CN106676084A

CN106676084A - 一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN106676084A
Application number: CN201710071285.1A
Authority: CN
Inventors: 郑仁朝; 郑裕国; 丁旭; 汤晓玲
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2017-02-09
Filing date: 2017-02-09
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2037-02-09
Also published as: CN106676084B

Abstract

本发明公开了一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及其在水解外消旋2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸乙酯合成(3S)‑2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸中的应用，所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位、207位和259位氨基酸中的一位或多位进行突变后获得。经过蛋白质分子改造，TTL立体选择性水解CNDE的活力由4.50U/mg提高到160.55U/mg，远高于目前已报道的脂肪酶水解CNDE的活力。因此，本发明所获得的突变体在高效催化CNDE合成普瑞巴林手性中间体(3S)‑2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸中具有良好的应用前景。

Description

一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种脂肪酶及应用，特别涉及一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及在不对称拆分2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

(二)背景技术

普瑞巴林(Pregabalin，PGB)，商品名化学名为(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸，是一种钙离子通道调节剂，能够有效抑制与神经病理性疼痛、癫痫等相关的神经元过度兴奋及神经递质释放增加的疾病(Curr.Opin.Pharmacol.2006,6:108-113)。目前已被FDA批准用于带状疱疹后神经痛、糖尿病外周神经痛、癫痫、纤维肌痛等疾病的治疗。与加巴喷丁等传统类似药物相比，普瑞巴林使用剂量低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强(Curr.Med.Res.Opin.2006,22:375-384)，因此被多个国际指南推荐为神经病理性疼痛治疗的一线药物。

目前已有大量普瑞巴林关键中间体合成方法的报道。其中，化学法包括不对称合成法、手性拆分法、手性配体法和手性源法等。化学法合成普瑞巴林存在原子经济性低，有机溶剂使用量大，生产条件苛刻等缺陷，限制了其大规模工业应用。美国辉瑞公司研发的新一代普瑞巴林生产工艺以Novozymes公司商品化脂肪酶为催化剂不对称拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)合成关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，后者再经过脱羧、碱水解、氢化等步骤制得普瑞巴林成品。该路线脂肪酶作为生物催化剂，提高了原料利用率，减少“三废”排放，有机溶剂使用量减少90％，产物ee值可达98％。

脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)，是一类能够催化三酯酰甘油酯键水解的酶。除了水解酯键以外，还能催化酯合成、转酯化、氨解等反应。脂肪酶生物催化具有选择性高，副反应少及反应条件温和等特点，在生物催化尤其是在光学纯化合物制备领域具有重要应用前景。

定向进化技术包括易错PCR和DNA shuffling等，是蛋白质分子改造的重要手段。从易错PCR技术出发，筛选引起酶催化性能改变的突变点，并结合定点突变分析该突变点在酶功能实现中的作用，对提高脂肪酶催化合成普瑞巴林手性中间体的性能具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是通过易错PCR结合定点突变技术对来源于嗜热踝节菌的脂肪酶进行分子改造，获得一种高效动力学拆分外消旋CNDE合成普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的突变体。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶(TTL)突变体，所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位、207位和259位氨基酸中的一位或多位进行突变后获得。

进一步，优选所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突变为苯丙氨酸和/或第207位脯氨酸突变为苯丙氨酸和/或第259位亮氨酸突变为苯丙氨酸，更优选所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第207位脯氨酸突变为苯丙氨酸，同时第259位亮氨酸突变为苯丙氨酸。

进一步，优选所述突变体氨基酸序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9之一所示。

本发明还提供一种所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8或SEQ ID No.10之一所示。

本发明还涉及一种含所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌。

本发明还提供一种所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，具体所述的应用为：将含来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌发酵培养，取培养液离心后的上清提取纯酶，以所述的纯酶为催化剂，以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，添加醋酸锌，以纯水(或100mM，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液)为反应介质构成反应体系，于35℃、200rpm反应，反应过程维持pH为7.0，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸；所述反应体系中，底物终浓度为3M，醋酸锌终浓度50mM，纯酶用量为300U/mL。

