CN107988194A

CN107988194A - 一种酶活提高的L-天冬氨酸α-脱羧酶变体及其构建方法

Info

Publication number: CN107988194A
Application number: CN201711350235.3A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 张腾辉; 张显; 杨套伟; 徐美娟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN107988194B

Abstract

本发明公开了一种酶活提高的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第56位谷氨酸突变成丝氨酸。本发明得到的突变体在大肠杆菌中表达，经过对纯酶的酶活测定，突变酶E56S的酶活相对原始酶BsADC提高了55％，并且用水作为溶剂进行的产β丙氨酸实验，可以实现8h产215gβ丙氨酸，且其转化率为94％。本发明表明56位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

Description

一种酶活提高的L-天冬氨酸α-脱羧酶变体及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的L-天冬氨酸α-脱羧酶变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase，E.C.4.1.1.1)能够将L-天冬氨酸在α位脱羧形成β-丙氨酸和气体二氧化碳，β-丙氨酸在医药和保健品上都要很重要的应用，在医药上β-丙氨酸可用合于成作泛酸钙、肌肽、怕米磷酸钠和巴柳氮等医用药品，他们在神经修复、缓解肿瘤性骨痛和治疗肠道性等疾病时有较好的效果，在食品添加剂方面，β-丙氨酸主要用于提高人体机能，实现肌肉的发育方面等，是运动员常使用的一种保健品。L-天冬氨酸α-脱羧酶主要在细菌中存在，在植物和部分动物中也有发现，但由于微生物来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶具有蛋白小，易于表达等优点，被广泛研究和用于生产β-丙氨酸。

异源表达L-天冬氨酸α-脱羧酶的问题是个别来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶不能自我成熟需要相关蛋白的协助，这增加的酶应用的难度；并且L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活相对比较低，这些都限制了L-天冬氨酸α-脱羧酶生产β丙氨酸在工业中的应用。因此，选取一种可以自我成熟和高酶活的L-天冬氨酸α-脱羧酶是实现大规模工业化应用的关键，在可以自我成熟的枯草芽孢杆菌来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基础上，进行定点突变提高L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活和热稳定，对于扩大L-天冬氨酸α-脱羧酶产β丙氨酸工业化应用前景具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种酶活提高L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸如序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将56位氨基酸由谷氨酸突变成丝氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供所述基因的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的制备方法，所述方法是在SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第56位的谷氨酸的密码子突变成了编码丝氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pET28a。

在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：

(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，以Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)，Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.3所示的重组基因。

(2)将步骤(1)得到的重组基因序列，连接到pET28a表达载体中，得到重组质粒pET28a-E56S，重组质粒化转化E.coli，获得重组大肠杆菌工程菌株，命名为E.coli/pET28a-E56S。

本发明的第六个目的是提供所述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体在医药化工领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于制备合成泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、β-丙氨酸金属配合物或巴柳氮。

本发明在天然L-天冬氨酸α-脱羧酶的基础上，通过定点突变生物技术改造L-天冬氨酸α-脱羧酶分子结构，突变体酶的纯酶液比酶活较突变前提高55％。突变体酶E56S的热稳定得到一定的提升，在65℃下保持12h依旧残留81％的活性，并且通过全细胞转化可以得到225g/L的β丙氨酸，转化率可以达到94％。本发明表明56位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。本发明所得可用于制备治疗肿瘤性骨痛和肠道性疾病的药物。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

大肠杆菌发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物8g/L，K₃HPO₄ 4g/L，一水合柠檬酸2.1g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，甘油10g/L，硫酸铵2.5g/L，MgSO₄ 0.24g/L，NaCl 3g/L。调节pH 6.8-7.0。

酶活定义：每分钟内能催化L-天冬氨酸转化为1μmolβ丙氨酸所需要的酶量为一个酶活单位。

L-天冬氨酸α-脱羧酶活测定方法：以L-天冬氨酸为底物，通过HPLC测定在催化反应中生成的β丙氨酸量来测定酶活。反应混合物(1mL)组成为：920μL 0.1M pH7.0 PB缓冲液；50μL 100g/L的L-Asp溶液(用NaOH调节pH为7.0)；30μL纯酶液。反应混合物在37℃，pH7.0条件下，反应20min后，加入100μL 0.1M NaOH溶液终止反应。随后去一定量的反应液进行HPLC检测，用于测定酶活。

HPLC方法：高效液相色谱仪为Agilent 1260 series，色谱柱为ZORBAX SB-C18柱(4.6×150mm 5-Micron,Agilent)，HPLC条件为：流动相A：0.1M乙酸钠，0.023％三乙胺，0.5％四氢呋喃。流动相B：0.15M乙酸钠，40％甲醇，40％乙腈。柱温40℃，流速1mL/min，OPA柱前衍生。

