CN111705027B - 一种利用微生物发酵生产乙偶姻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微生物发酵生产乙偶姻的方法，属于生物工程技术领域。本发明构建的基因工程菌株B.subtilis 6‑7ΔacuBΔacoBΔrex于5L发酵罐中培养96h得到67.5g·L‑1的乙偶姻，乙偶姻的生产效率提高至0.7g·L‑1·h‑1，乙偶姻摩尔得率为0.92，相对于原始菌株B.subtilis 6‑7，乙偶姻摩尔得率提高了37％。此外，基因工程菌株B.subtilis 6‑7ΔacuBΔacoBΔrex不含抗性基因，得到的产物可直接用于食品加工中，安全高效。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用微生物发酵生产乙偶姻的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
乙偶姻广泛存在于苹果、可可、草莓和玉米等物质中，具有特殊的奶油香味。乙偶姻是我国明确规定的食品添加剂，通常被添加到烘培食物、糖果、乳制品和饮料等食品中。
目前，在利用化学法生产乙偶姻时，会用到2,3-丁二醇或者双乙酰，而这些底物一般来源于石油，石油比较匮乏，限制了化学法生产乙偶姻在工业上的发展。
同时，乙偶姻也是多种微生物的次级代谢产物。许多微生物可以利用葡萄糖合成乙偶姻或2,3-丁二醇，而乙偶姻和2,3-丁二醇是中性物质，可调节胞内酸碱平衡。枯草芽孢杆菌是被FDA认可的GRAS菌株，遗传背景清晰，具有良好的可操作性和安全性，是一种重要的工业生产菌株。若想提高枯草芽孢杆菌合成乙偶姻的能力，除了加强乙偶姻合成途径中关键基因的表达以外，削弱乙偶姻降解相关基因也可提高乙偶姻的合成量，比如敲除枯草芽孢杆菌中2,3-丁二醇脱氢酶基因bdhA可显著提高乙偶姻的积累并降低2,3-丁二醇的合成。
但同时，利用微生物法生产乙偶姻可能存在抗性基因污染环境的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明以Bacillus subtilis 6-7作为出发菌株，利用Cre/loxP敲除技术，实现基因acuB、acoB及基因rex的无痕敲除，构建高效合成乙偶姻的重组菌株。
本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌敲除了基因acuB、基因acoB或基因rex中的一个或多个。
在本发明的一种实施方式中，所述基因acuB的Gene ID为937318；所述基因acoB的Gene ID为939697；所述基因rex的Gene ID为939871。
在本发明的一种实施方式中，所述B.subtilis 6-7已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CTCC NO:M 2009200，公开于公开号为CN101851598A的专利中。
本发明提供一种提高枯草芽孢杆菌乙偶姻产量的方法，将枯草芽孢杆菌中的基因acuB、基因acoB或基因rex中的一个或多个敲除。
在本发明的一种实施方式中，在枯草芽孢杆菌基因组上敲除基因。
本发明提供一种生产乙偶姻的方法，所述方法是以葡萄糖为碳源，利用所述基因工程菌生产乙偶姻。
在本发明的一种实施方式中，将OD600为10～20的基因工程菌，以体积比5％～15％的接种量接种至发酵体系中。
在本发明的一种实施方式中，发酵体系中含有酵母浸膏2～10g·L-1、尿素1～5g·L-1、玉米浆5～10g·L-1、葡萄糖100～200g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，在30～40℃，发酵72～96h。
本发明还保护所述基因工程菌，或所述提高枯草芽孢杆菌乙偶姻产量的方法在制备乙偶姻中的应用。
有益效果：本发明在B.subtilis 6-7中成功实现了乙偶姻降解相关基因acuB、acoB及rex的无痕敲除，成功构建了基因工程菌株B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoBΔrex。将基因工程菌株B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoBΔrex于5L发酵罐中培养96h得到67.5g·L-1的乙偶姻，乙偶姻的生产效率提高至0.7g·L-1·h-1，乙偶姻摩尔得率为0.92，相对于原始菌株B.subtilis 6-7，乙偶姻摩尔得率提高了37％。此外，基因工程菌株B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoBΔrex不含抗性基因，得到的产物可直接用于食品加工中，安全高效。
具体实施方式
实施例1：acuB基因的敲除