本发明所述催化剂按如下方法制备：将含来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至YPD培养基中，30℃培养16-22h，获得种子液；然后将种子液以体积浓度1％的接种量转接至BMGY培养基中，30℃培养16-22h后，5000rpm离心去上清，将菌体(即沉淀)用BMMY培养基重悬后，每隔12h添加体积浓度1％的甲醇，30℃诱导培养5天后，将培养液8000rpm离心5min；取上清，在冰浴条件下利用硫酸铵盐析法沉淀目的蛋白，沉淀过夜后，8000rpm离心10min，将沉淀的粗蛋白用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬后，透析于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)过夜；将酶液(即截留液)上样于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0-0.5M NaCl的50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集0.2～0.3M NaCl浓度下洗脱的目的蛋白，透析于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)过夜，取截留液即为纯酶；所述YPD培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；所述BMGY培养基组成：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，甘油10g/L，0.1mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，115℃灭菌后加入4×10^-5％生物素；所述BMMY培养基组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，0.1mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，115℃灭菌后加入4×10^-5％生物素。

本发明利用易错PCR技术对脂肪酶TTL编码基因(SEQ ID No.2)进行随机突变，首先利用T7引物进行PCR扩增，进行随机突变，得到脂肪酶突变体核苷酸序列，连接至表达载体pET-28b(+)后转入大肠杆菌宿主，诱导表达后通过高通量筛选方法检出正突变子，然后结合定点突变的方法，得到活力进一步提高的突变体。从而获得能够高效催化CNDE立体选择性水解合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的突变体。

其中，所述的取代较佳的氨基酸位点为：将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突变为苯丙氨酸；所述氨基酸序列中的第207位脯氨酸突变为苯丙氨酸；所述氨基酸序列中的第259位亮氨酸突变为苯丙氨酸。

具体方法如下：嗜热踝节菌脂肪酶TTL(GenBank accession No.AEE61324.1)即SEQ ID No:1，由269个氨基酸残基组成，其核苷酸序列SEQ ID No:2所示。将构建获得的pET-28b-TTL表达质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中表达。采用易错PCR方法进行随机突变，并重组至表达载体pET-28b(+)，再将重组质粒转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，构建突变文库。挑选突变文库中的单菌落至96孔板中诱导表达蛋白，利用溴百里香酚蓝作为指示剂筛选活力高于对照组的菌株。将活力提高的菌株进行测序分析，获得突变体序列信息。将活力提高的突变体蛋白进一步进行定点突变，通过气相色谱测定水解CNDE的活力，将筛选得到的高活力突变体菌株进行测序分析，经过对上述构建的突变文库筛选以及理性设计方法，获得了活力提高的突变体为：L259F(氨基酸序列SEQ ID No:3，核苷酸序列SEQ IDNo:4所示)、L206F/259F(氨基酸序列SEQ ID No:5，核苷酸序列SEQ ID No:6所示)、P207F/L259F(氨基酸序列SEQ ID No:7，核苷酸序列SEQ ID No:8所示)和L206F/P207F/L259F(氨基酸序列SEQ ID No:9，核苷酸序列SEQ ID No:10所示)。

将野生型和上述筛选得到的突变体在毕赤酵母宿主中进行分泌表达以克服在大肠杆菌宿主表达时出现包涵体的现象，从而实现蛋白的可溶性表达与催化活力的提高。

在本发明制备的脂肪酶突变体的方法中，所获得的脂肪酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞内表达，也可以采用本领域已知的任何适当的方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。

本发明制备脂肪酶突变的方法中，所述载体的宿主细胞为原核生物或真核生物。所述原核生物包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。所述真核生物包括但不限于毕赤巴斯德酵母、酿酒酵母和黑曲霉。

所述的脂肪酶突变体可以以纯酶形式使用，也可以以未纯化的粗酶液等方式使用。如果需要可以对其进行固定化后进行使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：经过蛋白质分子改造，TTL立体选择性水解CNDE的活力由4.50U/mg提高到160.55U/mg，远高于目前已报道的脂肪酶水解CNDE的活力。因此，本发明所获得的突变体在高效催化CNDE合成普瑞巴林手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中具有良好的应用前景。

(四)附图说明

图1为野生型和突变后脂肪酶蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图。其中：泳道M为蛋白质标准样品；泳道1为野生型TTL蛋白纯化样品；泳道2为突变体L259F蛋白纯化样品；泳道3为突变体L206F/L259F蛋白纯化样品；泳道4为突变体P207F/L259F蛋白纯化样品，泳道5为突变体L206F/P207F/L259F蛋白纯化样品。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1构建脂肪酶突变文库

