커스(S. haemolyticus) L62인 원균에 대해서는 8.2배 증가한 양으로 산업적으로 효소의 이용이 용이할 것으로 사료된다.
따라서, 재조합 플라스미드 pSHML로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 대장균 BL21(DE3)/pSHML로 명명하고, 이를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 8월 18일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 8956P를 부여받았다.
실시예 5: 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML으로부터 생산되는 L62 리파제의 분리
상기 실시예 4에서 제조한 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML으로부터 생산되는 L62 리파제는 높은 등전점(pI=9.7)을 갖기 때문에 다음과 같이 간단한 방법으로 순수 분리하였다. 1 mM IPTG 처리 후, 4시간 동안 배양하여 얻은 균체를 초음파 분쇄법으로 파쇄한 후에 원심분리를 통해 상층액을 얻고, 이를 20 mM 트리스/HCl 완충액(pH 8.8)으로 투석하였다.
음이온성 교환수지인 리소스(Resourse) Q 컬럼(pH 8.8)에서는 대부분의 대장균 단백질은 결합하지만, L62 리파제는 결합하지 않으므로, 리소스(Resourse) Q 컬럼을 한번 통과시킴으로써 간단히 리파제를 순수 분리하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 6: L62 리파제의 트리올레인(triolein)에 대한 위치 특이성
상기 실시예 5에서 분리된 L62 리파제의 트리올레인에 대한 위치 특이성을 확인한 결과, L62 리파제는 트리올레인의 1,3-위치를 특이적으로 분해하는 1,3-위치 특이적 리파제임을 확인하였고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 즉, L62 리파제를 처리하면 트리올레인으로부터 1(3)-모노올레인 및 1,2(2,3)-다이올레인을 얻을 수 있다.
실시예 7: L62 리파제 활성에 대한 계면활성제의 영향
L62 리파제 활성에 대한 계면활성제의 영향을 검토하기 위하여 각종 계면활성제를 1 부피% 및 5 부피%가 되도록 L62 리파제액에 첨가하여 상온에서 10분간 방치한 후, L62 리파제의 활성을 pH 스태트(stat)법으로 측정하였다. 그 결과를 다음 표 3에 나타내고, 비이온성 계면활성제에 의해 L62 리파제의 활성이 4∼6배정도 증가했으며, SDS와 같은 음이온성 계면활성제는 효소의 활성을 감소시켰다. 또한, 담즙산(bile salt)인 타우로콜레이트(taurocholate)도 리파제의 활성을 증가시켰다.
계면활성제 상대활성 (%)
농도(1%) 농도(5%)
무처리(None) 100 100
에오에스(AOS) 90 0
브리즈(brij35) 359 95
라스(LAS) 0 0
데옥시콜레이트(deoxycholate) 134 0
SDS 0 0
타우로콜레이트(taurocholate) 433 283
트리톤 X-100 275 317
트리톤 X-114 213 233
트윈 20 366 567
트윈 40 442 358
트윈 60 467 467
트윈 80 467 467
한편, 계면활성제가 처리된 L62 리파제의 기질 특이성을 조사한 결과, 대부분의 트리글리세라이드에 대한 효소 활성이 1.5∼3배 증가하였으며, 특히, 불포화 지방산을 함유한 트리리놀레인(trilinolein, C18:2) 및 트리리놀레인(trilinolenin, C18:3)에 대한 효소의 활성은 각각 10배 및 3배 증가하였다. 또한, 트윈 80이 처리된 L62 리파제는 트리글리세라이드 중에서 트리프로피오닌(C3), 트리뷰트린(C4), 트리미리스틴(C14) 및 트리리롤레인(C18:2)에 대해 무처리된 L62 리파제보다 효소 활성이 커졌으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
아실기의 사슬길이 리파제 활성(U/㎖)
무처리된 리파제 트윈 80 처리된 리파제
C2 9 19
C3 68 130
C4 120 340
C6 10 11
C8 7 24
C10 10 18
C12 19 34
C14 60 82
C16 8 14
C18 8 9
C18:1 15 28
C18:2 6 61
C18:3 18 52
또한, 트윈 80이 처리된 L62 리파제는 천연유지 중 리놀레산(linoleic acid, C18:3)이 다량 함유된 대두유(리놀레산 53% 함유), 목화유(리놀레산 47% 함유), 맥아유(wheat germ oil, 리놀레산 42% 함유) 및 옥수수유(리놀레산 39% 함유)에 대한 효소의 활성이 무처리된 L62 리파제에 비해 5∼7배 증가하였다(도 8). 상기와 같이 계면활성제가 처리된 L62 리파제의 경우, 효소의 기질특이성이 변하는 것을 산업적 목적에 맞게 이용할 수 있다는 장점이 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 계면활성제에 활성화되는 저온성 L62 리파제를 생산하는 신균주 스타필로코커스 헤모리티커스(S. haemolyticus) L62 및 형질전환된 대장균 BL21(DE3)/pSHML을 이용한 L1 리파제의 대량생산법에 관한 것으로, L62 리파제는 비이온성 계면활성제에 의해 효소의 활성이 5∼6배 증가하고, 저온에서 효소의 활성이 우수한 것으로 밝혀져서, 고온에서 불안정한 화합물 및 불포화 지방산이 함유된 천연유지를 가수분해하여 고가의 불포화 지방산을 생산하거나, 에스테르 및 펩타이드를 합성하는 공정 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

  1. L62 리파제를 생산하는 것임을 특징으로 하는 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus) L62(KCTC 8957P).
  2. L62 리파제를 대량생산하는 것임을 특징으로 하는 대장균 BL21(DE3)/pSHML(KCTC 8956P).
  3. 스타필로코커스 헤모리티커스(Staphylococcus haemolyticus) L62(KCTC 8957P) 또는 대장균 BL21(DE3)/pSHML(KCTC 8956P)에 의해 생산된 것으로, 비이온성 계면활성에 의해 활성이 증가되고 저온에서도 높은 활성을 나타내는 것임을 특징으로 하는 L62 리파제.
  4. 서열 3에 기재되어 있는 L62 리파제를 암호화하는 염기서열.
  5. 서열 4에 기재되어 있는 L62 리파제에 대한 아미노산 서열.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 L62 리파제는 음이온성 교환수지인 리소스(Resourse) Q 컬럼(pH8.8)을 이용하여 분리되는 것임을 특징으로 하는 L62 리파제.
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