从NCBI网站公布的B.subtilis168基因组序列，确定acuB的序列位置，并下载acuB前后各800bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以B.subtilis 6-7基因组为模板，P1和P2为引物PCR扩增获得acuB上游同源臂，P5和P6为引物PCR扩增获得acuB下游同源臂。以p7Z6质粒为模板(所述p7Z6质粒公开于X,Yan,H.-J,等《Cre/lox System and PCR-BasedGenome Engineering in Bacillus subtilis》，公开日2008年)，P3和P4为引物PCR扩增获得lox71-zeo-lox66片段。利用重叠延伸PCR技术将acuB上、下游同源臂基因片段和lox71-zeo-lox66片段融合扩增得到一条2.2kb左右的重组基因片段；将菌株B.subtilis 6-7制作成感受态，将重组基因片段导入B.subtilis 6-7感受态细胞中，涂布于含30mg/L、zeo抗性的LB平板、37℃培养箱中培养16h，挑取单克隆进行测序，测序正确的为敲除acuB的zeor阳性转化子。将阳性转化子制作成感受态细胞，将pTSC(所述质粒公开于X,Yan,H.-J,等《Cre/lox System and PCR-Based Genome Engineering in Bacillus subtilis》，公开日2008年)转入该转化子感受态细胞中，涂布于含50mg/L的卡那霉素抗性LB平板，获得无博来霉素抗性的转化子；再将所得到的转化子挑到无抗LB平板中，51℃培养48h，除去热敏型质粒pTSC，获得无抗且不含pTSC的acuB敲除菌株，命名为B.subtilis 6-7ΔacuB。
P1(SEQ ID NO.1)：
5’-GAATTGATGGGACGGTGAATTAGTG-3’
P2(SEQ ID NO.2)：
5’-TCGAATTCGTAATCATGGTCTATTTTTTCCCCTTTGTCAGTGTCAGT-3’
P3(SEQ ID NO.3)：
5’-CTGACAAAGGGGAAAAAATAGACCATGATTACGAATTCGAGCTC-3’
P4(SEQ ID NO.4)：
5’-ATAGATAAATACACTGTCTCTGTAAAACGACGGCCAGTGC-3’
P5(SEQ ID NO.5)：
5’-GCACTGGCCGTCGTTTTACAGAGACAGTGTATTTATCTATTCTCCATCCTACC-3’
P6(SEQ ID NO.6)：
5’-GTCGTAGTAATGGGCATCGGC-3’
实施例2：acoB基因的敲除
从NCBI网站公布的B.subtilis168基因组序列中确定acoB的序列位置，并下载acoB前后各800bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以B.subtilis 6-7基因组为模板，P7和P8为引物PCR扩增获得acoB上游同源臂，P11和P12为引物PCR扩增获得acoB下游同源臂。以p7Z6质粒为模板，P9和P10为引物PCR扩增获得lox71-zeo-lox66片段。利用重叠延伸PCR技术将acoB上、下游同源臂基因片段和lox71-zeo-lox66片段三条基因片段融合扩增得到一条2.2kb左右的重组基因片段；将实施例1中制备得到的菌株B.subtilis 6-7ΔacuB制备成感受态，将得到的重组基因片段导入B.subtilis 6-7ΔacuB感受态细胞中，涂布于30mg/L、zeo抗性的LB平板，37℃培养箱中培养16h，挑取单克隆进行测序，测序正确的为敲除acoB的zeor阳性转化子。将该阳性转化子制作成感受态，将pTSC转入该转化子感受态细胞中，涂布于含50mg/L的卡那霉素抗性平板，培养16h，长出的单克隆即为无博来霉素(zeor)抗性的转化子；再将所得到的转化子挑到无抗性LB平板中，51℃培养48h，除去热敏型质粒pTSC，获得无抗且不含pTSC的acoB敲除菌株，命名为B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoB。
P7(SEQ ID NO.7)：
5’-CATTGTATCGCCAAAGGCTGTGA-3’
P8(SEQ ID NO.8)：
5’-TCGAATTCGTAATCATGGTCCTCTTACATTCCTCCTTTTTCATATGACAC-3’
P9(SEQ ID NO.9)：
5’-AAAAAGGAGGAATGTAAGAGGACCATGATTACGAATTCGAGCTCG-3’
P10(SEQ ID NO.10)：
5’-CGCCATTTGTGTCCCCCCTTGTAAAACGACGGCCAGTGC-3’
P11(SEQ ID NO.11)：
5’-GCACTGGCCGTCGTTTTACAAGGGGGGACACAAATGG-3’
P12(SEQ ID NO.12)：
5’-GCACATGGGGATGTGTGATG-3’
实施例3：rex基因的敲除
从NCBI网站公布的B.subtilis168基因组序列中确定rex的序列位置，并下载rex前后各800bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以B.subtilis 6-7基因组为模板，P13和P14为引物PCR扩增获得rex上游同源臂，P17和P18为引物PCR扩增获得rex下游同源臂。以p7Z6质粒为模板，P15和P16为引物PCR扩增获得lox71-zeo-lox66片段。