CN113801869A - β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用 - Google Patents

β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及涉及一种催化效率提高的β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用。所述β丙氨酸合成酶突变体氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明比较了不同菌株的panD基因对β‑丙氨酸产量的影响，确定了在panD基因第43号氨基酸位点进行突变，由Lys变为Tyr时，获得的重组大肠杆菌全细胞发酵所产的β‑丙氨酸的量达到5.04g/L，而野生型菌株所产的β‑丙氨酸的量为1.58g/L，提高了约3.2倍。本发明应用定点突变技术对panD基因进行定向改造，获得的突变菌株β‑丙氨酸产量明显提高，育种目标明确、效率高，具有较好应用前景。

Description

β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用
(一)技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种催化效率提高的β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用。
(二)背景技术
β-丙氨酸又称β-氨基丙酸，在医药、化妆品、食品、化工产品等方面有广泛的应用。β-丙氨酸又是一种重要的前体物质，可以衍生合成泛酸、泛酸钙以及肌肽等。目前全球D-泛酸钙需求量巨大，导致产品供不应求，其他领域的β-丙氨酸及其衍生物的市场应用需求量也在不断上升。现在，β-丙氨酸的工业化生产主要是化学法和生物法，化学法合成的成本高、其中在生产的过程中会产生大量有毒副产物，既不利于分离纯化，也会污染环境。生物法合成的成本低，且不会产生有毒副产物，既环保也可高效利用。
L-天冬氨酸-α-脱羧酶(简称panD)能催化L-天冬氨酸产生β-丙氨酸和CO2。于是β-丙氨酸可以用panD来生产。鉴于天然的panD酶活比较低，且直接从自然界中获得高酶活的panD较为困难，于是在1996年，美国NSC技术有限公司利用基因重组技术，对大肠杆菌的panD基因进行克隆表达，1999年，Dusch等人也对panD基因克隆到大肠杆菌以及谷氨酸棒杆菌中进行表达。尽管合成了β-丙氨酸，但是产量依旧不高，离实际应用还有一段距离。
L-天冬氨酸-α-脱羧酶(简称panD)能催化L-天冬氨酸产生β-丙氨酸和CO2。于是β-丙氨酸可以用panD来生产。鉴于天然的panD酶活比较低，且直接从自然界中获得高酶活的panD较为困难，于是在1996年，美国NSC技术有限公司利用基因重组技术，对大肠杆菌的panD基因进行克隆表达，1999年，Dusch等人也对panD基因克隆到大肠杆菌以及谷氨酸棒杆菌中进行表达。尽管合成了β-丙氨酸，但是产量依旧不高，离实际应用还有一段距离。
(三)发明内容
为了提高生物发酵法合成β-丙氨酸的产率，本发明提供一种催化效率提高的β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用。
本发明采用的技术方案是：
一种催化效率提高的β丙氨酸合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还涉及编码所述的突变体的基因。
具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述panD突变基因SEQ IDNo.1是panD基因第43号氨基酸的密码子由AAA变成UAC而得的。所述panD基因来源于E·coli中编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶的panD基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.1序列如下：
ATGTATCGAA CAATGATGAG CGGCAAACTT CACAGGGCAA CTGTTACGGA AGCAAACCTG 60AACTATGTGG GAAGCATTAC AATTGATGAA GATCTCATTG ATGCTGTGGG AATGCTTCCT 120AATGAATACG TACAAATTGT GAATAATAAT AATGGAGCA CGTCTTGAAA CGTATATTAT 180TCCTGGTAAA CGGGGAAGCG GCGTCATATG CTTAAACGGT GCAGCCGCAC GCCTTGTGCA 240GGAAGGAGAT AAGGTCATTA TTATTTCCTA CAAAATGATG TCTGATCAAG AAGCGGCAAG 300CCATGAGCCG AAAGTGGCTG TTCTGAATGA TCAAAACAAA ATTGAACAAA TGCTGGGGAA 360CGAACCAGCC CGTACAATTT TGTAG
SEQ ID No.2序列如下：
Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr GluAla Asn Leu
Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu Ile Asp Ala Val GlyMet Leu Pro
Asn Glu Tyr Val Gln Ile Val Asn Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu ThrTyr Ile Ile
Pro Gly Lys Arg Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala ArgLeu Val Gln
Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln GluAla Ala Ser
His Glu Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn Lys Ile Glu Gln MetLeu Gly Asn
Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu*
SEQ ID No.3序列如下：
ATGTATCGAA CAATGATGAG CGGCAAACTT CACAGGGCAA CTGTTACGGA AGCAAACCTGAACTATGTGG GAAGCATTAC AATTGATGAA GATCTCATTG ATGCTGTGGG AATGCTTCCT AATGAAAAAGTACAAATTGT GAATAATAAT AATGGAGCA CGTCTTGAAA CGTATATTAT TCCTGGTAAA CGGGGAAGCGGCGTCATATG CTTAAACGGT GCAGCCGCAC GCCTTGTGCA GGAAGGAGAT AAGGTCATTA TTATTTCCTACAAAATGATG TCTGATCAAG AAGCGGCAAG CCATGAGCCG AAAGTGGCTG TTCTGAATGA TCAAAACAAAATTGAACAAA TGCTGGGGAA CGAACCAGCC CGTACAATTT TGTAG
本发明还涉及含有所述的编码基因的重组质粒以及基因工程菌。
具体的，所述基因工程菌按如下方法构建获得：将SEQ ID No.2所示基因克隆到PET-28b(+)表达载体上，得到重组质粒PET-28b-panD，将所得的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，获得重组大肠杆菌E·coli BL21-
PET28b-panD，即所述基因工程菌。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。
具体的，所述应用为：以L-天冬氨酸为反应底物，以所述基因工程菌发酵获得的产酶细胞为催化剂，于缓冲液中进行反应制备β-丙氨酸。
具体方法可如下：将基因工程菌液加入L-天冬氨酸的水溶液(用氢氧化钠预先调节水溶液的pH值至7.0)和pH缓冲液，37℃，摇床180rpm，反应24小时，制备β-丙氨酸。所述L-天冬氨酸在初始反应体系中的浓度为60～100g/L，优选为80g/L。
所述基因工程菌通常需要经过预培养，具体培养方法如下：
1、从平板上分别挑取重组菌株E·coli BL21-PET-28b-panD的单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素抗性的5mL LB试管里，37℃培养12h，转接1mL菌液到含有50mg/L卡那霉素抗性100mL LB摇瓶中培养，培养至OD600＝0.3～0.5，加入0.5mmol的IPTG，诱导12h，离心收集菌，得到重组菌株E·coli BL21-PET-28b-panD的细胞。
2、全细胞培养：培养配方：PBS磷酸缓冲液、80g/L的L-天冬氨酸水溶液，将步骤1得到的细胞用磷酸缓冲液进行洗涤离心，重复步骤一次，然后将洗涤好的细胞按磷酸缓冲液和L-天冬氨酸水溶液1：1的比例进行全细胞培养，培养温度：37℃，培养时间：12～24h(优选24h)。
其中，PBS的缓冲液按如下组成配制：磷酸二氢钾：0.27g；磷酸氢二钠：1.42g或者十二水合磷酸氢二钠：2.58g；氯化钠：8g；氯化钾：0.2g加去离子水约800ml(充分搅拌溶解，然后加盐酸调pH至7.4，最后定容至1L)。
本发明的有益效果主要体现在：本发明比较了不同菌株的panD基因对β-丙氨酸产量的影响，确定了在panD基因第43号氨基酸位点进行突变，由Lys变为Tyr时，获得的重组大肠杆菌全细胞发酵所产的β-丙氨酸的量达到5.04g/L，而野生型菌株所产的β-丙氨酸的量为1.58g/L，提高了约3.2倍。本发明应用定点突变技术对panD基因进行定向改造，获得的突变菌株β-丙氨酸产量明显提高，育种目标明确、效率高，具有较好应用前景。
(四)附图说明
图1为突变株与亲本和野生型的酶活对比。
图2为三种菌株不同时间生产β-丙氨酸对比。
图3为重组菌株全细胞催化L-天冬氨酸转化为β-丙氨酸的产量对比。
(五)具体实施方式
下面结合具体实例对本发明做进一步详细地说明，但本发明并不限于以下实施例：
实施例1：大肠杆菌panDK43Y基因突变体的构建
(1)含大肠杆菌panD基因的pET28b(+)-panD质粒的获得：从实验室通过一步克隆已有构建好的大肠杆菌BL21-pET28b(+)-panD(构建过程：将质粒PET28b(+)作为模板PCR并通过琼脂糖凝胶电泳检测得到载体，将PCR得到的SEQ ID No.3所示panD片段通过一步克隆的方法连接到载体PET28b(+)得到PET28b(+)-panD重组质粒)接种于LB液体培养基中，于37℃、200rpm转速下摇床培养12h，8000rpm离心5min，收集菌体细胞，用质粒抽提试剂盒抽提质粒pET28b(+)-panD；取2μL质粒DNA用ND500超微量紫外可见分光光度计测定样品的浓度和纯度；LB液体培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0，卡那霉素50mg/L，以水为溶剂。
(2)定点突变PCR反应的建立：(a)设计定点突变的正向引物(panD-F：5’-GAATGCTTCCTAATGAATACGTAC-3’，下划线为突变碱基)和反向引物(panD-R：5’-CACAATTTGTACGTATTCATTAGG-3’，下划线为突变碱基)；(b)配置50μL的PCR反应体系：25μLphanta mix，2μL上游引物panD-F，2μL下游引物panD-R，1μL模板pET28b(+)-panD，其余为无菌水；(c)将PCR反应混合液置于PCR仪上进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性20s；退火温度56℃20s 30个循环数；72℃延伸4min 30s；72℃彻底延伸7min，然后保存在4℃下。扩增结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳确证PCR产物大小。
(a)50μL的扩增体系用2μL Quickcut Dpn I和5μL 10×Quickcut Buffer以及DNA纯化试剂盒纯化PCR扩增产物；取2μL纯化后PCR产物用ND5000超微量紫外可见分光光度计测定样品的浓度和纯度。按《分子克隆实验指南》将扩增产物转化至50μL大肠杆菌BL21感受态细胞。涂布至含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基平板，37℃培养过夜。长出的转化子挑选3～4个用含50mg/L卡那霉素的LB试管中培养，获得的菌株送往杭州擎科生物有限公司测序，通过原始序列比对，得到了我们所需要的目标菌株。