以克隆来源于嗜热踝节菌的脂肪酶基因(GenBank accession No.JF414585.1)并连接至pET-28b(+)的pET-28b-TTL质粒为模版(核苷酸序列SEQ ID NO.2)，利用T7promoter和T7terminator为引物(表1)进行PCR扩增，随机引入突变。PCR反应体系(50μL)：模版0.5～20ng，1×Taq Buffer(不含Mg²⁺)，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，0.1mM dCTP，0.1mM dTTP，0.2mMMnCl₂，引物T7promoter与T7terminator各0.2μM，Taq DNA聚合酶5U。PCR条件(1)95℃预变性3min；(2)95℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后切胶回收，利用NcoI和Xhol双酶切，与同样双酶切pET-28b(+)表达载体连接，化学转化导入E.coli BL21(DE3)，涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，得到单菌落即成功构建突变文库。

表1引物设计表

实施例2突变体的高通量筛选

挑取实施例1中的单菌落至96深孔板中培养，每个孔板加入200μL LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素)，37℃培养2.5h至OD₆₀₀约为0.6左右时，加入终浓度为0.1mM IPTG诱导，并在28℃诱导培养20h。将96深孔板的菌体离心15min(5000rpm，4℃)，弃上清后，用Tris-HCl(20mM，pH 8.0)缓冲液重悬菌体作为反应的生物催化剂。将菌体悬液加入96浅孔板各孔中，每孔200μL，然后加入底物CNDE(终浓度100mM)，并以0.01％溴百里香酚蓝作为指示剂，30℃反应1-3h。

根据颜色变化的快慢程度挑取活力提高的菌体(以野生型菌株为对照)，利用气相色谱复筛验证CNDE的催化活性。色谱柱类型：Astec CHIRALDEX^TM G-TA毛细管柱；色谱条件：柱温135℃，进样室温度220℃，FID检测器温度220℃，载气He流量：1mL/min，分流比：30:1。测序分析后确定活力提高突变体为L259F，其氨基酸序列见序列表SEQ ID NO.3，其核苷酸序列见序列表SEQ ID No.4。

实施例3定点突变与筛选

为了进一步提高突变体酶活，利用定点突变继续筛选更优的复合突变体。以表达质粒pET-28b-L259F为模版，通过全质粒扩增进行定点突变。PCR体系(50μL)为：模版0.5～20ng，5×PrimeSTAR Buffer 10μL，dNTP Mixture 4μL，突变引物(表1)各1μL，PrimeSTARDNA Polymerase 0.5μL。PCR条件(1)95℃预变性3min；(2)95℃变性15s；(3)55℃退火10s；(4)72℃延伸5min，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳验证，利用DpnI消化后导入E.coli BL21(DE3)，涂布至含有50μg/mL卡那霉素的LB平板。利用气相色谱检测各突变体对CNDE的催化活性，确定活力提高突变体为L206F/L259F，P207F/L259F和L206F/P207F/L259F，其氨基酸序列分别如序列表SEQ IDNO.5，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示，核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.10所示。其中，催化活力最高的为突变体L206F/P207F/L259F。

实施例4毕赤酵母表达脂肪酶

为了实现野生型和突变体的高效可溶性表达，提高其催化效率，将野生型和突变体在毕赤酵母宿主中实现分泌表达。以pET-28b表达质粒为模版，利用毕赤酵母表达引物Pic-F和Pic-R将野生型和突变体基因进行PCR扩增。PCR体系(50μL)：模版0.5～20ng，1×Pfu Buffer，0.2mM dNTP，引物各0.2μM，Pfu DNA聚合酶5U。PCR条件(1)95℃预变性3min；(2)95℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min，步骤(2)～(4)共30个循环；(5)最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后切胶回收，用XhoI和XbaI双酶切，与同样双酶切后的pPICZα-A连接，化学转化至E.coli JM109中，然后涂布至含有25μg/mL Zeocin^TM的LB平板。挑取单菌落测序，确定阳性克隆后提取质粒用SacI线性化处理、乙醇沉淀，电转化导入购置于Invitrogen公司毕赤酵母X33宿主中，涂布至含有25μg/mLZeocin^TM的YPDS平板。挑取单菌落验证阳性表达子，成功构建表达野生型、突变体L259F、L206F/259F、P207F/L259F和L206F/P207F/L259F脂肪酶的重组毕赤酵母X33。