利用重叠延伸PCR技术将acuB上、下游同源臂基因片段和lox71-zeo-lox66片段融合扩增得到一条2.2kb左右的重组基因片段；将实施例2中制备得到的菌株B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoB制备成感受态，将该重组基因片段导入B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoB感受态细胞中，涂布于30mg/L、zeo抗性的LB平板，37℃培养箱中培养16h，挑取单克隆进行测序，测序正确的为敲除rex的zeor阳性转化子。将该阳性转化子制作成感受态，将pTSC转入该转化子感受态细胞中，涂布于含50mg/L的卡那霉素抗性平板，培养16h，长出的单克隆即为无博来霉素抗性的转化子；再将所得到的转化子挑到无抗性LB平板中，51℃培养48h，除去热敏型质粒pTSC，获得无抗且不含pTSC的rex敲除菌株，命名为B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoBΔrex。
P13(SEQ ID NO.13)：
5’-CATACGAAAGCTGGCCTGCGATAATTTTAAGGAGCGTGGATTTTC-3’
P14(SEQ ID NO.14)：
5’-AATCATGGTCTTTTGGTCCTCCAAATTATACTCGGATAGTTCTCTTTTAAAGTCACCG-3’
P15(SEQ ID NO.15)：
5’-CCGAGTATAATTTGGAGGACCAAAAGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGG-3’
P16(SEQ ID NO.16)：
5’-GCATATTTGGGCTCCTCCTTTCCCTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCT-3’
P17(SEQ ID NO.17)：
5’-GGCACTGGCCGTCGTTTTACAAGGGAAAGGAGGAGCCCAAATATGCCGAT-3’
P18(SEQ ID NO.18)：
5’-AGCGTAAAATACGCATACTTTCTGATTTTCGCCAAGAACATCGGT-3’
实施例4：重组菌的5L发酵罐发酵实验
(1)种子培养
种子培养基为LB培养基：酵母粉5g·L-1、蛋白胨10g·L-1、NaCl 10g·L-1。
将菌株B.subtilis 6-7、重组菌B.subtilis 6-7ΔacuB、B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoB、B.subtilis6-7ΔacuBΔacoBΔrex接种至LB平板中、37℃进行培养至长出单菌落，将单菌落接种于20mL LB培养基中，37℃振荡培养12h，然后转接10％接种量接种于180mL种子培养基中，37℃培养12h，培养至OD600为12的种子液。
(2)发酵培养
摇瓶发酵培养基：酵母浸膏5g·L-1、尿素2g·L-1、玉米浆6g·L-1、葡萄糖150g·L-1。
将步骤(1)中的种子液按体积比10％接种量接种于5L发酵罐中(含1.8L发酵培养基)进行发酵培养，发酵温度为37℃，发酵pH控制在6.5，发酵时间为96h。每隔12h取样一次，采用紫外分光光度仪在A600下测定细胞OD值，用生物传感分析仪测定(SBA-40ES，山东省科学院生物研究所)葡萄糖的含量，并采用HPLC测定乙偶姻(安捷伦1100，美国)。
结果表明，重组菌株B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoBΔrex于5L发酵罐中培养96h得到67.5g·L-1的乙偶姻，乙偶姻的生产效率提高至0.7g·L-1·h-1。B.subtilis 6-7ΔacuBΔacoBΔrex的乙偶姻摩尔得率为0.92，相对于原始菌株B.subtilis 6-7，乙偶姻摩尔得率提高了37％。
表1不同菌株的乙偶姻产量(g·L-1)
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用微生物发酵生产乙偶姻的方法
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaattgatgg gacggtgaat tagtg 25
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcgaattcgt aatcatggtc tattttttcc cctttgtcag tgtcagt 47
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgacaaagg ggaaaaaata gaccatgatt acgaattcga gctc 44
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
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atagataaat acactgtctc tgtaaaacga cggccagtgc 40
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcactggccg tcgttttaca gagacagtgt atttatctat tctccatcct acc 53
<210> 6
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<400> 6