实施例2：将空载菌株、亲本以及基因工程突变株菌分别进行预培养
1、从平板上分别挑取单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素抗性的5mL LB试管里，37℃培养6～8h转接到含有50mg/L卡那霉素抗性50mL LB摇瓶里，培养OD600＝0.5～0.6，加入0.5mmol IPTG，37℃摇床培养，诱导10h后离心收集菌。
2、将步骤1中得到的菌体转接至摇瓶，通过分批补料培养，37℃，180rpm，反应36h，制备β-丙氨酸。如图2所示，突变株的β-丙氨酸产量在24h达到5.72g/L,比亲本和野生型在同样的培养条件下分别提高了1.84倍和2.23倍。
3、将步骤1中所得到的菌体用PBS洗涤两次重悬，控制L-天冬氨酸在初始反应体系中的浓度为80g/L，按重悬液和L-天冬氨酸的体积比1:1进行全细胞发酵，37℃，180rpm，反应24h，制备β-丙氨酸。如图3所示，突变株的β-丙氨酸产量达到5.04g/L，比亲本和野生型在同样的培养条件下分别提高了1.38倍和3.17倍。
实施例3：突变菌株的动力学特征的研究
将实施例1中测序结果正确的转化子和亲本株以及空载菌株分别接入含有50mg/L的5mL LB试管中，37℃培养6～8h后转接到含50mg/L卡那霉素的50mL LB摇瓶里，至OD600＝0.5～0.6时，加入0.5mmol IPTG，37℃摇床培养，10h后，4℃6000rpm离心5min，得到表达panD的三种细胞。使用PBS分别洗涤菌株两次，最后用PBS重悬，超声破胞，4℃10000rpm离心5min收集上清液，即为粗酶液，然后用蛋白纯化试剂盒过NI柱纯化目的蛋白，最终得到的纯蛋白用BCA试剂盒测其浓度。空载菌株、亲本菌株(K43R)及突变株(K43Y)的蛋白浓度分别约为5.36μg/μL、4.39μg/μL、3.93μg/μL。将纯化的酶液分别加入80g/L的L-天冬氨酸的水溶液(用氢氧化钠预先调节水溶液的pH值至7.0)和200mM PBS缓冲液(体积1：1)，进行全细胞发酵。37℃，反应20min，取样，进行检测，计算酶活，结果见下表：
Figure BDA0003280674020000071
可见与亲本株与野生型相比，本发明突变株活性得到了显著提高。
序列表
<110> 浙江工业大学
黑龙江华瑞生物科技有限公司
<120> β丙氨酸合成酶突变体、编码基因、基因工程菌及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 384
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60
aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120
aatgaatacg tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180
cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240
gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300
catgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360
gaaccagccc gtacaatttt gtag 384
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
Met Tyr Arg Thr Met Met Ser Gly Lys Leu His Arg Ala Thr Val Thr
1 5 10 15
Glu Ala Asn Leu Asn Tyr Val Gly Ser Ile Thr Ile Asp Glu Asp Leu
20 25 30
Ile Asp Ala Val Gly Met Leu Pro Asn Glu Tyr Val Gln Ile Val Asn
35 40 45
Asn Asn Asn Gly Ala Arg Leu Glu Thr Tyr Ile Ile Pro Gly Lys Arg
50 55 60
Gly Ser Gly Val Ile Cys Leu Asn Gly Ala Ala Ala Arg Leu Val Gln
65 70 75 80
Glu Gly Asp Lys Val Ile Ile Ile Ser Tyr Lys Met Met Ser Asp Gln
85 90 95
Glu Ala Ala Ser His Glu Pro Lys Val Ala Val Leu Asn Asp Gln Asn
100 105 110
Lys Ile Glu Gln Met Leu Gly Asn Glu Pro Ala Arg Thr Ile Leu
115 120 125
<210> 3
<211> 384
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
atgtatcgaa caatgatgag cggcaaactt cacagggcaa ctgttacgga agcaaacctg 60
aactatgtgg gaagcattac aattgatgaa gatctcattg atgctgtggg aatgcttcct 120
aatgaaaaag tacaaattgt gaataataat aatggagcac gtcttgaaac gtatattatt 180
cctggtaaac ggggaagcgg cgtcatatgc ttaaacggtg cagccgcacg ccttgtgcag 240
gaaggagata aggtcattat tatttcctac aaaatgatgt ctgatcaaga agcggcaagc 300
catgagccga aagtggctgt tctgaatgat caaaacaaaa ttgaacaaat gctggggaac 360
gaaccagccc gtacaatttt gtag 384