实施例5毕赤酵母表达野生型和突变体脂肪酶的表达纯化

1、野生型和突变体脂肪酶在毕赤酵母中的表达

将实施例4中成功构建的重组毕赤酵母X33接种至YPD培养基(蛋白胨20g/L；酵母粉10g/L；葡萄糖20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0)中。30℃培养16-22h，然后以体积浓度1％接种量转接至BMGY培养基(酵母粉10g/L；蛋白胨20g/L；YNB13.4g/L；甘油10g/L；0.1mol/LpH 6.0磷酸缓冲液；115℃灭菌后加入4×10^-5％生物素)中。30℃培养16-22h后，5000rpm离心去上清，取菌体用BMMY培养基(酵母粉10g/L；蛋白胨20g/L；YNB13.4g/L；0.1mol/L pH6.0磷酸缓冲液；115℃灭菌后加入4×10^-5％生物素)重悬后，30℃诱导培养，每12h添加甲醇诱导，甲醇体积添加量为1％。

2、毕赤酵母表达脂肪酶野生型和突变体的纯化

毕赤酵母发酵5天后，将发酵液8000rpm离心5min。取上清，在冰浴条件下利用硫酸铵盐析法沉淀目的蛋白。沉淀过夜后，8000rpm离心10min，将沉淀的粗蛋白用Tris-HCl(50mM，pH 8.0)进行重悬后，透析于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)缓冲液过夜。将酶液(即截留液)上样于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱(1.6×20cm,GE)，用含0-0.5M NaCl的Tris-HCl(50mM，pH 8.0)线性洗脱，收集0.2～0.3M NaCl浓度下洗脱的目的蛋白，透析于Tris-HCl(50mM，pH 8.0)缓冲液过夜，取截留液即为纯酶。通过SDS-PAGE分析目的蛋白，蛋白电泳结果如图1所示。

实施例6脂肪酶活力测定

对实施例5中纯化后的酶蛋白进行酶活测定。脂肪酶活力检测反应体系(10mL)：缓冲液Tris-HCl(100mM，pH 8.0)，100mM底物CNDE，5mM醋酸锌，纯酶终浓度20μg/mL。反应液于35℃、200rpm反应1h。取样200μL，加入50μL 1M的HCl终止反应后用乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸钠处理后，利用气相色谱(岛津GC-14C)外标法测定转化液2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯转化率和(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的对映体过量值。酶活定义(U)：在35℃，Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 8.0)条件下，每分钟催化生成1μmol(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸所需要的酶量定义为1U。野生型和突变体脂肪酶酶活测定结果参见表2。

表2：野生型和突变体嗜热踝节菌脂肪酶活力

实施例7脂肪酶突变体在(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

在100mL反应体系中，加入23.5mL纯水，3M底物CNDE(即765g/L)，醋酸锌终浓度50mM，最优突变体L206F/P207F/L259F纯酶用量为300U/mL。反应温度35℃，反应过程中通过滴加4M NaOH控制pH值维持7.0，搅拌转速为200rpm。反应过程中取样200μL，加入50μL 1M的HCl终止反应后用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠处理后，利用气相色谱测定转化液2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯转化率和(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的对映体过量值。从反应结果可知，在高底物浓度条件下，最优突变体L206F/P207F/L259F转化6小时后，转化率可达到45.5％，产物的ee>95％。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体、编码基因及其应用

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<211> 269

<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Ala Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

35 40 45

Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr

50 55 60

Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Arg Leu Ile Val Leu Ser Phe

65 70 75 80

Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu Asp

85 90 95

Leu Lys Gly Ile Asp Asp Ile Cys Ser Gly Cys Lys Gly His Asp Gly

100 105 110

Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asn Thr Leu Thr Gln Gln Val

115 120 125

Gln Asn Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Ser Leu Arg

145 150 155 160

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr

180 185 190

Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

210 215 220

Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val Lys Val Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile Ala

245 250 255

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tgcccggaag ttgaaaaagc tgacgctacc ttcctgtact ctttcgaaga ctctggtgtt 180