gtcgtagtaa tgggcatcgg c 21
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cattgtatcg ccaaaggctg tga 23
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<212> DNA
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tcgaattcgt aatcatggtc ctcttacatt cctccttttt catatgacac 50
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<212> DNA
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aaaaaggagg aatgtaagag gaccatgatt acgaattcga gctcg 45
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cgccatttgt gtcccccctt gtaaaacgac ggccagtgc 39
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gcactggccg tcgttttaca aggggggaca caaatgg 37
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<400> 14
aatcatggtc ttttggtcct ccaaattata ctcggatagt tctcttttaa agtcaccg 58
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccgagtataa tttggaggac caaaagacca tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgg 58
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gcatatttgg gctcctcctt tcccttgtaa aacgacggcc agtgccaagc t 51
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggcactggcc gtcgttttac aagggaaagg aggagcccaa atatgccgat 50
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agcgtaaaat acgcatactt tctgattttc gccaagaaca tcggt 45
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，敲除了枯草芽孢杆菌基因acuB，或敲除基因acuB和基因acoB，或敲除基因acuB、基因acoB和基因rex。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因acuB的Gene ID为937318；所述基因acoB的Gene ID为939697；所述基因rex的Gene ID为939871。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以保藏编号为CTCC NO: M 2009200的B. subtilis 6-7作为出发菌株。
4.一种提高枯草芽孢杆菌乙偶姻产量的方法，其特征在于，敲除acuB，或敲除基因acuB和基因acoB，或敲除敲除基因acuB、基因acoB基因。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因acuB的Gene ID为937318；所述基因acoB的Gene ID为939697；所述基因rex的Gene ID为939871。
6.一种生产乙偶姻的方法，其特征在于，以葡萄糖为碳源，利用权利要求1~3任一所述基因工程菌发酵生产乙偶姻。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将OD600为10~20的基因工程菌，以5%~15%的接种量接种至发酵体系中。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵体系中含有酵母浸膏2~10 g/L、尿素1~5 g/L、玉米浆5~10 g/L和葡萄糖100~200 g/L。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在30~40℃，发酵60~96 h。
10.权利要求1~3任一所述基因工程菌，或权利要求4~9任一所述方法在制备乙偶姻或含乙偶姻的烘培食物、糖果或饮料中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111705027A (zh) | 2020-09-25 |
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