Claims (8)

1.一种催化效率提高的β丙氨酸合成酶突变体，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。
2.编码权利要求1所述的突变体的基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.含有权利要求2所述的编码基因的重组质粒。
5.含有权利要求2所述的编码基因的基因工程菌。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌按如下方法构建获得：将SEQ ID No.1所示基因克隆到PET-28b(+)表达载体上，得到重组质粒PET-28b-panD，将所得的重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，获得重组大肠杆菌E.coli BL21-PET28b-panD，即所述基因工程菌。
7.权利要求5或6所述基因工程菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为：以L-天冬氨酸为反应底物，以所述基因工程菌发酵获得的产酶细胞为催化剂，于缓冲液中进行反应制备β-丙氨酸。
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张腾辉: "L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达、改造及全细胞制备β-丙氨酸", 《江南大学硕士学位论文》 *
王姗姗: "易错PCR对L-天冬氨酸-α-脱羧酶的分子改造", 《浙江工业大学硕士学位论文》 *
王超: "L-天冬氨酸α-脱羧酶热稳定性改造及全细胞催化制备β-丙氨酸", 《江南大学硕士学位论文》 *
莫芹: "L-天冬氨酸α-脱羧酶催化失活相关分子机制的研究", 《江南大学博士学位论文》 *
陈虹: "L-天冬氨酸-α-脱羧酶的蛋白质工程改造及其在β-丙氨酸生产中的应用", 《浙江工业大学硕士学位论文》 *

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CN113801869B (zh) 2022-03-25

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