实施例1：含L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的重组载体的构建

(1)G107D突变体的获得：以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)、Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ IDNO.3所示的重组基因。

(2)将重组基因与pET28a分别用NcoI、XhoI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pET28a-E56S。测序工作由上海生工完成。

实施例2：产L-天冬氨酸α-脱羧酶大肠杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pET28a-E56S化学法转化入E.coli感受态细胞，具体方法如下：

(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：

LB：酵母提取物5，蛋白胨10，NaCl10。

50％甘油，0.1M CaCl₂，115℃湿热灭菌。

(1)接种大肠杆菌JM109或者大肠杆菌BL21(DE3)于50mL新鲜LB培养液中37℃，220r/min过夜培养。

(2)取过夜培养物1mL接种到100mL新鲜LB培养基中37℃，220r/min振荡培养。

(3)培养1h后开始用分光光度计检测培养液的OD₆₀₀值，每隔20min左右检测一次，直到OD600值达到0.6时为止(约需要2h)。

(4)将培养液等份35mL分装于50mL的离心管中，并放置在冰上预冷约10min。

(5)4℃，1000g离心5min，完全弃去上清。

(6)向50mL的离心管中加入2mL预冷的0.1M氯化钙溶液，缓慢吹打均匀冰上静置15min，重复操作两次。

(7)随后加入3.2mL 0.1M氯化钙溶液和1.6mL50％甘油后分装于1.5mL的离心管中，每支离心管分装120μL。

大肠杆菌感受态热击转化方法为，在120μL感受态中加入5μL质粒，混匀后冰上放置半小时，然后42℃准确热击90s，冰上冷置5分钟后加入800μL LB培养基，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌E.coli/pET28a-E56S。

实施例3：重组菌E.coli/pET28a-E56SL-天冬氨酸α-脱羧酶高效表达及酶活测定

将实施例2构建的重组菌E.coli/pET28a-E56S与表达未突变的酶的对照菌株E.coli/pET28a-BsPanD分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按4％的接种量转接于大肠杆菌发酵培养基中诱导表达，37℃培养14h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，然后采用Ni柱纯化得到纯酶液，用于酶活力的测定。

结果表明重组菌E.coli/pET28a-E56S表达的L-天冬氨酸α-脱羧酶比酶活为8.06U/mg，比对照菌株E.coli/pET28a-BsADC L-天冬酰胺酶5.2U/mg酶活提高55％。

突变体酶E56S的热稳定得到一定的提升，在65℃下保持12h依旧残留81％的活性，而未突变的酶在在65℃下保持12h，只有52％活性。

通过发酵诱导得到的E.coli/pET28a-E56S菌体进行全细胞转化生产β丙氨酸，在1L的发酵罐中，把菌体悬浮于水中，菌体的OD₆₀₀为100，控制反应的pH为7.0，转速为600rpm，不断的分批添加固体底物天冬氨酸，在8h可以转化生产215gβ丙氨酸，转化率为94％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种酶活提高的L-天冬氨酸α-脱羧酶变体及其构建方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Ile Val Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Ser Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn

100 105 110

Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu

115 120 125

<210> 2

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr

1 5 10 15

Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu

20 25 30

Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Lys Val Gln Ile Val Asn

35 40 45

Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg

50 55 60

Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln

85 90 95

Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn

100 105 110

Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu

115 120 125

<210> 3

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60

aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120

aatgaaaaag tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttagcac gtatattatt 180

cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240

gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300

catgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360

gaaccagccc gtacaatttt gtag 384

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcttagtac gtatattatt c 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tatacgtgct aagacgtgc 19

Claims

1.一种L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.一种含有权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.一种表达权利要求1所述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

6.一种制备权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，是在SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第56位的谷氨酸的密码子突变成了编码丝氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到大肠杆菌基因工程菌。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述方法具体是:(1)以SEQ ID NO.4所示核酸序列为模板，以序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的引物，进行PCR，得到编码第56位谷氨酸突变成丝氨酸的E56S突变体基因序列；(2)将步骤(1)得到的重组基因序列，连接到pET-28a表达载体中，得到重组质粒pET28a-E56S，重组质粒化转化到大肠杆菌宿主中，获得重组大肠杆菌基因工程菌。

8.权利要求1所述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体在医药化工领域的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是用于制备合成泛酸钙、肌肽、帕米磷酸钠、β-丙氨酸金属配合物或巴柳氮。