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cgtggttctc gttctctgga aaactggatc ggtaacatca acctggacct gaaaggtatc 300

gacgacatct gctctggttg caaaggtcac gacggtttca cctcttcttg gcgttctgtt 360

gctaacaccc tgacccagca ggttcagaac gctgttcgtg aacacccgga ctaccgtgtt 420

gttttcaccg gtcactctct gggtggtgct ctggctaccg ttgctggtgc ttctctgcgt 480

ggtaacggtt acgacatcga cgttttctct tacggtgctc cgcgtgttgg taaccgtgct 540

ttcgctgaat tcctgaccgc tcagaccggt ggtaccctgt accgtatcac ccacaccaac 600

gacatcgttc cgcgtctgcc gccgcgtgaa ctgggttact ctcactcttc tccggaatac 660

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Asn Val Thr Cys Arg Gly Ser Ile Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp

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65 70 75 80

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Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro

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Arg Glu Leu Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Thr Ser

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Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Lys Asn Asp Ile Val Lys Val Glu Gly

225 230 235 240

Ile Asp Ser Thr Asp Gly Asn Asn Gln Pro Asn Thr Pro Asp Ile Ala

245 250 255

Ala His Phe Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

260 265

<210> 4

<211> 807

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

gaagtttctc aggacctgtt cgaccagttc aacctgttcg ctcagtactc tgctgctgct 60

tactgcgcta aaaacaacga cgctccggct ggtgctaacg ttacctgccg tggttctatc 120

tgcccggaag ttgaaaaagc tgacgctacc ttcctgtact ctttcgaaga ctctggtgtt 180

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cgtggttctc gttctctgga aaactggatc ggtaacatca acctggacct gaaaggtatc 300

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tacttcggtc tgatcggtac ctgcctg 807

<210> 5

<211> 269

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asp Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr

1 5 10 15

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Arg Gly Ser Arg Ser Leu Glu Asn Trp Ile Gly Asn Ile Asn Leu Asp

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100 105 110

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Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val

165 170 175

Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Ala Gln Thr Gly Gly Thr

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<223> 人工序列

<400> 10

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Claims

1.一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位、207位和259位氨基酸中的一位或多位进行突变后获得。

2.如权利要求1所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突变为苯丙氨酸和/或第207位脯氨酸突变为苯丙氨酸和/或第259位亮氨酸突变为苯丙氨酸。

3.如权利要求1所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第206位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第207位脯氨酸突变为苯丙氨酸，同时第259位亮氨酸突变为苯丙氨酸。

4.如权利要求1所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列为SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7或SEQ ID No.9之一所示。

5.一种权利要求1所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因。

6.如权利要求5所述编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNo.4、SEQ IDNo.6、SEQ IDNo.8或SEQ IDNo.10之一所示。

7.一种含权利要求5所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌。

8.一种权利要求1所述来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌进行发酵培养，取发酵培养液离心后的上清提取纯酶，以所述的纯酶为催化剂，以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，添加醋酸锌，以纯水为反应介质构成反应体系，于35℃、200rpm反应，反应过程维持pH为7.0，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸；所述反应体系中，底物终浓度为3M，醋酸锌终浓度50mM，纯酶添加量为300U/mL。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至YPD培养基中，30℃培养16-22h，获得种子液；然后将种子液以体积浓度1％接种量转接至BMGY培养基中，30℃培养16-22h后，5000rpm离心去上清，取沉淀用BMMY培养基重悬后，每隔12h添加体积浓度1％甲醇，30℃诱导培养5天后，将培养液8000rpm离心5min；取上清，在冰浴条件下利用硫酸铵盐析法沉淀目的蛋白，沉淀过夜后，8000rpm离心10min，将沉淀用50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬后，透析于50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液过夜；取截留液上样于50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0-0.5M NaCl的50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集0.2～0.3M NaCl浓度下洗脱的目的蛋白，透析于50mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液过夜，取截留液即为纯酶；所述YPD培养基组成为：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；所述BMGY培养基组成：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB13.4g/L，甘油10g/L，0.1mol/L、pH 6.0磷酸缓冲液，115℃灭菌后加入4×10^-5％生物素；所述BMMY培养基组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13.4g/L，0.1mol/L、pH 6.0磷酸缓冲液，115℃灭菌后加入4×10^-5％生物素。